CN103417971A - 二肽基肽酶抑制剂和b族维生素的药物组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂和B族维生素的药物组合物，由治疗有效量的DPP-4抑制剂及其药用前体、活性代谢产物或盐类中的一种、治疗有效量的B族维生素的一种或多种、和药学上可接受的载体组成；其中，DPP-4抑制剂的含量为2～200mg，B族维生素的含量为0.01～50mg。本发明还涉及该组合物在制备治疗糖尿病药物中的用途。由本发明提供的药物组合物制成的药物，在有效降低血糖的基础上，还具有明显的预防或改善糖尿病血管病变并发症的有益效果，因此是更适宜的抗糖尿病药物。

Description

二肽基肽酶抑制剂和B族维生素的药物组合物及用途

技术领域

本发明涉及一种含有二肽基肽酶-4抑制剂和B族维生素的药物组合物及其用途，尤指一种治疗糖尿病、防治糖尿病血管病变并发症的化学药组合物，属于药学领域。

背景技术

糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其特点是慢性高血糖伴随因胰岛素分泌不足和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。据流行病学调查，我国糖尿病患病率高达9.7％，估算全国成年糖尿病患者总数达9240万人【Yang W，et al.Prevalence ofdiabetes among men and women in China.N Engl J Med.2010；362：1090-1101】。另外，根据国际糖尿病联盟(Intemational Diabetes Federation，IDF)统计，2010年全球糖尿病患者达2.85亿，预计到2030年全球将有近5亿人患糖尿病。因此，糖尿病已是一个严重的公共卫生问题。

糖尿病随病程进展常发生血管并发症，包括大血管病变和微血管病变，导致心、脑、肾、眼等器官的慢性进行性损害，糖尿病的危害主要来自这些并发症。据中华医学会糖尿病分会的报道，我国糖尿病血管并发症的患病率为：高血压31.9％、脑血管病12.2％、心血管病15.9％、下肢血管病5.0％、肾脏病(肾微血管病变)33.6％、视网膜病变24.3％，总患病率73.2％【中华医学会糖尿病分会慢性并发症调查组.全国住院糖尿病患者慢性并发症及其相关危险因素10年回顾性调查分析.中国糖尿病杂志，2003；11：232-237】。

糖尿病的治疗目标是使血糖达到或接近正常水平，纠正代谢紊乱，消除糖尿病症状，防止或延缓并发症，降低病死率。目前治疗2型糖尿病的降血糖药物包括双胍类、磺脲类、噻唑烷二酮类、格列奈类、α-葡萄糖苷酶抑制剂以及二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂等。其中，DPP-4抑制剂属于较新的一类降糖药物，亦称肠促胰岛素增强剂，首个药物上市于2006年。DPP-4抑制剂通过抑制DPP-4酶活性而减少胰高血糖素样多肽1(GLP-1)在体内的失活，结果是增加GLP-1在体内的水平。GLP-1以葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，并且还有延迟胃排空、促进胰岛β细胞增殖和分化以及增强饱食感等作用。目前在全球不同地区获准上市的DPP-4抑制剂有：西格列汀(Sitagliptin，捷诺维)、维格列汀(Vildagliptin，佳维乐)、沙格列汀(Saxagliptin，安立泽)、阿格列汀(Alogliptin)、林格列汀(Linagliptin)、替格列汀(Teneligliptin)等，其中前3个已进入我国市场。单独使用DPP-4抑制剂不增加低血糖发生的风险，也不增加体重，但在肾功能不全的患者中使用时应减少药物剂量【中华医学会糖尿病学分会主编.中国2型糖尿病防治指南(2010年版).北京大学医学出版社，2011年9月第1版，21～23页】。目前全球正处于DPP-4抑制剂开发的黄金时期，研发中的产品列表如下。

与传统降血糖药物相比，DPP-4抑制剂的优势是具有葡萄糖依赖性的刺激胰岛素分泌作用，故在有效控制血糖过程中不易引起低血糖事件，具有较好的安全性，同时还保留胰岛β细胞功能。但是，DPP-4抑制剂也存在一些不足：其一，与传统降糖药物相比，DPP-4抑制剂的临床应用历史短暂，在防治糖尿病血管病变并发症方面缺乏循证医学数据，因而无明显优势；其二，在我国，DPP-4抑制剂类药物均为进口，用药成本较高，在市场竞争中处于价格劣势；其三，由于DPP-8和DPP-9与DPP-4属于同一酶家族，DPP-4抑制剂也可能对这些酶产生抑制作用，虽然目前尚未发现与抑制上述两酶相关的不良反应，但由于这些药物上市时间不长，对不良反应方面的信息应持警惕态度。

