CN103374015A - 喜树碱衍生物、其制备方法及其在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了喜树碱衍生物、其制备方法及在制备治疗肿瘤药物中的应用，该喜树碱衍生物具有以下的结构通式，该衍生物、其盐、组合物应用于制备治疗哺乳动物细胞增殖疾病如癌症等药物中。本发明通过自有的药物分子设计，通过对制备合成的化合物进行进一步的生物学体外和体内活性测定，发现其对各种癌症都具有明显的抑制活性，在抑制小鼠肿瘤生长模型中都表现出良好的效果。

Description

喜树碱衍生物、其制备方法及其在制备治疗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及喜树碱衍生物、其制备方法及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症是目前人类健康的头号杀手。2010年卫生部公布的统计数据显示，恶性肿瘤已成为中国人的首要死因，每年死于肿瘤的患者超过100万。而据世界卫生组织（WHO）统计，全世界平均每年死于恶性肿瘤的者近70万，新发病例约870万例，而且每年还在不断增长，死亡率居第二位，仅次于心脑血管疾病。因此，癌症的治疗刻不容缓。

喜树碱(Camptothecin，CPT)是1966年从珙桐科植物喜树中提取的一种细胞毒性生物碱，其结构式如下：

喜树碱属于色氨酸-萜烯类生物碱，经肿瘤实验证明这种色氨酸-萜烯类生物碱具有明显的抗肿瘤活性，尤其对消化道肿瘤、白血病、膀胱癌等活性更强，但它易引起骨髓抑制、呕吐和血尿等副作用，且其不溶于水又难溶于脂，不便于制成适宜的剂型，进一步限制了它的应用。直到1985年的研究证实，CPT是拓扑异构酶Ⅰ的特异性抑制剂，使其又成为抗肿瘤药物研究的热点。通过对CPT环7、9、10、11位的结构改造（见喜树碱结构式），可得到拓扑替康（结构式见图1）、伊立替康、勒托替康、羟基喜树碱等抗肿瘤活性更高、毒性更低的喜树碱类衍生物。两种喜树碱类衍生物，拓扑替康和伊立替康已经在全世界范围内分别用于小细胞肺癌/卵巢癌及大肠直肠癌的治疗，虽然相比喜树碱这两种药品的溶解性更强，但他们的毒性及不良反应仍然很强，包括腹泻、血尿、呕吐、恶心等，这就限制了他们的疗效及用量，目前还未开发出一种口服制剂。不过虽然如此，这两种药物2005年全球销售额仍然很巨大：伊立替康，大肠直肠癌一线药品，销售额达9亿美金；拓扑替康，卵巢癌及小细胞肺癌二线药品，销售额达2亿美金。

世界卫生组织已经把喜树碱衍生物的研究作为抗癌药物的主攻方向之一，各国科学家都在争相合成新的喜树碱类衍生物(CPTs)并进行筛选。目前许多对喜树碱的结构改造主要在7、9、10位上，或在A环上进行变化，又或者把E环打开、扩环以及衍生化。

发明内容

本发明的目的在于提供一类喜树碱衍生物。

本发明的目的还在于提供该类喜树碱衍生物的制备方法。

本发明的目的还在于提供该类喜树碱衍生物及其盐、组合物在抗肿瘤制药中的应用。

本发明的喜树碱衍生物是通过在喜树碱的9，10，20位上进行结构修饰，在保持喜树碱新衍生物的稳定性前提下，提高其生物活性，增加其水溶性，并降低毒性，最终实现提高其体内抗肿瘤的高效性和作为药物的应用。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：

喜树碱衍生物，其化学结构通式（1）如下，也可见图2：

式中，R₁和R₂均为H；

或R₁为(CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)；

或R₁为(CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为异丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)。

上述的喜树碱衍生物的制备方法，R₁和R₂均为H的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

喜树碱的20位的羟基被甘氨酸酯化，甘氨酸的氨基末端再被顺丁烯二酸酐酰化得到在20位连接亲水基团的喜树碱衍生物，其化学结构式（2）如下，其合成路线见图3：

其中，R₁为(CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)或异丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

