CN103479690A - 中药复方药物组合物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含有下述重量配比的原料药在制备用于辅助生殖的药物中的用途：川牛膝1-16份、龟板胶1-16份。本发明还提供了一种促卵母细胞体外成熟的方法，它包括如下步骤：a、取未成熟卵母细胞；b、置于M199培养液中，采用微滴法培养24h，即得成熟卵母细胞；其中培养液中含有2%的药物。本发明药物体外可以促进未成熟卵母细胞生长发育，主要是促进卵母细胞核成熟，并且不增加成熟卵母细胞的细胞骨架异常的几率。本发明药物还可以对精子穿卵能力产生影响，为临床防治男性精子功能障碍，提高IVF成功率，减少ICSI的使用率，提供可靠的依据。

Description

中药复方药物组合物的新用途

本申请是专利申请号：201210292197.1的分案申请。原案申请号为：201210292197.1，申请日为：2012年8月16日，发明名称：中药复方药物组合物的新用途。

技术领域

本发明涉及一种中药复方药物组合物的新用途，具体地，是在制备用于辅助生殖的药物中的用途。

背景技术

近年来，由于环境污染严重、工作压力加大、饮食习惯改变、生殖系统疾病等因素对正常受孕造成不利影响，不孕症患者数量呈上升势头，发病率约为12.5%～15%，且有逐年增加趋势。因此世界卫生组织（WHO）宣布将不孕症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。

自1978年全球首例试管婴儿诞生以来，以体外授精-胚胎移植（IVF-ET）为代表的辅助生殖技术（ART）的引入给不孕不育症的成功治疗提供了更大的可能。助孕的相关研究对于解决不孕不育患者的实际问题具有现实的意义。IVF-ET俗称试管婴儿，其成功率（指临床妊娠率）还不太令人满意，一般为30%～40%^[1]，并且容易造成卵巢过度刺激综合征（OHSS）。此外，一些卵巢反应低下或卵子成熟障碍的患者如多囊卵巢综合征（PCOS）、卵巢早衰（POF），还有一些不能接受超排卵治疗如乳腺癌、卵巢癌术后的患者，仍无法解决生育问题。因而，卵母细胞的体外成熟(IVM)作为IVF-ET的衍生新兴技术之一日益受到关注。与传统的IVF相比，IVM避免了OHSS的发生。此外，容易获得的未成熟卵母细胞，还可为卵母细胞捐供提供来源。然而IVM目前仍存在很多亟待解决的问题，包括卵母细胞成熟率低、受精率低等。ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)即卵胞浆内单精子注射技术，也就是第二代“试管婴儿”，该技术是借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精。该技术仅需数条精子可以达到受精、妊娠，是严重男性因素不育患者的最有效治疗方法。

补肾中药介入辅助生殖技术，具有调经、助孕、促卵泡发育及排卵、提高卵细胞质量以及提高卵子受精率、促进早期胚胎发育的作用^[2-5]，已得到证实。补肾中药的上述作用与激素、细胞因子等因素有关^[6-9]。目前在辅助生殖技术中与补肾中药联系较为紧密的环节主要是超促排卵和胚胎移植。研究主要以卵细胞质量^[3,4,10]、体外受精及胚胎发育^[5,11]、子宫内膜容受性^[12-15]为切入点。补肾中药对卵母细胞体外成熟的影响研究尚未见报道。

生殖激素是哺乳动物卵母细胞成熟的基本调节物。卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）和雌二醇（E₂）是常用激素。孕马血清促性腺激素（PMSG）也能使卵母细胞体外成熟。哺乳动物卵母细胞成熟通常分为核和胞质的成熟：核成熟通常以卵母细胞的第一极体排出为代表而胞质成熟则主要指卵母细胞具有受精能力及相应的早期胚胎发育能力。（1）FSH。FSH在早期卵泡体外发育中起到了关键作用，在卵母细胞体外成熟中促进核及胞质的成熟，对于卵裂及囊胚的发育有积极作用。人未成熟卵-冠-丘复合物(OCCCs)中的颗粒细胞上可以检测到FSH受体mRNA的存在。FSH和LH对在不含血清的TCM199中的卵母细胞体外成熟有显著影响，卵丘细胞的扩张受剂量依赖的FSH和LH的浓度的影响，在体内卵丘细胞的扩张有利于精子穿透、受精和合子发育。FSH以环腺苷酸(cAMP)作为细胞内第二信使，通过影响卵母细胞和卵泡中cAMP的浓度控制未成熟卵母细胞的核成熟和减数分裂的恢复。FSH对哺乳动物卵母细胞核和胞质的成熟均有作用，主要调节卵母细胞核成熟。FSH的最佳作用剂量为100IU/L。（2）E₂。研究证实，卵泡液中甾体类激素的存在对卵母细胞成熟至关重要。雌激素在多种哺乳动物中能促进卵母细胞的体外成熟。一定浓度的17β-E₂有促进卵细胞胞质成熟的作用，有利于受精和胚胎进一步发育，但浓度过高则会降低受精及卵裂能力。E₂可保持卵母细胞减数分裂停滞，从而使细胞核及胞浆成熟同步化，有利于卵母细胞的发育。另外，在卵母细胞内有E₂受体，说明E₂可以直接与卵母细胞结合，调节卵母细胞胞质成熟。E₂的最佳作用剂量为1mg/L或1.5mg/L。但E₂是类固醇激素，一般须要溶于特殊溶剂如二甲基亚砜（DMSO）或乙醇。考虑到DMSO有一定的细胞毒性，卵细胞对乙醇比较敏感，这两种溶剂的浓度不易控制，加之前期预实验也证实了这一点，故不采用E₂作为阳性对照品。（3）PMSG。孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG)是取自早期妊娠马血清中的糖蛋白促性腺激素，是由孕马子宫内膜杯状细胞合成分泌到血液中的糖蛋白性激素，兼有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的作用，类似于人绝经期促性腺激素(HMG)。孕马血清促性腺激素（PMSG）能使卵母细胞体外成熟。其最佳作用剂量在牛为40和50IU/mL，在狗为100IU/mL。目前还未见PMSG在小鼠卵母细胞体外成熟中的应用报道。（4）目前尚无其它公认的促卵母细胞体外成熟的药物面世。