B族维生素包括维生素B₁、维生素B₂、维生素PP、维生素B₆、维生素B₁₂、叶酸、泛酸和生物素等，对机体新陈代谢、红细胞形成、保持神经系统和免疫系统功能具有重要作用。B族维生素属于水溶性维生素，经人体肠道吸收，由尿排出体外，在体内存留时间短暂，很少蓄积，所以必须经常从体外摄取以满足机体营养和代谢需要。B族维生素缺乏可导致诸多不良后果，包括肌无力、精神混乱、神经系统紊乱、消化障碍、皮肤皱裂、严重贫血和心脏损害等。其中，叶酸、维生素B₆、维生素B₁₂缺乏时影响同型半胱氨酸的代谢，据认为同型半胱氨酸是一种心血管危险因子。

目前市场上抗糖尿病药物都重在纠正糖尿病的血糖异常状态和代谢紊乱，而在一定程度上忽略了对引发糖尿病并发症(例如糖尿病血管病变)的复合危险因素的早期干预。如前述，糖尿病治疗的重要目标之一即是防止或延缓各种并发症，从而降低病死率，所以有必要对各种并存的损害因素或临床疾病进行处理。因此，如何进一步提高DPP-4抑制剂类降糖药物对糖尿病患者血管组织的保护作用，降低糖尿病引发血管并发症的危险，无论从临床意义抑或社会意义来说，都是值得研究和需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是克服DPP-4抑制剂存在的不足，提供一种在纠正糖尿病的血糖异常状态和防治糖尿病血管并发症方面优于DPP-4抑制剂、而毒副作用不增加的药物组合物(复方药物及制剂)。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种药物组合物，包括

(1)药用剂量的DPP-4抑制剂及其药用前体、活性代谢产物或其盐类中的一种；

(2)药用剂量的B族维生素的一种或几种；

(3)药剂学上可接受的载体。

上述的“药用剂量”是指具有协同、预防或治疗效应的药理作用的量。

所述的DPP-4抑制剂选自西格列汀(Sitagliptin)、维格列汀(Vildagliptin)、沙格列汀(Saxagliptin)、阿格列汀(Alogliptin)、林格列汀(Linagliptin)、替格列汀(Teneligliptin)、吉格列汀(Gemigliptin)、曲格列汀(Trelagliptin)、度格列汀(Dutogliptin)、美格列汀(Melogliptin)、卡格列汀(Carmegliptin)、SK-0403、TA-6666、PF-734200，优选西格列汀、维格列汀、沙格列汀、阿格列汀、林格列汀。

通过实验研究，上述优选DPP-4抑制剂的含量分别为：西格列汀(25～125mg)、维格列汀(25～200mg)、沙格列汀(2～10mg)、阿格列汀(5～40mg)、林格列汀(2～10mg)，上述物质药用前体、活性代谢产物或盐类的含量与相应的上述物质含量等同。

所述的B族维生素选自维生素B₆、维生素B₁₂和叶酸类物质的一种或几种。

所述维生素B₆类物质包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质。

所述维生素B₁₂类物质包括钴胺素、甲钴胺素、5’-脱氧腺苷钴胺素、羟钴胺素、氰钴胺素及上述物质的衍生物和可在体内代谢和/或生成该类化合物的物质。

所述叶酸类物质包括叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸、左亚叶酸钙、叶酸可药用盐、叶酸或叶酸可药用盐的活性代谢产物和可在体内代谢和/或生成叶酸的物质。

B族维生素类物质在本发明中的治疗有效量分别为：叶酸类物质的含量为0.1mg～5mg，维生素B₆类物质的含量为5～50mg，维生素B₁₂类物质的含量为0.01～1mg；其更佳的治疗有效量分别为：叶酸类物质0.2～2mg，维生素B₆类物质10mg～40mg，维生素B₁₂类物质0.05～0.5mg。

本发明优选由以下含量的组分作为活性成份的药物组合物：其中DPP-4抑制剂选自西格列汀(50～100mg)、维格列汀(50～100mg)、沙格列汀(2.5～5mg)、阿格列汀(12.5～25mg)、林格列汀(2.5～7.5mg)，B族维生素选自叶酸类物质(0.2～2mg)，更优选叶酸、5-甲基四氢叶酸或甲酰四氢叶酸(0.4～1.6mg)。

