CN103450198A - 咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯、其合成、抗肿瘤活性及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯[式中的R为L-氨基酸的侧链，具体为H，CH₃，CH(CH₃)₂，CH₂CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₃，CH₂C₆H₅，CH(OH)CH₃，CH₂CO₂Bzl，CH₂C₆H₄OH-p，(CH₂)₃NHC(NH)NH(NO₂)，CH₂CONH₂，(CH₂)₂CONH₂，Indole-5-yl-CH₂，(CH₂)₂CO₂Bzl或(CH₂)₂SCH₃]、公开了它们的制备、公开了它们的体外和体内的抗肿瘤活性，因而公开了它们作为抗肿瘤药物的临床应用前景。

Description

咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯、其合成、抗肿瘤活性及应用

发明领域

本发明涉及通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯[式中的R为L-氨基酸的侧链，具体为H，CH₃，CH(CH₃)₂，CH₂CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₃，CH₂C₆H₅，CH(OH)CH₃，CH₂CO₂Bzl，CH₂C₆H₄OH-p，(CH₂)₃NHC(NH)NH(NO₂)，CH₂CONH₂，(CH₂)₂CONH₂，Indole-5-yl-CH₂，(CH₂)₂CO₂Bzl或(CH₂)₂SCH₃]、涉及它们的制备、涉及它们的体外和体内的抗肿瘤活性，因而涉及它们作为抗肿瘤药物的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。 

背景技术

世界卫生组织(WHO)的官员在2009年初美国亚特兰大召开的“国际肿瘤学”年会上声明，恶性肿瘤正严重威胁着人类的生命与健康，到2010年癌症将超过心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。根据WHO的数据，2007年全球新确诊的肿瘤病人数已经达到1200万，而全球每年死于癌症的患者高达700万人以上。 

治疗肿瘤方法主要有外科治疗、放射治疗和化学治疗，其中化学治疗因为抗肿瘤药的深入而被广泛的研究，现在已成为这三种手段中发展最快最有前景的治疗方法。临床应用的抗肿瘤药物存在的疗效不理想和毒性高等缺陷，使得研究疗效好和毒副作用低的新型抗肿瘤药物一直是药物研究的热点之一。在天然产物中骆驼蓬碱被广泛用作抗肿瘤先导结构。发明人披露，用氨基酸苄酯修饰骆驼蓬碱不仅可以提高活性，而且可以降低毒副作用。 

近年来，人们对于含有咪唑并吡啶杂环类衍生物的结构、生物活性以及结构与活性相互关系有了广泛的研究和较为深入的认识。例如发明人就发现，3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸是抗肿瘤活性确切的先导结构。根据氨基酸苄酯修饰骆驼蓬碱不仅可以提高活性而且可以降低毒副作用的经验，发明人认识到往3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸的羧基引入天然氨基酸苄酯可能产生更为优秀的抗肿瘤活性。按照这些发现与认识，发明人提出与3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰氨基酸苄酯相关的发明。 

发明内容

本发明的第一个内容是提供通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯[式中的R为L-氨基酸的侧链，具体为H，CH₃，CH(CH₃)₂，CH₂CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₃，CH₂C₆H₅，CH(OH)CH₃，CH₂CO₂Bzl，CH₂C₆H₄OH-p，(CH₂)₃NHC(NH)NH(NO₂)，CH₂CONH₂，(CH₂)₂CONH₂，Indole-5-yl-CH₂，(CH₂)₂CO₂Bzl或(CH₂)₂SCH₃]。 

本发明的第二个内容是提供通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯的制备方法，该方法可用图1描述： 

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸； 

(2)(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸的3，5-二仲胺基用Boc保护； 

(3)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸与15种L-AA-OBzl偶联得到15种(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl； 

(4)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl用4N的氯化氢乙酸乙酯溶液脱Boc得到(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl； 

(5)以三乙胺为催化剂(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl先在甲醇中与丙酮缩合，后用KMnO₄或H₂O₂氧化得到通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯。 

本发明的第三个内容是评价涉通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯的体外和体内的抗肿瘤活性。 

本发明的第四个内容是阐述通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯作为抗肿瘤药物的临床应用前景。 

本发明中所出现的缩略语的说明： 

附图说明

图1咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯的合成路线.i)H₂SO₄，HCHO，H₂O；ii)NaOH，(Boc)₂，H₂O，1，4-二氧六环；iii)DCC，HOBt，NMM，THF，氨基酸苄酯；iv)4NHCl/EtOAc，无水EtOAc，丙酮，CH₃OH，Et₃N，无水MgSO₄，KMnO₄，H₂O，THF或H₂O₂，丙酮.3a和4a中R＝H，3b和4b中R＝CH₃，3c和4c中R＝CH(CH₃)₂，3d和4d中R＝CH₂CH(CH₃)₂，3e和4e中R＝CH(CH₃)CH₂CH₃，3f和4f中R＝CH₂C₆H₅，3g和4g中R＝CH(OH)CH₃，3h和4h中R＝CH₂CO₂Bzl，3i和4i中R＝CH₂C₆H₄OH-p，3j和4j中R＝(CH₂)₃NHC(NH)NH(NO₂)，3k和4k中R＝CH₂CONH₂，3l和4l中R＝(CH₂)₂CONH₂，3m和4m中R＝Indole-5-yl-CH₂，3n和4n中R＝(CH₂)₂CO₂Bzl，3o和4o中R＝(CH₂)₂SCH₃. 

