JP2022088462A - 炎症のイメージングのための分子標識としてのＣＤ３１ｓｈｅｄ - Google Patents

Abstract

【課題】炎症状態のイメージングおよび診断に関する信頼可能な解決策を提供する。【解決手段】炎症状態の分子イメージングにおいて標的として使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄを提供する。異なるラット炎症モデルにおいて、放射標識ペプチドＰ８ＲＩをＣＤ３１ｓｈｅｄリガンドとして投与することにより、ＣＤ３１ｓｈｅｄが検出可能なシグナルを可能にする量で活性化細胞に存在するが、循環中の活性化細胞および炎症に関与していない他の臓器または細胞に存在するＣＤ３１ｓｈｅｄに対応するノイズシグナルはほとんどない。よって、炎症状態の分子イメージングにおける分子イメージング剤としての標識ＣＤ３１ｓｈｅｄリガンドおよびその使用にも関する。炎症部位の分子イメージングは、特に、対象が炎症状態を罹患している、または有するリスクがある、または抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定することを可能にする。【選択図】なし

Description

本発明は、特に、対象が炎症状態を罹患している、または炎症状態を有するリスクがある、または炎症状態を発症するリスクがあるかどうかを決定するため、および抗炎症治療後に炎症状態の度合いの変化をモニタリングするための、炎症部位の分子イメージングに関する。

炎症部位のイメージングは、炎症状態の診断に有用なツールである。炎症における高レベルのグルコース代謝により、^１８Ｆ－ＦＤＧ（２－デオキシ－２－^１８Ｆ－フルオロ－Ｄ－グルコース）ＰＥＴの使用が促されている。しかしながら、^１８Ｆ－ＦＤＧは、特異性が不十分であり、その生理的な取り込みが心臓、肺、および脳で多いことにより、その用途が限定されている。よって、炎症組織をイメージングするためのより特異的な標的が必要とされている。

ＣＤ３１は、白血球、血小板、および内皮細胞により恒常的に発現されている膜貫通型糖タンパク質受容体である。これは、６個のＩｇ様細胞外ドメイン、短い膜貫通セグメント、および免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）として作用する２つの重要なチロシンベースのモチーフ（Ｙ６６３およびＹ６８６の周辺）を含む細胞質テールを含む一本鎖分子からなる。ＣＤ３１の構造を、以下の表１に示す。

同種親和性および阻害性の機能により、ＣＤ３１は、循環のホメオスタシスで重要な役割を発揮している。炎症促進性の状態では、受容体の同種親和性部分が、切断により失われており、活性化細胞はＣＤ３１の切断型を発現する。実際に、国際特許公開公報第２０１０／０００７５６号は、ＣＤ３１が、活性化／メモリーＴリンパ球において、第５および第６の細胞外Ｉｇ様ドメインの間で切断されることを開示している。対して、国際特許公開公報第２０１３／１５２９１９号は、活性化血小板が、同様に、第６の細胞外ドメインと膜近傍配列との間で切断されているＣＤ３１を発現することを開示している。両種の、ＣＤ３１の切断された細胞外配列（「可溶性ＣＤ３１」とも呼ばれている）は、次に循環の中に放出され、循環中で、健常な内皮細胞により産生される、ＣＤ３１の可溶性スプライシングバリアントと共に存在する。切断の後に膜に固定されたままである残りの小さなＣＤ３１エクトドメインは、「ＣＤ３１^ｓｈｅｄ」と呼ばれている。国際特許公開公報第２０１０／０００７５６号および国際特許公開公報第２０１３／１５２９１９号は、個体の生物学的試料における前記可溶性のＣＤ３１の検出に基づき血栓性障害または自己免疫性障害を診断するための方法を開示している。

国際特許公開公報第２０１０／０００７４１号は、活性化白血球および血小板上のＣＤ３１^ｓｈｅｄを特異的に標的化することにより、ＣＤ３１の生理的な免疫調節機能を回復させることができるＣＤ３１のエクトドメインの膜近傍のアミノ酸に対応するペプチドを開示している。このようなペプチドは、血栓障害または自己免疫障害の治療に有用である。国際特許公開公報第２０１３／１９００１４号は、さらに、血栓障害または炎症障害の治療に関する有用性を保持し、薬物開発により適した物理化学的特性を呈する、細胞外ＣＤ３１の膜傍近位部の中の、８アミノ酸の特異的ペプチドを開示している。

依然として、炎症状態のイメージングおよび診断に関する信頼可能な解決策を提供する必要がある。

本発明の説明
本発明者らは、意外にも、ＣＤ３１^ｓｈｅｄ自体が、特に炎症部位の分子イメージングを可能にすることにより、炎症状態の診断のための分子標的として使用できることを見出した。実際にＣＤ３１^ｓｈｅｄは、驚くべきことに、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを使用する場合に検出可能なシグナルを得ることができる量で活性化細胞上に存在することが見いだされたが、循環中の活性化細胞、および炎症に関与していない他の臓器または細胞に存在するＣＤ３１^ｓｈｅｄに対応するノイズシグナルはほとんどなく、これにより良好なシグナル対ノイズ比がもたらされた。本発明者らは、実際に炎症の動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに特異的な放射標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを前記動物に投与することにより、ＣＤ３１^ｓｈｅｄを発現する活性化細胞への放射標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの特異的結合、およびその後の炎症部位における濃度により、炎症部位を局在化することを可能にする一方で、残存する放射標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドが迅速に動物の体から排出されることを示している。

これに関連して、本発明者らは、ＰＥＧスペーサーを介してＨＹＮＩＣ（６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸）に結合させるとともに９９ｍＴｃで放射標識した、Ｄ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドＰ８ＲＩを使用した。前記放射標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において安定であり、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに特異的であり、血漿タンパク質への結合が非常に少ないことが見いだされた。

よって、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに特異的に結合できる標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド（特に小さなペプチド）が、炎症の分子イメージングのためのトレーサーとして有用である。

よって、本発明の１つの目的は、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドと少なくとも１種のイメージング標識（好ましくは少なくとも１種の放射性核種）とを含む、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドである。

前記ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは、
ａ）
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位により定義される配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチド、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類ＣＤ３１において配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位に対応する配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一である配列からなる３～１５アミノ酸のペプチド、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）のレトロ－インベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチド、および
（ｖ）少なくとも１つもしくは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）
からなる群において選択されるペプチド、
または、
ｂ）ペプチドａ）のペプチド模倣体
である。

（ｖ）のＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは、Ｄ－エナンチオマー型である少なくとも１つのアミノ酸を含む。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは、配列番号２の配列のペプチド、配列番号３の配列のペプチド、配列番号４の配列のペプチド、配列番号５の配列のペプチド、Ｄ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチド、配列番号７の配列のペプチド、およびＤ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号８の配列のペプチドからなる群で選択される。

好ましいＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、配列番号５の配列のペプチド、またはＤ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドである。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの放射性核種は、好ましくは、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ＳＰＥＣＴおよび／もしくはＰＥＴのハイブリッド、またはそれらの組み合わせなどの分子イメージング技術（複数可）により検出可能である。

たとえば、放射性核種は、テクネチウム－９９ｍ（９９ｍＴｃまたは^９９ｍＴｃ）、ガリウム－６７（^６７Ｇａ）、ガリウム－６８（^６８Ｇａ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、レニウム－１８６（^１８６Ｒｅ）、フッ素－１８（^１８Ｆ）、銅－６４（^６４Ｃｕ）、またはタリウム－２０１（^２０１Ｔｌ）である。

好ましい標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドとしてのＤ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドと、放射性核種としての^９９ｍＴｃとを含む。

１つの好ましい実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、任意に少なくとも１つのスペーサーを介して、ＨＹＮＩＣ（６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸）と結合している。

本発明の別の目的は、特に、対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするために、炎症部位をイメージングするための分子イメージング剤として使用するための上記に定義されている標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。また本発明は、特に炎症部位をイメージングするために、分子イメージング剤として上記に定義される標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの使用に関する。

本発明の別の目的は、好ましくは、対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするための方法、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記方法が、
対象から得た生物学的試料において、上記に定義された標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドで細胞表面上のＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在を検出するステップを含む、
方法に関する。

本発明の別の目的は、炎症部位のイメージングのため、より具体的には、対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするために、分子イメージングの標的として使用するためのＣＤ３１^ｓｈｅｄに関する。また本発明は、特に炎症部位をイメージングするために、分子イメージングの標的として使用するためのＣＤ３１^ｓｈｅｄの使用に関する。

炎症状態
炎症状態は、多数の疾患の根底にある。たとえば免疫系は、多くの場合、アレルギー反応および一部のミオパチーの両方で実証されているように、炎症状態に関与しており、多くの免疫系の障害が、異常な炎症をもたらしている。

本明細書を通して使用されている用語「炎症状態」は、限定するものではないが、慢性炎症状態、免疫障害、自己免疫障害、急性および慢性の移植片による同種異系免疫状態（ｇｒａｎｔ ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、急性および慢性の感染性炎症状態、炎症性プロセスの病因を伴う非免疫疾患、またはそれらの組み合わせを含む。

慢性炎症状態は、たとえば、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、脳アミロイド血管症および／または血管炎である。

免疫障害は、たとえばアレルギーおよび／またはミオパチーである。

自己免疫障害は、たとえば、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グレーブス病、および／または糖尿病である。

急性および慢性の同種異系免疫状態は、たとえば、同種異系移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。

急性および慢性の感染性の炎症状態として、敗血症性肉芽腫（膿瘍）および／または敗血症性ショックが挙げられる。

炎症性プロセスの病因を伴う非免疫疾患は、たとえば、癌、血栓症、虚血性および／または虚血―再灌流による臓器障害（たとえば心筋梗塞および／または脳梗塞）、動脈炎症状態（アテローム血栓症、動脈解離、および／もしくは非治癒型／血栓性動脈瘤など）、ならびに／または神経変性疾患である。

炎症状態は、たとえば、関節リウマチ、多発性硬化症、アレルギー、ミオパチー、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、脳アミロイド血管症、血管炎、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、糖尿病、急性もしくは慢性の移植片拒絶、癌、血栓症、アテローム血栓症、虚血性心筋梗塞および／もしくは脳梗塞、ならびに／または神経変性疾患からなる群から選択される。

イメージングを行う、診断および／または治療すべき対象
本発明の文脈での「対象」は、ヒトまたは非ヒトの哺乳類である。

用語「ヒト」、「個体」、または「患者」は、本明細書中同義であり、互換可能に使用され得る。

前記ヒトは、たとえば男性または女性といった任意の性別であってもよく、かつ、たとえば乳児、小児、青年、成年、高齢者といった任意の年齢であってもよい。

非ヒトの哺乳類は、好ましくは、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類である。

対象は、炎症状態を罹患していてもよく、炎症状態を罹患している疑いがあってもよく、炎症状態を有するリスクがあってもよく、または炎症状態の再発のリスクがあってもよい。