拓扑替康的10位被丙基磺酸化或被异丙基磺酸化后，接着其20位的羟基被甘氨酸酯化，甘氨酸的氨基末端再被顺丁烯二酸酐酰化得到所提及的10、20位的双酯化的连接亲水基团的拓扑替康衍生物，即为喜树碱衍生物。其中，所述拓扑替康也为喜树碱衍生物，其化学结构式（3）或化学结构式（4）如下，其合成路线见图4～5：

优选的，R₁和R₂均为H的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

1)喜树碱与2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸进行酯化反应，得喜树碱-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯；优选的，喜树碱、2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸的重量比为2：3；

2)将喜树碱-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯用三氟乙酸处理脱去Boc保护基，得喜树碱-2-胺基-乙酸酯；

3)喜树碱-2-胺基-乙酸酯与顺丁烯二酸酐进行N-酰化反应，得目标产物；优选的，喜树碱-2-胺基-乙酸酯与顺丁烯二酸酐的重量比为1.79：1.01。

优选的，R₁为(CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)或异丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

1)对拓扑替康进行磺酰化，采用正丙基磺酰氯或异丙基磺酰氯为磺酰化剂，得磺酰化的拓扑替康；优选的，拓扑替康、正丙基磺酰氯的摩尔比为1：8；优选的，拓扑替康、异丙基磺酰氯的摩尔比为1：15。

2)磺酰化的拓扑替康与2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸进行酯化反应，得磺酰化的拓扑替康-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯；优选的，磺酰化的拓扑替康与2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸的摩尔比为1：5。

3)将磺酰化的拓扑替康-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯用三氟乙酸处理脱去Boc保护基，得磺酰化的拓扑替康-2-胺基-乙酸酯；

4)磺酰化的拓扑替康-2-胺基-乙酸酯与顺丁烯二酸酐进行N-酰化反应，得目标产物。优选的，磺酰化的拓扑替康-2-胺基-乙酸酯与顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：0.3。

本发明所述的喜树碱衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的喜树碱衍生物的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，喜树碱衍生物的组合物由喜树碱衍生物或其药物学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合组成。

本发明所述的喜树碱衍生物的组合物与其他药物合用在制备治疗肿瘤药物中的应用，喜树碱衍生物的组合物由喜树碱衍生物或其药物学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合组成。

优选的，喜树碱衍生物的药学上可接受的盐，包括盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、三氟醋酸盐。

优选的，肿瘤包括小细胞肺癌、直肠癌、乳腺癌、淋巴癌。

本发明的喜树碱衍生物在抑制直肠癌、肺癌、淋巴癌、乳腺癌有更优于上市药物拓扑替康的体外生物活性，在小鼠体内非小细胞肺癌生物活性测试中，用药量更低的情况下表现得比市场用药拓扑替康疗效更好，而且毒性也低于拓扑替康。

因此，本发明的喜树碱衍生物在作为一类低毒、高效的候选新药应用具有广泛前景。

由于喜树碱内酯环有一个分子内氢键，起到了稳定其内酯环的开环形式，因此药物被吸收进入血浆中，喜树碱更多的以开环形式存在，造成了其毒性大等不良反应，其闭环形式的减少也使得喜树碱对靶点－Topoisomerase I的结合能力下降，最终导致其抗肿瘤活性降低。

基于此，本发明通过酯化包括了用亲水基团酯化拓扑替康20位的羟基，以及磺酸化10位羟基，打破其分子内氢键，降低使得喜树碱/拓扑替康衍生物在血浆中开环可能性，保持其闭环形式，最终达到提高这类衍生物的生物活性和降低毒性。