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。 

实施例1 制备(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1) 

冰浴下向30.00g(0.193mol)L-组氨酸和120mL蒸馏水中逐滴加入6mL浓硫酸，搅拌均匀使完全溶解。然后加入60mL甲醛溶液(40％)，60℃油浴反应8小时。反应物冷却至室温，用浓氨水在冰浴调pH至6，过滤，得到的无色沉淀先用水洗，再用丙酮洗。得到28.04g(87％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)167[M+H]⁺。 

实施例2 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2) 

将10.52g(0.063mol)(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)分散在100mL蒸馏水中，冰浴下滴加12.6mLNaOH水溶液(6N)。向该反应液加31.59g(Boc)₂°与113mL二氧六环的溶液，用NaOH水溶液(6N)调pH 9。反应混合物室温搅拌24小时，TLC(氯仿∶甲醇∶冰醋酸＝15∶1∶0.06)显示化合物1消失。冰浴下用饱和硫酸氢钾水溶液调反应液至中性。减压浓缩除去二氧六环，残留物加50mL蒸馏水，冰浴下滴加饱和硫酸氢钾水溶液调pH 2，用乙酸乙酯萃取(100mL×1，50mL×2)。合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液反复洗至中性，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩至干得13.59g(59％)标题化合物，为无色固体。ESI/MS(m/z)368[M+H]⁺。 

实施例3 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰甘氨酸苄酯(3a) 

向14.94g(40.7mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与200mL无水四氢呋喃(THF)的溶液中加5.49g(40.7mmol)HOBt，溶解后在冰浴搅拌 下加入9.15g(44.4mmol)DCC，活化30min。将12.47g(37mmol)Tos·Gly-OBzl混悬于200mL无水THF，用NMM调pH至中性，然后将混悬液加入上面活化过的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8左右，室温反应16h，TLC显示2基本消失，过滤除去二环己基脲(DCU)。将滤液减压浓缩至干后用乙酸乙酯溶解，然后再次过滤除去DCU，滤液依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液、饱和NaHCO₃水溶液及饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色糖浆状物经硅胶柱层析纯化(石油醚/丙酮，100/2)，得到6.59g(35％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)515[M+H]⁺。 

实施例4 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰丙氨酸苄酯(3b) 

按照实施例3的方法，从15.34g(41.8mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与13.34g(38mmol)Tos·Ala-OBzl得到5.28g(26％)标题化合物，为无色固体。。ESI-MS(m/z)529[M+H]⁺。 

实施例5 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰缬氨酸苄酯(3c) 

按照实施例3的方法，从14.94g(40.7mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与14.03g(37mmol)Tos·Val-OBzl得到7.76g(38％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)557[M+H]⁺。 

实施例6 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰亮氨酸苄酯(3d) 

按照实施例3的方法，从12.85g(35mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与15.13g(38.5mmol)Tos·Leu-Obzl得到无色固体10.92g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)571[M+H]⁺。 

实施例7 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰异亮氨酸苄酯(3e) 

按照实施例3的方法，从12.85g(35mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与15.13g(38.5mmol)Tos·Ile-OBzl得到9.36g(47％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)571[M+H]⁺。 

实施例8 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰苯丙氨酸苄酯(3f) 

按照实施例3的方法，从8.44g(23mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与8.92g(20.9mmol)Tos·Phe-OBzl得到8.35g(66％)标题化合物，为无 色固体。ESI-MS(m/z)605[M+H]⁺。 

实施例9 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰苏氨酸苄酯(3g) 

按照实施例3的方法，从12.84g(35mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与14.67g(38.5mmol)Tos·Thr-OBzl得到6.93g(35％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)559[M+H]⁺。 

实施例10 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰天冬氨酸双苄酯(3h) 

按照实施例3的方法，从7.89g(21.5mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与11.47g(23.65mmol)Tos·Asp(OBzl)-OBzl得到8.56g(60％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)663[M+H]⁺。 

实施例11 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰酪氨酸苄酯(3i) 

按照实施例3的方法，从8.047g(22mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与10.721g(24.2mmol)Tos·Tyr-OBzl得到5.75g(42％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)621[M+H]⁺。 