「炎症状態を有するリスクがある」、「炎症状態を罹患しているリスクがある」、および「炎症状態を発症するリスクがある」との表現は、本明細書中同義である。

本発明の文脈での「リスク」は、たとえば炎症状態への転換といった事象が特定の期間にわたって起こる可能性に関する。

炎症のイメージング
「炎症部位のイメージング」および「炎症のイメージング」との表現は、本明細書中同義である。

炎症部位のイメージングは、対象の体内の炎症組織および／または炎症臓器の位置を特定することを可能にする。

炎症部位のイメージングは、多くの利点を呈する。

たとえば、炎症部位のイメージングは、炎症状態の診断、炎症状態の確認、炎症組織もしくは炎症臓器の位置特定、治療、たとえば抗炎症治療に対する応答のモニタリング、治療の炎症的な副作用のモニタリング、炎症状態の発症のリスクの予測、および／または抗炎症治療後の炎症状態の再発のリスクの決定を、可能にする。

よって、炎症部位のイメージングは、対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするために使用されてもよい。

分子イメージングの標的および／または分子イメージング剤は、炎症のイメージングを実行するために必要とされる。

本明細書中使用されている用語「分子イメージングの標的」は、分子イメージング技術を使用することにより検出できる化合物を表す。

本明細書中使用されている用語「分子イメージング剤」は、分子イメージング技術を使用することにより、特定の生物学的要素、特に分子イメージングの標的を検出するために使用できる化合物を表す。

分子イメージング剤は、好ましくは、共有結合または非共有結合でイメージング標識に結合している薬剤である。

本発明の文脈では、分子イメージング剤は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで（たとえば対象の血液試料において）、ＣＤ３１^ｓｈｅｄを検出するために使用される。

分子イメージングの標的として使用するためのＣＤ３１^ｓｈｅｄ
よって本発明は、炎症部位をイメージングするための分子イメージングの標的として使用するためのＣＤ３１^ｓｈｅｄに関する。

また本発明は、炎症部位のイメージングのための分子イメージングの標的としてのＣＤ３１^ｓｈｅｄの使用に関する。

特に、本発明は、特にｉｎ ｖｉｖｏにおいて、炎症部位をイメージングするための方法において分子イメージングの標的として使用するためのＣＤ３１^ｓｈｅｄに関する。

本明細書中使用されている「ＣＤ３１^ｓｈｅｄ」は、ＣＤ３１膜貫通型糖タンパク質受容体の切断の後に、内皮細胞、血小板、または白血球の膜に固定したままである、残存している小さなＣＤ３１エクトドメインを表す。

活性化内皮細胞、血小板、および白血球の表面にあるＣＤ３１^ｓｈｅｄは、少なくともＣＤ３１の第１～第５の細胞外Ｉｇ様ドメインを欠いている。

活性化血小板および活性化内皮細胞の表面にあるＣＤ３１^ｓｈｅｄは、ＣＤ３１の第１～第５の細胞外Ｉｇ様ドメイン、および第６の細胞外Ｉｇ様ドメインの少なくとも一部を欠いている。

活性化白血球の表面にあるＣＤ３１^ｓｈｅｄは、第１～第５の細胞外Ｉｇ様ドメインを欠いているが、第６の細胞外Ｉｇ様ドメインを含んでいる。

また本発明は、対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするための方法、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏでの方法において上記に定義するように使用するためのＣＤ３１^ｓｈｅｄに関する。

また本発明は、特にｉｎ ｖｉｖｏにおいて、対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするために使用するためのＣＤ３１^ｓｈｅｄに関する。

「炎症状態」および「炎症部位のイメージング」との表現は、上記に定義される通りである。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド
用語「ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド」は、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに特異的に結合できるいずれかの化合物を表す。

細胞表面上に存在するＣＤ３１^ｓｈｅｄへの化合物の特異的な結合は、当業者に周知のいずれの方法によって評価してもよい。

たとえば、特異的な結合は、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、またはｂｅｔａ－ｉｍａｇｅｒにより測定され得る。

好ましい実施形態では、細胞表面に存在するＣＤ３１^ｓｈｅｄへの試験される化合物の結合を、以下のように評価する：試験される化合物、または陰性対照としての無関係のアナログを、蛍光プローブ（たとえばフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ））に結合させる。この化合物を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含む生理食塩水バッファー（ＨＢＳＳ、培養培地）中１０^６個の細胞／ｍｌの密度でＣＤ３１＋細胞（たとえば、ＪｕｒｋａｔＴ細胞などの細胞株、または末梢血Ｔ細胞などの初代培養細胞に由来）と共に連続希釈（たとえば１、１０、１００μｍｏｌ）でインキュベートする。細胞活性化因子（たとえば細胞がＴリンパ球の場合、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｅ抗体＋２０μｇ／ｍｌの二次Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどのＴＣＲ架橋）の存在下で、同等の条件をインキュベートする。この反応を、冷たいバッファーで繰り返し洗浄することによって５または２０分後に停止させる。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、再度洗浄する。個々の細胞における試験される化合物の結合は、フローサイトメーターを使用して相対的な蛍光シグナルにより検出する。対照と比較して特定の化合物に関するシグナルが大きければ、および休止細胞と比較して細胞の活性化因子を含む条件のシグナルが大きければ、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに適切に結合することを表す。

あるいは、試験される化合物、または陰性対照としての無関係のアナログを、活性化内皮細胞（たとえば、ヒトの免疫化した細胞株の血管由来の初代培養細胞）への結合に関して、試験する。この細胞を、コンフルエンスとなるまでＩ型コラーゲン薄層上で培養する。活性化のために、細胞を、培養培地中で、ヒト組み換え型ＴＮＦαと共に３０分間インキュベートする。この反応を、冷却した生理食塩水バッファーで細胞をすすぐことにより停止させ、細胞を固定する（たとえばＺｉｎｃ－ｆｉｘａｔｉｖｅ溶液を室温で１０分間用いる）。生理食塩水バッファーで十分にすすいだ後、活性化内皮細胞を、蛍光プローブ（たとえばフルオレセイン）に結合した試験される化合物または陰性対照としての無関係のアナログにより標識し、細胞膜の色素（たとえばＣｅｌｌ Ｍａｓｋ（商標））および核染色（たとえばＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）により対比染色する。個々の細胞における試験される化合物の結合を、蛍光顕微鏡を使用して相対的な蛍光シグナルにより検出する。対照と比較して特異的な化合物に関するシグナルが大きければ、および休止細胞と比較して細胞活性化因子を含む条件のシグナルが大きければ、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに適切に結合することを表す。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、ペプチド、ペプチド模倣体、化学化合物、抗体、またはアプタマーであってもよい。

よって、用語「抗体」は、抗原結合領域を有するいずれかの抗体様分子を表すように使用されており、この用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢまたはＶＨＨ）、ＴａｎｄＡｂｓダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、ビボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合物、それぞれ二重特異性または３重特異性）；ｓｃ－ダイアボディ；κ（λ）ボディ（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合物）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性形式）；ＳＩＰ（小分子免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小モジュール免疫薬」、ｓｃＦｖ－Ｆｃダイマー；ＤＡＲＴ（二本鎖安定化ダイアボディ「Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ」）；１つまたは複数のＣＤＲを含む小さな抗体模倣体などを含む。様々な抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該分野で周知である。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、非内部移行型である。本明細書中使用される用語「非内部移行型抗体」は、それぞれが、細胞表面に存在する標的抗原に結合する特性を有し、この標的抗原に結合しても細胞に入らず、リソソームで分解される抗体を表す。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、軽鎖イムノグロブリンである。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは重鎖イムノグロブリンである。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、軽鎖を生来欠いているラクダ科の哺乳類で見出され得る種類の抗体の単一の重鎖可変ドメインである。

特に、本発明の文脈では、抗体は、単一ドメイン抗体である。用語「単一ドメイン抗体」は、当該分野での一般的な意味を有し、かつ、軽鎖を生来欠いているラクダ科の哺乳類で見出され得る種類の抗体の単一の重鎖可変ドメインを表す。このような単一ドメイン抗体はまた、ＶＨＨまたは「ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）」とも呼ばれている。（単一の）ドメイン抗体の一般的な説明に関しては、上述の従来技術、およびＥＰ ０ ３６８ ６８４， Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ １９８９ Ｏｃｔ １２； ３４１ （６２４２）： ５４４－６）、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００３， ２１（１１）：４８４－４９０；および国際特許公開公報第０６／０３０２２０号、国際特許公開公報第０６／００３３８８号を参照されたい。単一ドメイン抗体のアミノ酸配列および構造は、それぞれ「フレームワーク領域１」またはＦＲ１；「フレームワーク領域２」またはＦＲ２；「フレームワーク領域３」またはＦＲ３；および「フレームワーク領域４」またはＦＲ４と当該分野および本明細書中で呼ばれている、４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」から構成されると考えることができ、フレームワーク領域の間には、それぞれ「ＣＤＲ１」、すなわち「相補性決定領域１」、または「ＣＤＲ２」、すなわち「相補性決定領域２」、または「ＣＤＲ３」すなわち「相補性決定領域２（３）」と当該分野で呼ばれている、３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」が存在する。よって、単一ドメイン抗体は、一般的な構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有するアミノ酸配列と定義することができ、ここでＦＲ１～ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１～４を表し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は、相補性決定領域１～３を表す。本発明の文脈では、単一ドメイン抗体のアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）の情報システムによるアミノ酸のナンバリングにより提供されるＶＨドメインに関する一般的なナンバリングに従ってナンバリングされている（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）。

特に、本発明の文脈では、抗体は、一本鎖可変フラグメントである。用語「一本鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖフラグメント」は、リンカー分子を介して結合した抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む単一のフォールディングされたポリペプチドを表す。このようなｓｃＦｖフラグメントでは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかの順とすることができる。この産生を容易にすることに加えて、ｓｃＦｖフラグメントは、スペーサーを介してｓｃＦｖに結合するタグ分子を含んでもよい。よって、ｓｃＦｖフラグメントは、抗原認識に関与しているＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むが、対応する抗体の免疫原性の定常ドメインを含まない。

本発明の一実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドはペプチドである。

本ペプチドは、好ましくは、国際特許公開公報第２０１０／０００７４１号または同２０１３／１９００１４号に開示されているペプチドである。

好ましくは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは合成ペプチドである。

「合成ペプチド」とは、そのペプチドが、生きている生物（たとえばヒト）の中に存在しないことを意図する。

合成ペプチドは、好ましくは精製されている。

合成ペプチドは、組成物またはキットの一部であってもよい。

本ペプチドは、
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位により定義されている配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドと、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類のＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位に対応する配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドと、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一である配列からなる３～１５アミノ酸のペプチドと、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のレトロ－インベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチドと、
（ｖ）少なくとも１つもしくは少なくとも１つのさらなる化学的修飾、好ましくはＤ－エナンチオマー型の少なくとも１つのアミノ酸を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、もしくは（ｉｖ）と
からなる群で選択されてもよい。

「フラグメント」は、本明細書中、連続したアミノ酸の配列を表す。たとえば、フラグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸のフラグメントであってもよい。

