CN113521176A - 一种温肾填精中药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种温肾填精中药组合物，它包括如下质量份的原料药：熟地黄10～20份、山药10～20份、山茱萸10～20份，菟丝子10～20份、鹿角霜7～13份、淫羊藿7～13份、骨碎补7～13份、肉苁蓉7～13份。本发明温肾填精中药组合物将温助肾阳、填补肾精相结合，通过药物间相互配伍，酌盈剂虚，纠正线粒体动力学状态，从而恢复线粒体功能、提升卵母细胞质量，增强卵巢储备，改善子宫微环境，改变妊娠结局。

Description

一种温肾填精中药组合物
技术领域
本发明具体涉及一种温肾填精中药组合物。
背景技术
《黄体内经》有“肾藏精，主生殖”，是对生殖功能的高度总结，认为“肾藏精”是“肾主生殖”基础。《素问·上古天真论》“二七，肾气盛，天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子...七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通”明确揭示了肾精生产、贮藏、排泄调控了天癸的至与竭，使冲任二脉相资调达，从而对生殖生理功能发挥了重要作用。肾阳来源于肾精，是具有激发、温煦、推动作用的精微物质。结合现代生殖医学角度，肾中所藏之精是生殖的物质基础，肾精化肾气，肾气中具有温煦、推动作用的部分为肾阳，肾阳鼓动下冲任、气血调畅。肾精不足，则冲任气血亏损，胞宫胞脉空虚，卵泡缺乏物质基础，无法正常生长发育；肾精不足无以化生肾阳，冲任、气血失于温煦，阳气推动无力，则卵巢藏泄失常，卵子无法按时排出。因此可知，肾精、肾阳影响了冲任盛衰，对卵子发育、成熟和排出以及卵巢功能中发挥着重要作用。
有研究发现，肾阳虚状态下，线粒体内复合酶活性整体受到抑制，氧化磷酸化进行障碍，减少ATP的生成，且体内NO含量增加，进一步抑制ATP的产生。此外，ATP合成同样受到线粒体内膜与外膜之间电位差即△Ψm的驱动。研究表明，卵母细胞胞浆△Ψm水平和ATP含量增加是卵母细胞成熟必要条件。Wilding等发现△Ψm降低影响卵母细胞减数分裂时线粒体组装形态，从而影响卵母细胞受精后胚胎发育，导致胚胎镶嵌紊乱。国内外均有学者认为线粒体膜电位下降，标志着卵母细胞凋亡早期的信号。
目前还没有通过温肾填精法纠正线粒体动力学状态，恢复线粒体功能、提升卵母细胞质量研究，更没有用于冲任虚寒导致的生殖功能降低的温肾填精阳组合物。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种温肾填精中药组合物，它包括如下质量份的原料药：
熟地黄10～20份、山药10～20份、山茱萸10～20份，菟丝子10～20份、鹿角霜7～13份、淫羊藿7～13份、骨碎补7～13份、肉苁蓉7～13份。
进一步地，它是由下述重量配比的原料药制备而成：
熟地黄15份、山药15份、山茱萸15份，菟丝子15份、鹿角霜10份、淫羊藿10份、骨碎补10份、肉苁蓉10份。
进一步地，它是由原料药的药粉、或原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
进一步地，所述制剂为口服制剂。
更进一步地，所述口服制剂为颗粒剂、散剂、丸剂或溶液剂。
本发明还提供了前述药物组合物的制备方法，它包括以下步骤：
(1)按照前述配比称取原料药；
(2)原料药研为粉末，或原料药的水或有机溶剂提取液，加入药学上常用的辅料或辅助性成分，即得。
本发明最后提供了一种前述的中药组合物在制备治疗子宫和/或卵巢疾病的药物中的用途。
进一步地：所述药物是改善子宫微环境的药物。
更进一步地，所述药物是提高血清性激素、子宫内膜厚度、腺体面积、雌孕激素受体表达、子宫微血管密度和/或子宫局部面积因子的药物。
进一步地，所述药物是治疗卵巢功能低下的药物。
更进一步地，所述药物是上调卵子数量，降低异常卵泡率、改善卵巢血供和/或增强卵巢储备的药物。
冲任虚寒状态，通过女性生殖轴肾-天癸-冲任-胞宫最终影响到女性生育功能。正如《神农本草经》中记载：“女子风寒在子宫，绝孕十年无子。”《诸病源候论》也有“子脏冷无子”的论述。《圣济总录》有记载：“妇人所以无子，由充任不足，肾气虚寒故也。”张景岳《妇人规.子嗣类》提出了：“冲任不充则胎孕不受。”都说明了冲任虚寒与生殖功能降低的密切关系。本发明温肾填精中药组合物将温助肾阳、填补肾精相结合，通过药物间相互配伍，酌盈剂虚，纠正线粒体动力学状态，从而恢复线粒体功能、提升卵母细胞质量，增强卵巢储备，改善子宫微环境，改变妊娠结局。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫雌激素受体表达的影响12h
图2不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫雌激素受体表达的影响72h
图3不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫孕激素受体表达的影响12h
图4不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫孕激素受体表达的影响72h
图5不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫CD138表达的影响12h