本研究发现，B族维生素与DPP-4抑制剂合用时，能协同增强后者的降血糖作用，并能协同加强对糖尿病引起血管损害的预防或治疗作用。因此，本发明提供了含有药用剂量的DPP-4抑制剂、药用剂量的B族维生素及药剂学上可接受的载体的药物组合物在制备用于治疗糖尿病、防治及延缓糖尿病血管并发症及相关疾病的药物中的用途。

糖尿病引起的血管并发症包括但不限于动脉粥样硬化、冠心病、脑血管病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病足等。

根据本发明，药物组合物中的活性成分是组合物中的基本组分，其中一个活性成分来自于DPP-4抑制剂中的一种，另一个活性成分为B族维生素的一种或多种，该药物组合物的剂型包括但不限于普通片剂、双层片剂、多层片剂、缓释片剂、单室控释片剂、双室控释片剂、微孔型控释片剂、舌下含片、口腔速崩片、分散片、肠溶片、颗粒剂、丸剂、肠溶胶囊、延迟释放片、定时/位释放片、普通胶囊、缓释胶囊、控释胶囊、含有微丸或小片的胶囊、含有微丸或小片的pH依赖型胶囊、口服液、膜剂或贴剂。特别指出的是，将含有DPP-4抑制剂和B族维生素的一种或多种药物组合物制成片剂或胶囊。

该药物组合物中还含有药剂学可接受的载体，可制成普通口服制剂，包括普通片剂、普通胶囊、颗粒剂等，制成片剂时所述可药用载体包括有助于将活性化合物配制成药用制剂的赋形剂和辅药，如微晶纤维素、无机盐类、乳糖、氯化钠、柠檬酸和亚硫酸钠等的一种或几种物质的组合物，属于本领域常识。

本发明提供的药物组合物中的化合物在相同的制剂中可以同时施与患病个体，也可分别地相继施与个体。若是相继施与，则第二个(或附加的)活性成分施与的延迟不应当导致活性成分联合带来的有益效果的损失。若是同时施与患病个体，组合物中的化合物可以混合存在于同一个药物制剂形式中，也可以以同样的制剂形式分别独立存在。若是以同样的制剂形式分别独立存在，则药物组合物可以变通地以“组合药盒”形式存在。“组合药盒”是一种盒状容器，内置一种或多种剂量形式的药物组合及使用说明书，在本发明中优选DPP-4抑制剂中的一种和B族维生素的一种或多种组成“药盒”。

本发明的另一个目的是提供含有药用剂量的DPP-4抑制剂及其药用前体、活性代谢产物或其盐类中的一种、药用剂量的B族维生素的一种或多种和可药用载体的药物组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。本发明提供的药物组合物因能够治疗糖尿病、防治和延缓糖尿病血管并发症，因而成为更适宜的抗糖尿病药物。其中，DPP-4抑制剂选自西格列汀、维格列汀、沙格列汀、阿格列汀、林格列汀、替格列汀、吉格列汀的一种，B族维生素选自维生素B₆、维生素B₁₂和叶酸类物质中的一种或多种。

本发明的优点：本发明提供了含有药用剂量的DPP-4抑制剂的一种、药用剂量的B族维生素的一种或多种和可药用载体的药物组合物。DPP-4抑制剂和B族维生素的联合效果并不是各个活性物质的各自作用的简单相加，而是导致2型糖尿病患者的在显著改善高血糖的基础上减少血管并发症的发生。也就是说，DPP-4抑制剂和B族维生素联合用药取得了协同治疗效果，因此是更适宜的抗糖尿病药物。

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限定，凡依照本发明内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

具体实施方式

以下药物制剂实施例的制剂过程和制剂所用物质或制剂所用物质的用量不限于文字表述，凡含有本发明提供的药物组合物的制剂方法，均属于本发明的保护范围，具体的实验方法可参考药物制剂常用参考书，如《药剂辅料应用与制备》、《药剂学》、《生物药剂学与药物动力学》等。

实施例1制备复方西格列汀/叶酸片(1000片量)

制备方法：将原辅料过80目筛，干燥备用。取处方量叶酸、西格列汀按照等量递增法混合均匀，称取处方量的微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、羧甲基淀粉钠，与原料药混合粉按等量递增法充分混匀，加入适量5％聚维酮95％乙醇溶液制成软材，20目筛制粒，50℃干燥约6h，20目筛整粒，控制颗粒的含水量为2-3％，将干燥后的颗粒与处方量的硬脂酸镁混合均匀，中间体进行检测，压制成1000片。制备过程中注意避光，制成的片剂需铝塑泡罩包装，避光保存。制成的复方片剂中每片含西格列汀100mg、叶酸0.8mg。

实施例2制备复方沙格列汀/叶酸片(1000片量)