实施例12 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰硝基精氨酸苄酯(3j) 

按照实施例3的方法，从11.01g(30mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与15.87g(33mmol)Tos·Arg(NO₂)-OBzl得到3.72g(19％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)659[M+H]⁺。 

实施例13 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰天冬酰胺苄酯(3k) 

按照实施例3的方法，从9.85g(26.84mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与6.307g(24.4mmol)HCl·Asn-OBzl得到5.75g(41％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)572[M+H]⁺。 

实施例14 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰谷胺酰胺苄酯(3l) 

按照实施例3的方法，从14.937g(40.7mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与10.08g(37mmol)HCl·Gln-OBzl得到3.49g(16％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)608[M+Na]⁺。 

实施例15 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰色氨酸苄酯(3m) 

按照实施例3的方法，从9.909g(27mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与10.9g(29.7mmol)HCl·Trp-OBzl得到6.72g(39％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)644[M+H]⁺。 

实施例16 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰谷氨酸双苄酯(3n) 

按照实施例3的方法，从9.909g(27mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与14.82g(29.7mmol)Tos·Glu(OBzl)-OBzl得到10.45g(57％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)677[M+H]⁺。 

实施例17 制备(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰蛋氨酸苄酯(3o) 

按照实施例3的方法，从11.01g(30mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸(2)与13.563g(33mmol)Tos·Met-OBzl得到5.24g(30％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)589[M+H]⁺。 

实施例18 制备氯化[8H-咪唑并吡啶物并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-乙酸苄酯(4a) 

将5.14g(10mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰甘氨酸苄酯(3a)用20mL无水乙酸乙酯溶解，冰浴下滴加77mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4N)，反应11.5h后TLC显示3a消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物加20mL乙酸乙酯，再减压浓缩至干。该操作反复三次。残留物加20mL无水乙醚研磨，得到(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰甘氨酸苄酯，为粉末状固体。该粉末用甲醇溶解，用Et₃N调pH 7，与150mL丙酮混合，用Et₃N调pH 9。于24h内分两次向该化合物中加入4.8g(40mmol)无水硫酸镁，室温搅拌10天，TLC显示(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰甘氨酸苄酯基本消失，减压抽滤，滤液用冰醋酸调pH 7，减压浓缩至干。残留物加100mL乙酸乙酯溶解，过滤，滤液用饱和NaCl水溶液洗(50mL×1，30mL×2)，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩至干。得到的粘稠物先用100mLTHF充分分散。然后将1.58g(10mmol)KMnO₄与100mL蒸馏的溶液于冰浴下滴加到THF分散液中，反应45min，过滤，滤液减压浓缩至干，残留物用4×20cm硅胶柱分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(100∶1-15∶1)，得到593mg(17％)标题化合物，为无色固体。Mp 238-239℃(分解). 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3745，3434，3018，2734，2626，2523，1755，1713，1618， 1536，1458，1426，1373，1326，1197，987，930，749，698，647，610，463cm^-1；ESI/MS(m/z)：351[M-Cl]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝10.008(s，1H)，8.768(s，1H)，8.378(s，1H)，7.416-7.336(m，5H)，5.238(s，2H)，4.662(s，2H)，1.933(s，6H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝168.34，161.37，158.89，152.29，144.99，136.00，130.08，128.95，128.72，128.54，108.22，84.26，67.08，41.68，26.28；Anal.Calcd for C₁₉H₁₉N₄O₃ ⁺Cl^-：C，58.99；H，4.95；N，14.48；O，12.41；Cl，9.16.纯度：98.05％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 45∶55，1ml/min；保留时间：11.3min. 

实施例19 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲基乙酸苄酯(4b) 

按照实施例18的方法，从5.28g(10mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰丙氨酸苄酯(3b)得到388mg(11％)标题化合物，为无色固体。Mp 224-225℃. 

(c＝0.1，CH₃OH)；IR(KBr)：3745，3439，3044，2996，2948，1736，1706，1620，1536，1457，1421，1374，1350，1328，1222，1150，1095，1025，927，746，696，648，617，468cm^-1；ESI/MS(m/z)：365[M-Cl]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.755(s，1H)，8.574(s，1H)，8.171(s，1H)，7.336-7.278(m，5H)，5.185(q，J＝12.6Hz，2H)，4.954(q，J＝6.9Hz，1H)，1.969(s，3H)，1.891(s，3H)，1.650(d，J＝6.9Hz，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝170.11，165.32，158.64，155.48，146.31，136.18，128.86，128.66，128.50，128.07，126.70，108.16，83.63，67.08，49.92，26.57，26.16，15.91；Anal.Calcd for C₂₀H₂₁N₄O₃ ⁺Cl^-：C，59.92；H，5.28；N，13.98；O，11.97；Cl，8.84.纯度：99.66％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 48∶52，1ml/min；保留时间：9.5min. 