图6不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫CD138表达的影响72h
图7不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)12h
图8不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)72h
图9不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫组织学指标12h
图10不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫组织学指标72h
具体实施方式
由本发明中药组合物制成的溶液剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂等制剂的制备工艺成熟，参照现有技术常规方法即可制成。
实施例1、本发明药物的制备
配方：熟地黄15g、山药15g、山茱萸15g，菟丝子15g、鹿角霜10g、淫羊藿10g、骨碎补10g、肉苁蓉10g。
制备方法：取上述各药味，加水煎煮，浓缩至稠浸膏，药渣干燥后进行细粉，然后与浸膏混匀，喷雾干燥成颗粒。
实施例2、本发明药物的制备
配方：熟地黄10g、山药10g、山茱萸10g，菟丝子10g、鹿角霜7g、淫羊藿7g、骨碎补7g、肉苁蓉7g。
制备方法：制备方法：取上述各药味，加水煎煮，浓缩至稠浸膏，药渣干燥后进行细粉，然后与浸膏混匀，喷雾干燥成颗粒。
实施例3、本发明药物的制备
配方：熟地黄20g、山药20g、山茱萸20g，菟丝子20g、枸杞子20g、鹿角霜13g、淫羊藿13g、骨碎补13g、肉苁蓉13g。
制备方法：制备方法：取上述各药味，加水煎煮，浓缩至稠浸膏，药渣干燥后进行细粉，然后与浸膏混匀，喷雾干燥成颗粒。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1本发明对冲任虚寒小鼠子宫的影响
1.材料
1.1实验动物
SPF级雌性昆明小鼠72只，6周龄，动物批准号为scxk(川2020-030)，饲养方法同前。雄鼠40只，10周龄。饲养环境清洁通风，保持光照12小时/天，室内温度恒定，保持在25±1℃，小鼠自由饮水进食，保持所有小鼠处于同样的饲养环境。小鼠的饲养及处死均遵循了《实验动物管理条例》、《药物非临床研究质量管理规范》、《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。
1.2实验药物及试剂
羟基脲片，齐鲁制药有限公司；孕马血清促性腺激素(PMSG)，北京索莱宝科技有限公司；注射用绒促性素(HCG)，丽珠集团丽珠制药厂；MOUSE E2、P、AMH、IgA、IgG、IgM、C3、C4、NK、CD4+、CD8+、ATP、NO、cAMP、cGMP ELISA KIT，上海联麦生物工程有限公司；无水乙醇，成都市科隆化学品有限公司；95％乙醇，成都市科隆化学品有限公司；二甲苯，成都市科隆化学品有限公司；多聚甲醛，成都市科隆化学品有限公司；中性环保速干胶，南昌雨露实验器材有限公司；组化二抗试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；Anti-estrogen receptoralpha，Abcam；Anti-progesterone receptor antibody，Abcam；EnvisionTM DetectionKit，丹麦DAKO公司。
1.3实验仪器与设备
恒温干燥箱；恒温水浴锅；THERMO FISHER微量移液器；THERMO FISHER酶标仪；Leica石蜡切片机；OLMPUS光学显微镜；Leica显微成像系统；OLMPUS成像系统。
2.方法
2.1分组
小鼠适应性饲养1周，挑选周期处于动情间期的小鼠，按照随机数字表的方式，将小鼠分为模型组、温肾填精低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组18只。
2.2造模
各组造模均按照4℃羟基脲0.4g/kg/d的剂量进行灌胃，每日1次，连续给药3周。
2.3中药干预
温阳填精组方药：熟地黄15g、山药15g、山茱萸15g，菟丝子15g，鹿角霜10g，骨碎补10g、淫羊藿10g、肉苁蓉10g。制备成混悬液，低剂量组给药剂量为1.7g/kg/d，中剂量组给药剂量为3.4g/kg/d，高剂量组给药剂量为5.1g/kg/d。
模型组予等量温水灌胃。
2.4超促排卵
采用PMSG+HCG的方式进行超促排卵。于小鼠动情间期腹腔注射PMSG 5IU，48h后腹腔注射HCG 5IU。
2.5合笼
注射HCG后按照雌鼠：雄鼠2：1的比例进行合笼。合笼后次日查看雌性小鼠阴道，见阴栓说明合笼成功。计数子代及存活情况。
2.6标本留取
小鼠分别于注射HCG后12小时、72小时后解剖。麻醉后采用目内眦取血法取血，离心后留取血清。留取子宫标本，经4％多聚甲醛液固定备查。
2.7检测指标
2.7.1生殖内分泌指标检测
2.7.1.1血清生殖激素检测
采用酶联免疫法测定小鼠血清性激素，使用上海联麦生物工程有限公司的MOUSEELISA E2、P、AMH KIT试剂盒分别进行小鼠血清雌激素、孕激素、抗苗勒氏激素测定。操作步骤按照各试剂盒的说明书进行。
2.7.1.2子宫雌孕激素受体表达