左、右归丸出自明代温补名家张景岳的《景岳全书·新方八阵》，为补益肾阴、肾阳的经典方，临床上均可用于治疗女性绝经前后诸症。左归丸治疗围绝经期综合征,可消除烘热汗出、烦躁易怒、口干咽燥等症状,能增加阴道分泌物，改善外阴、阴道干涩症状，对雌激素不足的闭经也有较好的疗效（朱玲,陈彬彬,黄泉智,等.左归丸临床与实验研究进展[J].国医论坛,2003,18(2):51-53。）“左归丸”治真阴肾水不足，不能滋养营卫，渐至衰弱，或虚热往来，自汗盗汗，或神不守舍，血不归原，或虚损伤阴，或遗淋不禁，或气虚昏运，或眼花耳聋，或口燥舌干，或腰酸腿软，凡精髓内亏，津液枯涸等证，俱速宜壮水之主，以培左肾之元阴，而精血自充矣，宜此方主之。“右归丸”治元阳不足，或先天禀衰，或劳伤过度，以致命门火衰，不能生土，而为脾胃虚寒，饮食少进，或呕恶膨胀，或番胃噎膈，或怯寒畏冷，或脐腹多痛，或大便不实，泻痢频作，或小水自遗，虚淋寒疝，或寒侵溪谷而肢节痹痛，或寒在下焦而水邪浮肿。总之，真阳不足者，必神疲气怯，或心跳不宁，或四体不收，或眼见邪祟，或阳衰无子等证，俱速宜益火之原，以培右肾之元阳，而神气自强矣，此方主之。目前，有文献报道左、右归丸用于治疗不孕症，如：杨丽影，右归丸在妇科疾病中的应用体会，《河北中医》，2001年23卷8期，张君满，左归丸加减在妇科疾病中的应用，《四川中医》，2007年25卷5期；韦艳萍，等，左归丸治疗黄体功能不健不孕症的临床研究，《现代中西医结合杂志》，2010年19卷32期，方云芸，等，右归丸对雄激素致排卵障碍型不孕大鼠血清E2、T和IGF-1的水平影响，《环球中医药》，2010年3卷3期等。但是将左右归丸用于辅助生殖，如卵母细胞的体外成熟(IVM)技术方面，目前尚无相关文献报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种中药复方药物组合物的新用途。具体地，是在制备用于辅助生殖的药物中的用途。

本发明提供了含有下述重量配比的原料药在制备用于辅助生殖的药物中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份。

本发明还提供了含有下述重量配比的原料药在制备用于辅助生殖的药物中的用途：川牛膝1-16份、龟板胶1-16份。进一步优选地，所述的原料药的重量配比为：川牛膝9份、龟板胶12份。

本发明还提供了含有下述重量配比的原料药在制备用于辅助生殖的药物中的用途：杜仲1-16份、肉桂1-9份、当归1-16份、制附子1-16份。

进一步优选地，所述的原料药的重量配比为：杜仲12份、肉桂6份、当归9份、制附子6份。

其中，所述的药物是促卵母细胞体外成熟的药物。

其中，所述的药物是治疗不孕症的药物。

其中，所述的药物是提高精子活力或精子受精能力的药物。

其中，所述药物是由下述重量配比的原料药制备而成的药剂：

熟地24份、山茱萸9-12份、山药12份、枸杞子9-12份、菟丝子12份、鹿角胶12份。其中，所述的原料药中还含有川牛膝9份、龟板胶12份。

进一步优选地，所述的药物是由下述重量配比的原料药制备而成：

熟地24份、山茱萸12份、山药12份、枸杞子12份、菟丝子12份、鹿角胶12份、川牛膝9份、龟板胶12份。

其中，所述的原料药中还含有杜仲12份、肉桂6份、当归9份、制附子6份。进一步优选地，所述的药物是由下述重量配比的原料药制备而成：

熟地24份、山茱萸9份、山药12份、枸杞子9份、菟丝子12份、鹿角胶12份、杜仲12份、肉桂6份、当归9份、制附子6份。

本发明还提供了一种促卵母细胞体外成熟的方法，它包括如下步骤：

a、取未成熟卵母细胞；

b、置于含药血清的M199培养液中培养24h，即得成熟卵母细胞；其中血清中含有2%的权利要求1-13任意一项所述的药物。

体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术中获得适当多数目、高质量的卵子是达到妊娠的关键环节之一，通常需要采用控制性超排卵（COH）来实现。但是，COH始终存在不可忽视的安全性问题，容易造成卵巢过度刺激综合征（OHSS）。一些卵巢反应不良、卵子成熟障碍或不能接受COH的患者仍无法解决生育问题，可通过IVF-ET的衍生新兴技术之一——卵母细胞的体外成熟(IVM)技术获得妊娠。

本发明是将补肾中药复方左右归丸及其拆方组份用于促进卵母细胞体外成熟，具有重要意义，可以从一个侧面反应中医调经种子理论在辅助生殖技术中的指导价值，进而为试管婴儿领域开拓新思路、新途径，用于配合卵母细胞IVM技术治疗不孕症，有助于拓展ART的应用空间。本发明药物体外可以促进未成熟卵母细胞生长发育，主要是促进卵母细胞核成熟，并且不增加成熟卵母细胞细胞骨架的异常几率。本发明药物对精子穿卵能力产生影响，为临床应用防治男性精子功能障碍，提高IVF成功率，减少ICSI的使用率，提供可靠的实验室依据。

