CN103431128B - 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法 - Google Patents
一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及食品与饮料营养领域，具体是一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：以古尼拟青霉为出发菌株，采用茶叶、麸皮、葡萄糖、碳酸钙、水组成发酵培养基，生物转化茶咖啡因。本发明方法以茶叶为主要培养基质，将茶叶中咖啡因部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤，丰富了茶叶中的生理活性物质，可开发茶饮料新品种。方法简单，原料易得，成本低，适合大面积推广，绿色环保。
Description
技术领域
本发明属于食品与饮料营养领域，具体涉及一种茶咖啡因生物转化方法。
背景技术
生物碱是一类含氮杂环的碱性天然有机物，广泛存在于植物体内，大多数具有重要的医疗价值。咖啡因、茶碱、1,7二甲基黄嘌呤和可可碱是黄嘌呤甲基衍生物，它们的母体结构相同，只是甲基取代基的数目和位置不同。这些天然甲基黄嘌呤类生物碱具有兴奋中枢神经系统、心脏和骨骼肌，舒张血管，松弛平滑肌和利尿等生理作用，普遍存在于茶叶、咖啡、可可、糖果等各种食品当中。其制品近年来在食品工业中更是得到了日益广泛的应用，但过量摄入以上四种物质均会产生一定的毒副作用。乌龙茶等茶叶中咖啡因含量极高，而其它黄嘌呤甲基衍生物含量极少，或没有。随着生活水平的提高，人们越来越追求健康的生活方式，由于咖啡因对特殊人群(如孕妇、儿童、老年人和心脏病、失眠症、神经衰弱者)有一定的危害，近年来国外市场已有很多低咖啡因或脱咖啡因茶饮料，让这类人群既能享受到饮茶的乐趣，又尽可能减少咖啡因对健康带来的不利影响。因此，脱咖啡因技术日益受到国内外科研人员的重视。
目前，主要采用直接法去除咖啡因，即通过有机溶剂萃取、水浸提和超临界ＣＯ2处理等方法。有机溶剂法会改变茶叶的色、香、味、形，尤其是不可避免地存在有机溶剂残留，对人体健康构成危害。水浸提法咖啡因脱除率较低，而且茶叶风味受到较大损失。超临界二氧化碳处理法脱除咖啡因的同时，也脱除了茶中的芳香和风味物质，使得所生产的脱咖啡因茶的品质明显下降，且过程复杂，设备成本较高。国外对微生物降解咖啡因的研究发现，细菌类的假单胞菌(Pseudomonas)和沙雷氏菌属(Serratia genus) 以及真菌类的青霉菌(Penicillium sp．)，曲霉菌(Aspergillus sp．)降解咖啡因的效果较好。Ramarethinam等人在茶树叶表面喷洒苔状细菌(Bacillus licheniformis)悬浮液可以有效降低茶鲜叶的咖啡因含量而不影响茶鲜叶其他有效成分的质量。目前，微生物降解咖啡因的研究还没有实用性进展，于是研制一种利用微生物降解茶叶中咖啡因的方法具有十分重要的意义。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）生物转化茶叶中咖啡因的方法。
本发明采取的技术方案如下：
一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：以古尼拟青霉为出发菌株，采用茶叶、麸皮、葡萄糖、碳酸钙、水组成发酵培养基，生物转化茶咖啡因，包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用古尼拟青霉为出发菌株，将其划线接种于试管斜面,培养成熟，准备移种；
（2）种子液制备：直接挑取活化后的菌体，接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的三角瓶中，摇瓶培养，制备古尼拟青霉种子液；
（3）生物转化过程：将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中，在古尼拟青霉生长发酵作用下，茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤；
所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量，接入发酵培养基中，在25-28 ℃下恒温培养20-50d, 自然pH值。
所述发酵培养基干物质的组成为茶叶60－85%、麸皮占10-35%、葡萄糖2－10%、碳酸钙1－5%，所述水与干物质比重为100:（55-75）。
所述的灭菌为121 ℃下，高压灭菌30-60min。
本发明利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法与现有技术相比，所产生的有益效果是：
