CN103454368B - 一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法 - Google Patents
一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医疗技术领域，提供了一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法，包括配制1mg/ml的氯丙嗪标准溶液、1mg/ml的安定内标溶液、空白标样、正常人血液标样、病人血液标样，放入色谱仪里绘制色谱图，根据色谱图判断病人血液里面是否含有氯丙嗪；然后根据色谱图绘制氯丙嗪标准曲线，再将病人血液标样色谱图中的氯丙嗪峰值、安定内标溶液峰值与氯丙嗪标准曲线进行比较，计算出病人血液中的氯丙嗪含量。本发明有效解决了色谱图中杂峰多、灵敏度低、精确度低、成本高、绘制出的氯丙嗪标准曲线线性范围较小、过氧化物多影响氯丙嗪稳定提取的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，特别涉及一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法。
背景技术
氯丙嗪属二甲胺族分噻嗪类药物，镇静作用明显，可产生较强的抗胆碱作用及中度的锥体外系症状，止吐作用较强，可制止多种原因引起的呕吐，为抗精神病药的代表药物，小剂量可作为镇吐药使用。
氯丙嗪口服易吸收，但吸收不规则，个体差异甚大，吸收速度受胃内食物和抗胆碱药的影响，吸收后2～4h血药浓度达到高峰；氯丙嗪肌内注射吸收迅速，15～30min血药浓度达到高峰。氯丙嗪脂溶性高，易透过血脑屏障，脑内浓度可达血浆浓度的10倍，但是主要代谢在肝脏，易产生药物残留，残留的氯丙嗪和部分具有原药活性的代谢物，能够引起白细胞减少和粒细胞缺乏症，从而引起人体肝脏、肾脏的病变，还会引起眼部并发症等。
目前，市场上存在的氯丙嗪血液浓度的测试方法中，浓度较低的点很难提取，例如5、10、20ng/ml的含量点不能在标准曲线上绘制出来，并且标准曲线的最高点的浓度为160ng/ml，临床上有很多病人的氯丙嗪含量远远超过该最高点，故此线性范围过窄；过氧化物多，使对过氧化物敏感的氯丙嗪的提取率不稳定。
因此，生物医疗技术领域急需一种杂峰少、灵敏度高、精确度高、能够绘制出较大线性范围的氯丙嗪标准曲线、成本低廉、降低过氧化物存在率，能够稳定提取氯丙嗪的高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法。
发明内容
为了克服现有氯丙嗪含量检测不准确的缺点，本发明提供一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法，技术方案如下：
一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：
第一步，配制lmg/ml的的氯丙嗪标准溶液；
首先，称取分析纯氯丙嗪500mg，放入500mL容量瓶中，然后将色谱纯甲醇倒入装有氯丙嗪的容量瓶中，稀释至500ml，摇匀；
第二步，配制1mg/ml的的安定内标溶液；
首先，称取分析纯安定100mg，放入100mL容量瓶中，然后将去离子水倒入装有安定的容量瓶中，稀释至100ml，摇匀。
第三步，配制17.6μg/ml维生素C；
首先，称取维生素C1.76mg,放入100mL容量瓶中，将去离子水加入装有维生素C的容量瓶中，稀释至100ml，摇匀；
第四步，配制2129.6ml流动相；
首先将甲醇1400ml、冰醋酸5.2ml、四甲基乙二胺4.4ml25000ml的容量瓶中，然后向装有甲醇、冰醋酸、四甲基乙二胺的容量瓶中倒入720ml去离子水，摇匀。
第五步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，作为空白标样；
第六步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样1；
第七步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后依次量取300ng氯丙嗪标准溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样2；
第八步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，分别与10ng、50ng、100ng、200ng、300ng、600ng氯丙嗪标准溶液，一起倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样3、4、5、6、7、8；
第九步，取500μl病人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样9；
第十步，首先分别向空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9中加入维生素C100μl，摇匀后再分别加入2mol/l氢氧化钠500μl，再加入色谱纯乙醚4.5ml，漩涡振荡3分钟，静置20分钟；
第十一步，分别从离心后的空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9中移取3.5ml上清液至10支洁净的10ml具塞抽提管中，放置于50℃下水浴，并在氮气流下蒸发至完全干燥；
第十二步，首先将取出的残留物分别用250μl流动相漩涡混匀、溶解，然后将溶解物分别吸入10支尖底离心管中；
第十三步，分别从10支尖底离心管中取出100μl，放入10支试管中，再将10支试管放入色谱仪中进行光谱测量，得出10张色谱图；
第十四步，根据空白标样、标样1、标样2、标样3的比较可以判断出安定内标溶液的峰值，氯丙嗪标准溶液的峰值；进一步地，根据标样3的色谱图可以判断出标样9中是否含有氯丙嗪；进一步地，色谱仪根据标样3、4、5、6、7、8的色谱图绘制出氯丙嗪标准曲线；进一步地，色谱仪根据色谱图中氯丙嗪的峰值、安定内标溶液的峰值、氯丙嗪标准曲线，计算出标样9中氯丙嗪的含量。
如上的一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪的方法，其中，空白标样的色谱图为一条接近于平滑的直线。