附图说明

图1：含药鼠血清对体外成熟卵母细胞Cyclin B1mRNA表达的影响

图2：图2A体内受精百分率；图2B体外培养3天后囊胚生成百分率

图3：体外受精百分率

图4：图4A两组完整顶体百分率  图4B顶体酶活性检测

具体实施方式

实施例1本发明药物组合物1的制备（左归丸）

称取原料：熟地黄200g、菟丝子100g、牛膝75g、龟板胶100g、鹿角胶100g、山药100g、山茱萸100g、枸杞子100g；

制备方法：以上八味，除鹿角胶、龟板胶外，其余熟地黄等六味粉碎成细粉，过筛混匀。取鹿角胶、龟板胶烊化，与上述细粉混匀。每100g粉末加炼蜜10g与适量的水，泛丸，干燥，即得；或不加蜜，仅为粉末散剂。

实施例2本发明药物组合物2的制备（右归丸）

称取原料：熟地黄24g、山药12g、山茱萸9g、枸杞子9g、菟丝子12g、鹿角胶12g、杜仲12g、肉桂6g、当归9g、制附子6g。

制备方法：将熟地蒸烂杵膏，余为细末，烘干密封保存，兑水服用，或加炼蜜为丸，如弹子大。每嚼服二三丸（6～9g），以滚白汤送下。

实施例3本发明药物的制备

称取原料：熟地24g、山茱萸12g、山药12g、枸杞子12g、菟丝子12g、鹿角胶12g；

制备方法：以上六味，除鹿角胶外，其余熟地黄等六味粉碎成细粉，过筛混匀。取鹿角胶烊化，与上述细粉混匀，烘干密封保存，兑水服用，或每100g粉末加炼蜜10g与适量的水。

实施例4本发明药物的制备

称取原料：熟地24g、山茱萸9g、山药12g、枸杞子9g、菟丝子12g、鹿角胶12g；

按实施例3方法制备。

实施例5本发明药物的制备

称取原料：熟地18g、山茱萸9g、山药8g、枸杞子9g、菟丝子8g、鹿角胶8g；按实施例3方法制备。

实施例6本发明药物的制备

熟地30g、山茱萸12g、山药16g、枸杞子12g、菟丝子16g、鹿角胶16g，按实施例3的方法制备。

实施例7本发明药物的制备

取川牛膝9g、龟板胶12g，按实施例1的方法制备。

实施例8本发明药物制备

取杜仲12g、肉桂6g、当归9g、制附子6g，按实施例3的方法制备。

上述原料可以用原生药，也可以用原生药的炮制品。

以下是通过药效实验及临床实验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明药物促卵母细胞体外成熟实验

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

清洁级ICR雌性小白鼠，6～8周龄，体重22～26g，90只，清洁级ICR雄性小白鼠，8～10周龄，体重30～35g，6只，分批次购自四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所，许可证号:SCXK(川)2006-18。二级实验室，室温为22～250C，湿度为45～65%，照明昼夜明暗交替时间为12：12，分笼喂养。

1.1.2实验药物

高效液相色谱（HPLC）监测制备含左右归丸及其拆方组份的鼠血清1#、2#、3#（其中1#组为实施例3、2#组为实施例7、3#组为实施例8）。

阳性对照品：r-hFSH：75IU，Laboratoires Serono S.A.，Y11A9874

主要试剂：孕马血清促性腺激素（PMSG）宁波市三生药业有限公司兽药字（2007）110044564；M199GIBCO Lot:no.507765；牛血清白蛋白(BSA)Sigma2039B054、透明质酸酶Sigma H3506、无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、琼脂糖、Tris-醋酸(Tris-acetate，TAE)、GoldView、焦磷酸二乙酯(diethylpyrophosphate，DEPC)处理水等。

含药鼠血清的制备：

分别取实施例1和实施例2制备的左归丸、右归丸原料药，按标准方法加水煎煮，于4℃贮存。将制备的汤剂喂服小鼠14天，取血；血清通过HPLC检测含有左归丸或右归丸的活性成分。含药血清贮存于-80℃备用。

1.1.3主要仪器设备与耗材：

AIR-TECH超净工作台、Millipore纯水仪、HERAEUS BB5O6O培养箱、Olymbus SZX9体视显微镜、TOKAI HIT体视镜用玻璃恒温板、Olymbus CK40倒置显微镜、Olymbus BX51反射荧光显微镜等。

1.2实验方法

1.2.1小鼠未成熟卵母细胞的采集

小鼠处死前46～48h腹腔注射10IU PMSG／0.1mL／只，颈椎脱臼处死后，置于清洁托盘中，75%乙醇棉球擦拭消毒腹部，打开腹腔，取出卵巢，去除脂肪、输卵管组织等附着物后放入盛有操作液的培养皿中，立即送至超净工作台。在解剖显微镜下，用1ml注射器针头剔除卵巢周围的脂肪结缔组织，用操作液洗涤卵巢3次。用1ml注射器针头刺破卵巢表面的卵泡，轻轻挤压使丘细胞－卵母细胞复合体（COCs）溢出，并用吸卵管吸取。最后移入覆盖石蜡油经预平衡后的微滴培养液中，准备体外成熟培养（IVM）。

1.2.2实验分组及观测指标

245个未成熟COCs体外成熟培养，分为空白组（在M199培养液中未添加鼠血清）、空白鼠血清组（在M199培养液中添加了2%空白鼠血清）、含药鼠血清1#、2#、3#（在M199培养液中分别添加了2%含本发明药物鼠血清1#、2#、3#），共五组，体视显微镜和倒置显微镜下计数观察本发明药物对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。

约238个未成熟COCs体外成熟培养，分为空白组、FSH组（在M199培养液中添加了100IU/L FSH）、空白鼠血清组、含药鼠血清1#组四组，实验分四批进行，第一批，显微镜计数观察本发明药物对小鼠卵母细胞体外成熟、受精及卵裂的影响，重复3次实验。第二批，免疫荧光标记法结合荧光检测仪观察并定量分析本发明药物对体外培养小鼠卵母细胞MPF调节亚基Cyclin B1表达的影响。第三批，免疫荧光标记法结合反射荧光显微镜观察本发明药物对体外培养小鼠卵母细胞细胞骨架（纺锤体、染色体）的影响。第四批，半定量RT-PCR法观察本发明药物对体外培养小鼠卵母细胞MPF调节亚基Cyclin B1mRNA的表达的影响。