实施例20 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-异丙基乙酸苄酯(4c) 

按照实施例18的方法，从2.78g(5mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰缬氨酸苄酯(3c)得到573mg(29％)标题化合物，为无色固体。Mp 207-208℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3745，3427，3064，2973，1742，1723，1619，1534，1459，1421，1327，1277，1176，1066，980，922，751，697，646，609，494cm^-1；ESI/MS(m/z)：393[M-Cl]⁺，427[M-H]^-；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.718(s，1H)，8.573(s，1H)，8.175(s，1H)，7.332-7.254(m，5H)，5.165(dd，J＝12.6Hz，J＝14.4Hz，2H)，4.324(d，J＝9.3Hz，1H)，3.046-2.925(m，1H)，1.953(s，3H)，1.801(s，3H)，1.138(d，J＝6.6Hz，3H)，0.963(d，J＝6.9Hz，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝169.84，165.34，159.37，155.51，146.36，135.97，128.84，128.63，128.53，126.51，126.48，108.24，84.01，67.09，55.37，28.49，26.69，21.02，20.83；Anal.Calcd for C₂₂H₂₅N₄O₃ ⁺Cl^-：C，61.61；H，5.87；N，13.06；O，11.19；Cl，8.27.纯度：99.93％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 56∶44，1ml/min；保留时间：9.2min。 

实施例21 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-异丁基乙酸苄酯(4d) 

按照实施例18的方法，从8.55g(15mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰亮氨酸苄酯(3d)得763mg(13％)标题化合物，为无色固体。Mp 185-187℃. (c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)：3412，2958，2871，1719，1619，1535，1460，1329，1199，1062，972，810，751，699，646，606，481cm^-1；ESI/MS(m/z)：407[M-Cl]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.742(s，1H)，8.576(s，1H)，8.172(s，1H)，7.329-7.287(m，5H)，5.174(dd，J＝12.6Hz，J＝21.3Hz，2H)，4.708(t，J＝6.9Hz，1H)，2.248-2.089(m，2H)，1.956(s，3H)，1.879(s，3H)，1.820-1.689(m，1H)，0.958(t，J＝6.9Hz，6H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝170.25，165.24，159.37，155.41，146.32，136.09，128.87，128.72，128.57，128.23，126.62，108.15，83.99，67.20，53.64，26.83，26.26，25.10，23.32，22.55；Anal.Calcd for C₂₃H₂₇N₄O₃ ⁺Cl^-：C，62.37；H，6.14；N，12.65；O，10.84；Cl，8.00.纯度：99.42％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 56∶44，1ml/min；保留时间：15.3min。 

实施例22 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-仲丁基乙酸苄酯(4e) 

按照实施例18的方法，从6.27g(11mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰异亮氨酸苄酯(3e)得到775mg(19％)标题化合物，为无色固体。Mp172-173℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3426，2968，2359，1722，1619，1535，1458，1326，1248，1177，1065，973，751，698，646，608，493cm^-1；ESI/MS(m/z)：407[M-Cl]⁺； ¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.720(s，1H)，8.574(s，1H)，8.171(s，1H)，7.326-7.259(m，5H)，5.169(dd，J＝12.6Hz，J＝14.4Hz，2H)，4.357(d，J＝9.0Hz，1H)，2.767-2.692(m，1H)，1.934(s，3H)，1.795(s，3H)，1.616-1.537(m，1H)，1.175-1.122(m，1H)，1.078(d，J＝6.6Hz，3H)，0.871(t，J＝7.2Hz，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝169.89，165.42，159.40，155.57，146.42，135.97，128.84，128.63，128.59，126.44，108.22，84.04，67.08，60.79，34.92，26.72，26.66，26.29，16.82，12.08；Anal.Calcd for C₂₃H₂₇N₄O₃ ⁺Cl^-：C，62.37；H，6.14；N，12.65；O，10.84；Cl，8.00.纯度：99.53％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 56∶44，1ml/min；保留时间：14.5min。 

实施例23 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-苄基乙酸苄酯(4f) 