免疫组化法测定子宫雌孕激素受体表达。4％多聚甲醛固定的组织样本，包埋组织块于石蜡中。采用Leica RM2235切片机将组织切片，60℃烘烤切片至少2h。Envision二步法染色，脱水、封片。显微镜下观察雌孕激素受体阳性表达情况，并采图。
2.7.2免疫指标检测
2.7.2.1血清免疫学指标
使用上海联麦生物工程有限公司的MOUSE ELISA IgA、IgM、IgG、C3、C4、NK、CD4+、CD8+试剂盒测定小鼠血清免疫指标，测定方法按照试剂盒说明书进行。
2.7.2.2子宫CD138表达
采用免疫组化Envision二步法检测子宫CD138表达，方法同前。
2.7.3子宫局部微循环指标
2.7.3.1子宫微血管密度(MVD)、血管面积占比(RVA％)
免疫组化法测定子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)，方法同前。
2.7.3.2子宫组织学指标
4％多聚甲醛固定的组织样本，包埋组织块于石蜡中，切片、烘烤。切片经二甲苯脱蜡后，流水洗涤20min，用苏木素染色30min，流水洗涤20min，盐酸酒精分化，伊红染色5min，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树脂胶封片。显微成像系统对组织样品拍照，测量子宫内膜厚度及腺体面积、腺体最大直径。
2.7.4血清能量代谢指标
使用上海联麦生物工程有限公司的MOUSE ELISA ATP、NO、cAMP、cGMP试剂盒测定小鼠血清免疫指标，测定方法按照试剂盒说明书进行。
2.8统计分析
实验数据用Excel录入，SPSS21进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布且方差齐性的数据，多组数据比较采用单因素方差分析进行；非正态分布或方差不齐采用秩和检验。以p＜0.05为数据具有统计学差异，p＜0.01为数据有显著统计学差异。
3.结果
3.1不同剂量温肾填精中药对小鼠生殖内分泌的影响
3.1.1血清生殖激素的影响
表1不同剂量温肾填精中药对小鼠血清生殖激素的影响
Figure BDA0003158806460000061
注：与模型组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01
如表1所示，12h雌二醇水平，中剂量组显著高于模型组(p＜0.01)，高剂量组高于模型组(p＜0.05)。72h雌二醇水平，低、中、高剂量组均显著高于模型组(p＜0.01)。72h孕酮水平，低、中、高剂量组均显著高于模型组(p＜0.01)。抗苗勒氏激素水平，低、中、高剂量组均显著高于模型组(p＜0.01)。
3.1.2不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫雌孕激素受体表达的影响
不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫雌孕激素受体表达的影响，结果如表2及图1～4所示。
表2不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫雌孕激素受体表达的影响(％)
Figure BDA0003158806460000071
注：与自然周期组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
从结果可知：低剂量组72h子宫ER表达显著高于模型组(p＜0.01)。中剂量组12h子宫ER表达高于模型组(p＜0.05)，72h子宫ER表达显著高于模型组(p＜0.01)。高剂量组72h子宫ER表达、72h子宫PR表达显著高于模型组(p＜0.01)。
数据表明：低剂量对提高72h子宫ER表达有显著促进作用；中剂量组对12h、72h的子宫ER表达均有促进作用；高剂量对72h的雌孕激素受体表达均有促进作用。
3.2不同剂量的温肾填精中药对小鼠免疫的影响
3.2.1血清免疫指标
不同剂量的温肾填精中药对小鼠血清免疫指标的影响结果见表3。从结果可见：低、高剂量组血清NK高于模型组(p＜0.05)。
表3不同剂量的温肾填精中药对小鼠血清免疫指标的影响
Figure BDA0003158806460000072
Figure BDA0003158806460000073
注：与模型组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01
3.2.2子宫CD138表达
不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫CD138％及CD138表达量结果见表4及图5-6。
表4不同剂量的温肾填精中药对小鼠子宫CD138％及CD138表达量
Figure BDA0003158806460000081
注：与模型组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01
从结果可见：与模型组比较，低剂量组与模型组各期数据均无统计学差异，中剂量组72hCD138％低于模型组(p＜0.05)，72hCD138表达显著低于模型组(p＜0.05)；高剂量组72hCD138表达低于模型组(p＜0.05)。数据表明，中、高剂量组对降低CD138 72h表达均有效，且中剂量组效果最为显著。