本发明利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因，不仅降低了茶叶中咖啡因的含量，也丰富了茶叶中生理活性物质种类。目前，主要采用直接法去除咖啡因，即通过有机溶剂萃取、水浸提和超临界ＣＯ2处理等方法。这些方法有无法避免的缺陷，如有机溶剂残留，过程复杂，设备成本较高等。本发明利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，易于掌握、简单实用、绿色环保，适用于规模化的生产，也适用于食品行业。对比于现有技术中的降低咖啡因的做法，本发明方法的优点在于生物转化所具有的的高效性、安全性与经济性等。通过试验证明，在古尼拟青霉固体发酵作用下，可以改善茶叶中的生理活性物质种类，减少咖啡因在茶叶中的含量，使其部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤。
附图说明
附图1为咖啡因的化学分子结构式。
附图2为1,7二甲基黄嘌呤的晶体结构。
附图3为茶碱的晶体结构。
附图4 为古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的TLC分析。其中字母C代表咖啡因，字母P代表1,7二甲基黄嘌呤，字母T代表茶碱。1为古尼拟青霉固体发酵茶提取物的TLC展开图谱，2、3、4、5依次分别为茶、菌茶培养基、古尼拟青霉接种液的菌茶培养基及古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物的提取物的TLC展开图谱，用碘化铋钾试剂显色结果表明，茶的咖啡因（C）经古尼拟青霉固体发酵后，一部分咖啡因转化为茶碱（T）和1,7二甲基黄嘌呤（P）。
附图5为古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的HPLC分析。其中字母C代表咖啡因，字母P代表1,7二甲基黄嘌呤，字母T代表茶碱。1表示3种生物碱的HPLC图谱，咖啡因、1,7二甲基黄嘌呤和茶碱保留时间分别为21.307min、12.992 min和11.408 min；2－4依次为古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物、茶培养基质及古尼拟青霉固体发酵茶提取物的HPLC图谱。HPLC分析表明，茶咖啡因（C）经古尼拟青霉发酵后，转化为茶碱（T）和1,7二甲基黄嘌呤（P）。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：以古尼拟青霉为出发菌株，采用红茶茶叶、麸皮、葡萄糖、碳酸钙、水组成发酵培养基，生物转化茶咖啡因，包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用古尼拟青霉为出发菌株，将其划线接种于试管斜面,培养成熟，准备移种；
（2）种子液制备：直接挑取活化后的菌体，接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的三角瓶中，摇瓶培养，制备古尼拟青霉种子液；
（3）生物转化过程：将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中，在古尼拟青霉生长发酵作用下，茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤；
所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量，接入发酵培养基中，在25℃下恒温培养50d, 自然pH值。
所述发酵培养基干物质的组成为红茶茶叶60g、麸皮占10g、葡萄糖2g、碳酸钙1g，所述水与干物质比重为100:55。
所述的灭菌为121 ℃下，高压灭菌30min。
实施例2
一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：以古尼拟青霉为出发菌株，采用绿茶茶叶、麸皮、葡萄糖、碳酸钙、水组成发酵培养基，生物转化茶咖啡因，包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用古尼拟青霉为出发菌株，将其划线接种于试管斜面,培养成熟，准备移种；
（2）种子液制备：直接挑取活化后的菌体，接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的三角瓶中，摇瓶培养，制备古尼拟青霉种子液；
（3）生物转化过程：将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中，在古尼拟青霉生长发酵作用下，茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤；
所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量，接入发酵培养基中，在26 ℃下恒温培养35d, 自然pH值。
所述发酵培养基干物质的组成为绿茶茶叶70g、麸皮占25g、葡萄糖6g、碳酸钙3g，所述水与干物质比重为100:60。
所述的灭菌为121 ℃下，高压灭菌45min。
实施例3