上述未成熟卵母细胞即为初级卵母细胞。

1.2.3卵母细胞成熟率的测定

将矿物液滴入培养液上，各组丘细胞－卵母细胞复合体（COCs）于37℃、5%CO2下微滴法培养24h后，用100IU／ml透明质酸酶溶液处理5min，用口径略大于卵母细胞直径的吹卵管反复吹打卵丘细胞-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes，COCs)1min去除颗粒细胞，使之成为裸卵（denuded oocyte，DO)。显微镜下观察卵母细胞形态，以生发泡破裂(GVBD)作为减数分裂启动的标志，第一极体排出(PB1)作为第一次减数分裂完成的标志即卵母细胞核成熟标志。分别计算GVBD发生率、PB1排出率和GVBD+PB1发生率。

GVBD发生率=GVBD个数/卵母细胞总数

PB1排出率=PB1个数/卵母细胞总数

GVBD+PB1发生率=GVBD+PB1个数/卵母细胞总数

所述的成熟卵母细胞即为次级卵母细胞。

1.2.4小鼠精子的采集及处理

ICR雄性小白鼠，周龄8～10周，体重30～35g，颈椎脱臼法处死，取附睾置于培养液中，用眼科剪剪开或注射针针头刺破附睾并轻轻挤压使精子释出，将精子连同培养液一起转移至培养板内，置37℃、5%CO2培养箱内培养1～2h。将培养获能后的精子计数并调整浓度至1×10⁶个／mL～5×10⁶个／mL。按精：卵比约为10000:1的比例将精子加入含有卵母细胞的培养液中继续孵育5～6h。显微镜下观察卵母细胞的形态，以出现2个原核(2PN)和第二极体为正常受精标志，计算受精率。24h后观察受精卵卵裂及早期胚胎发育情况。

受精率=受精卵个数/PB1个数

卵裂率=卵裂球个数/受精卵个数

1.2.5免疫荧光标记法

免疫染色前将卵母细胞在0.3%B-PBS液中洗涤3次，每次5min，4%多聚甲醛37℃固定1h；固定好的卵母细胞在0.3%B-PBS液中洗涤3次，0.5%Triton-10037℃下作用15min后，0.3%B-PBS液洗涤3次，1%B-PBS液封闭1h；再在0.3%B-PBS液洗涤3次，在清洗间隙即可用0.3%B-PBS稀释一抗(l:100)，并做成液滴，清洗好卵母细胞之后，将其置于加入一抗的PBS液滴中，放入暗湿盒，然后4℃孵育过夜；第二天用0.3%B-PBS液滴清洗卵母细胞3次，每次5min，同样在清洗间隙用0.3%B-PBS稀释二抗(FITC-山羊抗兔IgG)(l:100)，并做滴，然后将卵母细胞置于加入二抗的PBS液滴中，放入暗湿盒，37℃下孵育lh。

二抗染色完成后，若要观察染色体则用含0.3%B-PBS清洗3次，用PI复染。

用0.3%B-PBS液洗涤3次,将卵母细胞在体视镜下吸出，滴在载玻片上，吸去多余液体，再用甘油与PBS(9:1)及含抗荧光淬灭剂的混合液封片，反射荧光显微镜下观察卵母细胞的荧光着色情况。

上述所有的清洗环节、抗体孵育和染色步骤均是在液滴中完成的，液滴做在培养皿中。

1.2.6荧光定量分析MPF调节蛋白B的表达强度：

免疫荧光染色步骤同1.2.5，二抗染色完成后，用PBS液洗涤3次，将卵母细胞在体视镜下吸出，移至每孔预先滴有500μl PBS液的24孔板内，每组6孔，每孔8个卵母细胞，荧光定量检测仪分析MPF调节蛋白B1的表达强度。

1.2.7卵母细胞细胞骨架的观察方法

应用免疫荧光标记法，在OLYMPUS BX51反射荧光显微镜下进行观察。卵母细胞纺锤体分型：正常纺锤体：纺锤体呈对称的桶型，且极性存在；异常纺锤体：纺锤体极性消失、纵轴上微管减少或断裂、纺锤体消失、微管消散。

卵母细胞染色体分型：正常染色体：染色体紧密排列在赤道板；异常染色体：染色体结构松散或凝结成团，从赤道板中脱落。

1.2.8RT-PCR检测卵母细胞MPF调节亚基Cyclin B1mRNA的表达

（1）卵母细胞总RNA的提取：未成熟卵母细胞200个，分为含药鼠血清1#组和空白鼠血清组，每组100个，体外培养24h后，分别从对照组和含药鼠血清1#组取出卵母细胞，透明质酸酶去除卵丘细胞后，PBS洗两次，采用Trizol法提取总RNA。

（2）引物：小鼠Cyclin B1的特异片段为417bp，其引物序列参照文献以Primer5.0软件设计，其序列为：

5’-GTAATCCTTGCAGTGAGTGACG(525-546)；

5’-CATCTCCATCTGTCTGATCTGG(920-941)。

以广泛存在于细胞中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogease，GAPDH）作为内参照，其特异片段为321bp。

（3）反应体系：DEPC H₂O1.75μl，Buffer1.25μl，dNTP1.25μl，MgC1₂2.5μl，AMV逆转录酶0.25μl，RAN酶抑制剂0.25μl，Taq酶0.25μl，正向及反向引物各0.5μl，RNA样品4μl，总体积12.5μl。反应条件：50℃30min，94℃2min，随后94℃10s，55℃10s，70℃20s重复20个循环，72℃5min，扩增GAPDH片段。50℃30min，90℃2min，随后94℃30s，56℃30s，68℃1min重复40个循环，72℃10min，扩增Cyclin B1片段。4℃保存。