按照实施例18的方法，从5.436g(9mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑 [4，5-c]并吡啶-6-甲酰苯丙氨酸苄酯(3f)得到550mg(14％)标题化合物，为无色固体。Mp200-201℃. (c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3426，3065，2983，1721，1618，1533，1497，1456，1417，1356，1326，1255，1198，1070，999，925，753，699，647，596，478cm^-1；ESI/MS(m/z)：441[M-Cl]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.579(s，1H)，8.570(s，1H)，8.231(s，1H)，7.360-7.285(m，5H)，7.242-7.156(m，5H)，5.252(q，J＝12.6Hz，2H)，5.078(q，J＝4.8Hz，1H)，3.680(m，1H)，3.550(dd，J＝4.8Hz，J＝13.5Hz，1H)，1.774(s，3H)，0.977(s，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝169.27，165.51，159.62，155.46，146.40，137.80，136.03，130.23，128.88，128.83，128.60，128.28，128.15，127.30，126.54，108.31，83.73，67.40，56.99，34.70，26.71，25.19；Anal.Calcd for C₂₆H₂₅N₄O₃ ⁺Cl^-：C，65.47；H，5.28；N，11.75；O，10.06；Cl，7.43.纯度：99.67％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 60∶40，1ml/min；留时间：14.4min。 

实施例24 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-α-羟乙基乙酸苄酯(4g) 

按照实施例18的方法，从6.138g(11mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰苏氨酸苄酯(3g)得到529mg(11％)标题化合物，为无色固体。Mp 213-214℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3839，3804，3746，3675，3649，3618，3169，3047，1744，1699，1651，1620，1520，1460，1420，1380，1328，1251，1210，1181，1110，445cm^-1；ESI/MS(m/z)：395[M-Cl]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.751(s，1H)，8.586(s，1H)，8.216(s，1H)，7.352-7.262(m，5H)，5.315(d，J＝6.9Hz，1H)，5.183(dd，J＝12.6Hz，J＝14.7Hz，2H)，4.707(d，J＝7.5Hz，1H)，4.578(q，J＝6.9Hz，1H)，1.924(s，3H)，1.830(s，3H)，1.323(d，J＝6.0Hz，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝168.57，165.47，160.17，155.49，146.40，136.02，128.84，128.56，129.29，126.62，108.36，84.26，67.09，64.51，61.78，26.71，26.56，22.08；Anal.Calcd for C₂₁H₂₃N₄O₄ ⁺Cl^-：C，58.54；H，5.38；N，13.00；O，14.85；Cl，8.23.纯度：99.57％；Waters Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 45∶55，1ml/min；保留时间：12.2min。 

实施例25 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-苄氧羰乙基乙酸苄酯(4h) 

按照实施例18的方法，从6.62g(10mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰天冬氨酸双苄酯(3h)得到519mg(10％)标题化合物，为无色固体。Mp188-190℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3837，3804，3745，3674，3649，3616，3565，2979，1867，1828，1740，1649，1620，1520，1459，1422，1357，1330，1264，1198，937，756，730，701，441cm^-1；ESI/MS(m/z)：499[M-Cl]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.736(s， 1H)，8.592(s，1H)，8.203(s，1H)，7.314-7.262(m，10H)，5.246-5.157(m，4H)，5.112(d，J＝3.0Hz，1H)，3.473(dd，J＝7.8Hz，J＝16.2Hz，1H)，3.195(dd，J＝6.3Hz，J＝16.2Hz，1H)，1.926(s，3H)，1.876(s，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝170.32，168.79，165.48，159.48，155.41，146.46，136.26，135.79，128.85，128.80，128.61，128.47，128.40，128.21，128.05，126.71，108.42，83.94，67.65，66.48，51.42，35.14，27.00，25.89；Anal.Calcd for C₂₈H₂₇N₄O₅ ⁺Cl^-：C，62.86；H，5.09；N，10.47；O，14.95；Cl，6.63.纯度：99.83％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 62∶38，1ml/min；保留时间：12.0min。 

实施例26 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-对羟基苄基乙酸苄酯(4i) 

按照实施例18的方法，从5.518g(8.9mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰硝基精氨酸苄酯(3j)得到284mg(7％)标题化合物，为黄色晶体。Mp231-232℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3859，3745，3674，3649，3617，3564，3008，2808，2683，2610，2285，1746，1706，1615，1516，1461，1422，1382，1333，1258，1221，1063，1000，926，888，825，741，697，645，588，524，453cm^-1；ESI/MS(m/z)：457[M-Cl]⁺，491[M-H]^-；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.589(s，1H)，8.576(s，1H)，8.231(s，1H)，7.354-7.294(m，5H)，7.013(d，J＝8.4Hz，2H)，6.599(d，J＝8.4Hz，2H)，5.234(q，J＝12.6Hz，2H)，4.969(dd，J＝4.8Hz，J＝10.8Hz，1H)，3.580(t，J＝11.1Hz，1H)，3.438(d，J＝4.8Hz，1H)，1.766(s，3H)，1.028(s，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝169.35，165.25，159.48，156.50，155.30，146.26，136.06，131.18，128.88，128.58，128.33，128.24，127.77，126.66，115.52，108.28，83.88，67.31，57.28，33.75，26.71，25.32；Anal.Calcd for C₂₆H₂₅N₄O₄ ⁺Cl^-：C，63.35；H，5.11；N，11.37；O，12.98；Cl，7.19.纯度：99.50％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 52∶48，1ml/min；保留时间：13.5min。 