附图说明

图1是拓扑替康分子结构式；

图2是本发明喜树碱衍生物的通式；

图3是本发明喜树碱/拓扑替康衍生物的合成路线一；

图4是本发明喜树碱/拓扑替康衍生物的合成路线二；

图5是本发明喜树碱/拓扑替康衍生物的合成路线三；

图6是实施例1产物的核磁共振氢谱图；

图7是实施例1产物的核磁共振碳谱图；

图8是实施例2产物的核磁共振氢谱图；

图9是实施例2产物的核磁共振碳谱图；

图10是实施例3产物的核磁共振氢谱图；

图11是实施例3产物的核磁共振碳谱图；

图12是三个抑制剂在体外对4种肿瘤细胞的抑制效果；

图13是三个抑制剂不同给药量下对NCI-H460人非小细胞肺癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用（肿瘤重量的变化）；

图14是三个抑制剂不同给药量下对NCI-H460人非小细胞肺癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用（肿瘤体积随时间的变化图）。

具体实施方式

1.药学中可接受的盐

本文所述的“药学上可接受的”指在化合物如盐或赋形剂中缺少不能接受的毒性。碱性化合物能够与各种酸形成不同形式的盐，这些酸被用以制备药学上可接受的盐，这些盐的无机阴离子，包括但并不限于，硫酸根、硫酸氢根，亚硫酸根、硝酸根、亚硝酸根、氯离子、溴离子、碘离子、磷酸根、磷酸(一、二)氢根、异烟酸等；有机阴离子包括醋酸根、乳酸根、草酸根、马来酸根、枸橼酸根、水杨酸根、肉桂酸根、油酸根、富马酸根、酒石(氢)酸根、丙酮酸根、丹宁酸根、三氟醋酸盐、丙酸根、柠檬酸根、泛酸根、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸根、蔗糖盐、甲酸盐、苯酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸根、乙烷磺酸根、苯磺酸根、甲基苯磺酸根、双羟萘酸根等。

所发明的酸式化合物在自然界也可以与药理学上可接受的阳离子形成碱式盐，这些盐包括但并不限于碱土金属、碱性金属，尤其钙离子、镁离子、钠离子、锂离子、锌离子、钾离子、铁离子等等。

2.治疗方法和剂型：

本发明提供了用于治疗或预防癌症的方法，包括制定病人的治疗有效量，化合物或组合物，化合物及其组成，药学上可接受的载体、赋形剂，或稀释剂。该发明的化合物及其组合成分可以治疗或预防癌症包括但不仅限于，如淋巴管肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，腺癌，肾细胞癌，肝癌，子宫颈癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，恶性黑色素瘤，白血病，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病（粒细胞，早幼粒细胞，粒细胞，单核细胞和白血病）；慢性白血病（慢性粒细胞白血病（粒）和慢性淋巴细胞白血病），淋巴癌（霍奇金疾病和非霍奇金疾病），多发性骨髓瘤等等。

本发明的化合物和组合物可以连续地或间断地任何与其他分子相容的方式给药，口服或不经肠道的方式吸收，包括肌肉注射、腹腔、静脉、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、阴道，透皮，直肠，通过吸入或外敷，特别是耳朵，鼻子，眼睛，或皮肤等。也可能是与另一种生物活性剂一起作用。其作用可以是全身或局部。不同的药物输送系统包括了，封装于脂质体、微粒子、微胶囊、胶囊等。

本发明也可以通过使用吸入器或喷雾器，和制成气雾剂，或通过灌注在氟碳化合物或合成的肺表面活性剂。本发明的化合物还可作为栓剂，以传统的粘合剂和载体如甘油三酯。

“药学上可接受”普遍公认的药典所列在动物身上，更尤其是在人类身上载体是指稀释剂，助剂，辅料。这种载体可以诸如水和油。动物，蔬菜或合成来源，如花生油，大豆油，矿物油，香油之类的。载体亦可以为生理盐水，阿拉伯胶，明胶，淀粉糊，滑石粉，角质，胶体二氧化硅等等。此外。辅助剂，稳定剂，增稠剂，润滑剂，着色剂均可以使用。当给病人用药时，发明的化合物成分和药学上可接受载体，赋形剂或稀释剂，最好是无菌的。静脉给药时，水是本发明的化合物是首选的载体。盐、葡萄糖和甘油的溶液也可作为液态载体，特别是注射的方案中。合适的制药载体还包括诸如辅料淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，硅胶，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸，滑石粉，氯化钠，脱脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。目前化合物和组成，如果有需要的话，也可以包含适量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