配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位により定義されている配列は、配列番号１２である。

よって、本ペプチドは、配列番号１２の配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなり得る。

また本ペプチドは、非ヒト哺乳類ＣＤ３１において配列番号１２の配列に対応する配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなってもよい。

非ヒト哺乳類のＣＤ３１の非限定的な例は、配列番号９の配列のマウスＣＤ３１、配列番号１０の配列のウシＣＤ３１、および配列番号１１の配列のブタＣＤ３１である。

当業者は、たとえば、配列番号１の配列と、前記非ヒト哺乳類ＣＤ３１タンパク質の配列、たとえば配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１の配列のうちの１つを含む配列との間で配列アライメントを行うことにより、非ヒト哺乳類ＣＤ３１タンパク質における配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位、すなわち配列番号１２に対応する配列を容易に同定することができる。

たとえば、ＢｉｏＰｅｒｌ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＬＡＬＩＧＮ、Ｊａｌｉｇｎｅｒ、ｍａｔｃｈｅｒ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアおよびＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムなどのアライメントアルゴリズムを使用する、配列アライメントおよび配列同一性の決定のための方法が、当業者に周知である。

本発明に係るＣＤ３１ペプチドの配列は、好ましくはヒトＣＤ３１またはマウスＣＤ３１の配列に由来している。

本ペプチドはまた、ペプチド（ｉ）、すなわち配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位により定義されている配列の３～１５アミノ酸のフラグメントの配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％同一である配列からなる３～１５アミノ酸のペプチドであってもよい。

４～６アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大１つのアミノ酸が異なる。

７～９アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大２つのアミノ酸が異なる。

１０～１３アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大３つのアミノ酸が異なる。

１４または１５アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大４つのアミノ酸が異なる。

「参照配列と少なくともｘ％同一である配列」は、対象ペプチドのアミノ酸配列が、参照配列と同一であるか、または参照配列の１００個アミノ酸あたり最大１００－ｘ個のアミノ酸変化によって参照配列と異なることが意図されている。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくともｘ％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列のアミノ酸残基の最大１００－ｘ％を、挿入、欠失、または別のアミノ酸に置換してもよい。

２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該分野で周知である。たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１で利用可能なプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して、２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの「ローカルホモロジー（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」アルゴリズムを使用し、２つの配列間で最良に類似性のある単一の領域を発見する。配列間の同一性を決定するための他のプログラムもまた、当該分野で周知であり、たとえばＮｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３に記載されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づいており、たとえば、ポリペプチド配列の比較に関して以下のパラメータを用いる：比較行列：ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ：１０、およびギャップ伸長ペナルティ：０．５、エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープンペナルティ＝１０、エンドギャップ伸長ペナルティ＝０．５；ならびにポリヌクレオチド配列の比較に関して以下のパラメータを用いる：比較行列：ＤＮＡＦＵＬＬ；ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープンペナルティ＝１０、エンドギャップ伸長ペナルティ＝０．５。

参照配列と「少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である」アミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列と比較して、欠失、挿入、および／または置換などの変異を含み得る。

置換の場合、置換は、好ましくは、以下の表１に表されている保存的置換に対応する。好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸からなるペプチドは、保存的置換によってのみ参照配列と異なる。

別の好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列の天然に存在するアレルバリアントに対応する。

さらなる別の好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列と比較して、別の非ヒト哺乳類種に由来するホモログ配列に対応する。

好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドは、保存的置換により参照配列と異なり、および／または参照配列と比較して別の非哺乳類種に由来するホモログ配列に対応する。

「ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のレトロ－インベルソ配列からなるペプチド」との表現は、本明細書中で、そのアミノ酸が、ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の配列とそれぞれ比較すると逆の順番にあり、天然に存在するＬ－アミノ酸の代わりにＤ－アミノ酸からなるという点で、ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）と異なるペプチドを意味する。

アミノ酸のＤ－エナンチオマー（Ｄ－アミノ酸とも呼ばれている）は、対応するＬ－エナンチオマー（Ｌ－アミノ酸とも呼ばれている）と同一の文字ではあるが小文字により表されている。よって、たとえばアルギニンのＬ－エナンチオマーは「Ｒ」と表されるが、Ｄ－エナンチオマーは、「ｒ」と表されている。

好ましくは、本ペプチドは、有機溶媒はまたは非有機溶媒に可溶性である。

好ましい実施形態では、本ペプチドは水溶性である。より具体的には、本ペプチドは、好ましくは、水および／またはトリフルオロ酢酸塩（たとえば０．１％のトリフルオロ酢酸塩溶液中）、ＮａＣｌ（９ｇ／Ｌ）、ＰＢＳ、トリス、もしくはトリス－リン酸などの水性バッファーに可溶性である。水および水性バッファーに可溶であることは、薬理学的観点から特に好適である。このような可溶性のため、本ペプチドは、たとえば少なくともまたは最大、１マイクロモル濃度、１０マイクロモル濃度、５０マイクロモル濃度、１００マイクロモル濃度、５００マイクロモル濃度、１ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭに等しい濃度で、水溶液に溶解し得る。

水に容易に溶解できる本発明のＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、少なくとも１つの荷電アミノ酸（好ましくはアルギニン（Ｒ）および／またはリジン（Ｋ））の存在により得ることができる（前記荷電アミノ酸は、２つの疎水性残基の間に含まれていない）。

よって、好ましい実施形態では、本発明に係るＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、少なくとも１つの荷電アミノ酸、好ましくはアルギニンおよび／またはリジンを含み、前記荷電アミノ酸は、２つの疎水性残基の間に含まれていない。

より好ましい実施形態では、前記荷電アミノ酸は、配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置している。

たとえば、本発明に係る好ましいＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの配列は、モチーフＲＶ（たとえばＶＲＶの代わりに）で始まる。

好ましい実施形態では、本ペプチドは、ペプチダーゼ、特に真核生物のペプチダーゼに抵抗性である。

「ペプチダーゼに抵抗性である」は、本明細書中では、哺乳類の血清と共に３７℃でインキュベーションした後、または生きている実験動物に注射した後に、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）により決定した場合に、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドが未消化なままであることを意味する。ペプチドの血清中での安定性を評価することを目的とする臨床検査は、十分に規格化されている（たとえばＪｅｎｓｓｅｎ ａｎｄ Ａｓｐｍｏ， ２００８， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４９４， １７７－１８６を参照されたい）。非常にペプチターゼ抵抗性であるペプチドは、タンパク質分解酵素の存在下で、元の質量の最大７０％が未消化のままであり、および／または２４０分より長い半減期を示すペプチドである（たとえば、Ｋｕｍａｒａｓｉｎｇｈｅ ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ， ２０１５， Ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｂ．Ｍ． Ｄｕｎｎ， ｅｄ． （Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｗｉｌｅｙ）， ｐｐ． ２４７－２６を参照）。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは、可溶性ペプチダーゼまたは細胞表面に存在するペプチダーゼなどの、血中に存在するペプチダーゼに抵抗性である。

またＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくはその安定性および／生物学的利用率を改善するために、少なくとも１つまたは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含んでもよい。

このような化学的修飾は、一般的に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける酵素的分解に対するペプチドの保護を増大させ、および／または膜障壁を通る能力を増大させることにより、その半減期が増加する、および／またはその生物活性を維持もしくは改善するペプチドを得ることを目的とする。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、少なくとも１つの人工のアミノ酸を含んでもよく、上記人工のアミノ酸は、好ましくは、Ｄ－エナンチオマーのアミノ酸、βメチルアミノ酸、α置換型αアミノ酸、およびアミノ酸アナログからなる群から選択される。

「βメチルアミノ酸」は、本明細書中、側鎖にアミノメチル基を含むアミノ酸アラニンの誘導体を意味する。この非タンパク質原性アミノ酸は、極性塩基として分類される。

「α置換型αアミノ酸」は、本明細書中、Ｌアミノ酸のα炭素上の基（ＮＨ２）が、別の非タンパク質性の基、たとえばメチル基、アリール基、またはアシル基に変化していることを意味する。

「アミノ酸アナログ」は、本明細中、天然のアミノ酸の他のいずれかの人工のアナログを意味する。

よって、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、少なくとも１つのＤ－エナンチオマー型のアミノ酸を含んでもよい。たとえば、上記に定義されているＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個が、Ｄ－エナンチオマー型であってもよい。

一実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、Ｄ－アミノ酸からなる。

またＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、逆位の配列、すなわちアミノ酸鎖の逆位を（Ｃ末端からＮ末端まで）含んでもよい。本ペプチドのアミノ酸配列全体が逆位であってもよく、またはアミノ酸配列の一部が逆位であってもよい。たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸の連続した配列が逆位であってもよい。本明細書中「逆位の」アミノ酸の意味は、配列における連続したアミノ酸の配列の逆位を表す。

他の化学的修飾として、限定するものではないが、
ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端への修飾、たとえばＮ末端のメチル化、Ｎ末端のアシル化（好ましくはアセチル化）もしくは脱アミノ化、もしくはＣ末端カルボキシル基のアミド基もしくはアルコール基への修飾、
２つのアミノ酸間でのアミド結合での修飾：２つのアミノ酸を結合するアミド結合の窒素原子もしくはα炭素でのアシル化（好ましくはアセチル化）、もしくはアルキル化（好ましくはメチル化）、
２つのアミノ酸を結合するアミド結合のα炭素での修飾、たとえば、２つのアミノ酸を結合するアミド結合のα炭素でのアシル化（好ましくはアセチル化）もしくはアルキル化（好ましくはメチル化）、
１つもしくは複数の天然に存在するアミノ酸（Ｌ－エナンチオマー）が、アミノ酸鎖の逆位（Ｃ末端からＮ末端まで）と共に、対応するＤ－エナンチオマーに置換されている、レトロインベルソ、
１つもしくは複数のα炭素が窒素原子に置換されている、アザペプチド、
１つもしくは複数のアミノ酸のアミノ基が、α炭素ではなくてβ炭素に結合する、βペプチド、
エステル結合（複数可）（αヒドロキシ酸（複数可）など）、
追加のメチレン基（複数可）（たとえばβアミノ酸およびγアミノ酸（複数可））の挿入、ならびに／または
ペプトイド（複数可）、オリゴ尿素（ｏｌｉｇｏｕｒｅａ）（複数可）、アリールアミド（複数可）および／もしくはオリゴヒドラジド（複数可）
が、挙げられる。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当該分野で周知の化学修飾の技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸を含む。このような修飾は、基本的なテキストおよびより詳細な研究論文、ならびに多くの研究文献で良好に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドの任意の場所で起こり得、所定のポリペプチドのいくつかの部位で同じ程度にまたは様々な程度で、同種の修飾が存在し得ると認識されている。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、これらは、分岐を伴うまたは伴わない環状であってもよい。環状ポリペプチド、分岐型ポリペプチド、および環状の分岐型ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスからもたらされてもよく、または合成方法により作製されてもよい。修飾として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボース化、アライド化（ａｒａｉｄａｔｉｏｎ）、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化（ｍｅｆｈｙｌａｔｉｏｎ）、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｉａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのトランスファーＲＮＡ介在型のタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が、挙げられる。