（4）结果检测：PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外图象扫描仪扫描并采用KODAK ID图像分析软件分析电泳带的平均灰度并照相。结果以特异泳带与GAPDH泳带平均灰度的比值表示。

1.2.9血清FSH、E2的测定

采用酶联免疫法测定大鼠血清FSH、E2水平。严格按照酶联免疫试剂盒说明操作，于酶标仪450nm吸光度，读取吸光度值(optical denstiy，OD)，根据标准品的浓度和OD值做出标准曲线，计算得出样品中FSH、E2的浓度。

1.3统计学处理

以下所有实验数据均采用SPSS17.0统计软件处理，均数比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响

表1不同含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响

注：与空白组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白鼠血清组比，☆P＜0.05

结果显示，空白鼠血清、含药鼠血清1#、2#、3#组均较空白组成熟率高；含药鼠血清1#、2#、3#组均较空白鼠血清组成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、含药鼠血清1#、2#、3#组均较空白组高。

2.2含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响（重复3次实验）结果见表2。

表2含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响

注：与空白组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白鼠血清组比，☆P＜0.05

结果显示，空白鼠血清、FSH、含药鼠血清1#组均较空白组成熟率高。FSH、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组成熟率高，空白鼠血清、FSH、含药鼠血清1#组均较空白组高。

2.3含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响，结果见表3。

表3含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响

注：与空白组比，*P＜0.05；与空白鼠血清组比，☆P＜0.05

结果显示，空白鼠血清、FSH、含药鼠血清1#组均较空白组成熟率高。FSH、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、FSH、含药鼠血清1#组均较空白组高。

2.4含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响，结果见表4。

表4含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响3-1

注：与空白组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白鼠血清组比，☆P＜0.05

结果显示，FSH、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、FSH、含药鼠血清1#组均较空白组高。

含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响（三次实验总体统计），结果见表5、6。

表5含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响

表6含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响(A)-2

注：与空白组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白鼠血清组比，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

结果显示，FSH、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、FSH、含药鼠血清1#组均较空白组高。FSH、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组高。

含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响(B)

表7含药鼠血清对卵母细胞体外成熟的影响(B)

注：与空白组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白鼠血清组比，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

结果显示，FSH、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组成熟率高。FSH、含药鼠血清1#组均较空白鼠血清组高。

含药鼠血清对体外培养卵母细胞MPF调节蛋白Cyclin B1的表达强度的影响

表9含药鼠血清对体外培养卵母细胞Cyclin B1表达的影响

注：与空白组比，**P＜0.01；与空白鼠血清组比，☆☆P＜0.01

结果显示，荧光强度，空白鼠血清、FSH、含药鼠血清1^#组均较空白组强，分别P＞0.05、P＜0.01、P＜0.01；FSH、含药鼠血清1^#组均较空白鼠血清组强，P均＜0.01。FSH与含药鼠血清1^#组比较，P＞0.05。

含药鼠血清对体外成熟卵母细胞细胞骨架的影响

表10含药鼠血清对体外成熟卵母细胞细胞骨架的影响

结果显示，卵子骨架，空白组、空白鼠血清组、FSH组、含药鼠血清1^#组各组之间比较，无显著性差异，P均＞0.05。

含药鼠血清对体外成熟卵母细胞MPF调节亚基Cyclin B1mRNA表达的影响结果见图1；结果显示，含药鼠血清1^#组Cyclin B1mRNA的表达（CyclinB1/GAPDH=2.78）较空白鼠血清组（Cyclin B1/GAPDH=2）增强。

2.5本发明药物对大鼠血清FSH和E2水平的影响

表11本发明药物对大鼠血清FSH和E2水平的影响

结果显示，含药鼠血清1#、2#、3#组血清FSH、E2水平与空白鼠血清组比较，无显著性差异，P均＞0.05。含药鼠血清各组之间比较，P＞0.05。

实施例2本发明药物IVM试验

根据试验例1的步骤方法，将I号药（实施例3制备的药物）进行IVM实验，具体实验结果和数据如下：

一、实验数据和统计学处理：

注：Ⅷ号含药血清为空白血清；Ⅰ号含药血清组为中药含药血清。

实验数据采用SPSS17.0统计软件处理，卡方检验。

二、实验结果分析

（一）成熟率(IVM%)

（1）空白血清组、FSH对照组、Ⅰ号含药血清组均较空白对照组成熟率高，分别P=0.000、P=0.00118、P=0.000，皆为P<0.01。

（2）FSH对照组、Ⅰ号含药血清组均较空白血清组血清成熟率低，分别P=0、P=0.0056，皆为P<0.01。

（3）FSH对照组与Ⅰ号含药血清组比较，P=0，P<0.01。

（二）受精率（IVF%）

（1）空白血清组血清、FSH对照组、Ⅰ号含药血清组均较空白对照组受精率高，分别P=0.0032、P=0.00118、P=0，皆为P<0.01。

（2）FSH对照组、Ⅰ号含药血清组均较Ⅷ号含药血清受精率高，分别P=0.0018、P=0.0022，皆为P<0.01。

（3）FSH对照组与Ⅰ号含药血清组比较，P=0.000，P<0.01。

三、结论

1、实验组（Ⅰ号、空白血清组血清及FSH阳性对照）的IVM%显著高于空白对照组，P<0.01；但实验组中的空白血清组血清IVM%又显著高于FSH对照组和Ⅰ号含药血清组，且FSH对照组的IVM%显著高于Ⅰ号含药血清组。

2、实验组（Ⅰ号、空白血清组血清及FSH阳性对照）的IVF%显著高于空白对照组，P<0.01；而实验组中的IVF%FSH对照组、Ⅰ号含药血清组均显著高于空白血清组血清，且FSH对照组的IVF%显著高于Ⅰ号含药血清组。

