CN103409395A - 微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法 - Google Patents

微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，所述的微生物是浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH，所述的发酵方法包括菌种活化、种子液培养、发酵罐发酵产酶和粗酶液的收集步骤。本发明提供的发酵方法，可生产高活力的内切型壳聚糖酶，发酵液中内切型壳聚糖酶活力达到35U/mL，发酵周期50～60小时，该酶液可直接运用于壳寡糖的生产，发酵工艺简单，条件易控制，酶活收率高，发酵周期短，发酵液处理简单，适合用于内切型壳聚糖酶的工业化生产。

Description

微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，具体地说，是一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法。
背景技术
壳寡糖是指聚合度为2～10的聚氨基葡萄糖，相比其前体物质甲壳质和壳聚糖，除了具有共同的良好的生物相容性外，还具备下述优越特性：水溶性好、易被机体吸收利用及具有抑菌、抗肿瘤生理活性等。因此，壳寡糖在医药、食品、农业、环境及水处理等各领域有着广阔的应用前景。目前，应用壳聚糖制备壳寡糖主要有化学降解法和酶降解法，其中，生物酶法因具备专一性强、反应条件温和、过程易控制及环境污染少等特点，被本领域内的技术人员认为拥有更好的开发潜力。
壳聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.132）能在温和条件下催化壳聚糖分子中β-1,4-糖苷键的水解，为酶法制备壳寡糖的最主要的限制因素。壳聚糖酶主要来源于真菌、细菌等微生物，所得的壳聚糖酶性质因其来源而不尽相同。对已获得的壳聚糖酶生产菌株进行深入的酶学研究，结果表明，这些微生物在受到诱导时，同时表达两种或多种内切型和/或外切型壳聚糖酶。内切型壳聚糖酶彻底分解壳聚糖后的产物主要为聚合度是2～4的壳低聚糖，而外切型壳聚糖酶的酶解产物则为壳单糖，即聚合度为1。目前本领域内所指的壳寡糖主要是指聚合度为2～10的壳低聚糖，由于外切型和内切型壳聚糖酶的伴随存在，使得生产聚合度为2～10的壳寡糖成为一个难以解决的问题。
魏福卫等（详见：壳聚糖酶高产菌的筛选、鉴定与发酵产酶初探，上海海洋大学学报，2011年3月）筛出一株壳聚糖酶高产菌株，命名为浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH，基本发酵条件经优化后，发酵液中壳聚糖酶活力达到6.1U/mL。基本发酵条件为：按2%（V/V）的接种量接入发酵培养基进行摇瓶发酵，发酵温度30℃，转速150r/min，装液量100mL/250mL，摇床震荡培养60h。但是关于本发明的发酵方法，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，所得发酵液中壳聚糖酶的酶活力达35U/mL。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，所述的微生物是浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH。本发明所用菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号是CGMCC No.7742，保藏日是2013年6月18日，分类命名为Streptomyces roseolus。所述的发酵方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养2～4天以活化菌株；所述的平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.51～1.0g，K2HPO4 0.21～0.5g，氯化钠0.51～1.0g，硫酸镁0.01～0.2g，胶体壳聚糖1.01～1.2g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0～7.2；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，培养至种子液的OD600达到0.8～1.0，待用；所述的种子培养基配方为：蛋白胨0.51～1.0g，葡萄糖0.21～0.5g，氯化钠0.8～1.0g，K2HPO4 0.02～1.0g，KH2PO4 0.01～0.05g，酵母粉0.2～1.0g，硫酸镁0.02～0.08g，加水至100mL，自然pH；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比40%～70%的装液量装入发酵罐中，将步骤（2）中的种子液按体积百分比2.1%～3%的接种量接入发酵培养基中，所述的发酵罐为平叶涡轮搅拌型发酵罐，发酵过程中保持罐压0.08～0.11MPa，搅拌速率为180～250r/min，控制空气流速1.2～2.0m3/h，发酵温度为30～31℃，发酵时间为50～60h；所述的发酵培养基配方为：胶体壳聚糖0.9～1.2g，氯化钠0.8～1.0g，K2HPO4 0.05～0.15g，KH2PO4 0.04～0.2g，硫酸镁0.03～0.1g，酵母提取物0.2～2.0g，蛋白胨0.2～2.0g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.0～7.2；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，离心发酵液后合并上清液，即获得内切型壳聚糖酶的粗酶液。
所述的内切型壳聚糖酶水解壳聚糖的产物是聚合度为2～10的壳寡糖。
所述的胶体壳聚糖的制备方法为：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于0.1～2.0mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 9.0～10.0，以300～400目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀1～3次，直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀8～15min，打匀后即得胶体壳聚糖。