本発明の好ましい実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位により定義されている配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸５７９～５８１位、アミノ酸５８９～５９１位、アミノ酸５９９～６０１位、および／またはアミノ酸５９３～５９５位を含む、ペプチド、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類ＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位に対応する配列の３～１５アミノ酸のフラグメント、たとえば、配列番号９の配列のアミノ酸５６８～５９０位により定義されている配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、好ましくは、配列番号９のアミノ酸５６８～５７０位、アミノ酸５７８～５８０位、アミノ酸５８８～５９０位、および／またはアミノ酸５８２～５８４位を含む、ペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９０％同一である配列からなる３～１５アミノ酸のペプチド、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のレトロ－インベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチド、および
（ｖ）少なくとも１つまたは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）
からなる群で選択される。

このようなペプチドは、たとえば、ＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１３、配列番号９のアミノ酸５７６～５９０位）、ＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１４、配列番号９のアミノ酸５７７～５９０位）、ＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１５、配列番号９のアミノ酸５７８～５９０位）、ＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１６、配列番号９のアミノ酸５７９～５９０位）、ＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１７、配列番号９のアミノ酸５８０～５９０位）、ＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号３、配列番号９のアミノ酸５８１～５９０位）、ＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１８、配列番号９のアミノ酸５８２～５９０位）、ＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１９、配列番号９のアミノ酸５８３～５９０位）、ＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号２０、配列番号９のアミノ酸５８４～５９０位）、ＬＡＰＷＫＫ（配列番号２、配列番号９のアミノ酸５８５～５９０位）、ＡＰＷＫＫ（配列番号２１、配列番号９のアミノ酸５８６～５９０位）、ＰＷＫＫ（配列番号２２、配列番号９のアミノ酸５８７～５９０位）、ＷＫＫ（配列番号９のアミノ酸５８８～５９０位）、ＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２３、配列番号１のアミノ酸５８７～６０１位）、ＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２４、配列番号１のアミノ酸５８８～６０１位）、ＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２５、配列番号１のアミノ酸５８９～６０１位）、ＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２６、配列番号１のアミノ酸５９０～６０１位）、ＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２７、配列番号１のアミノ酸５９１～６０１位）、ＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号４、配列番号１のアミノ酸５９２～６０１位）、ＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２８、配列番号１のアミノ酸５９３～６０１位）、ＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２９、配列番号１のアミノ酸５９４～６０１位）、ＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号３０、配列番号１のアミノ酸５９５～６０１位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲ（配列番号３１、配列番号９のアミノ酸５６８～５８２位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶ（配列番号３２、配列番号９のアミノ酸５６８～５８１位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡ（配列番号３３、配列番号９のアミノ酸５６８～５８０位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬ（配列番号３４、配列番号９のアミノ酸５６８～５７９位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴ（配列番号３５、配列番号９のアミノ酸５６８～５７８位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳ（配列番号３６、配列番号９のアミノ酸５６８～５７７位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳ（配列番号３７、配列番号９のアミノ酸５６８～５７６位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲ（配列番号３８、配列番号９のアミノ酸５６８～５７５位）、ＳＳＭＲＴＳＰ（配列番号３９、配列番号９のアミノ酸５６８～５７４位）、ＳＳＭＲＴＳ（配列番号４０、配列番号９のアミノ酸５６８～５７３位）、ＳＳＭＲＴ（配列番号４１、配列番号９のアミノ酸５６８～５７２位）、ＳＳＭＲ（配列番号４２、配列番号９のアミノ酸５６８～５７１位）、ＳＳＭ（配列番号９のアミノ酸５６８～５７０位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲ（配列番号４３、配列番号１のアミノ酸５７９～５９３位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶ（配列番号４４、配列番号１のアミノ酸５７９～５９２位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴ（配列番号４５、配列番号１のアミノ酸５７９～５９１位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬ（配列番号４６、配列番号１のアミノ酸５７９～５９０位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩ（配列番号４７、配列番号１のアミノ酸５７９～５８９位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫ（配列番号４８、配列番号１のアミノ酸５７９～５８８位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳ（配列番号４９、配列番号１のアミノ酸５７９～５８７位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲ（配列番号５０、配列番号１のアミノ酸５７９～５８６位）、ＮＨＡＳＳＶＰ（配列番号５１、配列番号１のアミノ酸５７９～５８５位）、ＮＨＡＳＳＶ（配列番号５２、配列番号１のアミノ酸５７９～５８４位）、ＮＨＡＳＳ（配列番号５３、配列番号１のアミノ酸５７９～５８３位）、ＮＨＡＳ（配列番号５４、配列番号１のアミノ酸５７９～５８２位）、ＮＨＡ（配列番号１のアミノ酸５７９～５８１位）、ＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡ（配列番号５５、配列番号９のアミノ酸５７２～５８６位）、ＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬ（配列番号５６、配列番号９のアミノ酸５７３～５８５位）、ＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦ（配列番号５７、配列番号９のアミノ酸５７４～５８４位）、ＲＳＳＴＬＡＶＲＶ（配列番号５８、配列番号９のアミノ酸５７５～５８３位）、ＳＳＴＬＡＶＲ（配列番号５９、配列番号９のアミノ酸５７６～５８２位）、ＳＴＬＡＶ（配列番号６０、配列番号９のアミノ酸５７７～５８１位）、ＴＬＡ（配列番号９のアミノ酸５７８～５８０位）、ＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡ（配列番号６１、配列番号１のアミノ酸５８３～５９７位）、ＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬ（配列番号６２、配列番号１のアミノ酸５８４～５９６位）、ＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩ（配列番号６３、配列番号１のアミノ酸５８５～５９５位）、ＲＳＫＩＬＴＶＲＶ（配列番号６４、配列番号１のアミノ酸５８６～５９４位）、ＳＫＩＬＴＶＲ（配列番号６５、配列番号１のアミノ酸５８７～５９３位）、ＫＩＬＴＶ（配列番号６６、配列番号１のアミノ酸５８８～５６２位）、ＩＬＴ（配列番号１のアミノ酸５８９～５９１位）、ＲＶＦ（配列番号９のアミノ酸５８２～５８４位）、ＲＶＦＬ（配列番号６７、配列番号９のアミノ酸５８２～５８５位）、ＲＶＦＬＡ（配列番号６８、配列番号９のアミノ酸５８２～５８６位）、ＲＶＦＬＡＰ（配列番号６９、配列番号９のアミノ酸５８２～５８７位）、ＲＶＦＬＡＰＷ（配列番号７０、配列番号９のアミノ酸５８２～５８８位）、ＲＶＦＬＡＰＷＫ（配列番号５、配列番号９のアミノ酸５８２～５８９位）、ＲＶＩ（配列番号１のアミノ酸５９３～５９５位）、ＲＶＩＬ（配列番号７１、配列番号１のアミノ酸５９３～５９６位）、ＲＶＩＬＡ（配列番号７２、配列番号１のアミノ酸５９３～５９７位）、ＲＶＩＬＡＰ（配列番号７３、配列番号１のアミノ酸５９３～５９８位）、ＲＶＩＬＡＰＷ（配列番号７４、配列番号１のアミノ酸５９３～５９９位）、ＲＶＩＬＡＰＷＫ（配列番号７、配列番号１のアミノ酸５９３～６００位）からなる群から選択される配列を有する。

本発明のより好ましい実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位により定義されている配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸５７９～５８２位、アミノ酸５８８～５９２位、アミノ酸５９８～６０１位、および／またはアミノ酸５９３～５９５位を含む、ペプチド、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類ＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位に対応する配列の３～１５アミノ酸のフラグメント、たとえば、配列番号９の配列のアミノ酸５６８～５９０位により定義されている配列の３～１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、好ましくは、配列番号９のアミノ酸５６８～５７１位、アミノ酸５７８～５８０位、アミノ酸５８７～５９０位、および／またはアミノ酸５８２～５８４位を含む、ペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９０％同一である配列からなる３～１５アミノ酸のペプチド、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のレトロ－インベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチド、ならびに
（ｖ）少なくとも１つまたは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）
からなる群で選択されている。

好ましい実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、逆位および／または少なくとも１つの非天然のアミノ酸、たとえば少なくとも１つのＤ－アミノ酸を含む８アミノ酸のフラグメントである。実際に、このようなペプチドは、元のペプチドの活性を保持しているか、またはさらには活性の改善を示している。治療上の使用が意図されるペプチドに非天然のアミノ酸を組み込むことは、ペプチドの安定性を増大させるために、特にｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を増大させるために有用である。

本発明の別の好ましい実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、配列番号２の配列のペプチド、配列番号３の配列のペプチド、配列番号４の配列のペプチド、配列番号５の配列のペプチド、Ｄ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチド、配列番号７の配列のペプチド、およびＤ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号８の配列のペプチドからなる群で選択される。

より好ましいＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、配列番号５の配列のペプチド、またはＤ－エナンチオマーアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドである。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、少なくとも１つのキレート剤をさらに含んでもよい。

キレート剤は、リガンドに共有結合し、放射性金属（複数可）との錯体形成を可能にする分子である。

概して、キレート剤は、６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）、キレーティングペプチド、たとえばＧｌｙ－Ｇｌｙ－ＣｙｓまたはＨｉｓベース配列（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉ ２００４， Ｗａｉｂｅｌ １９９９， Ａｌｉ ２０１１）、ＭＡＧ３ ｅｎ Ｎ－ｔｅｒ（Ｏｋａｒｖｉ ２０１２， ２００４）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７－トリス（カルボキシメチルアザ）シクロドデカン－１０－アザアセチルアミド（ａｚａａｃｅｔｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＯ３Ａ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｄ－ペニシラミン、２，３－ジメルカプトコハク酸、２，３－ジメルカプト－１－プロパンスルホン酸、２，３－ジメルカプトプロパノール（ＢＡＬ）、トリエチレンテトラミン、テトラチオモリブデン酸アンモニウムアニオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２－（ｐ－イソチオシアナトベンジル）－６－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＩＢ４Ｍ）、またはヒドロキシピリジノン（ＨＯＰＯ）とすることができる。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、直接キレート剤と結合してもよく（たとえばキレート剤は、外側のアミノ酸長鎖に結合する）、または、たとえば少なくとも１つのスペーサーを介して間接的にキレート剤と結合してもよい。

好ましいキレート剤は、６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）である。

このような場合、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドのペプチドは、直接ＨＹＮＩＣと結合してもよく（たとえばＨＹＮＩＣは、外側のアミノ酸長鎖に結合する）、またはたとえば少なくとも１つのスペーサーを介して間接的にＨＹＮＩＣと結合してもよい。

スペーサーは、たとえば少なくとも１つのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、たとえば１つ、２つ、もしくは少なくとも３つのＰＥＧ、より好ましくは３つのＰＥＧおよび／または少なくとも１つの脂肪族のスペーサーを、含む、またはからなる。

好ましいＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、以下の式：

の化合物である。

この化合物は、以下でＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩとも呼ばれている。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、化学合成、たとえば固相合成もしくは液相合成、または遺伝子操作などの、当技術分野で周知のいずれかの手法により、調製することができる。固相合成として、たとえば合成されるペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を、有機溶媒に不溶性の支持体に結合させ、適切な保護基で保護したこれらのアミノ基および側鎖官能基を有するアミノ酸を、Ｃ末端からＮ末端の順序で、１つずつ縮合する反応と、樹脂に結合したアミノ酸またはペプチドのアミノ基の保護基が放出される反応を交互に繰り返すことにより、この方法によってペプチド鎖を伸長させる。望ましいペプチドを合成した後、これを脱保護反応に供し、固相支持体から切り離す。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法ではフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸、Ｆｍｏｃ法ではＴＦＡを用いて行われてもよい。

固相合成法は、使用される保護基の種類に応じて、大きく、ｔＢｏｃ法およびＦｍｏｃ法により分類される。概して使用される保護基として、アミノ基ではｔＢｏｅ（ｔ－ブトキシカルボニル）、Ｃｌ－Ｚ（２－クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ－Ｚ（２－ブロモベンジルオキシ（ｏｙｙ）カルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメトキシ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｃｔｈｏｘｙ）カルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’－ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、およびＣｌｚ－Ｂｚｌ（２，６－ジクロロベンジル）；グアニジノ基ではＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２， ５，７，８－ペンタメチルクロマン－６－スルホニル）；ならびにヒドロキシル基ではｔＢｕ（ｔ－ブチル）が、挙げられる。

あるいは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、組み換え技術を使用して合成してもよい。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを生産する方法は、任意に、前記ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを精製するステップ、前記ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを化学的に修飾するステップ、および／または前記ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを医薬組成物に製剤化するステップを含んでもよい。

一実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、上述のペプチドのペプチド模倣体、すなわち前記ペプチドを模倣する化合物である。

「ペプチド模倣体」は、所定のペプチドを模倣することにより、前記ペプチドと同等または前記ペプチドと同様の生物学的活性を化合物に付与する、非ペプチドの構造要素からなる、または本質的になる、化合物である。

ペプチド模倣体は、好ましくは、有機溶媒または無機溶媒に可溶性である。

上述のペプチドとして、ペプチド模倣体は、好ましくは水溶性である。

所定のペプチドのペプチド模倣体を設計および合成するための方法は、当該分野で周知であり、たとえば、Ｒｉｐｋａ ａｎｄ Ｒｉｃｈ（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １９９８； ２（４）：４４１－５２）およびＰａｔｃｈ ａｎｄ Ｂａｒｒｏｎ（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２００２； ６（６）：８７２－７）に記載されるものが挙げられる。

イメージング標識
本発明に係る標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、少なくとも１つのイメージング標識を含む。

前記イメージング標識は、放射性核種または造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔｏｐｈｏｒ）であり得る。

本明細書中使用される用語「造影剤」は、たとえばキレート剤を含む、造影剤を表す。

造影剤に使用され得るキレート剤の例が、「ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド」の節で以下に提供されている。

造影剤の非限定的な例として、Ｇｄ－ＤＴＰＡ（ガドリニウムおよびＤＴＰＡの錯体）、またはＧｄ－ＤＯＴＡ（ガドリニウムおよびＤＯＴＡの錯体）がある。

造影剤は、好ましくはＭＲＩ（以下で「ＩＲＭ」または「核磁気共鳴画像法」とも呼ばれている）に使用されている。

本明細書中使用される用語「放射性核種」は、放射活性核種、ラジオアイソトープ、または放射活性アイソトープと同じ意味を有する。

放射性核種は、好ましくは、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ＳＰＥＣＴおよび／もしくはＰＥＴのハイブリッド、またはそれらの組み合わせなどの核医学の分子イメージング技術（複数可）により検出可能である。

本明細書中の単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）は、プラナーシンチグラフィー（ＰＳ）を含む。

ＳＰＥＣＴおよび／またはＰＥＴのハイブリッドは、たとえば、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ、ＰＥＴ／ＣＴ、ＰＥＴ／ＩＲＭ、またはＳＰＥＣＴ／ＩＲＭである。

ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴは、対象の身体に導入された放射性核種の濃度（または取り込み）に関する情報を取得する。ＰＥＴは、陽電子（ポジトロン）を発する放射性核種により発せられたガンマ線の対を間接的に検出することにより、画像を作製する。ＰＥＴ解析は、対象の領域（たとえば脳、胸、肝臓．．．）にわたり身体の一連の薄い切片の画像をもたらす。これらの薄い切片の画像を、試験領域の３次元表示に組み立てることができる。ＳＰＥＣＴは、ＰＥＴと類似しているが、ＳＰＥＣＴで使用される放射活性物質は、ＰＥＴで使用されるものよりも長い減衰時間を有し、二重のガンマ線の代わりに単一のガンマ線を発する。ＳＰＥＣＴの画像は、ＰＥＴの画像よりも感度が低く詳細ではないが、ＳＰＥＣＴ技術は、ＰＥＴよりも安価であり、粒子加速器が近くにあることを必要としないとの利点を提供する。実際の臨床上のＰＥＴは、ＳＰＥＣＴよりも高感度であり、空間解像度が良好であり、光子の大きなエネルギーにより正確な減衰の補正の利点を呈し；よってＰＥＴは、ＳＰＥＣＴよりも正確な定量データを提供する。プラナーシンチグラフィー（ＰＳ）は、同じ放射性核種を使用する点で、ＳＰＥＣＴに類似している。しかしながら、ＰＳは、２Ｄの情報のみを作製する。

ＳＰＥＣＴは、コンピュータで作製された、局所的な放射性トレーサーの取り込みの画像を作製し、ＣＴは、ヒトの身体のＸ線密度の解剖学的な３Ｄ画像を作製する。ＳＰＥＣＴ／ＣＴのイメージングの組み合わせは、１度の試験の間に得られる、ＳＰＥＣＴからの機能的な情報およびＣＴからの解剖学的な情報を逐次的に提供する。またＣＴのデータは、単一の光子放出のデータの迅速かつ最適な減衰補正にも使用されている。異常および／または生理的なトレーサーの取り込みの領域を正確に局所化することにより、ＳＰＥＣＴ／ＣＴは、感度および特異性を改善し、同様に、正確な線量測定用の推定値を得るため、ならびに介入手法を誘導するため、または体外照射療法に関する標的体積を良好に定義するためにも役立ち得る。単一の光子を発する放射性トレーサーを伴うガンマカメラのイメージングは、この手法の大部分を占める。

好ましい実施形態では、放射性核種は、ＳＰＥＣＴまたはＳＰＥＣＴ／ＣＴのハイブリッドにより検出可能である。

放射性核種は、テクネチウム－９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、ガリウム－６７（^６７Ｇａ）、ガリウム－６８（^６８Ｇａ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、レニウム－１８６（^１８６Ｒｅ）、フッ素－１８（１８Ｆ）、銅－６４（^６４Ｃｕ）、またはタリウム－２０１（^２０１Ｔｌ）からなる群で選択されてもよい。

好ましい放射性核種は、テクネチウム－９９ｍ（^９９ｍＴｃ）である。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド
よって、本発明は、特に、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよび少なくとも１つのイメージング標識を含む標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよびイメージング標識は、同じ名前の節で上記に定義されている通りである。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの放射化学的比活性は、好ましくは、７０ＧＢｑ／μｍｏｌ超、より好ましくは８０ＧＢｑ／μｍｏｌ超、より好ましくは９０ＧＢｑ／μｍｏｌ超、たとえば１００ＧＢｑ／μｍｏｌ超である。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは安定している。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの安定性は、当業者によく知られたいずれかの方法、たとえば放射化学的な純度（ＲＣＰ）を決定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで評価され得る。

放射化学的な純度（ＲＣＰ）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／または迅速薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）、好ましくは両方の方法を使用することにより、評価してもよい。

たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性は、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドをｉｎ ｖｉｔｒｏで血漿中、好ましくは３７℃のヒトの血漿中で、たとえば少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間のインキュベーション後に、評価してもよい。

たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性は、ヒトまたは非ヒトの哺乳類に標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを投与した後の、上記ヒトまたは非ヒトの哺乳類の尿、たとえばラットの尿の試料において、評価してもよい。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでのＲＣＰは、好ましくは８０％超、好ましくは８５％超、たとえば８９％超である。

活性化血小板、内皮細胞、および白血球による標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの生体分布および特異的な取り込みは、エラスターゼの局所的な注入、次いでヒトの腹部大動脈瘤（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ａｏｒｔａ ａｎｅｕｒｙｓｍ：ＡＡＡ）に存在し、ＡＡＡの炎症を誘導することが公知である歯周部の細菌の静脈内注入により誘導される実験的なＡＡＡなどの、炎症モデル、たとえば心臓の炎症、脳の炎症、またはラット血管炎症モデルにおいて、評価してもよい。たとえば、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの静脈内注射の直後に、たとえばハイブリッドＳＰＥＣＴ／ＣＴカメラ（ＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ， Ｂｉｏｓｃａｎ Ｉｎｃ）を使用して、連続的な全身データ取得（たとえば第１の時間で１０分ごと）を行う。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの血漿タンパク質への結合は、好ましくは低く、たとえば３７℃のヒトの血漿において４時間インキュベーションした後に、１０％未満、より好ましくは５％未満である。

血漿タンパク質への低い結合性は、たとえば、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドをｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間、血漿、好ましくは３７℃のヒト血漿中において、インキュベーションした後に、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当業者に周知のいずれかの方法により、評価してもよい。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよびイメージング標識は、共有結合または非共有結合していてもよい。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよびイメージング標識は、好ましくは非共有結合している。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドがキレート剤を含む場合、好ましくは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、上記キレート剤を介して、好ましくは非共有結合で、イメージング標識と結合している。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは放射標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドである。

よって、好ましい標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよび少なくとも１つの放射性核種を含む。

本発明の１つの好ましい実施形態では、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドとしてのＤ－エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドと、放射性核種としての^９９ｍＴｃとを含む。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、さらに、少なくとも１つの共リガンド、すなわち、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに結合した１つまたは複数のリガンドを含んでもよい。

共リガンド（複数可）は、好ましくは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに結合したイメージング標識を安定させるために使用される。

たとえば、共リガンドは、トリシン、ＥＤＤＡ（エチレンジアミン二酢酸）（ＥＤＤＡ）、アミノカルボン酸塩、ホスフィン、またはピリジンであってもよい。

一実施形態では、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、たとえば放射性核種が^９９ｍＴｃである場合、共リガンドとしてトリシンおよびＥＤＤＡの両方を含む。

少なくとも１つの共リガンドを使用する場合、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、上記共リガンド（複数可）、上記ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド、および上記放射性核種を含む複合体を含む、またはからなる。

本発明の一実施形態では、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、上記に定義されているように、スペーサーを介して結合したＤ―エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドである。

好ましい標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、^９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩと呼ばれており、
式：

