CN103409518A

CN103409518A - 一种从土壤中快速检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法

Info

Publication number: CN103409518A
Application number: CN2013103230119A
Authority: CN
Inventors: 张欣; 张贺; 谢艺贤; 漆艳香; 蒲金基
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-07-29
Also published as: CN103409518B

Abstract

本发明公开了一种从土壤中快速检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，包括如下步骤：1)对样品进行预处理，提取备检样品的DNA；2)特异性引物的制备；3)进行DNA环介导等温扩增技术反应；4)结果分析，在反应产物中加入1μl的核酸染料、瞬时离心至充分混匀，静止用肉眼观察。本发明的DNA环介导等温扩增技术，高特异性、灵敏度高、易操作、用时短、不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，也不需要昂贵而精密的温度循环装置，分析判断反应产物的方法极为简单，只需肉眼观察即可，适宜于广泛地推广应用。

Description

一种从土壤中快速检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测病原菌的方法，尤其涉及一种从土壤中快速检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法。

背景技术

香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是热带亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。香蕉枯萎病是香蕉产业的毁灭性病害，严重制约着我国香蕉产业健康发展。

香蕉枯萎病病原菌为Fusarium oxysporum Schlevht.f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyd.&Hans.，曾用名Fusarium cubense E.F.Smith，属于半知菌类，瘤座菌目，镰孢菌属，中文名称为尖孢镰孢菌古巴专化型。该菌分为3个小种。在我国，主要为1号小种和4号小种。1号小种发生历史悠久，可以通过改种Cavendish类香蕉来解决1号小种的危害。4号小种于1996年传入我国，严重危害我国香蕉产业的安全。4号小种又细分为亚热带4号小种和热带4号小种，在我国主要是热带4号小种。

香蕉枯萎病的传播危害分远距离传播和近距离传播，远距离以病原菌随香蕉组培苗二级苗的调运为主，近距离传播是病原菌在蕉园内随土壤传播蔓延。生产中，迫切需要土壤病原菌快速检测技术，用来检测组培苗二级苗土壤、新开辟蕉园土壤是否带菌以及疑似病株的快速诊断。因此，建立一套香蕉枯萎病病原菌热带4号小种快速、稳定的检测方法是我国香蕉安全生产的重要保证。

近年来，有报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测香蕉枯萎病病原菌热带4号小种，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(2～3小时)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实际检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。因此，将生物技术发展的最新成果应用于香蕉枯萎病病原菌热带4号小种检测，具有重要意义。

DNA环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性(Notomi等，2000)。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物，反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63℃保温1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。

Dita等人通过分析香蕉枯萎病病原菌不同小种转录间隔区基因序列之间的差异，设计了热带4号小种的PCR扩增的特异性引物对FocTR4-F(5′-CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3′)/FocTR4-R(5′-CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3′)，扩增片段大小为463bp。

使用Dita等人建立的PCR检测技术，需要提取较高纯度的样品基因组DNA、用时较长，也不能现场检测土壤样品，且需要昂贵而精密的温度循环装置，必须借助电泳仪才能判别扩增产物的阳性或阴性，成本高，不易操作，需要具有一定技术水平的专业人员才能开展检测工作。

本发明的DNA环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplificationof DNA，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，高特异性、灵敏度高、易操作、用时短、不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，也不需要昂贵而精密的温度循环装置，分析判断反应产物的方法极为简单，只需肉眼观察即可，适宜于广泛地推广应用。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的方法，包括如下步骤：

1)、样品预处理

对样品进行预处理，提取备检样品的DNA

2)、特异性引物的制备

特异性引物包含内引物和外引物各一对，两对引物分别为：外引物FocTR4-F3(5′-CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3′)、外引物FocTR4-B3(5′-CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3′)，内引物FocTR4-FIP(5′-ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3′)、内引物FocTR4-BIP(5′-GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3′)；

3)、进行DNA环介导等温扩增技术反应

将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63℃保温90min进行循环链置换反应；

4)、结果分析

在反应产物中加入1μl的核酸染料、瞬时离心至充分混匀，静止用肉眼观察。

本发明通常采用如下步骤进行：

步骤一、对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA

被检样品的DNA核酸提取：向0.1g待检测样品中加入300μl DNA提取液，研磨成糊状后，在95℃恒温水浴10min后，25℃、10000rpm下离心2分钟，取50μl上清液作为检测模板DNA。