所述步骤（1）中的平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.6g，K2HPO4 0.3g，氯化钠0.52g，硫酸镁0.1g，胶体壳聚糖1.1g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0。
所述步骤（2）中种子液的OD600为0.9～1.0。
所述步骤（2）中的种子培养基配方为：蛋白胨0.6g，葡萄糖0.3g，氯化钠0.8g，K2HPO4 0.07g，KH2PO4 0.03g，酵母粉0.5g，硫酸镁0.05g，加水至100mL，自然pH。
所述步骤（3）中发酵罐的体积为10升，发酵培养基按体积百分比60%的装液量装入发酵罐。
所述步骤（3）中种子液按体积百分比3%的接种量接入发酵培养基，所述的搅拌速率为200r/min，空气流速为1.4m3/h，发酵温度为30.5℃，罐压为0.1MPa。
所述步骤（3）中的发酵培养基配方为：胶体壳聚糖1.0g，氯化钠0.8g，K2HPO4 0.07g，KH2PO4 0.04g，硫酸镁0.05g，酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.2。
所述步骤（4）中的离心条件为3000r/min转速下离心10min。
本发明方法得到的内切型壳聚糖酶的酶活测定方法为DNS法，酶活力单位定义为每分钟产生1μmol氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位（U），具体操作参照文献（详见：壳聚糖酶高产菌的筛选、鉴定与发酵产酶初探，上海海洋大学学报，魏福卫，蒋霞云，陈舜胜，陈道春，党培育）。
本发明方法优点在于：
1、本发明提供的发酵方法，可生产高活力的内切型壳聚糖酶，发酵液中内切型壳聚糖酶活力达到35U/mL，该酶液可直接运用于壳寡糖的生产，大大简化了工艺；
2、该发酵工艺简单，条件易控制，酶活收率高，发酵周期50～60小时，发酵周期短，发酵液处理简单，适合用于内切型壳聚糖酶的工业化生产。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明的实施例中所用试剂均为市售商品。菌株是浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH。发酵罐型号为SFY-10，体积10升，为平叶涡轮搅拌型发酵罐，生产公司为镇江江大科技有限公司。酶活测定中所用仪器分光光度计型号为T6新世纪，生产公司为北京普析通用有限公司。
实施例1
胶体壳聚糖的制备：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于0.2mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 9.5，以350目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀13min，打匀后即得胶体壳聚糖。
菌种活化中所用平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.6g，K2HPO4 0.3g，氯化钠0.52g，硫酸镁0.1g，胶体壳聚糖1.1g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0。121℃、灭菌20分钟，待用。
液体种子培养基配方为：蛋白胨0.6g，葡萄糖0.3g，氯化钠0.8g，K2HPO4 0.07g，KH2PO4 0.03g，酵母粉0.5g，硫酸镁0.05g，加水至100mL，自然pH。200mL培养基装入500mL三角瓶，用8层纱布、锡皮纸封口，放入121℃的灭菌锅中灭菌20分钟，待用。
发酵培养基配方为：胶体壳聚糖1.0g，氯化钠0.8g，K2HPO4 0.07g，KH2PO4 0.04g，硫酸镁0.05g，酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.2。
发酵过程包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用划线分离的方法，将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养3天以活化菌株；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，以未接种的培养基调零，培养至种子液的OD600达到0.9～1.0，待用；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比60%的装液量装入10L发酵罐中，再加入10mL的食用植物油作为消泡剂，按发酵罐的使用方法分别先后进行空消和培养基实消；将步骤（2）中的种子液按体积百分比3%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.1MPa，搅拌速率为200r/min，控制空气流速1.4m3/h，发酵温度为30.5℃，发酵时间为53h；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，发酵液在3000r/min转速下离心10min，最后合并上清液，即获得含有内切型壳聚糖酶的粗酶液。
对步骤（4）所得的粗酶液进行酶活测定，结果表明，发酵液中内切型壳聚糖酶的酶活力为35.2U/mL。
实施例2
胶体壳聚糖的制备：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于1.0mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 9.0，以300目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀15min，打匀后即得胶体壳聚糖。
菌种活化中所用平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.51g，K2HPO4 0.21g，氯化钠0.7g，硫酸镁0.01g，胶体壳聚糖1.01g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.1。121℃、灭菌20分钟，待用。
液体种子培养基配方为：蛋白胨0.51g，葡萄糖0.21g，氯化钠0.9g，K2HPO4 0.02g，KH2PO4 0.01g，酵母粉0.2g，硫酸镁0.02g，加水至100mL，自然pH。200mL培养基装入500mL三角瓶，用8层纱布、锡皮纸封口，放入121℃的灭菌锅中灭菌20分钟，待用。