制备方法：将原辅料过80目筛，干燥备用。取处方量叶酸、沙格列汀按照等量递增法混合均匀，称取处方量的微晶纤维素、乳糖、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠，与原料药混合粉充分混匀，加入适量10％淀粉浆溶液制成软材，20目筛制粒，50℃干燥约6h，20目筛整粒，控制颗粒的含水量为2-3％，将干燥后的颗粒与处方量的山嵛酸甘油酯和硬脂酸镁混合均匀，中间体进行检测，压制成1000片。制备过程中注意避光，制成的片剂需铝塑泡罩包装，避光保存。制成的复方片剂中每片含沙格列汀5mg、叶酸0.8mg。

实施例3制备复方维格列汀/5-甲基四氢叶酸片(1000片量)

制备方法：辅料为直压辅料，干燥备用。取处方量的5-甲基四氢叶酸及10g微晶纤维素按照等量递增法混合均匀，得到混粉中间体1；称取处方量的剩余微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠，与维格列汀按等量递增法充分混匀，得到混粉中间体2；将混粉中间体1和混粉中间体2与处方量的硬脂酸镁按照等量递增法混合均匀，得最终混粉中间体，检测混粉中间体，压制成1000片。制备过程中注意避光，制成的片剂需铝塑泡罩包装，避光保存。制成的复方片剂中每片含维格列汀100mg、5-甲基四氢叶酸0.8mg，其质量比为100∶0.8。

实施例4制备复方阿格列汀/维生素B₆片(1000片量)

制备方法：辅料为直压辅料，干燥备用。取处方量的维生素B₆及10g微晶纤维素混合均匀，得到混粉中间体1；称取处方量的剩余微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)，与阿格列汀按等量递增法充分混匀，得到混粉中间体2；将混粉中间体1和混粉中间体2与处方量的硬脂酸镁混合均匀，得最终混粉中间体，进行检测混粉中间体，压制成1000片。制备过程中注意避光，制成的片剂需铝塑泡罩包装，避光保存。制成的复方片剂中每片含阿格列汀25mg、维生素B₆10mg，其质量比为2.5∶1。

实施例5制备复方沙格列汀/5-甲基四氢叶酸/维生素B₁₂胶囊(1000粒量)

制备方法：将原辅料过80目筛，干燥备用。取5-甲基四氢叶酸0.6g、维生素B₁₂0.05g、沙格列汀5g按照等量递增法混合均匀，再与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等量递增混合均匀后，加入5％聚维酮无水乙醇溶液适量，制软材，50℃干燥约6h过24目筛制颗粒，控制颗粒的含水量为2-3％，将干燥后的颗粒与处方量微粉硅胶、硬脂酸镁混合均匀，得到的颗粒中间体进行检测，检测合格后，装入空心胶囊即得。制备过程中注意避光，制成的胶囊需铝塑泡罩包装，避光保存。制成的胶囊中每粒含沙格列汀5mg、5-甲基四氢叶酸0.6mg、维生素B₁₂50μg。

实施例6制备复方维格列汀叶酸双层片

配方：

维格列汀层颗粒的制备方法：将原辅料粉碎过80目筛，干燥备用。取维格列汀100g，60g维晶纤维素和10g羧甲基淀粉钠，按照等量递增法均匀混合，用5％聚维酮K29/30-95％乙醇溶液制成软材，20目筛制粒，50℃干燥约6h，20目筛整粒，控制颗粒的含水量为2-3％，得到维格列汀层颗粒A；

叶酸层颗粒的制备方法：取叶酸0.8g，60g微晶纤维素和10g低取代羟丙基纤维素，按照等量递增法均匀混合，用5％聚维酮K29/30-95％乙醇溶液制成软材，20目筛制粒，50℃干燥约6h，20目筛整粒，控制颗粒的含水量为2-3％，得到叶酸层颗粒B；

双层片的制备方法：将干燥后的颗粒A、B分别与硬脂酸镁混合均匀，半成品分别进行检测，测定含量后，分别装入饲料斗中，用双层片压片机压制成1000片。制备过程中注意避光，制成的片剂需铝塑泡罩包装，避光保存。制成的复方片剂中每片含维格列汀100mg、叶酸0.8mg，其质量比为100∶0.8。