试验例1和试验例2的结果证明：

一、本发明药物可以促进卵母细胞生长发育：中医学认为，女性生殖系统的调节以肾气-天癸-冲任-胞宫的平衡协调关系为前提，肾气盛，天癸至，冲任通盛，则月经如期，孕育正常。《素问·上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛，齿更发长，二七天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子”。《素问·六节藏象论》又曰：“肾者主蛰，封藏之本，精之处也”。卵子属生殖之精的范畴，先天生殖之精藏于肾，肾中精气滋长是卵子发育成熟的基础，肾中精气盛衰直接影响着卵子的质量。肾藏之精是人体最基本的生命物质，如《素问·金匮真言论》言：“夫精者，身之本也。”女子卵细胞的生成、发育，都是以肾中所藏之精气为物质基础的。故卵细胞发育成熟及卵细胞质量与肾的功能最为密切。肾中精气充沛，则卵细胞的生成、发育正常，孕育有本。前期在体实验研究发现^[5]，本发明药物复方可以明显增加晚幼大鼠（160～170g）窦前卵泡数目、卵泡总数（P＜0.05），具有促进晚幼大鼠卵泡发育的作用。临床观察发现^[6,7]，卵泡发育障碍的患者，其中医辨证的病机本质在于肾虚。中医药补肾可以促卵泡发育。在IVF-ET过程中，补肾方药可以显著改善卵细胞成熟度^[8]、增加患者的获卵数^[9,10]、提高优质卵率^[11、12]；改善卵巢储备功能下降患者的E2、FSH、成熟卵数等^[13、14]。本发明药物具有促进卵细胞发育、改善卵子质量、提高卵巢储备的作用。

含本发明药物鼠血清可以增强体外小鼠卵母细胞Cyclin B1的表达。哺乳动物中存在两种类型的B型Cyclins：Cyclin Bl，Cyclin B2。Cyclin B1可以在细胞内膜和胞浆中存在，而Cyclin B2只与膜结合，Cyclin B1可以代替Cyclin B2的功能，反之则不可以。在小鼠卵母细胞，GVBD的发生不需要合成新的蛋白质，但新蛋白质的合成对后期卵母细胞的成熟是必要的。在牛、羊、猪、马等卵母细胞体外成熟研究结果也表明，在成熟期间的特定阶段需要有蛋白质的合成，这些蛋白质包括细胞周期素B。卵母细胞MⅡ期的维持与胞质中高水平的MPF有关。卵母细胞受精后，细胞周期蛋白B降解，从而引起MPF活性降低或消失，细胞离开MⅡ期，完成减数分裂并进行卵裂。实验结果显示，小鼠卵母细胞中的Cyclin B1，FSH、含药鼠血清1#组均较空白组、空白鼠血清组表达增强，P均＜0.01；FSH与含药鼠血清1#组比较，无显著性差异。含药鼠血清1#组Cyclin B1mRNA的表达（CyclinB1/GAPDH=2.78）较空白鼠血清组（Cyclin B1/GAPDH=2）增强。表明，含本发明药物的药鼠血清1#促进小鼠卵细胞体外成熟的作用与增强卵细胞成熟促进因子调节亚基Cyclin B1的表达有关。

综上，含本发明药物鼠血清1#可以促进小鼠卵细胞体外成熟，其作用可能与增强卵细胞成熟促进因子及其mRNA的表达有关。

二、补肾法促进卵母细胞体外成熟安全有效

本发明药物介入辅助生殖技术，可以调经、促进卵泡发育及排卵、改善卵细胞质量、促进受精和胚胎发育、改善子宫内膜的容受性，从而提高妊娠成功率。卵母细胞体外培养的培养液对卵母细胞发育具有重要作用。在培养液中加入有效的中药成分，从而对卵母细胞发育产生正面影响。本实验研究发现，将HPLC监测制备的含本发明药物的大鼠血清加入培养液中培养小鼠未成熟卵母细胞，可以促进小鼠卵母细胞体外成熟，增强卵母细胞成熟促进因子的表达，并且不增加成熟卵母细胞细胞骨架的异常几率。提示本发明药物可以通过增加有关促进成熟的蛋白因子表达等，发挥其对卵母细胞发育的间接促进作用。总之，本发明药物促进卵母细胞生长发育及成熟的作用机理是非常复杂的，有待于更加深入的探索。

试验例3本发明药物对小鼠精子及受精能力影响的研究

本实验着重研究补肾的经典名方左右归丸是否对精子穿卵能力产生影响，并对其作用机制做初步探索，为临床应用防治男性精子功能障碍，提高体外受精胚胎移植（IVF—ET）成功率，减少卵细胞胞浆内单精子注射（ICSI）的使用率，提供可靠的实验室依据。

1材料与方法

1.1药物制备左归丸由熟地、淮山药、枸杞子、山茱萸、菟丝子、川牛膝、鹿角胶、龟版胶依次按8:4:4:4:4:2:4:4称重，前六味浸泡半小时后水煎，分别煎煮20min、40min时、60min后将三次的药液混合，后两味加温熔于其中，制成1:1的水溶液，4℃保存。右归丸以熟地、山茱萸、山药、枸杞子、菟丝子、鹿角胶、杜仲、当归、肉桂、制附子按8：3：4：4：4：4：4：3：2：2比例称取，除鹿角胶烊化其余均水煎，方法同前。

1.2实验动物分组将4～5周正常雄性ICR小鼠进行随机分为两组，每组10只。采用灌胃方式灌服,每组分别灌服制备好的左右归丸和生理盐水，剂量为1ml/次，1次/日，连续灌胃14d，于末次灌胃后第21d与雌鼠交配做体内实验。