实施例27 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-硝基胍丙基乙酸苄酯(4j) 

按照实施例18的方法，从3.72g(5.65mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰硝基精氨酸苄酯(3j)得到211mg(14％)标题化合物，为微黄色晶体。Mp 240-241℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3859，3745，3673，3648，3352，3236，3049，2985，1709，1602，1536，1455，1335，1284，1087，1025，974，930，741，695，648，604，525，454cm^-1；ESI/MS(m/z)：495[M-Cl]⁺，529[M-H]^-；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.747(s，1H)，8.583(s，1H)，8.175(s，1H)，7.327(m，5H)，5.195(dd，J＝12.6Hz，J＝21.0Hz，2H)，4.819(t，J＝6.9Hz，1H)，3.224-3.204(m，2H)，2.306-2.283(m，2H)，1.963(s，3H)，1.856(s，3H)，1.687-1.644(m，2H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝169.79，165.38，159.75，159.37， 155.48，146.40，136.07，128.87，128.56，128.20，126.64，108.19，83.79，67.22，54.77，27.01，26.70，26.61，26.30；Anal.Calcd for C₂₃H₂₇N₈O₅ ⁺Cl^-：C，52.03；H，5.13；N，21.10；O，15.07；Cl，6.68.纯度：99.72％；Waters Symmetry C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：25℃，流动相：MeOH∶H₂O 42∶58，1ml/min；保留时间：12.7min。 

实施例28 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-乙酰胺基乙酸苄酯(4k) 

按照实施例18的方法，从9.136g(16mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰天冬酰胺苄酯(3k)得到740mg(11％)标题化合物，为微黄色晶体。Mp142-143.3℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3839，3746，3674，3649，3395，1713，1679，1621，1537，1458，1376，1329，1225，1067，929，750，699，647，467cm^-1；ESI/MS(m/z)：408[M-Cl]⁺，442[M-H]^-；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.750(s，1H)，8.578(s，1H)，8.184(s，1H)，7.599(s，1H)，7.315(m，5H)，7.052(s，1H)，5.174(q，J＝12.6Hz，2H)，5.109(m，1H)，3.422(m，2H)，1.929(s，6H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝171.32，169.38，165.47，159.34，155.47，146.44，136.00，128.82，128.48，128.26，128.06，126.73，108.25，83.86，67.38，51.60，36.49，26.96，26.21；Anal.Calcd for C₂₁H₂₂N₅O₄ ⁺Cl^-：C，56.82；H，5.00；N，15.78；O，14.42；Cl，7.99。 

实施例29 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)-2-丙酰胺基乙酸苄酯(4l) 

按照实施例18的方法，从3.487g(5.96mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰谷胺酰胺苄酯(3l)得到170mg(7％)标题化合物，为微黄色晶体。Mp86-87℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3837，3744，3673，3648，3395，1713，1672，1621，1536，1458，1418，1329，1219，933，749，700，646，517，442cm^-1；ESI/MS(m/z)：422[M-Cl]⁺，456[M-H]^-；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.751(s，1H)，8.579(s，1H)，8.177(s，1H)，7.331(m，5H)，7.276(s，1H)，6.787(s，1H)，5.192(q，J＝12.6Hz，2H)，4.812(t，J＝6.9Hz，1H)，2.476(m，2H)，2.305(m，2H)，1.976(s，3H)，1.852(s，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝173.91，169.77，165.46，159.38，155.53，146.42，136.09，128.87，128.57，128.52，128.23，126.60，108.19，83.80，67.20，54.44，31.87，26.78，26.46，25.45；Aral.Calcd forC₂₂H₂₄N₅O₄ ⁺Cl^-：C，57.70；H，5.28；N，15.29；O，13.98；Cl，7.74。 

实施例30 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-吲哚-5-甲基乙酸苄酯(4m) 

按照实施例18的方法，从6.687g(10.4mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰色氨酸苄酯(3m)得到480mg(10％)标题化合物，为无色固体。Mp 210 -211℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3839，3804，3746，3674，3649，3616，3565，3416，1867，1829，1712，1650，1621，1539，1458，1420，1330，1257，1219，747，701，646，440cm^-1；ESI/MS(m/z)：480[M-Cl]⁺，514[M-H]^-；¹H-NMR(DMSO-d₆，500Hz)：δ/ppm＝10.83(s，1H)，9.53(s，1H)，8.57(s，1H)，8.25(s，1H)，7.57(d，J＝10.0Hz，1H)，7.40-7.27(m，7H)，7.13(s，1H)，7.01-6.98(m，1H)，6.93-6.90(m，1H)，5.32(d，J＝10.0Hz，1H)，5.23(d，J＝15.0Hz，1H)，5.03(dd，J＝5.0Hz，J＝15.0Hz，1H)，3.91(m，1H)，3.69(m，1H)，1.75(s，3H)，0.80(s，3H)； ¹³C-NMR(DMSO-d₆，125Hz)：δ/ppm＝169.53，165.29，159.41，155.31，146.24，136.34，136.17，128.89，128.86，128.56，238.46，128.31，128.24，127.88，126.54，125.02，121.48，118.95，118.48，111.92，110.20，108.15，83.84，67.26，56.78，26.84，24.90，24.55；Anal.Calcd for C₂₈H₂₆N₅O₃ ⁺Cl^-：C，65.18；H，5.08；N，13.57；O，9.30；Cl，6.87。 