实施例7西格列汀叶酸组合物对糖尿病大鼠的降糖、血管保护作用

方法：a)链脲佐菌素溶液：称取600mg链脲佐菌素(STZ)临用前溶于200ml柠檬酸溶液中，配成3mg/ml的溶液。b)健康大鼠68只，随机选取10只大鼠作为正常对照组，其余大鼠腹腔注射STZ溶液(30mg/kg)，正常饮食，2周后眶后采血测定空腹血糖(FPG)值，筛选血糖值超过11.1mmol/L的大鼠制成高血糖大鼠用于后续的实验。c)将高血糖大鼠随机分为模型组、西格列汀组、西格列汀+叶酸组(见表1)，每组14只，每日分别灌胃给予生理盐水、西格列汀10mg/kg、西格列汀10mg/kg+叶酸0.08mg/kg，另以正常大鼠作空白对照，给予等量生理盐水，灌胃容量为1ml/100g，每日1次。正常饮食、连续给药6周后，各组大鼠眼眶采血测FPG和血浆内皮素-1(ET-1)。除去中途死亡大鼠，每组测得结果以均值±标准差表示(表1)，统计学检验方法采用配对t检验。

结果：见表1。模型组大鼠空腹血糖(FPG)水平显著高于正常对照组大鼠，表明模型组大鼠呈现高血糖状态，造模成功。给与糖尿病大鼠药物治疗后，西格列汀、西格列汀叶酸组合物组大鼠FPG显著降低(均P＜0.01)，且西格列汀叶酸组合物对高血糖大鼠的降血糖作用优于西格列汀单用(P＜0.05)，提示叶酸有协同降血糖作用。血浆内皮素水平是反映糖尿病血管病变的指标之一，本实验发现，与模型组或西格列汀组比较，西格列汀叶酸组合物组大鼠血浆ET-1有显著降低，提示叶酸对血管内皮的保护作用。

表1西格列汀叶酸组合物对大鼠的作用

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，″P＜0.01；与西格列汀组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实施例8维格列汀叶酸组合物对糖尿病大鼠的降糖和血管保护作用

方法：(1)动物造模及给药：SD大鼠66只，体重200～230g，雌雄各半，适应性饲养1周后随机抽取10只作为空白对照组，其余56只分别给予30mg/kg STZ(sigma产品)单次腹腔注射，14d后大鼠尾静脉采血测定空腹血糖(FPG)水平，大于11.1mmoL/L确定为糖尿病造模成功，取42只，随机分为3组，即模型对照组、维格列汀组、维格列汀+叶酸组，每组14只，后2组每日灌喂给予维格列汀7.5mg/kg、维格列汀7.5mg/kg+叶酸0.04mg/kg，空白组、模型组给予等量的生理盐水灌喂，各组用药或处理时间为8周。(2)标本采集、指标检测：8周后10％水合氯醛腹腔注射麻醉动物，腹主动脉取血测血糖，并按试剂盒说明书分别测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、内皮素(ET)水平。除去中途死亡大鼠，每组测得结果及统计见表2、3。

结果：见表2、3。给与糖尿病大鼠药物治疗8周后，与模型组比较，维格列汀、维格列汀叶酸组合物组大鼠FPG显著降低，且维格列汀叶酸组合物对大鼠的降糖作用强于维格列汀单用，表明维格列汀与叶酸合用有协同降血糖作用。与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠血清ET水平升高、SOD、CAT水平降低，提示糖尿病模型合并早期血管内皮损伤；与维格列汀组比较，维格列汀叶酸组显示有降ET、升高SOD、CAT的效应，提示叶酸有改善大鼠抗氧化及抗内皮损伤的作用。

糖尿病血管病变以动脉硬化为主要表现，血管内皮损伤是糖尿病血管并发症的始动环节，同时糖尿病血管病变的发生又进一步促进内皮损伤，但血管病变的机制尚未完全阐明。血液中ET是血管内皮细胞分泌的活性物质，是强烈的血管收缩剂，与糖尿病血管并发症密切相关。据文献报道，随糖尿病进展，ET水平逐渐升高，是反映糖尿病血管病变的良好指标。氧自由基是导致内皮损伤的重要因素，而血液中SOD、CAT是清除氧自由基的重要蛋白酶。根据上述结果，初步得出结论：叶酸与维格列汀联合应用不仅降血糖作用得到加强，还有显著改善糖尿病大鼠血管内皮损伤的作用。

表2维格列汀叶酸组合物对大鼠血糖的作用

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，′P＜0.05，″P＜0.01；

与维格列汀组比较，^△P＜0.05。

表3维格列汀叶酸组合物对大鼠血管的保护作用

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，′P＜0.05，″P＜0.01；

与维格列汀组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实施例9沙格列汀/5-甲基四氢叶酸组合物对糖尿病大鼠血管舒张功能的作用