1.3体内试验观察卵裂率和囊胚生成百分率

于末次灌胃后第21d与腹腔注射HCG10IU的雌鼠按雌雄比例2:1进行合笼，将确认有阴道栓形成、成功合笼的雌鼠，在注射HCG18-24小时后处死，取出1cell胚（受精卵），移入透明质酸酶中消化颗粒细胞，然后迅速将卵子移入HEPES-HTF中冲洗数次，再移入HTF培养液中冲洗后，移入预先已准备好的生长皿中，于5%CO₂培养箱中培养24小时，将分裂至2细胞期的胚胎置新培养液继续培养至D4-D6天，记录到达囊胚期的胚胎数(卵裂率)，计算囊胚生成百分率。

1.4体外实验观察IVF%和囊胚率%

将上述两组确认合笼成功的雄鼠3d后分别处死，后取其附睾制备精子悬液；以超排获取小鼠成熟卵细胞，分别进行精子穿卵实验，观察各组的受精率(%)和囊胚率(%)。

1.5FITC-PSA染色

1）分别处死两组小鼠，剪开附睾尾，立即放置于盛有培养基的表面皿中（培养基使用之前在37℃、5%CO₂孵箱预平衡过夜）。

2）两组精子在37℃、5%CO2孵箱获能1.5h后，各取20μl精子悬液5×10⁶cells/ml到0.5ml Ep管中。

3）为诱导顶体反应，将事先用工作缓冲液（working buffer）配制好的孕酮4μg/ml20μl分别加入两组的精子悬液，并在37℃黑暗中孵育1小时。两组各取20μl被孕酮诱导的精子悬液到0.5ml Ep管中，分别加入100%甲醇250μl后冰孵至少1小时。

4）离心1500g、5分钟、去上清液，分别取沉淀10μl涂片。在干燥的涂片上滴丙酮5秒后，立即在暗光下，用以配置好的FITC-PSA溶液染色至少10分钟。

5）用双蒸水洗涤2次，2分钟/次并用2%formalin固定15分钟。

6）用双蒸水洗涤、干燥后甘油封片。

在1000倍的荧光显微镜下，每张涂片计数至少400个精子，以计数完整顶体的百分率（AIS%）。若精子头部区域出现均匀的荧光代表完整的顶体；若在精子赤道板出现不均匀的荧光，则代表不完整的顶体，即在孕酮诱导下部分或完全发生顶体反应的精子。

1.6顶体酶活性检测

特异性顶体酶活性的检测采用Kennedy等^[5]1989的方法，包括测定管（T）和对照管（C），每例精子数量不得少于7.5×10⁶。

1）各取两组的每例精子悬液约200～500μl，加入到1.5ml Ep管中，每管中先加入0.5ml Ficoll溶液。

2）先将每一例的测定管（T）和对照管（C）两管的精子悬液用2%formalin100ul固定15分钟后加入反应液到测定管（T）和对照管（C）。

3）然后加入终止液到对照管（C）。

4）T、C管再同时在24℃水中孵育至少1小时。

5）最后加入100ul终止液到测定管（T），离心1500g、10分钟。

双蒸水调零后，用分光光度计（410nm波长、0.5cm比色杯）分别读出测定管（T）和对照管（C）两管的OD值。1IU的顶体酶活性表示在24℃下水解1.0umol/min DL-BAPNA，顶体酶活性可根据以下公式计算：

顶体酶活性(μIU/10⁶)=[(mean OD_test)–OD_control]×10⁶/1485×精子计数

1.7统计学方法观测值以

表示，组间均数的比较用t检验，同组内均数间比较用单因素方差分析，样本均数间两两比较用q检验。采用SPSS10.0软件作统计学处理，a=0.05为检验标准。

2结果

2.1体内试验观察卵裂率和囊胚生成百分率

2.1.1卵裂率：实验组88.3±1.29%vs.对照组62.1±3.48%,P=0.005;)。图2A显示：实验组卵裂率（体内受精百分率）与对照组比较有显著性差异。

2.1.2体外培养3天后囊胚生成百分率：实验组87.0±3.26vs.对照组83.0±3.36,P=0.295)。图2B显示：两组的囊胚生成百分率无显著性差异。

2.2体外实验观察IVF%和囊胚率%

2.2.1IVF%：实验组82.4±2.89%vs.对照组62.5±3.58%,P=0.015)。图3显示：实验组IVF%和对照组比较有显著性差异。

2.2.2囊胚率%：实验组和对照组无显性差异(data not shown)。

2.3.FITC-PSA染色和顶体酶活性检测

2.3.1实验组89.1±1.21%vs.对照组87.2±2.38%，P=0.257)，图4A显示两组完整顶体百分率(AIS%)无显著性差异。

2.3.2顶体酶活性检测实验组44.29±5.49IU vs.对照组27.12±4.87IU，P=0.048)。图4B实验组顶体酶活性和对照组比较有显著性差异。

3、讨论

本研究体内试验发现实验组卵裂率与对照组比较有显著性差异；体外实验发现实验组IVF%和对照组比较有显著性差异，而体内外实验均发现两组的囊胚生成百分率无显著性差异。这表明补肾的经典名方左右归丸能显著提高精子的受精能力即精子功能，进而影响到胚胎发育的卵裂率，而对胚胎发育的囊胚生成百分率无明显影响。

临床上不少精液常规正常的患者，由于精子功能低下即精子受精能力（或穿卵能力）的减弱而不得不选择ICSI。为了规避ICSI的遗传风险，如果能够通过中医药介入，充分发挥中医药的助孕优势，提高精子的受精能力，改善精子功能，有助于提高精子功能低下的患者做第一代试管婴儿－IVF的机会，也有助于提高IVF的成功率。

发明人从左右归丸对顶体功能的影响来探索其作用机理，而评价顶体功能最重要的指标即是完整顶体百分率（AIS%）和顶体酶活性检测。完整的顶体形态是发生顶体反应的重要前提，只有完整的顶体形态才能发生有效的顶体反应，研究中发现FITC-PSA染色显示AIS%没有差异，即在孕酮诱导下，两组均能发生正常的顶体反应，由此说明左右归丸与顶体的形态发育无关。精子的顶体酶活性检测是评价精子功能非常重要指标，也是临床上对不明原因男性不育患者一个较敏感的生物学指标之一。研究表明左右归丸能显著提高小鼠精子的顶体酶活性，认为左右归丸有可能通过调节顶体酶活性来影响小鼠精子的受精能力即精子功能。