DNA提取液包含：100mM Tris-HCl(pH7.4)、1M KCl、10mM EDTA和2％(w/v)PVPP。

步骤二、特异性引物的制备：根据Dita等人报道的特异基因序列，设计出2对特异性引物，包含内引物和外引物各一对。

由两对引物构成的引物混合液，两对引物分别为：外引物FocTR4-F3(5′-CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3′)、外引物FocTR4-B3(5′-CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3′)，内引物FocTR4-FIP(5′-ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3′)、内引物FocTR4-BIP(5′-GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3′)，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5pmol/μl；所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/μl。

表1香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的特异性检测引物

步骤三、进行DNA环介导等温扩增技术(LAMP)反应

将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63℃保温90min进行循环链置换反应。

在PCR管中配置25μl反应溶液：1μl的外引物FocTR4-F3、1μl的外引物FocTR4-B3、1μl的内引物FocTR4-FIP、lμl的内引物FocTR4-BIP，其核苷酸序列如表1所示；12.5μl的反应缓冲液；1μl的Bst DNA聚合酶；2μl的样品DNA；然后加水至25μl；瞬时离心后添加25μl石蜡油密封。设置阳性对照反应时，用香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的基因组DNA代替；设置阴性对照反应时，用100mMTris-HCl(pH8.0)和50mM EDTA代替，将含有配制好的反应溶液的PCR管置于63℃恒温反应90min。

12.5μl的反应缓冲液，所述反应缓冲液包含：4.0μl的10mM dNTP、2.5μl的10×ThermoPol反应缓冲液、1.0μl的150mM MgSO₄、5.0μl的5mM甜菜碱，此反应缓冲液是指水溶液。

Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl的；

核酸染料：稀释1000×的SYBR Green I；

阳性对照：香蕉枯萎病病原菌热带4号小种基因组DNA；

阴性对照：100mM Tris-HCl(pH8.0)和50mM EDTA。

步骤四、分析判断反应产物结果

在反应产物中加入1μl的核酸染料、瞬时离心至充分混匀，静止用肉眼观察。如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

附图说明

图1是本发明香蕉枯萎病病原菌热带4号小种LAMP检测引物设计示意图；

图2是香蕉枯萎病病原菌热带4号小种LAMP检测的特异性分析

图3是香蕉枯萎病病原菌热带4号小种LAMP检测的灵敏性分析

图4是香蕉枯萎病病原菌热带4号小种LAMP检测的田间应用

具体实施方式

按照上述步骤开展LAMP检测的特异性、灵敏性和田间应用分析。

实施例1

LAMP检测的特异性分析：以香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense(Foc))1号小种(race1)、亚热带4号小种(Subtropical Race4，ST4)、热带4号小种(Tropical Race4，TR4)、甜瓜蔓枯病菌(Mycosphaerella melonis)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)的DNA以及健康蕉园土壤、阴性对照来测试LAMP的特异性，结果显示仅模板是FocTR4基因组DNA的显色为绿色、表明为阳性，其余均为橙色、表明为阴性(见图2-A)；经2％琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR管的产物，仅模板是FocTR4基因组DNA显示有梯度条带，其余均无梯度条带(见图2-B)，表明在LAMP检测中只有阳性反应的才有梯度条带，而阴性反应的无梯度条带；参考Dita等人设计的香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的特异性PCR检测引物FocTR4-F/FocTR4-R，扩增用于特异性分析的供试病原菌，仅模板是FocTR4基因组DNA扩增出大小为463bp的单一条带，其余均无条带(见图2-C)。LAMP显色和电泳分析与Dita等人设计的香蕉枯病病原菌热带4号小种特异性检测结果一致，表明LAMP检测的特异性。

检测结果如图2和表2所示，(A)以香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense(Foc))1号小种(Race1)、亚热带4号小种(Subtropical Race4，ST4)、热带4号小种(Tropical Race4，TR4)、甜瓜蔓枯病菌(Mycosphaerella melonis)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)的DNA以及健康蕉园土壤、阴性对照液(100mMTris-HCl(pH8.0)和50mM EDTA)为对照用来测试LAMP的特异性(分别对应编号的1-8)，仅模板是FocTR4基因组DNA的显色为绿色，其余均为橙色。

(B)2％琼脂糖凝胶电泳检测“A”中各个PCR管的产物，仅模板是FocTR4基因组DNA显示有梯度条带，其余均无梯度条带；“M”Marker DL5000。

(C)使用香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的特异性PCR检测引物，扩增“A”中的1-8，仅模板是FocTR4基因组DNA显示有单一条带，其余均无条带；“M”Marker DL2000。

表2实施例1的检测结果

编号

1

2

3

4

5

6

7

8

LAMP检测(A)

阴性

阳性

阴性

琼脂糖凝胶电泳(B)