方法：SD大鼠用高脂饮食饲养4周后腹腔注射STZ(30mg/kg)，4周后测FPG确认大鼠2型糖尿病诱导成功，继续饲以高脂饮食。将42只糖尿病大鼠随机分为3组：模型组、沙格列汀组、沙格列汀+5-甲基四氢叶酸(5-MTF)组，每日治疗或处理相应喂等体积蒸馏水、0.5mg/kg沙格列汀、0.5mg/kg沙格列汀+0.1mg/kg5-MTF；另设正常对照大鼠10只(始终进食普通饲料)。给药10周后复测FPG，腹腔注射30mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，打开腹腔，分离腹主动脉和肠系膜上动脉，在腹主动脉分出肠系膜上动脉的上方和下方分别结扎，将一“Y”形管插入肠系膜上动脉，结扎动脉并固定在“Y”形管上，然后沿肠管将肠系膜完整剪下。“Y”形管一端连接于恒温水浴的蠕动泵灌流系统，可交替恒速灌流Krebs液(平衡和冲洗肠系膜血管床)或含药物的Krebs液(给药)。“Y”形管的另一端连接于四道生理记录仪，记录肠系膜血管床内压力(反映血管张力变化)。肠系膜血管舒张反应测定：在Krebs液中加入终浓度为1μmol/L的去甲肾上腺素(NE)，肠系膜血管收缩达最高并稳定后(血管床内压升高)，再加入终浓度为1μmol/L的乙酰胆碱(ACh)或1μmol/L的硝普钠(SNP)，血管舒张，肠系膜血管床内压下降。以肠系膜血管对ACh或SNP的松弛率百分比[(NE肠系膜血管内压力-ACh或SNP肠系膜血管内压力)/NE肠系膜血管内压力×100％]表示肠系膜血管床对ACh或SNP的舒张反应性。去内皮细胞血管舒张反应测定：在Krebs液中加入终浓度为1μmol/L的皂素去内皮(约灌流20mL，皂素破坏血管内皮而对血管平滑肌无影响)，用Krebs液灌流冲洗30min，再重复上述步骤，观察去内皮细胞后肠系膜血管对ACh或SNP的舒张反应性。

结果：数据见表4和表5。与正常对照组相比，模型组大鼠血糖显著升高，表明造模成功。给予糖尿病大鼠药物治疗后，沙格列汀组、沙格列汀+5-MTF组合物组大鼠FPG均显著降低，但沙格列汀+5-MTF的降血糖作用优于沙格列汀(P＜0.05)，提示5-MTF有辅助降血糖作用。糖尿病血管病变的初始原因是血管内皮细胞损害，本研究利用离体血管灌流技术观察本组合物对糖尿病大鼠肠系膜血管内皮细胞是否有保护作用。ACh的舒张率可反映内皮细胞功能。结果发现，与正常对照组比较，模型组大鼠肠系膜血管ACh舒张率明显降低，沙格列汀组、沙格列汀+5-MTF组血管ACh舒张率均较模型组均有改善，沙格列汀+5-MTF的改善程度显著优于沙格列汀单用，提示5-MTF有内皮保护作用。用皂素去内皮后，3个治疗组肠系膜血管对ACh舒血管的反应性均明显降低，组间无显著性差异。但去内皮处理前后，各组肠系膜血管对SNP(释放一氧化氮，直接松弛平滑肌，属于非内皮依赖性)舒张血管的反应性无显著变化，间接说明糖尿病大鼠早期血管病变主要是损害血管内皮。根据以上结果，我们认为沙格列汀/5-MTF组合物对2型糖尿病大鼠血管内皮具有显著保护作用。

表4沙格列汀/5-MTF组合物对大鼠血糖的作用

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，″P＜0.01；与沙格列汀组比较，^△P＜0.05。

表5沙格列汀/5-MTF组合物对大鼠血管内皮功能的影响

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，″P＜0.01；与沙格列汀组比较，^△△P＜0.01。

实施例10西格列汀/5-MTHF组合物对糖尿病大鼠肾、血管内皮功能的影响

方法：Wistar大鼠(雄性，体重200-250g)腹腔注射STZ(30mg/kg)，辅以基础饲料喂养，自由饮水，2周后眶后采血测血糖筛选出糖尿病大鼠42只，随机分为3组，分别为模型对照组、西格列汀组(5mg/kg)、西格列汀+5-MTHF组(5mg/kg+0.08mg/kg)，每组14只，灌胃给药，每天1次，连续8周；另设立正常对照组12只。除正常对照组喂普通饲料外，其余各组均喂以高热量饲料。实验期间动物饮水及饲料不加限制，实验结束时采血测血糖和一氧化氮(NO)含量，代谢笼法接取24h尿液，测定24h尿蛋白量。统计方法：数据用均数±标准差表示，组间比较用t检验。