目前的化合物和组合物可以采取解决方案的形式包括，悬浮物。乳剂，片剂，丸剂，装有液体的颗粒，胶囊，粉末，长控释制剂，栓剂，乳剂。航空溶胶，喷雾剂，悬浮物，或任何其他形式适合使用。

发明的化合物和组成物口服给药可能是在片剂，含片，水的形式或油性悬浮物，颗粒，粉末，乳液，胶囊剂，糖浆的。化合物和组成物口服给药方式也可以制定食品和食品混合。另外在药片或药丸形式的化合物成分可延迟解体和在胃肠道吸收，从而提供持续一个较长时期的效果。时间延迟材料包括如甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸。口服成分可以包括标准医药级别的载体如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等等。

2.1联合治疗

本发明的化合物可同时与一个或多个其他的治疗药物，用于哺乳动物，尤其人类。当结合使用其他治疗，如其他抗癌化合物，该化合物和治疗剂的加法可以充当或更好的协同作用。发明的化合物与其他治疗药物可以是同样的组成，或是分开的组合，之前或之后的用药方式。对于许多慢性疾病治疗，其体现就在于一个综合疗法与交互组合的用药方式，例如，以尽量减少特定的药物毒性。在某些情况，当发明的组成与另一种治疗剂或试剂使用可能产生的副作用，包括，但不仅限于毒性，可以降低治疗剂剂量以低于阈值达到降低所引起的不良副作用。

可用于与本发明的化合物组合的抗癌药物包括但不仅限于：阿西维辛；阿克拉霉素盐酸阿考达唑盐酸；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌醋酸；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；马利兰；卡铂；卡莫司汀；顺铂；克拉屈滨；阿糖胞苷；达卡巴嗪；紫杉醇；多西紫杉醇；盐酸阿霉素；屈洛昔芬柠檬酸；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟脲嘧啶；吉西他滨盐酸；吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；环磷酰胺；伊立替康；兰瑞肽醋酸曲唑；洛莫司汀；醋酸甲地孕酮；醋酸美伦；马法兰；甲氨蝶呤钠；噻氨酯哒唑；嘌呤盐酸；链黑菌素；替尼泊苷；硫酸长春碱；长春地辛硫酸；酒石酸长春瑞滨等等。

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。

实施例1

一种喜树碱衍生物，化学名为：20-{[(2Z)-3-羧基-2-丙烯酰基]氨基}乙酰氧基喜树碱，其化学结构式如下：

上述喜树碱衍生物的制备方法，包括如下步骤，其合成路线见图3：

将喜树碱(化合物60，1.2g，3.45mmol)水溶液、三氟甲磺酸钪盐(1.018g，2.07mmol)、二甲氨基吡啶(DMAP，1.264g，10.3mmol)、80mL无水二氯甲烷（DCM）混合后，在冰盐浴中冷却至-8℃，30min后加入1.8g(10.3mmol)2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸，在-8℃搅拌30min，加入3.557g(17.2mmol)二环己基碳二亚胺（DCCI），继续在-8℃搅拌30min，然后室温放置24h，过滤反应混合物，依次用2×30mL0.1N的盐酸，30mL蒸馏水，30mL饱和NaCl溶液洗涤。滤液的有机相用无水MgSO₄干燥，然后再次过滤，旋蒸得到固体，以甲醚重结晶固体得到收率为91％的1.58g产物－化合物65。化合物65由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合。

向1.58g的化合物65中依次加入20mL二氯甲烷、6mL三氟乙酸，搅拌30分钟，搅拌中溶液颜色由亮黄色变成深绿色，蒸发混合物并加入甲苯以除去残留的三氟乙酸。用乙醚结晶得到固体，过滤所得到棕黄色固体，再用甲醇重结晶得到1.973g黄色产物－化合物70。化合物70由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合。