发酵培养基配方为：胶体壳聚糖0.9g，氯化钠0.9g，K2HPO4 0.05g，KH2PO4 0.1g，硫酸镁0.03g，酵母提取物0.2g，蛋白胨0.2g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.0。
发酵过程包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用划线分离的方法，将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养2.5天以活化菌株；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，以未接种的培养基调零，培养至种子液的OD600达到0.8～0.9，待用；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比40%的装液量装入10L发酵罐中，再加入8mL的食用植物油作为消泡剂，按发酵罐的使用方法分别先后进行空消和培养基实消；将步骤（2）中的种子液按体积百分比2.1%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.08 MPa，搅拌速率为180r/min，控制空气流速1.2m3/h，发酵温度为30℃，发酵时间为50h；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，发酵液在3000r/min转速下离心12min，最后合并上清液，即获得含有内切型壳聚糖酶的粗酶液。
对步骤（4）所得的粗酶液进行酶活测定，结果表明，发酵液中内切型壳聚糖酶的酶活力为22.1U/mL。
实施例3
胶体壳聚糖的制备：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于0.1mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 10.0，以400目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀8min，打匀后即得胶体壳聚糖。
菌种活化中所用平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.8g，K2HPO4 0.25g，氯化钠0.8g，硫酸镁0.05g，胶体壳聚糖1.05g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0。121℃、灭菌20分钟，待用。
液体种子培养基配方为：蛋白胨0.65g，葡萄糖0.25g，氯化钠0.85g，K2HPO4 0.05g，KH2PO4 0.02g，酵母粉0.6g，硫酸镁0.07g，加水至100mL，自然pH。200mL培养基装入500mL三角瓶，用8层纱布、锡皮纸封口，放入121℃的灭菌锅中灭菌20分钟，待用。
发酵培养基配方为：胶体壳聚糖1.1g，氯化钠0.85g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.08g，硫酸镁0.06g，酵母提取物0.8g，蛋白胨0.8g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.1。
发酵过程包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用划线分离的方法，将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养4天以活化菌株；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，以未接种的培养基调零，培养至种子液的OD600达到0.9～1.0，待用；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比50%的装液量装入10L发酵罐中，再加入9mL的食用植物油作为消泡剂，按发酵罐的使用方法分别先后进行空消和培养基实消；将步骤（2）中的种子液按体积百分比2.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.11MPa，搅拌速率为220r/min，控制空气流速1.6m3/h，发酵温度为30.4℃，发酵时间为55h；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，发酵液在4000r/min转速下离心10min，最后合并上清液，即获得含有内切型壳聚糖酶的粗酶液。
对步骤（4）所得的粗酶液进行酶活测定，结果表明，发酵液中内切型壳聚糖酶的酶活力为31.7U/mL。
实施例4
胶体壳聚糖的制备：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于1.5mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 9.5，以300目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀14min，打匀后即得胶体壳聚糖。
菌种活化中所用平板培养基配方为：(NH4)2SO4 1.0g，K2HPO4 0.4g，氯化钠0.6g，硫酸镁0.15g，胶体壳聚糖1.15g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.2。121℃、灭菌20分钟，待用。
液体种子培养基配方为：蛋白胨0.55g，葡萄糖0.4g，氯化钠1.0g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.04g，酵母粉0.8g，硫酸镁0.08g，加水至100mL，自然pH。200mL培养基装入500mL三角瓶，用8层纱布、锡皮纸封口，放入121℃的灭菌锅中灭菌20分钟，待用。
发酵培养基配方为：胶体壳聚糖1.2g，氯化钠1.0g，K2HPO4 0.08g，KH2PO4 0.2g，硫酸镁0.08g，酵母提取物1.0g，蛋白胨1.0g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.0。