实施例31 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-苄氧羰丙基取代乙酸苄酯(4n) 

按照实施例18的方法，从7.436g(11mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰谷氨酸双苄酯(3n)得到602mg(11％)标题化合物，为无色固体。Mp144-145℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)3836，3744，3673，3648，3420，3042，2947，1731，1618，1535，1456，1332，1261，1178，1074，976，915，741，698，645，439cm^-1；ESI/MS(m/z)：513[M-Cl]⁺，547[M-H]^-；¹H-NMR(DMSO-d₆，300Hz)：δ/ppm＝9.725(s，1H)，8.579(s，1H)，8.163(s，1H)，7.340-7.328(m，10H)，5.757(s，1H)，5.197(q，J＝12.6Hz，2H)，5.090(s，2H)，4.815(t，J＝6.6Hz，1H)，2.691-2.604(m，2H)，2.554(m，1H)，1.936(s，1H)，1.834(s，1H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75Hz)：δ/ppm＝169.36，165.24，159.49，156.64，156.50，155.28，146.23，136.06，131.19，128.90，128.60，128.35，128.25，127.77，127.74，126.69，115.61，115.52，108.31，83.90，67.32，57.27，33.73，26.71，25.30；Anal.Calcd for C₂₉H₂₉N₄O₅ ⁺Cl^-：C，63.44；H，5.32；N，10.20；O，14.57；Cl，6.46。 

实施例32 制备氯化[8H-咪唑并吡啶并[1，2-c](2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-甲硫乙基乙酸苄酯(4o) 

按照实施例18的方法，从5.233g(8.9mmol)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰蛋氨酸苄酯(3o)得到230mg(6％)标题化合物，为无色固体。Mp 224-225℃. 

(c＝0.1，CH₃OH).IR(KBr)：；ESI/MS(m/z)：425[M-Cl]⁺，459[M-H]^-。 

实验例1 4a-o抗肿瘤细胞增殖活性 

本发明的4a-o均用含0.4％DMSO的细胞培养液配制成所需浓度。使用的HT-29(人结肠癌细胞)、HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)、K562(人慢性粒细胞白血病细胞)、A549(人肺癌细胞)和Bel7402(人肝癌细胞)5株肿瘤细胞均购自美国标准菌种收藏所 (ATCC)。 

96孔细胞培养板和25cm²培养瓶购自Corning Costar公司，RPMI-1640培养基干粉购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司，0.25％胰酶溶液购自Hyclone公司，青霉素和链霉素购自solarbio公司，MTT(四噻唑蓝)购自solarbio公司(溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤除菌后使用，避光保存)，阿霉素(ADR)购自北京华丰联合技术有限公司。每升PBS缓冲液溶液中含有8.2g NaCl，0.2g KCl，1.56g Na₂HPO₄·H₂O和0.2g KH₂PO₄，PH为7.4。 

分别将生长状态良好，处于对数生长期的HT-29，A549和Bel7402细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时待贴壁，按预设的按预设的浓度梯度400μM，40μM，10μM，5μM，1μM，100nM，5nM和1nM加入经灭菌处理的4a-o与0.4％DMSO的细胞培养液的溶液，每孔25μL。对照组加入等体积的0.4％DMSO的细胞培养液。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO(二甲基亚砜)，溶解紫色残留物(甲瓒)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长570nm。按照公式“相对生存率＝(D对照-D试样)/D对照×100％”计算每一个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率。实验平行重复3次，以抑制率对化合物浓度作图，计算样品的IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。 

分别将生长状态良好、处于对数生长期的HL-60和K562细胞以3-5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，按预设的浓度梯度400μM，40μM，10μM，5μM，1μM，100nM，5nM和1nM加入经灭菌处理的4a-o与0.4％DMSO的细胞培养液的溶液，每孔25μL。对照组加入等体积的0.4％DMSO的细胞培养液。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于37℃孵育四个小时，离心，3000rpm/min，5min，小心吸出上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解紫色残留物(甲瓒)，振荡约15min沉淀全部溶解，于酶标仪上测定O.D.(吸收值)，波长570nm。按照公式“相对生存率＝(D对照-D试样)/D对照×100％”计算每一个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率。实验平行重复3次，以抑制率对化合物浓度作图，计算样品的IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。 