将化合物70（1.793g，3.45mmol）的水溶液、1.606g（17.2mmol）甲基吡啶，1.014g（20.7mmol）顺丁烯二酸酐加入到25mL DMF中，冰浴至0℃并搅拌8h，然后旋蒸溶液得到固体，再采用硅胶柱层析得到0.85g终产物－化合物1，收率49%。化合物1结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图6和图7，表征数据如下：

mp250－252℃，

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.89(s,1H),9.29(s,1H),8.62(s,1H),8.17(d,J=8.3Hz,1H),8.06(d,J=8.0Hz,1H),7.83(t,J=7.4Hz,1H),7.67(t,J=7.2Hz,1H),7.17(s,1H),6.37(d,J=12.3Hz,1H),6.28(d,J=12.3Hz,1H),5.50(s,2H),5.20(s,2H),4.38(dd,J=18.0,5.4Hz,1H),4.20(dd,J=18.0,5.3Hz,1H),2.16(t,J=6.5Hz,2H),0.93(t,J=6.9Hz,3H).

¹³C NMR(500MHz;DMSO-d6)δ：7.95,30.85,41.14,50.61,66.79,77.03,95.64,119.39,128.11,128.40,128.91,129.38,130.13,130.55,130.82,132.01,133.07,145.50,146.45,148.35,152.71,156.95,165.90,166.43,167.41,168.76.

实施例2

一种喜树碱衍生物，化学名为：20-{[(2Z)-3-羧基-2-丙烯酰基]氨基}乙酰氧基-10-丙磺酰氧基-9-(二甲氨基)甲基喜树碱，其化学结构式如下：

上述喜树碱衍生物的制备方法，包括如下步骤，其合成路线见图4：

将拓扑替康(化合物80，0.2g，0.44mmol)、二甲氨基吡啶(0.04g，0.33mmol)混合，然后溶解在10mL DMF，将溶液降温至0℃，加入0.62mL三乙胺，然后逐滴加入5mL正丙基磺酰氯（0.40mL，3.52mmol）水溶液，在0℃磁力搅拌下反应6h后，加20mL水至反应混合液，用20mL×3次二氯甲烷萃取，用10％盐酸将溶液层pH调至7，然后抽滤所析出的固体得到0.11g亮黄色化合物85（图4），收率55％。化合物85结构被核磁氢谱和碳谱确定，mp94－96℃。

将0.4g（0.76mmol）的化合物85、0.224g（0.456mmol）三氟甲磺酸钪盐、0.278g（2.28mmol）二甲氨基吡啶、60mL无水二氯甲烷混合后，在冰盐浴中冷却至-8℃，30min后加入0.664g(3.80mmol)2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸，在-8℃磁力搅拌30min，加入1.1g(5.3mmol)二环己基碳二亚胺（DCCI），继续在-8℃搅拌30min，然后室温放置24h，抽滤反应混合物，滤液的有机相用无水MgSO4干燥，然后再次过滤，旋蒸得到固体。以甲醚重结晶固体得到收率为92.2％的0.48g产物－化合物90。其由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合。

向0.48g的化合物90中依次加入20mL二氯甲烷、4mL三氟乙酸，搅拌30min，搅拌中溶液颜色由黄色变成深黄色，蒸发混合物并加入甲苯以除去残留的三氟乙酸，用乙醚结晶得到固体，抽滤所得到棕黄色固体，再用甲醇重结晶得到0.55g黄色产物－化合物95，由核磁氢谱和碳谱确定结构吻合。