3.3不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫局部循环的影响
3.3.1子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)的影响
不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)的影响，结果见表5及图7～8。从结果可见：中剂量组72h微血管密度显著高于模型组(p＜0.01)，高剂量组高于模型组(p＜0.05)。
表5不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫微血管密度(MVD)及血管面积占比(RVA％)的影响
Figure BDA0003158806460000082
注：与模型组比较，▲p＜0.05，▲▲p＜0.01
3.3.2子宫组织学指标
3.3.2.1子宫内膜厚度
不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫内膜厚度的影响，结果见表6及图9～10。从结果可见：中剂量组72h子宫内膜厚度显著高于模型组(p＜0.01)。
表6不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫内膜厚度的影响
Figure BDA0003158806460000083
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
3.3.2.2子宫腺体情况
不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫腺体的影响，结果见表7。从结果可见：中剂量组12h、72h子宫腺体面积显著高于模型组(p＜0.01)。
表7不同剂量温肾填精中药对小鼠子宫腺体面积及腺体最大直径
Figure BDA0003158806460000091
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
3.4不同剂量温肾填精中药对小鼠能量代谢的影响
不同剂量温肾填精中药对小鼠能量代谢的影响结果见表8。从表8可见：低剂量组ATP高于模型组(p＜0.05)，高剂量组ATP显著高于模型组(p＜0.01)。高剂量组NO显著低于模型组(p＜0.01)。中剂量组cAMP、cGMP高于模型组(p＜0.05)。中剂量组cAMP/cGMP显著高于模型组(p＜0.01)，高剂量组高于模型组(p＜0.05)。
表8不同剂量温肾填精中药对小鼠能量代谢的影响
Figure BDA0003158806460000092
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
3.5不同剂量温肾填精中药对阳虚精亏小鼠子代数及存活率的影响
不同剂量温肾填精中药对阳虚精亏小鼠子代数及存活率的影响结果如表9所示。从表9可见：中剂量组产仔数、存活数均显著高于模型组(p＜0.01)。中剂量组存活率高于模型组(p＜0.05)，高剂量组显著高于模型组(p＜0.01)。
表9不同剂量温肾填精中药对小鼠子代数及存活率的影响
Figure BDA0003158806460000093
注：与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
4.结论
实验结果表明：从生殖内分泌方面比较，低、中、高剂量组升高了72h雌二醇、72h孕酮、抗苗勒氏激素；中、高剂量组升高12h血清雌二醇。低剂量组升高了72h子宫ER表达；中剂量组升高了12h、72h子宫ER表达；高剂量组升高了72h子宫ER表达、72h子宫PR表达。中、高剂量对冲任虚寒小鼠生殖内分泌均有较强的调控作用。从免疫功能看，低、高剂量组血清NK升高。中、高剂量组72h子宫CD138表达降低。小鼠子宫局部微循环方面，中剂量组子宫微血管密度、子宫内膜厚度、腺体面积升高；高剂量组子宫微血管密度升高。中剂量为调控局部循环的最佳剂量。能量代谢上，低、高剂量组ATP升高。高剂量组NO降低、cAMP/cGMP升高。中剂量组cAMP、cGMP、cAMP/cGMP升高。数据说明，三种剂量对小鼠能量代谢均有调控作用。小鼠的子代情况中，中剂量组产仔数、存活数、存活率升高；高剂量组存活率升高。中剂量是促进其生殖功能的最佳剂量。
综上，温阳填精复方中药中剂量为调控冲任虚寒小鼠生殖内分泌、促进子宫局部循环、生殖功能的最佳剂量。高剂量对小鼠的生殖内分泌功能也有较强的促进作用。三种剂量均能调节小鼠的能量代谢。
试验例2本发明对冲任虚寒小鼠卵巢的影响
1材料
1.1实验动物
SPF级昆明雌性小鼠，4～6周龄，体质量(20±2)g，144只。SPF级昆明雄性小鼠，6-8周龄，体质量(30±3)g，20只。均由成都达硕实验动物中心提供，生产许可证号为：SCXK(川)2020-030。饲养于屏障环境，采用分笼饲养，每笼6只小鼠，自由饮食、饮水，保持温度20～26℃，相对湿度40％～70％，昼夜光照。
1.2实验药物与配制