の化合物、および
放射性核種^９９ｍＴｃ
を含む。

ＨＹＮＩＣは、テクネチウムとＨＹＮＩＣのヒドラジン部分との間に^９９ｍＴｃ－Ｎ結合を形成する。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、当業者により完全に知られている従来の方法により、調製することができる。

本明細書中記載の方法および使用において、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、それ自体で使用してもよく、または以下に定義されている医薬組成物として使用してもよい。

本明細書中記載の方法および使用は、以下に定義されているキットを使用することにより、行われてもよい。

分子イメージング剤として使用するための標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド
また本発明は、炎症部位をイメージングするための、分子イメージング剤として上記に定義されている標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの使用に関する。

よって、本発明は、炎症部位をイメージングするための分子イメージング剤として使用するための、上記に定義されている標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。

特に本発明は、炎症部位を検出、より具体的にはイメージングするｉｎ ｖｉｖｏでの方法において分子イメージング剤として使用するための、上記に定義した標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。

特に、本発明は、対象が炎症状態を罹患している、もしくは炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするための方法、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏでの方法において、上記に定義されるように使用するための標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。

また本発明は、ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量を決定する、上記に定義されるように使用するための標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。実際に、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに結合する。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量は、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド、すなわち、前記標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドのイメージング標識に対応して検出されたシグナルの存在、局在化、および／または量により、決定される。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの存在、局在化、および／または量は、プラナーシンチグラフィー（ＰＳ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、光子単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ハイブリッドＳＰＥＣＴ／ＣＴ、またはそれらの組み合わせにより、決定されてもよい。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは、静脈内で使用または投与される。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、好ましくは、検出可能なシグナルを得るための十分な量で使用または投与、特には静脈内に１回注射される。

標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドのイメージング標識に対応するシグナルは、好ましくは、標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの投与の直後に検出される。

このシグナルは、対象の身体全体、または対象の一部のみで（特に対象の身体の一部のみで）、検出され得る。

よって、本発明は、特に、炎症部位を検出、具体的にはイメージングするための方法において使用するための、上記に定義されている標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドであって、前記方法が、
対象に前記標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを投与するステップと、
前記対象または前記対象の身体の少なくとも一部をイメージングすることにより、前記対象または対象の身体の一部におけるＣＤ３１^ｓｈｅｄへの標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの結合を検出するステップと
を含む、
標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。

よって本発明は、特に、対象が炎症状態を罹患している、もしくは炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または炎症状態の治療の有効性をモニタリングするための方法に使用するための、上記に定義されている標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドであって、上記方法が、
対象に上記標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを投与するステップと、
上記対象または上記対象の身体の少なくとも一部をイメージングすることにより、上記対象または対象の身体の一部において、ＣＤ３１^ｓｈｅｄへの標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドの結合を検出するステップと
を含む、
標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドに関する。

本発明の分子イメージング剤は、ＣＤ３１^ｓｈｅｄに関連する炎症状態を診断または評価するための強力なツールを表している。

ａ）対象が炎症状態を罹患している、または炎症状態を罹患するリスクがあるかどうかを決定すること
対象が炎症状態を罹患している、もしくは炎症状態を罹患するリスクがあるかどうかを決定するための方法において、診断される対象は、炎症状態を罹患している疑いがある、または罹患する可能性がある、または炎症状態を罹患している。本方法は、実際に、対象が炎症状態を罹患していることを確認するため、および／または炎症状態の種類を特定するために、行うことができる。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量は、対象が炎症状態を罹患していることを表し得る。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄの局在化は、炎症状態の種類をさらに表し得る。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄの量は、炎症状態の重症度をさらに表し得る。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量は、参照値または対照の生物学的な画像と比較してもよい。参照値または対照の生物学的試料が、健常な対象、特に、炎症状態を罹患していない対象、または健常な対象のパネルに対応する場合、生物学的試料中に検出されるＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量が参照値または対照の画像よりも高ければ、対象が炎症状態を罹患している、または有するリスクがあることを表している。

ｂ）抗炎症治療後の炎症状態の再発リスクの決定
本発明に係る方法および使用はまた、抗炎症治療後の炎症状態の再発のリスクを経過観察するために使用することもできる。特に、これらは、抗炎症治療後に対象をモニタリングするために使用することができる。このことはたとえば、ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量を決定するために、上記治療の終了後に、少なくとも１回、好ましくは２回、本方法を反復することにより達成できる。ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量が増大すれば、抗炎症治療後の炎症状態の再発のリスクが高いことを表し得る。ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量が安定または減少すれば、抗炎症治療後の炎症状態の再発のリスクが低いことを表し得る。たとえば、生物学的試料、および／または対象もしくは対象の少なくとも一部の画像は、治療の終了時、および治療後に少なくとも１回、作製される。治療の終了時および終了後の画像を比較することにより、抗炎症治療後の炎症状態の再発のリスクを、モニタリングすることが可能となる。

ｃ）炎症状態を罹患した対象の治療に対する応答のモニタリング
また本発明に係る方法および使用は、炎症状態を罹患した対象の治療に対する応答をモニタリングするために使用することもできる。このことはたとえば、少なくとも２回、たとえば治療前に１回および治療の間に少なくとも２回、または治療の間に少なくとも２回、本方法を反復することにより達成できる。たとえば、生物学的試料、および／または対象もしくは対象の少なくとも一部の画像は、治療、たとえば抗炎症治療の前、および治療の間に少なくとも１回、作製される。治療の前および治療の間の画像を比較することにより、特定の治療に対する対象の応答をモニタリングすることが可能となる。

ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量が増大すれば、治療が効率的ではない、またはこれ以上は効率的ではないことを表し得る。ＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在、局在化、および／または量の安定または減少は、治療が効率的であることを表し得る。

「治療に対する応答をモニタリングすること」、および「治療の有効性をモニタリングすること」との表現は、本明細書中では同義である。

前記治療は、治療上の処置または予防上の処置であってもよい。

前記治療は、少なくとも１つの抗炎症剤、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つのプロバイオティクス（すなわち、対象に健康上の有益性を提供し得る生きた微生物）、少なくとも１つの抗菌剤、またはそれらの組み合わせを投与することを含んでもよい、または本質的に投与することにある。

分子イメージング剤としての標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを使用した方法
また本発明は、上記に定義されている標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを使用する炎症部位のイメージングのための方法に関する。

また本発明は、対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または対象の炎症状態の治療の有効性をモニタリングするための方法、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記方法が、対象の生物学的試料において、上記に定義されている標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドによって、細胞の表面のＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在を検出することを含む、方法に関する。

この細胞は、好ましくは、血小板、白血球および／または内皮細胞である。

「生物学的試料」は、本明細書中、内皮細胞、血小板、もしくは白血球を含むことができる任意の試料、たとえば血液試料もしくはその画分（たとえば血栓）または組織試料、たとえば生検、を意味する。

本方法は、対象から生物学的試料を準備する最初のステップを含み得る。

また本発明は、前記生物学的試料における細胞表面上のＣＤ３１^ｓｈｅｄの検出が、対象が炎症状態を罹患している、または炎症状態を有するもしくは発症するリスクがある、または炎症状態の再発のリスクがあることを表す、上記に定義した方法に関する。

また本発明は、前記生物学的試料における細胞の表面上で検出したＣＤ３１^ｓｈｅｄの量を、参照値または対照の生物学的試料と比較する、上記に定義した方法に関する。参照値または対照の生物学的試料が、健常の対象、特に炎症状態を罹患していない対象、または健常な対象のパネルに対応する場合、生物学的試料で検出したＣＤ３１^ｓｈｅｄの量が参照値または対照の生物学的試料より大きければ、対象が、炎症状態を罹患している、炎症状態を有するもしくは炎症状態を発症するリスクがある、または炎症状態の再発のリスクがあることを表す。

また本発明は、治療前もしくは治療の間の早い段階の生物学的試料で検出した量と比較することによる前記生物学的試料における細胞の表面で検出されるＣＤ３１^ｓｈｅｄの量が増加すれば、前記治療が効率的ではないことを表し、かつ／または、治療前もしくは治療の間の早い段階の生物学的試料で検出した量と比較することによる前記生物学的試料における細胞の表面で検出されるＣＤ３１^ｓｈｅｄの量が安定または減少すれば、前記治療が効率的であることを表す、上記に定義した方法に関する。

前記方法は、細胞の表面のＣＤ３１^ｓｈｅｄの量を決定することをさらに含んでもよい。

前記生物学的試料における細胞表面上のＣＤ３１^ｓｈｅｄの検出は、好ましくは、イメージング技術により行われる。

上述の検出ステップは、分子イメージング剤としての標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド、好ましくは有効量の標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドと、対象の生物学的試料を接触させるステップを含む。

また本発明は、上記に定義した方法であって、前記方法が、
標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドと対象の生物学的試料を接触させるステップと、
ＣＤ３１^ｓｈｅｄに結合した標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを検出することにより、生物学的試料における細胞の表面のＣＤ３１^ｓｈｅｄの存在を検出するステップと
を含む、方法にも関する。

この接触は、好ましくは、分子イメージング剤が、（1）ＣＤ３１^ｓｈｅｄを発現し得る対象の細胞（好ましくは内皮細胞、血小板、および／または白血球）に達することが可能である、および／または（２）相互作用によってＣＤ３１^ｓｈｅｄに対する分子イメージング剤の結合がもたらされるように当該ＣＤ３１^ｓｈｅｄと相互作用することが可能である条件下で、行われる。標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドと接触した後、かつ相互作用を行うために十分な時間が経過した後に、対象の試料に存在するＣＤ３１^ｓｈｅｄに結合した分子イメージング剤を、上記に開示した分子イメージング技術により、検出する。

「有効量」は、（１）細胞に到達する、（２）ＣＤ３１^ｓｈｅｄと相互作用する、および（３）検出されるといったこれら３つの条件を分子イメージング剤が完遂できるために十分な量である。

炎症状態の治療方法
また本発明は、その必要がある対象の炎症状態を予防および／または治療するための方法であって、前記方法が、
対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するため、または対象の炎症状態の治療の有効性をモニタリングするために、上記に定義した方法を行うステップと、
対象が炎症状態を罹患している、炎症状態を有するリスクがある、もしくは抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあることが決定された場合、または治療が効率的ではない場合に、上記対象に適切な治療を行うステップと
を含む、方法に関する。

前記適切な治療は、少なくとも１つの抗炎症剤、少なくとも１つの免疫抑制剤、少なくとも１つのプロバイオティクス（すなわち、対象に健康上の利益を提供し得る生きた微生物）、少なくとも１つの抗菌剤、有効成分と結合した少なくとも１つのＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド、またはそれらの組み合わせを投与するステップを含み得る、または本質的に投与するステップにあり得る。

また本発明は、その必要がある対象の炎症状態を予防および／または治療するための方法であって、有効成分に結合したＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを、上記対象に投与するステップを含む、方法に関する。

有効成分は、たとえば、抗炎症剤なとの薬物である。これにより、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドは、薬物標的化剤として使用され、上記薬物の効果を改善することができる。

分子イメージング剤を含む医薬組成物
本発明に係る医薬組成物は、少なくとも１つの標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体とを含む。