将化合物95（0.53g，0.76mmol）的水溶液、0.28g（0.23mmol）甲基吡啶、0.224g（0.228mmol）顺丁烯二酸酐加入到20mL DMF中，冰浴至0℃并搅拌6h，然后旋蒸溶液得到固体，再用硅胶柱层析得到0.26g终产物－化合物2，收率50%。化合物2结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱和碳谱图分别见图8和图9，表征数据如下：

mp195－196℃，

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.62(s,1H),9.04(s,1H),8.22(d,J=9.3Hz,1H),7.84(d,J=9.3Hz,1H),7.19(s,1H),6.31(d,J=12.4Hz,1H),6.25(d,J=12.4Hz,1H),5.50(s,2H),5.32(m,2H),4.36(dd,J=18.1,5.6Hz,1H),4.17(dd,J=18.0,5.5Hz,1H),3.94(s,2H),3.80–3.73(m,2H),2.22(s,6H),2.15(dt,J=10.7,7.0Hz,2H),1.95(dd,J=15.0,7.5Hz,2H),1.10(t,J=7.4Hz,3H),0.92(t,J=7.3Hz,3H).

¹³C NMR(300MHz;DMSO-d₆)δ：7.98,12.91,17.64,30.71,41.04,45.33,50.97,53.13,53.63,66.74,76.95,95.85,119.59,125.50,128.10,128.87,130.10,130.46,130.68,131.07,133.80,145.46,146.17,146.21,147.03,153.06,156.92,165.90,166.75,167.47,168.88.

实施例3

一种喜树碱衍生物，化学名为：20-{[(2Z)-3-羧基-2-丙烯酰基]氨基}乙酰氧基-10-异丙磺酰氧基-9-(二甲氨基)甲基喜树碱，其化学结构式如下：

上述喜树碱衍生物的制备方法，包括如下步骤，其合成路线见图5：

将拓扑替康(化合物80，0.2g，0.44mmol)、二甲氨基吡啶(0.04g，0.33mmol)混合，然后溶解在10mL DMF，将溶液降温至0℃，加入0.92mL三乙胺，然后逐滴加入5mL异丙基磺酰氯（0.76mL，6.60mmol）水溶液，在0℃磁力搅拌下反应5h后，加30mL水至反应混合液，用20mL×3次二氯甲烷萃取，用10%盐酸将溶液层pH调至7，然后抽滤所析出的固体得到0.14g亮黄色化合物105，收率70％。化合物105结构被核磁氢谱和碳谱确定，mp142－144℃。

将0.2g（0.38mmol）的化合物105、0.112g（0.23mmol）三氟甲磺酸钪盐、0.139g（1.14mmol）二甲氨基吡啶、30mL无水二氯甲烷混合后，在冰盐浴中冷却至-8℃，30min后加入0.332g(1.90mmol)2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸，在-8℃磁力搅拌30min，加入0.548g(2.65mmol)二环己基碳二亚胺（DCCI）继续在-8℃搅拌30min，然后室温放置24h，抽滤反应混合物，滤液的有机相用无水MgSO₄干燥，然后再次过滤，旋蒸得到固体，以甲醚重结晶固体得到收率为96.12％的0.25g产物－化合物110。化合物110由核磁氢谱和碳谱确定其结构吻合。

向0.25g的化合物110中依次加入10mL二氯甲烷、2mL三氟乙酸，搅拌30min，搅拌中溶液颜色由黄色变成深绿色，蒸发混合物并加入甲苯蒸发以除去残留的三氟乙酸。用乙醚结晶得到固体，抽滤所得到棕黄色固体，再用甲醇重结晶得到0.264g黄色产物－化合物115。化合物115由核磁氢谱和碳谱确定其结构吻合。

将化合物115（0.264g，0.38mmol）的水溶液、0.141g（0.152mmol）甲基吡啶、0.112g（0.114mmol）顺丁烯二酸酐加入到10mL DMF中，冰浴至0℃并搅拌6h，然后旋蒸溶液得到固体，再用硅胶柱层析得到0.11g终产物－化合物3，收率42%。化合物3结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱和碳谱图分别见图10和图11，表征数据如下：

mp173－175℃。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.82(s,1H),9.03(s,1H),8.22(d,J=9.3Hz,1H),7.81(d,J=9.3Hz,1H),7.19(s,1H),6.29(d,J=12.5Hz,1H),6.25(d,J=12.5Hz,1H),5.50(s,2H),5.36–5.25(m,2H),4.35(dd,J=17.8,4.0Hz,1H),4.17(dd,J=17.9,3.9Hz,1H),4.03(m,1H),3.95(s,2H),2.23(s,6H),2.15(m,2H),1.54(d,J=6.8Hz,6H),0.92(t,J=7.3Hz,3H).