羟基脲，规格：500mg/片，生产厂家：齐鲁制药有限公司。将2g羟基脲片研成粉末，用50mL冰生理盐水配成混悬液，并放置4℃冰箱内保存。孕马血清促性腺激素(PregnantMare Serum Gonadotropin，PMSG)，规格：1000iu/支，生产厂家：北京索莱宝科技有限公司，溶于20mL 0.9％生理盐水中，放入-20℃冰箱中储存。人绒毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin，HCG)，规格：2000iu/支，生产厂家：丽珠集团丽珠制药厂，溶于20mL 0.9％生理盐水中，放入-20℃冰箱中储存。温肾填精免煎剂，熟地黄15g、山药15g、山茱萸15g、菟丝子15g、淫羊藿10g、肉苁蓉10g、骨碎补10g、鹿角霜10g组成，一剂温肾填精复方中药生药相当于免煎颗粒11.4g，溶于0.9％氯化钠溶液中配成0.23g/mL中药混悬液。
1.3实验试剂
透明质酸酶，(北京索莱宝科技有限公司，货号H3884)；Quinn’s缓冲培养液ART-1023，(美国SAGE公司，批号：19230140)；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，(中国上海碧云天生物有限公司，货号：C2006)；RNA提取液(Trizol，美国Invitrogen公司，货号：15596018)；三氯甲烷，(国药集团化学试剂有限公司，货号：10006818)；异丙醇，(国药集团化学试剂有限公司，货号：80109218)；无水乙醇，(国药集团化学试剂有限公司，货号：10009218)；HyPureTM Molecular Biology Grade Water,(美国HyClone公司，货号SH30538.02)；5X All-In-One MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)，(加拿大abm公司，货号：#G492)；EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix-No Dye,(加拿大abm公司，货号0194844830001)；MOUSE ATP/NO/cAMP/cGMP ELISA KIT，生产厂家均为上海联迈生物工程有限公司；伊红(美国Thermo Fisher公司，生产批号：392155)；苏木素(美国Thermo Fisher公司，生产批号：420699)；95％乙醇(科隆化学品有限公司，生产批号：2018012501)；二甲苯(科隆化学品有限公司，生产批号：2018011701)；多聚甲醛(科隆化学品有限公司，生产批号：2017041401)；中性环保速干胶(南昌雨露实验器材有限公司，生产批号：2018042101)；4％多聚甲醛通用型组织固定液，(Biosharp公司，生产批号:1810898)。
1.4实验仪器
洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司，SW-CK-2FD；台式冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司，Allegra X-15R；实时荧光定量PCR系统，美国BioRad公司，CFX96；组织匀浆机，北京鼎昊源科技有限公司，V4800；激光共聚焦培养皿，中国无锡耐思生命科技股份有限公司，80102；激光共聚焦显微镜，德国ZEISS公司，LSM710；解剖显微镜，日本Olympus公司，CK-40；CO2细胞培养箱，美国Thermo Scientific公司，3111；振荡器，中国海门其林贝尔，Vortex-5。恒温干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司，WGLL-125BE；微量移液器，美国Thermo fisher公司，Finnpipetter F3；酶标仪，美国Thermo fisher公司，Multiskan FC。石蜡切片机，德国Leica公司，RM2235；恒温水浴锅，中国天津泰斯特仪器有限公司，KD-98-ⅡA；徕卡显微成像系统，德国Leica公司，DM1000；切片刀，德国Leica公司，819；盖玻片，中国江苏世泰实验器材有限公司，10212020C；载玻片，中国江苏世泰实验器材有限公司，1a5105。
2 方法
2.1分组与造模
将所有小鼠适应性饲养一周，观察其阴道涂片，将动情周期规律的72只4周龄小鼠纳入实验。运用随机数字表法将小鼠分为自然周期组、促排对照组、冲任虚寒模型组、温肾填精颗粒组。本研究造模方法参考课题组前期研究阳虚小鼠造模方式并进行优化，自然周期组、促排对照组每日上午9：00灌胃15mL/kg生理盐水，另四组小鼠于同时按体质量灌胃400mg/kg浓度的冰羟基脲混悬液，灌胃期间监测小鼠体质量、肛温以及动情周期改变，持续灌胃21天后出现体重下降明显，肛温下降，动情周期紊乱，提示造模成功。
2.2药物干预
造模结束后各组分别予对应中药进行干预，每日一次，用药剂量按照《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表》(成人体质量按60kg计，小鼠平均体重按20g计)换算后20倍得出。温肾填精颗粒组每日灌服温肾填精颗粒3.4g/kg，自然周期组、促排对照组以及冲任虚寒模型组均灌服等容量生理盐水。各组小鼠均灌胃15天。
2.3合笼进行
干预结束后，除自然周期组，余各组小鼠下午16：00腹腔注射5IU PMSG，48h后即第三天下午16：00腹腔注射5IU HCG。各组超促排卵完成后每组随机选取6只雌鼠，以雌鼠与雄鼠1:1～2:1比例进行合笼，第二日晨观察各笼小鼠阴栓情况，如发现阴栓即代表受孕，受孕小鼠另归置于他笼进行饲养并进行标记，待子代小鼠出生后进行计数。