本明細書中使用される用語「薬学的に許容可能な担体」は、有効成分、すなわち分子イメージング剤の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ、投与される濃度（複数可）で、対象に対して過度に毒性ではない、担体媒体を表す。この用語は、溶媒（複数可）、分散媒体（複数可）、コーティング剤（複数可）、抗菌剤および／または抗真菌剤（複数可）、等張剤（複数可）、吸収遅延剤（複数可）、ならびにそれらの組み合わせを含む。このような、薬学的に活性の物質（複数可）に関する当該媒体および／または薬剤（複数可）の使用は、当技術分野で周知である。

本医薬組成物は、注射により投与されてもよい。注射による投与のために、分子イメージング剤を含む医薬組成物は、水性または非水性の無菌性液剤として、またはあるいは無菌性の注射可能な液剤の即時調製用の無菌性散剤として、製剤化されてもよい。本医薬組成物は、製造および保存の条件下で安定しているべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保護されていなければならない。

注射により投与するための薬学的に許容可能な担体（複数可）は、水性液剤（複数可）（たとえばハンクス溶液、アルコール性／水性液剤、または生理食塩水）、および非水性の担体（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル）などの、溶媒（複数可）または分散媒体（複数可）である。また、注射可能な医薬組成物は、非経口ビヒクル（複数可）（塩化ナトリウムおよびリンガーデキストロース）および／または静脈内ビヒクル（複数可）（体液および栄養補充剤など）；ならびに他の、塩（複数可）、バッファー（複数可）、および保存剤（複数可）、たとえば抗菌剤および／または抗真菌剤（たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（ｔｈｉｒｍｅｒｏｓａｌ）など）を含む、従来の薬学的に許容可能な非毒性の賦形剤（複数可）および添加剤（複数可）を含んでもよい。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅延できる薬剤（たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチン）を添加することにより、もたらすことができる。様々な構成要素のｐＨおよび濃度は、当業者により容易に決定することができる。

無菌性の注射可能な液剤は、必要量の適切な溶媒に活性化合物（複数可）、すなわち分子イメージング剤および他の成分（複数可）を組み込み、その後、得られた混合物を、たとえば濾過および／または照射によって滅菌することにより、調製され得る。

一般的に、分子イメージング剤（またはそれを含む医薬組成物）の用量は、対象の年齢、性別、および体重、ならびに患者が罹患している疑いのある特定の炎症状態、疾患の度合い、試験される身体の組織（複数可）、ならびに／またはイメージング標識の感受性などの検討事項に応じて変動する。禁忌、療法、および他の変数などの要因もまた、投与される分子イメージング剤の用量を調節するために考慮すべきである。しかしながら、これは、訓練を受けた医師により、容易に達成することができる。

一般的に、分子イメージング剤、すなわち標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンド、またはそれを含む医薬組成物の適切な用量の１つは、対象に存在するいずれかの関連するＣＤ３１^ｓｈｅｄの分子イメージングを可能にするために十分である、分子イメージング剤または医薬組成物の最少量に対応する。この用量を最小限にするために、投与は、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与であり、かつ好ましくは、試験される部位の近くで行われることが好ましい。

キット
また本発明は、本発明の方法および使用を実行するために有用な材料（複数可）を含むキットをも提供する。

特定の実施形態では、本キットは、上述の少なくとも１つのＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよび少なくとも１つのイメージング標識、好ましくは少なくとも１つの放射性核種と、任意に、前記ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよび前記イメージング標識、好ましくは放射性核種を結合させて、本発明に係る標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを形成するための説明書とを含む。

放射性核種は、好ましくは、短寿命の放射性核種、たとえばテクネチウム－９９ｍ（９９ｍＴｃ）、ガリウム－６７（６７Ｇａ）、イットリウム－９０（９０Ｙ）、インジウム－１１１（１１１Ｉｎ）、レニウム－１８６（１８６Ｒｅ）、およびタリウム－２０１（２０１Ｔｌ）、より好ましくは９９ｍＴｃである。

さらに、本キットは、トリシンおよび／またはエチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）などの少なくとも１つの共リガンドをさらに含んでもよい。

さらに本キットは、標識バッファー、標識試薬、精製バッファー、精製試薬、精製手段、注射媒体、および／または注射試薬のうちの１つまたは複数を含んでもよい。調製手段および／または投与の異なるステップを行うためのこれらバッファー（複数可）、試薬（複数可）、および／または手段を使用するためのプロトコルは、本キットに含まれていてもよい。

本キットに含まれている異なる成分は、固体（たとえば凍結乾燥した形態）または液体の形態で提供されてもよい。

本キットは、任意に、個々の各成分用の異なる容器（たとえばバイアル、アンプル、試験管、フラスコ、またはビン）を含んでもよい。各構成要素は、一般に、それぞれの容器での分割に適しており、または濃縮した形態で提供されている。また、調製方法の特定のステップを行うために適切な他の容器が提供されてもよい。本キットの個々の容器は、好ましくは、商業的な販売のために厳重に密閉して維持されている。

特定の実施形態では、本キットは、本明細書中記載の炎症状態のイメージングのため、特には、本明細書中記載のように、対象が炎症状態を罹患している。炎症状態を有するもしくは発症するリスクがある、または抗炎症治療後に炎症状態の再発のリスクがあるかどうかを決定するために、その構成要素を使用するための説明書をさらに含む。

本発明に係るキットを使用するための説明書は、ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドおよびイメージング標識から標識ＣＤ３１^ｓｈｅｄリガンドを調製するための説明書、これにより得られた分子イメージング剤の用量および投与形式に関する説明書、ＣＤ３１^ｓｈｅｄの検出を行うための説明書、ならびに／または得られた結果を解釈するための説明書を含んでもよい。またキットは、医薬品または生物学的な製品の製造、使用、または販売を規制する行政機関により規定された形態での通知を含んでもよい。

本発明は、以下の実施例および図面を考慮して、さらに例示されている。

学術論文または抄録、公開済みまたは未公開の特許出願、発行済みの特許、または他のいずれかの参照を含む本明細書中記載の参照文献のすべては、記載の参照文献に存在するすべてのデータ、表、図面、およびテキストを含めた全体が本明細書中参照として援用されている。

共リガンドとしてのトリシン（Ａ）およびトリシン／ＥＤＤＡを含む９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩの放射性高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）。アセトニトリル分画のＨＰＬＣ解析は、トリシンを含む複数種のプロファイルに反してトリシン／ＥＤＤＡを含む主要な種（Ｔｒ＝１０．１分）を示す。 共リガンドとしてのトリシン／ＥＤＤＡを含む９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩの放射性ＨＰＬＣの安定性試験。ヒト血漿中で４時間インキュベーションした後の血漿での安定性。Ｂ．共リガンドとしてのトリシン／ＥＤＤＡを含む９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩ ７４ＭＢｑの注射から１時間後にラットの膀胱で回収した尿の放射性ＨＰＬＣのクロマトグラム。ＡおよびＢでは、アセトニトリル分画のピーク（Ｔｒ＝１０分）のピークは、分解の兆候がない最初の種に対応する。 ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を毎週注射した、腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）を有する雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットにおける［９９ｍＴｃ］ＥＤＤＡ／ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩのＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像。７４ＭＢｑのトレーサー注射から３０分後およびＡＡＡの外科手術から２１日後に、画像を取得した。腹部領域の横断面（Ａ）、冠状面（Ｂ）、および矢状面（Ｃ）が示されている。腎臓（Ｂの白い矢印）および膀胱（Ｃの白い矢印）を介したトレーサーの除去が観察される。［９９ｍＴｃ］ＥＤＤＡ／ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩの限局的な取り込みを、ＡＡＡの位置で観察することができる（Ａ、Ｂ、Ｃの黒い矢印）。 右後肢の炎症モデルにおける、テクネチウム－９９ｍで放射標識したメルチアチドを注射したラット（ｎ＝３）およびＰ８ＲＩを注射したラット（ｎ＝３）の大腿部の同じ領域で測定した、右後肢と左後肢との間の計測比の平均値の比較。簡潔に述べると、Ｗｉｓｔａｒ系ラットの右後肢にテレピン油を筋肉内注射し、反対側の大腿部に、生理食塩水を同様かつ同時に注射した。４８時間後および［９９ｍＴｃ］－ＨＹＮＩＣ－ＰＥＧ３－Ｐ８ＲＩまたは［９９ｍＴｃ］メルチアチドを８０ＭＢｑで注射してから３０分後に、ＳＰＥＣＴ／ＣＴの取得を行った。マン・ホイットニーのＵ検定を使用して、２つのグループ間の比較を実行した。０．０５未満のｐ値を、有意性があるとみなした。

配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号２は、ヒトまたはマウスＣＤ３１由来の６アミノ酸のペプチドの配列ＬＡＰＷＫＫに対応する。
配列番号３は、ＰｅｐＲｅｇ ＣＤ３１とも呼ばれている、マウスＣＤ３１由来の１０アミノ酸のペプチドの配列ＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫに対応する。
配列番号４は、ヒトＣＤ３１由来の１０アミノ酸のペプチドの配列ＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫに対応する。
配列番号５は、Ｐ８Ｆとも呼ばれている、マウスＣＤ３１に由来する８アミノ酸のペプチドの配列ＲＶＦＬＡＰＷＫに対応する。
配列番号６は、配列番号５の逆位の配列を有し、Ｄ－アミノ酸からなる、Ｐ８ＲＩとも呼ばれている８アミノ酸のペプチドの配列ｋｗｐａｌｆｖｒに対応する。
配列番号７は、ヒトＣＤ３１に由来する８アミノ酸のペプチドの配列ＲＶＩＬＡＰＷＫに対応する。
配列番号８は、配列番号７の逆位の配列を有し、Ｄ－アミノ酸からなる、８アミノ酸のペプチドの配列ｋｗｐａｌｉｖｒに対応する。
配列番号９は、マウスＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号１０は、ウシＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号１１は、ブタＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号１２は、配列番号１の配列のアミノ酸５７９～６０１位に対応する。
配列番号１３～７４は、上記に定義される通りである。

実施例
材料および方法
１．材料
特段記載した場合を除き、試薬を、シグマアルドリッチから購入し、そのまま使用した。Ｐ８ＲＩ（Ｈ－ｋｗｐａｌｆｖｒ－ＯＨ）を、ＲＰ－ＨＰＬＣ／ＭＳにより解析される８５％超の純度で、固相上で合成した。ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩを、Ｆｍｏｃ化学を使用した固相ペプチド合成により調製した（ＲＰ－ＨＰＬＣの精製後の収率：５２％、ＲＰ－ＨＰＬＣによる純度：９６％）。

Ｎａ^９９ｍＴｃＯ_４ ^－を、市販の^９９Ｍｏ／^９９ｍＴｃジェネレーター（ＴＥＫＣＩＳ（登録商標）， Ｉｂａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， Ｆｒａｎｃｅ）から得た。