如上的一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪的方法，其中，氯丙嗪的出峰时间为8.14±0.55分。
如上的一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪的方法，其中，氯丙嗪标准曲线的斜率为0.9998±0.0002。
本发明的有益效果是：
1.本发明实验过程中加入了维生素C，能够有效的消除过氧化物，更加稳定的提取出病人血液中的氯丙嗪。
2.能够绘制出氯丙嗪标准曲线，与病人的氯丙嗪色谱图相比较，从而计算出氯丙嗪含量。
3.本发明使用的实验仪器少、操作简单、灵敏度高、精确度高。
4.本发明采用色谱仪生成的色谱图杂峰少,具有更好的辨识度。
5.本发明检测成本低廉，提高了经济效益。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明：
图1是本发明的空白标样产生的色谱图。
图2是本发明的标样1产生的色谱图。
图3是本发明的标样2产生的色谱图。
图4是本发明的标样3产生的色谱图。
图5是本发明的标样9产生的色谱图。
图6是本发明根据标样3、4、5、6、7、8色谱图绘制出的氯丙嗪标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
本发明的具体实施步骤如下：
第一步，配制lmg/ml的的氯丙嗪标准溶液；
首先，称取分析纯氯丙嗪500mg，放入500mL容量瓶中，然后将色谱纯甲醇倒入装有氯丙嗪的容量瓶中，稀释至500ml，摇匀。
第二步，配制1mg/ml的的安定内标溶液；
首先，称取分析纯安定100mg，放入100mL容量瓶中，然后将去离子水倒入装有安定的容量瓶中，稀释至100ml，摇匀。
第三步，配制17.6μg/ml维生素C；
首先，称取维生素C1.76mg,放入100mL容量瓶中，将去离子水加入装有维生素C的容量瓶中，稀释至100ml，摇匀；
第四步，配制2129.6ml流动相；
首先将甲醇1400ml、冰醋酸5.2ml、四甲基乙二胺4.4ml25000ml的容量瓶中，然后向装有甲醇、冰醋酸、四甲基乙二胺的容量瓶中倒入720ml去离子水，摇匀。
第五步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，作为空白标样；
第六步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样1；
第七步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后依次量取300ng氯丙嗪标准溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样2；
第八步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，分别与10ng、50ng、100ng、200ng、300ng、600ng氯丙嗪标准溶液，一起倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样3、4、5、6、7、8；
第九步，取500μl病人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样9；
第十步，首先分别向空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9中加入维生素C100μl，摇匀后再分别加入2mol/l氢氧化钠500μl，再加入色谱纯乙醚4.5ml，漩涡振荡3分钟，静置20分钟；
第十一步，分别从离心后的空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9中移取3.5ml上清液至10支洁净的10ml具塞抽提管中，放置于50℃下水浴，并在氮气流下蒸发至完全干燥；
第十二步，首先将取出的残留物分别用250μl流动相漩涡混匀、溶解，然后将溶解物分别吸入10支尖底离心管中；
第十三步，分别从10支尖底离心管中取出100μl，放入10支试管中，再将10支试管放入色谱仪中进行光谱测量，得出10张色谱图；
第十四步，根据空白标样、标样1、标样2、标样3的比较可以判断出安定内标溶液的峰值，氯丙嗪标准溶液的峰值，图1是本发明的空白标样产生的色谱图，为一条直线，图2是本发明的标样1产生的色谱图，101为安定内标溶液的产生的峰，图3是本发明的标样2产生的色谱图，102为氯丙嗪溶液产生的峰，图4是本发明的标样3产生的色谱图，既含有101安定内标溶液产生的峰，又含有102氯丙嗪溶液产生的峰；进一步地，根据标样3、4、5、6、7、8的色谱图可以判断出标样9中是否含有氯丙嗪产生的峰，随即判断出是否含有氯丙嗪；进一步地，色谱仪根据标样3、4、5、6、7、8的色谱图绘制出图6，图6是本发明的氯丙嗪标准曲线，图5是本发明的标样9产生的色谱图；进一步地，色谱仪根据图5中氯丙嗪的峰值、安定内标溶液的峰值、图6中氯丙嗪标准曲线，计算出标样9中氯丙嗪的含量。
下面举例几组具体实施例，说明病人血液内的氯丙嗪含量的测试：
实施例一：在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出安定内标溶液在保留时间为6.045秒时的峰以及病人血液内的氯丙嗪在保留时间为8.146秒时的峰，根据图6中氯丙嗪的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的氯丙嗪含量为85.30239ng/ml。
实施例二：在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出安定内标溶液在保留时间为6.067秒时的峰以及病人血液内的氯丙嗪在保留时间为8.254秒时的峰，根据图6中氯丙嗪的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的氯丙嗪含量为33.56788ng/ml。