结果：见表6。①西格列汀/5-MTHF组合物对血糖的影响：模型组血糖显著升高，西格列汀单用可显著降低血糖，西格列汀/5-MTHF组合物有显著降糖作用，优于单药。②西格列汀/5-MTHF组合物对24h尿蛋白的影响：模型组尿蛋白显著升高，西格列汀组大鼠尿蛋白显著下降，西格列汀/5-MTHF组合物尿蛋白下降作用明显，且作用强于西格列汀，可见西格列汀与5-MTHF合用对肾功能的保护有显著的协同作用。③西格列汀5-MTHF组合物对血管内皮功能的影响：长期高血糖状态易引起血管病变，早期常表现有血管内皮功能改变，而血浆NO水平可间接反映血管内皮功能。本实验中，模型组血浆NO显著降低，西格列汀/5-MTHF组NO显著升高，提示两个药物间具有协同或相加的血管内皮保护作用。

表6西格列汀/5-MTHF组合物对血糖、24h尿蛋白和血浆NO的影响

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，′P＜0.05，″P＜0.01；

与西格列汀组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实施例11维格列汀/叶酸/Vit B₆组合物对糖尿病大鼠视网膜的保护作用

方法：大鼠适应性饲养后测空腹血糖低于7mmol/L者随机选取10只作为正常对照组，其余大鼠用STZ(Sigma公司产品，0.1mmol/L柠檬酸缓冲液配成1％浓度，经微孔滤膜过滤灭菌)按30mg/kg腹腔注射诱发糖尿病，72小时后取尾血测血糖，血糖FPG≥11.1mmoL/L即为糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠随机分为3组，每组14只：糖尿病对照组、维格列汀治疗组(12mg/kg)、维格列汀+叶酸+Vit B₆治疗组(12+0.08+2mg/kg)。每天灌胃给药。血糖升高后第12周，取尾血测血糖。每组取10只大鼠，取双侧眼球，置于冰生理盐水中，取出视网膜组织，精密天平称重，冰浴下制成10％组织匀浆，3000r/min离心10分钟，取上清液进行一氧化氮合酶(NOS)和醛糖还原酶(AR)活性测定(NOS用每毫克组织蛋白每分钟生成1mmol NO为一个酶活力单位表示；AR活性的测定用紫外测定法)，蛋白测定用考马斯亮兰比色法。AR单位酶活性为每mg匀浆蛋白每分钟消耗1umolNADPH。测得结果以均值±标准差

表示，统计方法采用t检验。

结果：糖尿病视网膜病变的发病机制中，AR活性增强，NOS表达增强。在本实验中，糖尿病大鼠血糖升高后第12周，模型组NOS和AR值均显著高于正常对照组，表明该糖尿病大鼠已经患有早期视网膜病变。维格列汀组糖尿病大鼠的NOS和AR值与模型组糖尿病大鼠相比没有显著差异，而维格列汀/叶酸/Vit B₆组糖尿病大鼠的NOS和AR值无论是与模型组相比、还是与维格列汀组大鼠相比，都有显著的统计学差异，表明维格列汀/叶酸/Vit B₆组合物具有协同防治糖尿病视网膜病变的作用。

表7维格列汀/叶酸/Vit B₆组合物对糖尿病视网膜的保护作用

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，″P＜0.01；与维格列汀组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

实施例12沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物对糖尿病大鼠的血管及内皮保护作用

方法：Wistar大鼠(雄性，体重200-250g)高脂饲料喂养12周。大鼠造模前禁食12小时，腹腔注射STZ(30mg/kg)，2周后眶后采空腹血，测血糖FPG≥11.1mmoL/L为糖尿病造模成功，将糖尿病大鼠按血糖值随机分为3组，分别为模型对照组、沙格列汀组(0.5mg/kg)、沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组(0.5+0.06+0.01mg/kg)，每组14只，灌胃给药，每天1次，连续12周；另设立正常对照组大鼠10只，以普通饲料喂养(模型对照及正常对照大鼠每日灌胃蒸馏水)。糖尿病大鼠各组均继续喂以高热量饲料，实验期间动物饮水及饲料不限制，实验12周结束时采血，测血糖以及按试剂盒说明书测定NO(硝酸还原酶法)、总一氧化氮合成酶(T-NOS)和总SOD活力；放免法测定血清血栓素(TXB₂)、前列腺素(6-keto-PGF1α，简称PGF1α)和血浆ET。数据用均数±标准差表示，组间比较行配对t检验。