2.4标本收集与处理
各组超促排完成后随机选取6只雌鼠，于超促排卵后12h(自然周期组通过阴道涂片选取动情前期小鼠)腹腔注射4％水合氯醛麻醉，通过眼眶静脉丛采血法，将采集血收集到2mL离心管中，4℃冰箱静置过夜后，3000rpm离心10min，分离得到血清。脱颈椎法牺牲各组小鼠，摘取双侧卵巢，将一侧卵巢放在4％多聚甲醛固定液中，一侧卵巢组织置于冻存管内，放入液氮中备存待检。
2.5Elisa法检测血清ATP、NO、cAMP、cGMP含有量
将各组已收集血清根据试剂盒说明书步骤，检测其中ATP、NO、cAMP、cGMP含有量。
2.6卵母细胞获取及计数
除自然周期组，余各组随机选取6只小鼠完成超促排卵后16h(自然周期组通过阴道涂片选取动情前期小鼠，16h后)进行水合氯醛麻醉，摘取双侧输卵管放到35mm培养皿中，体视显微镜下戳破输卵管壶腹部，并逐渐撕扯输卵管，将所有卵丘释放出来,将卵丘放到含有透明质酸酶的培养皿中，分离颗粒细胞，将分离出颗粒细胞的卵母细胞再次放入含有M2培养液的培养皿内，显微镜下观察卵母细胞分期并进行计数，各期卵母细胞特征及鉴定：
GV期：胞浆内可见生发泡；
MI期：生发泡破裂，第一极体尚未排出；
MII期：胞质均匀、卵周隙小，第一极体排出且表面光滑、透明袋清晰均匀；
异常卵：卵子形状不规则、胞质内出现折光区或大空泡、透明带增厚或凸起。
2.7激光共聚焦下检测卵母细胞线粒体膜电位(△Ψm)
分离卵母细胞方法同2.6，将卵母细胞放入含有JC-1工作液的培养皿内，于37℃孵育20分钟。孵育结束，用JC-1缓冲液进行洗涤2次，然后将卵母细胞转移共聚焦培养皿内，放置激光共聚焦显微镜下进行观察、拍照。图像运用Zen blue lite 2.3进行分析，测量卵母细胞红、绿荧光数值。
2.8HE染色法观察卵巢组织
将卵巢固定完成后包经过冲洗、脱水、透明后包埋于石蜡中，采用Leica RM2235切片机将组织切成5μm薄片，在温水中将组织展平后捞在载玻片上进行烘烤，经二甲苯脱蜡后用苏木素、伊红进行染色，并用树脂胶封片，最后运用显微成像系统对组织样品拍照，采用Image Pro Plus 6.0对图片中卵巢的各级卵泡和黄体计数。
2.9RT-qPCR法检测线粒体功能基因表达
液氮中将冻存组织取出，加入Trizol后放入匀浆仪中进行总RNA抽提，检测RNA浓度及纯度并进行相应稀释，使其终浓度为500ng/μL。使用反转录试剂盒合成cDNA。设计与合成引物，并运用EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-No Dye进行扩增，扩增条件为预变性95℃，10min，循环反应为95℃，15s→60℃，60s，40个循环。每个样品设3个复孔，结果处理采用2-△△Ct值代表各指标的相对表达量。以β-actin作为内参基因，引物序列见表10，引物由上海生生物工程股份有限公司合成。
表10引物序列
Figure BDA0003158806460000141
2.10统计学处理方法
各组数值均用均数和标
Figure BDA0003158806460000142
准差表示，用SpSS.19软件分析，各组采用单因素方差分析，两两比较方差齐用LSD法比较，方差不齐用Tamhane’s比较，当P<0.05时认为具有统计学意义。
3结果
3.1温肾填精方对小鼠合笼情况的影响
由表11可见，产仔数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组有所增加；活胎数组间对比，与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组有所增加，差异显著(P<0.01)；死胎数各组间没有统计学差异。
表11各组小鼠合笼子代数量结果
Figure BDA0003158806460000143
Figure BDA0003158806460000144
注：与自然周期组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与促排对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与冲任虚寒模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3.2温肾填精方对小鼠血清ATP、NO、cAMP、cGMP表达的影响
由表12可见，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组ATP表达含量较其减少(P<0.05)，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组与其无意义。冲任虚寒模型组比较温肾填精颗粒组ATP表达含量增多(P<0.05，P<0.01)。与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组NO表达含量均明显增加(P<0.05，P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组含量表达有所下降(P<0.01)。与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组CAMP表达水平显著下降(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组显著增加(P<0.01)。与自然周期组比较，冲任虚寒模型组CGMP表达含量没有差异，与促排对照组比较，温肾填精颗粒组CGMP表达水平增加明显(p<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组中药表达组表达水平显著下降(P<0.01)。