实施例三：在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出安定内标溶液在保留时间为5.992秒时的峰以及病人血液内的氯丙嗪在保留时间为8.254秒时的峰，根据图6中氯丙嗪的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的氯丙嗪含量为13.37199ng/ml。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的支是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (4)
1.一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：
第一步，配制lmg/ml的氯丙嗪标准溶液；
首先，称取分析纯氯丙嗪500mg，放入500mL容量瓶中，然后将色谱纯甲醇倒入装有氯丙嗪的容量瓶中，稀释至500ml，摇匀；
第二步，配制1mg/ml的的安定内标溶液；
首先，称取分析纯安定100mg，放入100mL容量瓶中，然后将去离子水倒入装有安定的容量瓶中，稀释至100ml，摇匀；
第三步，配制17.6μg/ml维生素C；
首先，称取维生素C1.76mg,放入100mL容量瓶中，将去离子水加入装有维生素C的容量瓶中，稀释至100ml，摇匀；
第四步，配制2129.6ml流动相；
首先将甲醇1400ml、冰醋酸5.2ml、四甲基乙二胺4.4ml25000ml的容量瓶中，然后向装有甲醇、冰醋酸、四甲基乙二胺的容量瓶中倒入720ml去离子水，摇匀；
第五步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，作为空白标样；
第六步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样1；
第七步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后依次量取300ng氯丙嗪标准溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样2；
第八步，取500μl正常人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，分别与10ng、50ng、100ng、200ng、300ng、600ng氯丙嗪标准溶液，一起倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样3、4、5、6、7、8；
第九步，取500μl病人的血清加入10ml具塞抽提管中，然后量取150ng安定内标溶液，倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样9；
第十步，首先分别向空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9中加入维生素C100μl，摇匀后再分别加入2mol/l氢氧化钠500μl，再加入色谱纯乙醚4.5ml，漩涡振荡3分钟，静置20分钟；
第十一步，分别从离心后的空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9中移取3.5ml上清液至10支洁净的10ml具塞抽提管中，放置于50℃下水浴，并在氮气流下蒸发至完全干燥；
第十二步，首先将取出的残留物分别用250μl流动相漩涡混匀、溶解，然后将溶解物分别吸入10支尖底离心管中；
第十三步，分别从10支尖底离心管中取出100μl，放入10支试管中，再将10支试管放入色谱仪中进行光谱测量，得出10张色谱图；
第十四步，根据空白标样、标样1、标样2、标样3的比较可以判断出安定内标溶液的峰值，氯丙嗪标准溶液的峰值；进一步地，根据标样3的色谱图可以判断出标样9中是否含有氯丙嗪；进一步地，色谱仪根据标样3、4、5、6、7、8的色谱图绘制氯丙嗪标准曲线；进一步地，色谱仪根据色谱图中氯丙嗪的峰值、安定内标溶液的峰值、氯丙嗪标准曲线，计算出标样9中氯丙嗪的含量；
在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出安定内标溶液在保留时间为6.045秒时的峰以及病人血液内的氯丙嗪在保留时间为8.146秒时的峰，氯丙嗪的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的氯丙嗪含量为85.30239ng/m；
或在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出安定内标溶液在保留时间为6.067秒时的峰以及病人血液内的氯丙嗪在保留时间为8.254秒时的峰，根据氯丙嗪的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的氯丙嗪含量为33.56788ng/ml；
或在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出安定内标溶液在保留时间为5.992秒时的峰以及病人血液内的氯丙嗪在保留时间为8.254秒时的峰，根据氯丙嗪的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的氯丙嗪含量为13.37199ng/ml。
2.如权利要求1所述的一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪的方法，其特征在于，空白标样的色谱图为一条接近于平滑的直线。
3.如权利要求1所述的一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪的方法，其特征在于，氯丙嗪的出峰时间为8.14±0.55分。
4.如权利要求1所述的一种高效液相色谱检测血液中氯丙嗪的方法，其特征在于，氯丙嗪标准曲线的斜率为0.9998±0.0002。
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| 高效液相色谱法检测氯丙嗪血药浓度;朱砾 等;《上海精神医学》;20041231;第16卷(第4期);第206-207页1.1.2节，第207页1.3节，2.2节，2.5节，3节第1段 * |
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