¹³C NMR(300MHz;DMSO-d₆)δ：7.96,16.92,30.69,41.08,45.23,50.94,53.42,53.86,66.72,76.93,95.96,119.58,125.55,127.83,128.85,130.04,130.43,130.66,131.17,134.13,145.55,145.94,146.11,146.97,153.01,156.95,165.99,167.00,167.50,168.90.

下面结合实验对本发明的应用作进一步的说明，但并不局限如此。

(1)制备得到的喜树碱/拓扑替康衍生物的体外抗肿瘤活性实验

实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对肿瘤细胞的杀伤效果。

实验步骤：

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度为1000-10000个/孔（边缘孔用无菌PBS填充）；将96孔板放在5%CO2，37℃培养箱中孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天晚上铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔5μL，设3-5个平行孔；5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察；每孔加入20μL MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪在490nm处测量各孔的吸光值。

4种药物分别用于检测4种肿瘤细胞的抗癌细胞活性，4种药物分别为：1）化合物1：实施例1喜树碱衍生物；2）化合物2：实施例2喜树碱衍生物；3）化合物3：实施例3喜树碱衍生物；4）拓扑替康。4种肿瘤细胞为：1）HT-29，Human Colorectal；2）Lewis Lung，Mouse Lung；3）P388，Mouse Lymphoma；4）MCF-7，Human Breast。实验结果如下表1及图12所示。

表1喜树碱/拓扑替康衍生物的体外抗肿瘤活性

图12显示了三种喜树碱衍生物和拓扑替康对四种不同肿瘤的体外抑制活性，纵坐标为IC₅₀，由表1及图12均可知，体外MTT试验检测这些化合物对四种主要肿瘤细胞株（乳腺癌、肺癌、结肠癌及淋巴癌）的抗肿瘤活性。化合物3对四种肿瘤都显示出强于拓扑替康的活性，而另外两种衍生物的抗肿瘤活性也具有等同于或略优上市药拓扑替康。

(2)制备得到的喜树碱/拓扑替康衍生物的体内抗肿瘤活性实验

移植瘤：人非小细胞肺癌NCI-H460裸小鼠移植瘤，由人非小细胞肺癌NCI-H460细胞株接种于裸小鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为1×10⁶，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代后使用。

实验方法：取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～300mm³后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周2次，每次测量时同时称鼠重。化合物1组每周腹腔注射给药（实施例1喜树碱衍生物）2次，化合物2组每周静脉给药（实施例2喜树碱衍生物）2次，化合物3组每周静脉给药（实施例3喜树碱衍生物）2次，Topotecan对照组每周静脉给药（拓扑替康）2次，阴性对照组同时给等量生理盐水。给药4周后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：

TV=1/2×a×b²

其中a、b分别表示长、宽。

表2各化合物对NCI－H460人非小细胞肺癌裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用(X±SD，n=8)

与空白组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

各化合物对人非小细胞肺癌裸小鼠移植瘤NCI-H460实验性治疗结果见表及图13～14。图13为对非小细胞肺癌裸小鼠移植瘤同时用药包括三种喜树碱衍生物和拓扑替康四周之后的肿瘤重量比较，图14为用药四周之内肿瘤体积的变化过程。实验结果显示，本发明的喜树碱衍生物对人非小细胞肺癌NCI-H460裸小鼠移植瘤均有一定的生长抑制作用。其中，化合物3静脉给药1.56mg/kg、0.78mg/kg剂量时，对人非小细胞肺癌NCI-H460的抑瘤率分别达55.8％和46.4％，化合物2静脉给药5.0mg/kg、2.5mg/kg剂量时，对人非小细胞肺癌NCI-H460的抑瘤率分别达49.7％和43.2％，化合物1腹腔注射给药0.625mg/kg、0.3125mg/kg剂量时，对人非小细胞肺癌NCI-H460的抑瘤率分别达42.5％和39.9％，同样条件下拓扑替康(Topotecan)以2.0mg/kg静脉注射时对人非小细胞肺癌NCI-H460的抑瘤率为48.7％。化合物3在用药剂量更小的而且对小鼠无毒的情况下有明显优于市场用药拓扑替康(Topotecan)的效果，化合物1在用药剂量远小于拓扑替康(Topotecan)也呈现了抗肿瘤效果，化合物2在无毒剂量的抗肿瘤作用也与拓扑替康相当，三个抑制剂都呈现了一定的剂量效应关系。此外，三种化合物对小鼠体重增长均有一定抑制作用。