表12各组小鼠ATP、NO、CAMP、CGMP表达
Figure BDA0003158806460000151
Figure BDA0003158806460000152
注：与自然周期组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与促排对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与冲任虚寒模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3.3温肾填精方对小鼠获卵数的影响
由表13可见，总卵数组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组增多明显(P<0.01)。MII卵数组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组明显增多(P<0.01，P<0.05)。异常卵数组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组显著增多，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组无差异。MII卵率组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组均较其显著降低(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组显著增加(P<0.01，P<0.05)。异常卵率比较，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组较其无差异，与促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著增多(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组显著下降(P<0.01)。
表13各组小鼠获卵分期及计数
Figure BDA0003158806460000161
Figure BDA0003158806460000162
注：与自然周期组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与促排对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与冲任虚寒模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3.4温肾填精方对小鼠卵母细胞△Ψm的影响
由表14可见，各组小鼠卵母细胞△Ψm对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组较其显著下降(P<0.01，P<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组升高明显(P<0.05)。
表14各组小鼠△Ψm
Figure BDA0003158806460000163
Figure BDA0003158806460000164
注：与自然周期组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与促排对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与冲任虚寒模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3.5温肾填精方对小鼠卵巢内各级卵泡的影响
由表15可见，原始卵泡数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组数目显著减少(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组显著增加(P<0.01)。初级卵泡数组间对比，与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著增加(P<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组无差异。次级卵泡数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著增加(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组无差异。成熟卵泡数组间对比，与自然周期、促排对照组比较，冲任虚寒模型组均较其减少，但与自然周期组无差异，与促排对照组差异显著(P<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组显著增加(P<0.01)。闭锁卵泡数组间对比，与自然周期组、促排对照组比较，冲任虚寒模型组显著增加(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组显著减少(P<0.01)。黄体数组间对比，与自然周期组、促排对照组组间对比，冲任虚寒模型组较其显著下降(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组黄体数目增加但无统计学差异。