结果列入表1。结果表明本发明的4a-o对五种肿瘤细胞都没有明显的细胞毒作用。 

表1 4a-o抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀±SD μM) 

a)n＝18 

实验例2 4a-o体内抗肿瘤活性评价 

无菌条件下抽取接种7天后生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶3)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按细胞浓度＝(4大方格内活细胞数/4)×10⁴稀释倍数＝细胞数/mL和细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞浓度和细胞存活率。 

ICR雄性小鼠(清洁级，体重为20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每12只小鼠一组。将S180活细胞存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1.5×10⁷个/mL的细胞悬液，于ICR雄性小鼠腋皮下接种(0.2mL/只)，造成荷S180实体瘤小鼠并接受治疗。化合物4a-o加少量吐温80助溶后逐渐加生理盐水至所需浓度。化合物4a-o均按1μmol/kg剂量口服给药，每天口服给药一次，连续给药7天。阳性对照为阿霉素加入生理盐水至所需浓度。它的给药剂量均为2μmol/kg，每天腹腔注射1次。连续给药7天。空白对照为等体积生理盐水。治疗至第8天，称小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，并剖取各组小鼠的肿瘤及各主要脏器称 重，最后统计各组药物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。脾指数＝脾重(mg)/处死体重(g)。本实验数据统计均采用t检验和方差分析。实验结果列入表2。 

实验观察到，在低于2μmol/kg剂量下，阿霉素不显示抗肿瘤作用。在2μmol/kg剂量下，阿霉素虽然显示抗肿瘤作用，但是在治疗的第四天小鼠即开始死亡，第五天没有小鼠存活，显示致命性毒性。在存活的4-5天内，小鼠显示躁动和不安等神经毒性症状。相反，1μmol/kg剂量下4a-m，o都显示优秀的抗肿瘤作用。其中1个化合物的活性与阿霉素没有显著性差异，也就是说这个化合物的抗肿瘤活性是阿霉素的2倍。在治疗的8天内，4a-o既没有引起任何小鼠死亡，即没有致命性毒性，也没有引起小鼠出现躁动和不安等神经毒性症状。因而在在致命性毒性和神经毒性方面，4a-o比阿霉素低很多。 

表2 4a-o对荷S180肉瘤小鼠肿瘤重量的影响 

注：a)n＝12，4a-o口腔灌胃给药，ADM腹腔注射给药；a)与NS比较，p＜0.05；b)与NS比较，p＜0.01；c)与阿霉素比较，p＞0.05. 

实验例3 化合物4l体内抗肿瘤活性的量效关系 

按照试验例2的方法，化合物4l选取高、中、低三个剂量，即1μmol/kg、0.1μmol/kg和0.01μmol/kg三个剂量考察化合物的剂量效应依赖关系。结果列入表3。治疗小鼠的肿瘤重表明，4l的抗肿瘤作用显示剂量效应依赖关系。 

表3 4l在不同剂量下对荷S180肉瘤小鼠肿瘤重量的影响 

a)与生理盐水，0.1μmol/kg 4l和0.01μmol/kg 4l比p＜0.01；b)与生理盐水比p＜0.01，与0.01μmol/kg 4l比P＜0.05；b)与生理盐水比P＜0.05。 

Claims (4)

1.通式I代表的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯，式中的R为L-氨基酸的侧链，具体为H，CH₃，CH(CH₃)₂，CH₂CH(CH₃)₂，CH(CH₃)CH₂CH₃，CH₂C₆H₅，CH(OH)CH₃，CH₂CO₂Bzl，CH₂C₆H₄OH-p，(CH₂)₃NHC(NH)NH(NO₂)，CH₂CONH₂，(CH₂)₂CONH₂，Indole-5-yl-CH₂，(CH₂)₂CO₂Bzl或(CH₂)₂SCH₃。

2.制备权利要求1的通式I代表的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯化合物方法，该方法有以下步骤构成：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸；

(2)(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸的3，5-二仲胺基用Boc保护；

(3)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸与15种L-AA-OBzl偶联得到15种(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl；

(4)(6S)-N³，N⁵-di-Boc-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl用4N的氯化氢乙酸乙酯溶液脱Boc得到(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl；

(5)以三乙胺为催化剂(6S)-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-AA-OBzl先在甲醇中与丙酮缩合，后用KMnO₄或H₂O₂氧化得到通式I的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯。

3.权利要求1的通式I代表的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯的体外和体内抗肿瘤活性。

4.权利要求1的通式I代表的15种咪唑并吡啶并咪唑-3-取代乙酸苄酯作为抗肿瘤剂的应用。 

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