本发明的三种喜树碱衍生物对NCI-H460人非小细胞肺癌的抗肿瘤作用由强到弱的次序为化合物3>化合物2>化合物1。以上数据和分析证实了新制备的三种新型喜树碱/拓扑替康类衍生物相较于上市的拓扑替康，降低了毒性，提高了生物活性，将可为非常有前景的候选新药。

Claims (9)

1.喜树碱衍生物，其化学结构通式（1）如下： 

（1）

式中，R₁和R₂均为H；

或R₁为 (CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)；

或R₁为(CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为异丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)。

2.权利要求1所述的喜树碱衍生物的制备方法，其中，R₁和R₂均为H的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

喜树碱的20位的羟基被甘氨酸酯化，甘氨酸的氨基末端再被顺丁烯二酸酐酰化得到在20位连接亲水基团的喜树碱衍生物；

其中，R₁为 (CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)或异丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

拓扑替康的10位被丙基磺酸化或被异丙基磺酸化后，接着其20位的羟基被甘氨酸酯化，甘氨酸的氨基末端再被顺丁烯二酸酐酰化得到所提及的10、20位的双酯化的连接亲水基团的拓扑替康衍生物，即为喜树碱衍生物。

3.根据权利要求2所述的喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于：R₁和R₂均为H的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

1)喜树碱与2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸进行酯化反应，得喜树碱-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯；

2)将喜树碱-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯用三氟乙酸处理脱去Boc保护基，得喜树碱-2-胺基-乙酸酯； 

3)喜树碱-2-胺基-乙酸酯与顺丁烯二酸酐进行N-酰化反应，得目标产物。

4.根据权利要求2所述的喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于：R₁为 (CH₃)₂-N-CH₂-，R₂为丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)或异丙基磺酸(CH₃CH₂CH₂SO₃-)的喜树碱衍生物的制备方法，步骤如下：

1)对拓扑替康进行磺酰化，采用正丙基磺酰氯或异丙基磺酰氯为磺酰化剂，得磺酰化的拓扑替康；

2)磺酰化的拓扑替康与2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸进行酯化反应，得磺酰化的拓扑替康-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯；

3)将磺酰化的拓扑替康-2-(叔丁氧基-羰基酰胺基)-乙酸酯用三氟乙酸处理脱去Boc保护基，得磺酰化的拓扑替康-2-胺基-乙酸酯； 

4)磺酰化的拓扑替康-2-胺基-乙酸酯与顺丁烯二酸酐进行N-酰化反应，得目标产物。

5.权利要求1所述的喜树碱衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。

6.权利要求1所述的喜树碱衍生物的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，喜树碱衍生物的组合物由喜树碱衍生物或其药物学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合组成。

7.权利要求1所述的喜树碱衍生物的组合物与其他药物合用在制备治疗肿瘤药物中的应用，喜树碱衍生物的组合物由喜树碱衍生物或其药物学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合组成。

8.根据权利要求5～7任一项所述的应用，其特征在于：喜树碱衍生物的药学上可接受的盐，包括盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、甲基苯磺酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、三氟醋酸盐。

9.权利要求5～7任一项所述的应用，其特征在于：肿瘤包括小细胞肺癌、直肠癌、乳腺癌、淋巴癌。

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