阴性

阳性

阴性

PCR检测(C)

阴性

阳性

阴性

实施例2

LAMP检测的灵敏性分析：以香蕉枯萎病病原菌热带4号小种基因组DNA为模板，按照10倍梯度系列稀释法将FocTR4基因组DNA从43ng/μl依次稀释至4.3×10^-5ng/μl，以无菌水为阴性对照，结果表明，FocTR4基因组浓度为43ng/μl～4.3×10^-4ng/μl的均显色为绿色，浓度为4.3×10^-5ng/μl和阴性对照显色为橙色，表明LAMP的检测下限为4.3×10^-4ng/μl(见图3-A)；2％琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR管的产物，FocTR4基因组浓度为43ng/μl～4.3×10^-4ng/μl的显示有梯度条带，其余均无梯度条带(见图3-B)，表明在LAMP检测下限为4.3×10^-4ng/μl，浓度低于4.3×10^-4ng/μl则检测不出。

检测结果如图3所示(A)以香蕉枯萎病病原菌热带4号小种基因组DNA为模板，按照10倍梯度系列稀释法将FocTR4基因组DNA从43ng/μl依次稀释至4.3×10-5ng/μl，分别对应编号1-7，编号8为阴性对照。仅1-6显色为绿色，7和8显色为橙色。(B)2％琼脂糖凝胶电泳检测“A”中各个PCR管的产物，编号1-6均有梯度条带，其余均无梯度条带；“M”Marker DL2000。

实施例3

LAMP检测的田间应用：采集香蕉枯萎病发病蕉园的土壤和未发病蕉园的土壤，进行LAMP检测，设置阳性对照和阴性对照，结果表明，发病蕉园的土壤检测为阳性，而未发病蕉园的土壤检测为阴性，表明发病蕉园的土壤中含有香蕉枯萎病病原菌热带4号小种，而未发病蕉园的土壤中未检测出病原菌，这与事实相符，可以将本发明的从土壤中环介导等温扩增技术快速检测香蕉枯萎病病原菌热带4号小种的方法应用到田间。

检测结果如图4所示，“+”为阳性对照；“-”为阴性对照；编号1-3和5-6为发病蕉园采集的土壤；编号4为未发病蕉园采集的土壤，检测结果中仅有阴性对照组和4号管为橙色，其余各管为绿色，说明本发明方法用于田间检测，结果准确。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种从土壤中快速检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法，包括如下步骤：

1)、样品预处理

对样品进行预处理，提取备检样品的DNA；

2)、特异性引物的制备

特异性引物包含内引物和外引物各一对，两对引物分别为，

外引物FocTR4-F3：

5′-CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3′，

外引物FocTR4-B3：

5′-CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3′，

内引物FocTR4-FIP：

5′-ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3′，

内引物FocTR4-BIP：

5′-GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3′：

3)、进行DNA环介导等温扩增技术反应

将经前处理的DNA、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63℃保温90min进行循环链置换反应；

4)、结果分析

在反应产物中加入核酸染料、瞬时离心至充分混匀，静止用肉眼观察。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)中，所述预处理的方法为，向待检测样品中加入DNA提取液，研磨成糊状后，在95℃恒温水浴10min后，离心2分钟，取上清液作为检测模板DNA；

所述DNA提取液包含：pH7.4的100mM Tris-HCl、1M KC1、10mM EDTA和2％(w/v)PVPP。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，配置所述外引物FocTR4-F3和FocTR4-B3的浓度均为5pmol/μl；所述内引物FocTR4-FIP和FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/μl。

4.如权利要求3所述的方法，其中步骤3)中，所述“DNA环介导等温扩增技术反应”的反应体系为：在PCR管中配置25μl的反应体系，包括，1μl的外引物FocTR4-F3、1μl的外引物FocTR4-B3、1μl的内引物FocTR4-FIP、1μl的内引物FocTR4-BIP、12.5μl的反应缓冲液、1μl的Bst DNA聚合酶、2μl的样品DNA，然后加水至25μl；

瞬时离心后添加25μl石蜡油密封，将含有配制好的反应溶液的PCR管置于63℃恒温反应90min；

所述反应缓冲液包含：4.0μl的10mM dNTP、2.5μl的10×ThermoPol反应缓冲液、1.0μl的150mM MgS04、5.0μl的5mM甜菜碱，此反应缓冲液是指水溶液；

所述Bst DNA聚合酶浓度为8U/μl。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤4)中，所述核酸染料为稀释1000×的SYBRGreen I；

结果判断方法为：如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

6.如权利要求5所述的方法，其中步骤4)中，加入所述核酸染料的量为1～5μl。