２．解析方法
２．１ ＨＰＬＣ
Ｂｅｒｔｈｏｌｄの放射測定用検出器に連結したＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００システムを、ＲＰ－ＨＰＬＣの解析に使用した。流速１ｍｌ／分および２２０ｎｍでのＵＶ検出を伴う、Ａ ＡＣＥ ３ Ｃ１８、３μ、１００Å、１５０×４．６ｍｍのカラムを、以下の移動相：Ａ：０．１％のＴＦＡ／水）、Ｂ：アセトニトリル（ＣＡＮ）と共に使用した。勾配は、０～２分 ２３％ Ｂ、２～２０分 ２３－５０％ Ｂ、２０～２３分 ５０～１００％ Ｂ、２３～２５分 １００～２３％ Ｂ、２５～２８分 ２３％ Ｂであった。

２．２ 薄層クロマトグラフィー
ＴＬＣを、放射性クロマトグラフィー（ＭｉｎｉＧｉｔａ， Ｒａｙｔｅｓｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。固定相はシリカゲル（ＩＴＬＣ－ＳＧ， Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）であり、異なる移動相を使用した。ＭＥＫを使用して、遊離の^９９ｍＴｃＯ_４ ^－（Ｒｆ＝１）の量を決定し、抗凝固剤のクエン酸デキストロース溶液（ＡＣＤ－Ａ， Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＵＳＡ）を使用して、非ペプチド結合した^９９ｍＴｃ共リガンドおよび^９９ｍＴｃＯ_４ ^－（Ｒｆ＝１）を決定し、^９９ｍＴｃ－コロイドには６０％ＡＣＮを使用した（Ｒｆ＝０）。

３．^９９ｍＴｃ放射標識
３．１ 共リガンドとしてのトリシン
ゴムで密閉しＮ２パージしたバイアルにおいて、２０μｇのＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩを、トリシン溶液（ＰＢＳ１×バッファー中４０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）５００μＬ、スズ（ＩＩ）溶液（ＨＣＬ中１ｍｇ／ｍＬ、０．１Ｎ）８０μＬ、１ＧＢｑの^９９ｍＴｃＯ４－溶出物、および総容量が３ｍｌとなるような適量のＰＢＳと、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。

３．２ 共リガンドとしてのＥＤＤＡ
ゴムで密閉しＮ２パージしたバイアルにおいて、２０μｇのＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩを、ＥＤＤＡ溶液（ＮａＯＨ中２０ｍｇ／ｍＬ、０．１Ｎ）５００μＬ、スズ（ＩＩ）溶液（ＨＣＬ中１ｍｇ／ｍＬ、０．１Ｎ）８０μＬ、１ＧＢｑの^９９ｍＴｃＯ４－溶出物、および総容量が３ｍｌとなるような適量のＰＢＳ１Ｘと、ＲＴで３０分間インキュベートした。

３．３ トリシン／ＥＤＤＡの交換標識
ＥＤＤＡ溶液（ＮａＯＨ中２０ｍｇ／ｍＬ、０．１Ｎ）５００μＬを除き、共リガンドとしてのトリシン以外は同じ手法を、反応バイアルに加え、１００℃で１０分間加熱した。

４．精製手法
精製を、エタノール１０ｍｌ、次いで水１０ｍｌおよび空気５ｍｌであらかじめ活性化したＣ１８ Ｓｅｐ－Ｐａｋカートリッジ（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８ Ｐｌｕｓ Ｌｉｇｈｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ， Ｗａｔｅｒｓ， ＵＳＡ）を使用して、実現した。放射標識した調製物をカートリッジに通し、８ｍｌの水で洗浄した後、放射標識したペプチドを８０％ＡＣＮで溶出し、その後真空下で蒸発させたの。

５．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性の試験
^９９ｍＴｃ複合体の安定性を、０分、３０分、１時間、２時間、および４時間のインキュベーションの後に、３７℃の新鮮なヒト血漿において、１００ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度で評価した。次に、血漿試料をメタノールで沈殿させ、遠心分離した（２００００ｇ、１０分間）。上清を、回収し、ろ過して（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ ０．２２μｍ ＰＶＤＦ， Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、次に、放射性ＨＰＬＣにより評価した。

６．Ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性の試験
７４ＭＢｑの（共リガンドとしてのトリシン／ＥＤＤＡと共に得られた）９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩを、雄性ｗｉｓｔａｒ系ラットに注射した。１時間後、ラットを屠殺し、シリンジを使用して尿を膀胱から直接収集し、０．２２μｍの濾過（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ ０．２２μｍ ＰＶＤＦ， Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を行った後に放射性ＨＰＬＣにより解析した。

７．タンパク質の結合
精製した放射標識ペプチドのタンパク質の結合を、３７℃の新鮮な血漿において、０分、３０分、１時間、２時間、および４時間のインキュベーションの後に決定し、サイズ排除クロマトグラフィー（ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ Ｇ－５０ Ｃｏｌｕｍｎｓ， Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， ＵＫ）の後に解析した。Ｇ－５０カラムを、２０００×ｇで１分間あらかじめ遠心沈降させ、次に、混合物２０μＬを添加し、カラムを２０００×ｇで２分間遠心分離した。放射標識ペプチドのタンパク質の結合を、ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ ＩＩ， Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でカラムおよび溶出物を測定することにより、推定した。同時に、放射標識ペプチドを、対照として３７℃のＰＢＳ １Ｘ中で１時間インキュベートした。

８．実験モデル
８．１ 腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）モデル
研究室で設定されているラット血管炎症モデル：実験的な腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）を、エラスターゼの局所注入、次いでヒトのＡＡＡに存在し、ＡＡＡの炎症を誘導することが知られている歯周部の細菌（ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ））（Ｄｅｌｂｏｓｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（４）： ｅ１８^６７９． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８６７９）の静脈内注射により誘導した。

８．２ 後肢の炎症モデル
ラット後肢炎症モデルを、右の後肢において、テレピン油（１５０μｌ）の筋肉内注入により誘導し、対して、左の後肢に、生理食塩水溶液（１５０μｌ）を注射した（反対側の対照）。

９．ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング―ＡＡＡモデル
７４ＭＢｑの放射標識ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩ（トリシン／ＥＤＤＡを使用して得た）の、陰茎静脈を介した静脈内注射の直後に、経時的なｗｈｏｌｅ－ｂｏｄｙ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（第１の時間で１０分ごと）を、小動物専用のハイブリッドＳＰＥＣＴ／ＣＴカメラ（ＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ， Ｂｉｏｓｃａｎ Ｉｎｃ．）を用いて行った。

１０．Ｘ線ＣＴスキャナ、ＳＰＥＣＴ、およびＳＰＥＣＴ／ＣＴの取得－右後肢の炎症
８０ＭＢｑの９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩ（共リガンドとしてのトリシン／ＥＤＤＡと共に得た）および^９９ｍＴｃ－メルチアチドをそれぞれ注射してから３０分後に、取得を行った。

結果
１．放射標識
６－ヒドラジノピリジン－３－カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）を、３（ＰＥＧ）スペーサーを介してＰ８ＲＩペプチドのＮ末端のアミノ酸に結合させて、ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩを得た。

次に、ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩを、共リガンドとしてのトリシン、ＥＤＤＡ、またはトリシン／ＥＤＤＡを使用して、高い比活性（＞７１ＧＢｑ／μｍｏｌ）で標識した。標識の収率は、表２に示されているように、６５．５％～９８．３％で変動した。トリシン／ＥＤＤＡ交換標識の戦略は、高い標識収率のため、およびＨＰＬＣにより解析されるように単一の主要な種をもたらすため、選択された（図１参照）。

２．安定性試験
ヒトの血漿におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性は、放射標識不純物の有意な放出または放射標識ペプチドの分解を伴うことなく９９ｍＴｃ複合体の安定性が高いことを明らかにした。ＲＣＰ（放射化学的純度）は、４時間のインキュベーションの後、８９％を超えていた（図２Ａ参照）。放射性ＨＰＬＣの解析によるラットの尿でのｉｎ ｖｉｖｏ安定性試験は、注射した放射性トレーサーに対応する保持時間で排泄された１つの主要な種を示した。この結果は、９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩが、未変化のまま排泄され得ることを表している。（図２Ｂ参照）。

３．タンパク質の結合
サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される非常に低レベルのタンパク質の結合（４時間のインキュベーション後５％未満）が、トリシン／ＥＤＤＡ共リガンド交換標識戦略を使用して見いだされた。この知見は、９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩが親水性化合物であり得ることを示唆している。

４．ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング―ＡＡＡモデル
代表的なＳＰＥＣＴおよびＣＴの画像を、図３に示されているように、ＡＡＡラットにおける９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩ（共リガンドとしてのトリシン／ＥＤＤＡと共に得た）の注射から３０分後の取得の後に、得た。生体分布のパターンは、ほぼ排他的な腎臓の取り込みおよび排泄を表していた。興味深いことに、ＡＡＡの位置に対応する大動脈経路上で放射性トレーサーの局所的な取り込みが存在した。

５．Ｘ線ＣＴスキャナ、ＳＰＥＣＴおよびＳＰＥＣＴ／ＣＴの取得―右後肢の炎症モデル
^９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩを、テレピン油を使用したラット右後肢炎症モデルにおいてさらに評価した。

メルチアチドは、腎機能の非特異的マーカーであり、ペプチドＰ８ＲＩに近い生体分布のパターン（特に低分子量および迅速なクリアランス）であるため陰性対照として使用した。

このモデルにおいて、テレピン油を注射した後肢と生理食塩水を注射した後肢との間でのテクネチウム－９９ｍで放射標識Ｐ８ＲＩの取り込みの比率は、テクネチウム―９９ｍで放射標識メルチアチドを注射した対照のグループと比較して高く、これにより炎症部位へのＰ８ＲＩの特異的結合を確認した（図４参照）。

結論
［９９ｍＴｃ］ＥＤＤＡ／ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩのＲＣＰは、精製することなく９３％超（ＨＰＬＣおよびＩＬＴＣ）であり、比活性は、７１ＧＢｑ／μｍｏｌ超であった。分解した放射標識ペプチドの有意な放出は存在せず（ＲＣＰ＞８９％）、血漿タンパク質に対する放射性トレーサーの結合は、非常に低かった（４時間のインキュベーション後、５％未満）。Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、トレーサーの血液クリアランスは、ほぼ独占的に腎臓で行われ、注射から１時間後の腎臓および膀胱におけるピーク活性はＨＰＬＣ上の未変化体のペプチドに対応した。さらに、ＡＡＡによる^９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩの取り込みは、動物において注射の３０分後から検出可能であり、免疫組織化学検査において活性化血小板および白血球に結合していた。また、^９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－Ｐ８ＲＩは、右後肢の炎症モデルにおいて炎症部位で特異的に検出された。

切断型ＣＤ３１（ＣＤ３１ｓｈｅｄ）を発現し、迅速な血液クリアランスを伴う、炎症に関与する活性化細胞を特異的に標的化することにより、放射標識Ｐ８ＲＩは、炎症のイメージングにおいて有用な新規の手法を構成する。

Claims (1)

1. 本願の明細書または図面に記載される発明。

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