试验例4本发明药物对小鼠精子及受精能力影响的研究

本实验着重研究补肾的经典名方左右归丸及其拆方Ⅰ号，Ⅱ号和Ⅲ号是否对精子穿卵能力产生影响，为临床应用防治男性精子功能障碍，提高IVF成功率，减少ICSI的使用率，提供可靠的实验室依据。

1、研究方法

1.1动物实验分组

将4～5周正常雄性小鼠进行随机分为4组，每组10只，将Ⅰ号，Ⅱ号和Ⅲ号每袋制成1:1的水溶液，4℃保存。（“Ⅰ号方为实施例3、Ⅱ号为实施例7、Ⅲ号为实施例8”）采用灌胃方式灌服,每组分别灌服Ⅰ号，Ⅱ号，Ⅲ号和生理盐水，剂量为1ml/次，qd，连续灌胃14d，于末次灌胃后第21d与雌鼠交配做体内实验。

1.2体内试验

以上4组雄鼠每组10只雄鼠，在准备与之合笼的雌鼠腹腔注射HCG10IU后，按雌雄小鼠合笼的比例2:1进行合笼。

将确认有阴道栓形成、成功合笼的雌鼠，在注射HCG10iu18-24小时后处死，取出1cell胚（受精卵），移入透明质酸酶中消化颗粒细胞，然后迅速将卵子移入HEPES-HTF中冲洗数次，再移入HTF培养液中冲洗，最后移入预先已准备好的生长皿中，于CO₂培养箱中培养。

1cell胚培养24小时后，观察卵裂情况并做好记录。将分裂至2细胞期的胚胎置新培养液继续培养至D4～D6天。记录到达囊胚期的胚胎数，计算囊胚生成百分率。

1.3体外受精百分率（IVF%）的检测

将上述4组确认合笼成功的雄鼠3d后分别处死，后取其附睾制备精子悬液；以超排获取小鼠成熟卵细胞，分别进行精子穿卵实验，观察各组的受精率(%)和囊胚率(%)。

2、实验结果

表12体内实验：

编号	1cell胚	受精数	囊胚数	受精率(%)	囊胚率(%)
						I号	57	56	50	95.25▲▲	89.29□□△▲
II号	46	43	28	93.45▲▲	65.12
						III号	36	32	21	88.89▲▲	65.63
0.9％NS	35	8	5	22.86	62.50

与0.9%NS比较，▲▲P<0.01，▲P<0.05

与Ⅱ号比较，□□P<0.01，□P<0.05

与Ⅲ号比较，△△P<0.01，△P<0.05

结果表明，Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号方组的受精率与生理盐水组比有显著性差异；Ⅰ号方组的囊胚率与Ⅱ号方组比有显著性差异，与Ⅲ号方组和生理盐水组比有差异。

表13体外试验

编号	卵子数	受精数	囊胚数	受精率(%)	囊胚率(%)
						I号	25	14	10	56.00△	71.43△
II号	28	21	17	75.00△△	80.95△△
						III号	34	10	2	29.41□□▲▲	20.00□□
0.9％NS	19	13	8	68.42	61.54

与0.9%NS比较，▲▲P<0.01，▲P<0.05

与Ⅱ号比较，□□P<0.01，□P<0.05

与Ⅲ号比较，△△P<0.01，△P<0.05

结果表明，Ⅲ号方组的受精率与生理盐水组和Ⅱ号方组比有显著性差异；与Ⅰ号方组比有差异。Ⅲ号方组的囊胚率与Ⅱ号方组比有显著性差异，与Ⅰ号方组比有差异。

以上研究可深化中医“肾藏精，主生殖”的客观化内涵，有利于在我们后期工作中，进一步探寻补肾中医药对男性生殖功能的调控机理和作用靶点打下基础。

综上所述，在体实验Ⅰ号组（98.25%）、Ⅱ号组（93.48%）、Ⅲ号组（88.89%）的受精率显著高于生理盐水组（22.86%），有统计学意义，P＜0.01；Ⅰ号组的囊胚率（89.29%）显著高于Ⅱ号方组（65.12%）、Ⅲ号组（65.63%）和生理盐水组（62.50%），差异有统计学意义，P＜0.05；体外实验Ⅲ号组受精率（29.41%）明显低于生理盐水组（68.42%），Ⅰ号组（56.00%）Ⅱ号方组（75.00%），差异有统计学意义，P＜0.05；Ⅲ号组囊胚率（20.00%）明显低于生理盐水组（61.54%）Ⅰ号组（71.43%）Ⅱ号方组（80.95%），差异有统计学意义，P＜0.05。结论：Ⅰ号补肾复方可显著提高小鼠受精能力。

综上所述，本发是药物以补肾为治疗大法的中医方药可以安全有效地促进卵母细胞的体外成熟，一方面，证实了补肾法是促进卵母细胞生长发育的有效手段；另一方面，提示本发明药物可以用于配合卵母细胞IVM技术治疗不孕症。

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Claims (6)

1.含有下述重量配比的原料药在制备用于辅助生殖的药物中的用途：川牛膝1-16份、龟板胶1-16份。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的原料药的重量配比为：川牛膝9份、龟板胶12份。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的药物是促卵母细胞体外成熟的药物。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗不孕症的药物。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的药物是提高精子活力或精子受精能力的药物。

6.一种促卵母细胞体外成熟的方法，它包括如下步骤：

a、取未成熟卵母细胞；

b、置于含药血清的M199培养液中培养24h，即得成熟卵母细胞；其中血清中含有2%的权利要求1-13任意一项所述的药物。

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