结果：见表8-10。①沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物对血糖的影响：模型组血糖显著升高，沙格列汀可显著降低血糖，沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物降糖作用更显著，优于前者。②沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物对NO、T-NOS、ET和NO/ET的影响：与正常组比较，模型组血浆NO降低，血清T-NOS活力显著下降，ET含量升高，NO/ET比值降低；与模型组比较，沙格列汀组仅NO、T-NOS有所升高，而沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组NO、T-NOS升高更明显，ET降低，同时NO/ET比值显著增高，提示5-MTHF/Vit B₁₂增强血管内皮保护。③沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物对TXB₂、PGF1α及两者比值的影响：与正常组比较，模型组血浆TXB₂显著升高，PGF1α变化不明显，TXB₂/PGF1α比值升高；与模型组比较，沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组TXB₂有明显下降，PGF1α变化幅度不大，TXB₂/PGF1α比值明显下降，同样提示5-MTHF/Vit B₁₂具有增强对血管栓塞的防治作用。④沙格列汀/5-MTHF/VitB₁₂组合物对血清总SOD活力的影响：与正常组比较，模型组血清总SOD活力显著降低，给药组SOD活力均有不同程度上升。其中，与沙格列汀组比较，沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组SOD活力升高更明显，提示药物间的协同血管保护作用。

表8沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物对大鼠血糖的作用

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，″P＜0.01；与沙格列汀组比较，^△P＜0.05。

表9沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物对大鼠血管内皮的保护作用

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，′P＜0.05，″P＜0.01；

与沙格列汀组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

表10沙格列汀/5-MTHF/Vit B₁₂组合物对大鼠血管的保护作用

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与沙格列汀组比较，^△P＜0.05。

糖尿病血管病变、尤其是微血管病变是糖尿病多种并发症的病理基础，其中血管内皮细胞损伤可能是重要原因之一，而一氧化氮/内皮素(NO/ET)和血栓素/前列腺素是两组血管活性物质，均由血管内皮细胞分泌，两组动态平衡对维持内皮细胞的正常功能及对血流动力学等起着重要作用。本研究结果提示，与单方相比，沙格列汀与5-MTHF/VitB₁₂联合应用更有利于维持NO/ET和血栓素/前列腺素的稳态平衡，有利于协助调节微血管的舒缩、抑制血小板聚集及血栓形成，因此具有防治糖尿病血管病变的药理作用。

Claims (8)

1.一种药物组合物，含有：

(1)药用剂量的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂及其药用前体、活性代谢产物、或盐类中的一种；

(2)药用剂量的B族维生素中的一种或多种；

(3)药剂学上可接受的载体。

2.根据权利要求1中所述的组合物，其特征在于：所述DPP-4抑制剂选自西格列汀(Sitagliptin)、维格列汀(Vildagliptin)、沙格列汀(Saxagliptin)、阿格列汀(Alogliptin)、林格列汀(Linagliptin)、替格列汀(Teneligliptin)、吉格列汀(Gemigliptin)、曲格列汀(Trelagliptin)、度格列汀(Dutogliptin)、美格列汀(Melogliptin)、卡格列汀(Carmegliptin)、SK-0403、TA-6666等；所述B族维生素选自维生素B₆、维生素B₁₂和叶酸类物质，其中叶酸类物质包括叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸、左亚叶酸钙。

3.根据权利要求2中所述的组合物，其特征在于：所述药用剂量的DPP-4抑制剂选自25～125mg西格列汀、25～200mg维格列汀、2～10mg沙格列汀、5～40mg阿格列汀或2～10mg林格列汀的一种；所述药用剂量的B族维生素选自5～50mg维生素B₆、0.01～1mg维生素B₁₂和0.1～5mg叶酸类物质的一种或多种。

4.根据权利要求3中所述的组合物，其特征在于：所述药用剂量的DPP-4抑制剂优选50～100mg西格列汀、50～100mg维格列汀、2.5～5mg沙格列汀、12.5～25mg阿格列汀、2.5～7.5mg林格列汀，所述药用剂量的B族维生素优选0.2～2mg叶酸类物质，更加优选0.4～1.6mg叶酸、5-甲基四氢叶酸或甲酰四氢叶酸。

5.根据权利要求1～4任一项所述的组合物，其特征在于所述的药物组合物的制药剂型为口服制剂，包括片剂、胶囊或颗粒剂等。

6.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。

7.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备用于防治糖尿病血管病变并发症的药物中的用途。

8.权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的糖尿病血管病变并发症包括动脉粥样硬化、冠心病、脑血管病、糖尿病性肾病、视网膜病变、下肢坏疽等。