表15各组小鼠卵巢各级卵泡及黄体数目
Figure BDA0003158806460000171
Figure BDA0003158806460000172
注：与自然周期组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与促排对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与冲任虚寒模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
3.6温肾填精方对小鼠卵巢线粒体功能的影响
由表16可见，Mfn1mRNA表达水平组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组较其显著降低(P<0.01)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组增高(P<0.05)。OPA1mRNA表达水平组间对比，与自然周期组比较冲任虚寒模型组较其有所下降(P<0.05)，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组显著增加(P<0.01)。Drp1 mRNA表达水平组间对比，与自然周期组比较，冲任虚寒模型组显著增加，与冲任虚寒模型组比较，温肾填精颗粒组表达显著下降(P<0.01，P<0.05)。Fis1mRNA表达水平各组间均无统计意义。
表16各组小鼠线粒体动力学相关因子表达
Figure BDA0003158806460000173
Figure BDA0003158806460000174
注：与自然周期组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与促排对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与冲任虚寒模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
4、结论
本发明温肾填精组合物对冲任虚寒小鼠生殖功能有正向调节作用，①使线粒体内氧化磷酸化趋近正常，增加△Ψm，增强线粒体呼吸水平，加强ATP合成，保护卵母细胞减数分裂，改善卵子功能，增强卵巢储备；②改善线粒体功能及分布，加强线粒体能量代谢，促进卵母细胞成熟，并抑制细胞过度凋亡，减少异常卵子及闭锁卵泡发生。
综上，本发明温肾填精中药组合物将温助肾阳、填补肾精相结合，通过药物间相互配伍，酌盈剂虚，纠正线粒体动力学状态，从而恢复线粒体功能、提升卵母细胞质量，增强卵巢储备，改善子宫微环境，改变妊娠结局。

Claims (11)

1.一种温肾填精中药组合物，其特征在于：它包括如下质量份的原料药：
熟地黄10～20份、山药10～20份、山茱萸10～20份，菟丝子10～20份、鹿角霜7～13份、淫羊藿7～13份、骨碎补7～13份、肉苁蓉7～13份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成：
熟地黄15份、山药15份、山茱萸15份，菟丝子15份、鹿角霜10份、淫羊藿10份、骨碎补10份、肉苁蓉10份。
3.根据权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于：它是由原料药的药粉、或原料药的水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
4.根据权利要求1～3任一项所述的中药组合物，其特征在于：所述制剂为口服制剂。
5.根据权利要求4所述的中药组合物，其特征在于：所述口服制剂为颗粒剂、散剂、丸剂或溶液剂。
6.权利要求1～5任一项所述中药组合物的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)按照权利要求1所述配比称取原料药；
(2)原料药研为粉末，或原料药的水或有机溶剂提取液，加入药学上常用的辅料或辅助性成分，即得。
7.权利要求1～5任一项所述的中药组合物在制备治疗子宫和/或卵巢疾病的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述药物是改善子宫微环境的药物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述药物是提高血清性激素、子宫内膜厚度、腺体面积、雌孕激素受体表达、子宫微血管密度、和/或子宫局部面积因子的药物。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗卵巢功能低下的药物。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述药物是上调卵子数量，降低异常卵泡率、改善卵巢血供，改善阳虚状态和/或增强卵巢储备功能的药物。
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