一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：以古尼拟青霉为出发菌株，采用红茶茶叶、麸皮、葡萄糖、碳酸钙、水组成发酵培养基，生物转化茶咖啡因，包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用古尼拟青霉为出发菌株，将其划线接种于试管斜面,培养成熟，准备移种；
（2）种子液制备：直接挑取活化后的菌体，接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的三角瓶中，摇瓶培养，制备古尼拟青霉种子液；
（3）生物转化过程：将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中，在古尼拟青霉生长发酵作用下，茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤；
所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量，接入发酵培养基中，在28 ℃下恒温培养50d, 自然pH值。
所述发酵培养基干物质的组成为红茶茶叶85g、麸皮占35g、葡萄糖10g、碳酸钙5g，所述水与干物质比重为100:75。
所述的灭菌为121 ℃下，高压灭菌60min。
实施例4
一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：以古尼拟青霉为出发菌株，采用乌龙茶茶叶、麸皮、葡萄糖、碳酸钙、水组成发酵培养基，生物转化茶咖啡因，包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用古尼拟青霉为出发菌株，将其划线接种于试管斜面,培养成熟，准备移种；
（2）种子液制备：直接挑取活化后的菌体，接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的三角瓶中，摇瓶培养，制备古尼拟青霉种子液；
（3）生物转化过程：将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中，在古尼拟青霉生长发酵作用下，茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤；
所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量，接入发酵培养基中，在28 ℃下恒温培养50d, 自然pH值。
所述发酵培养基干物质的组成为乌龙茶茶叶250g、麸皮占100g、葡萄糖20g、碳酸钙5g，所述水与干物质比重为100:75。
所述的灭菌为121 ℃下，高压灭菌60min。
实验1 茶叶中生物转化前后咖啡因定量对比的实验
1）以茶叶为主要培养基质的古尼拟青霉固体发酵
以实施例4展开说明，配制茶基质固体培养基（配方：250g乌龙茶、100g麸皮、20g葡萄糖和5g碳酸钙），加水混匀，分装于250mL的三角瓶，取其中一瓶接种5mL已活化好的古尼拟青霉菌液作为对照，也在121 ℃下灭菌30min。培养基冷却后，接种5mL已活化好的古尼拟青霉菌液，于25 ℃的恒温培养箱中静置培养35d。
2）古尼拟青霉固体发酵茶有机粗提物的制备
将静置培养好的古尼拟青霉固体发酵茶取出，于50℃下烘干、称取200g，加入甲醇浸泡三次，获得粗提物12.12g，先将粗提物用乙酸乙酯:水（1:1）萃取后，往水相中加入等体积的正丁醇，正丁醇相用旋转蒸发仪浓缩蒸干，获得正丁醇提取物2.53g。
3）古尼拟青霉固体发酵茶中的咖啡因、茶碱和1,7二甲基黄嘌呤的分离
取2）所述的古尼拟青霉固体发酵茶正丁醇相粗提物1.5g，用适量甲醇溶解后经凝胶柱（120g）层析，甲醇洗脱，流速约为15-20s/drop，每管收集3mL，后经TLC检测分析后合并得到组分GN1 (181.4mg)和GN2（52.7mg）。
GN1经适量甲醇充分溶解后，用反相硅胶（30g）柱层析，10%、20%、30%、100%的甲醇分别各洗脱500mL，流速控制为12 mL/min，后经TLC检测后，在10%甲醇洗脱出来的组分GN1.1（112.4mg）。GN1.1（112.5mg）13mg，经正相硅胶（0.6g）柱层析，氯仿-甲醇（100:1）洗脱200mL，每试管大约收集10mL，得到的GN.1.1.1（11.3mg）。GN1.1.1（11.3mg）用适量甲醇充分溶解后，经凝胶柱层析甲醇洗脱，流速约为15-20s/drop，每管收集3mL，经TLC检测分析后得到纯化合物JCN-1（9.3mg），经核磁共振波谱测定，化合物JCN-1的1H NMR(500 MHz， CD3OD)：δ 7.86 (s, 1H, H-8), δ 3.34(s, N1-CH3), δ 3.52 (s,1H, N3-CH3), δ 3.98 (s,1H, N7-CH3)，化合物JCN-1的13C NMR(500 MHz, CD3OD)：δ(149.8,C-2), δ(153.2, C-4), δ(108.7,C-5), δ(156.7, C-6), δ(140.2,C-5), δ(144.0,C-6), δ(30.1,N1-CH3), δ(33.9, N3-CH3), δ(28.2, N7-CH3)，经与文献比较将化合物JCN-1确定为咖啡因，如图1所示。
GN2经适量甲醇充分溶解后，用反相硅胶（30g）柱层析，30%、50%、70%、100%的甲醇分别各洗脱500mL，流速控制为12mL/min，经TLC检测后，在30%甲醇洗脱出来的组分GN2.1（39.3mg）。GN2.1（39.3mg）27mg，经正相硅胶（0.7g）柱层析，石油醚-丙酮（5:1）洗脱500mL，每试管大约收集10mL，经TLC检测分析，合并得到组分GN2.1.1和GN2.1.2。GN2.1.1经反相硅胶（10g）柱层析，10%甲醇洗脱500mL，流速控制为12 mL/min，经TLC检测分析得纯化合物JCN-2.1（2.3mg），经晶体衍射分析鉴定，化合物JCN-2.1为1,7二甲基黄嘌呤，如图2所示。GN.2.1.2经反相硅胶（30g）柱层析，10%甲醇洗脱500mL，流速控制为12mL/min，经TLC检测分析获得纯化合物JCN-2.2（17.1mg），经晶体衍射分析鉴定，化合物JCN-2.2为茶碱，如图3所示。
4）古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的TLC分析
取培养所用的茶20g、高压灭活的菌茶培养基20g、高压灭活含有古尼拟青霉接种液的菌茶培养基20g及古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物（用40℃旋转蒸发仪蒸干），按照2）所述的方法制备这4种提取物作为对照。将古尼拟青霉固体发酵茶提取物与4种提取物一起作TLC分析，用氯仿：甲醇（10:1）为展开剂，碘化铋钾试剂（2 mL的0.6 mol/L HCl溶液中加入碘化铋钾1g，再加水至10 mL，摇匀）为显色剂，使用时将薄层板浸于碘化铋钾试剂溶液中，水冲洗后观察。结果如图4所示，茶的咖啡因经古尼拟青霉固体发酵后，一部分咖啡因转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤，丰富了茶叶中生物碱种类，平衡优化了茶叶中各生物碱的含量。
同样的，对实施例1、2和3也做了相应实验，实验结果与实施例4的实验结果无明显差别，故在此不作复述。
5）古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的HPLC分析
将菌茶分离到的3个化合物咖啡因、茶碱和1,7二甲基黄嘌呤分别配成1 mg/mL甲醇溶液。将4）所述的茶、高压灭活的菌茶培养基、高压灭活含有古尼拟青霉接种液的菌茶培养基及古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物的4种提取物，分别用甲醇配成10mg/mL，用0.2 um有机滤膜过滤后，进行HPLC分析，用含有0.1%甲酸的20%甲醇为洗脱剂，流速为1 mL/min，紫外吸收值为270 nm。化合物咖啡因、茶碱和1,7二甲基黄嘌呤的保留时间分别为21.307min、12.992 min和11.408 min。HPLC分析表明如图5所示，茶咖啡因经古尼拟青霉发酵后，转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤。
同样的，对实施例1、2和3也做了相应实验，实验结果与实施例4的实验结果无明显差别，故在此不作复述。
Claims (2)
1.一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：以古尼拟青霉为出发菌株，采用茶叶、麸皮、葡萄糖、碳酸钙、水组成发酵培养基，生物转化茶咖啡因，包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用古尼拟青霉为出发菌株，将其划线接种于试管斜面,培养成熟，准备移种；
（2）种子液制备：直接挑取活化后的菌体，接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的三角瓶中，摇瓶培养，制备古尼拟青霉种子液；
（3）生物转化过程：将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中，在古尼拟青霉生长发酵作用下，茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和1,7二甲基黄嘌呤；
所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量，接入发酵培养基中，在25-28 ℃下恒温培养20-50d, 自然pH值；
所述发酵培养基干物质的组成为茶叶65－85%、麸皮占10-35%、葡萄糖2－10%、碳酸钙1－5%，所述水与干物质比重为100:（55-75）。
2.根据权利要求1中的一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法，其特征在于：步骤（3）所述的灭菌为121 ℃下，高压灭菌30-60min。
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