发酵过程包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用划线分离的方法，将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养3天以活化菌株；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，以未接种的培养基调零，培养至种子液的OD600达到0.9～1.0，待用；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比70%的装液量装入10L发酵罐中，再加入10mL的食用植物油作为消泡剂，按发酵罐的使用方法分别先后进行空消和培养基实消；将步骤（2）中的种子液按体积百分比3%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.1MPa，搅拌速率为240r/min，控制空气流速1.8m3/h，发酵温度为30.6℃，发酵时间为54h；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，发酵液在4000r/min转速下离心10min，最后合并上清液，即获得含有内切型壳聚糖酶的粗酶液。
对步骤（4）所得的粗酶液进行酶活测定，结果表明，发酵液中内切型壳聚糖酶的酶活力为28.5U/mL。
实施例5
胶体壳聚糖的制备：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于2.0mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 9.0，以350目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀10min，打匀后即得胶体壳聚糖。
菌种活化中所用平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.7g，K2HPO4 0.5g，氯化钠1.0g，硫酸镁0.2g，胶体壳聚糖1.2g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.1。121℃、灭菌20分钟，待用。
液体种子培养基配方为：蛋白胨0.8g，葡萄糖0.5g，氯化钠0.9g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.03g，酵母粉1.0g，硫酸镁0.04g，加水至100mL，自然pH。200mL培养基装入500mL三角瓶，用8层纱布、锡皮纸封口，放入121℃的灭菌锅中灭菌20分钟，待用。
发酵培养基配方为：胶体壳聚糖1.05g，氯化钠0.95g，K2HPO4 0.15g，KH2PO4 0.15g，硫酸镁0.1g，酵母提取物2.0g，蛋白胨2.0g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.1。
发酵过程包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用划线分离的方法，将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养2天以活化菌株；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，以未接种的培养基调零，培养至种子液的OD600达到0.95～1.0，待用；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比60%的装液量装入10L发酵罐中，再加入10mL的食用植物油作为消泡剂，按发酵罐的使用方法分别先后进行空消和培养基实消；将步骤（2）中的种子液按体积百分比3%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.1MPa，搅拌速率为250r/min，控制空气流速2.0m3/h，发酵温度为31℃，发酵时间为60h；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，发酵液在3000r/min转速下离心10min，最后合并上清液，即获得含有内切型壳聚糖酶的粗酶液。
对步骤（4）所得的粗酶液进行酶活测定，结果表明，发酵液中内切型壳聚糖酶的酶活力为32.9U/mL。
实施例6
胶体壳聚糖的制备：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于0.5mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 10.0，以400目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀12min，打匀后即得胶体壳聚糖。
菌种活化中所用平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.65g，K2HPO4 0.35g，氯化钠0.9g，硫酸镁0.12g，胶体壳聚糖1.08g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0。121℃、灭菌20分钟，待用。
液体种子培养基配方为：蛋白胨1.0g，葡萄糖0.35g，氯化钠0.8g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 0.05g，酵母粉0.4g，硫酸镁0.06g，加水至100mL，自然pH。200mL培养基装入500mL三角瓶，用8层纱布、锡皮纸封口，放入121℃的灭菌锅中灭菌20分钟，待用。
发酵培养基配方为：胶体壳聚糖1.0g，氯化钠0.8g，K2HPO4 0.12g，KH2PO4 0.06g，硫酸镁0.04g，酵母提取物1.5g，蛋白胨1.5g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.0。
发酵过程包括以下步骤：
（1）菌种活化：采用划线分离的方法，将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养2天以活化菌株；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，以未接种的培养基调零，培养至种子液的OD600达到0.9～0.95，待用；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比50%的装液量装入10L发酵罐中，再加入9mL的食用植物油作为消泡剂，按发酵罐的使用方法分别先后进行空消和培养基实消；将步骤（2）中的种子液按体积百分比2.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.1MPa，搅拌速率为200r/min，控制空气流速1.5m3/h，发酵温度为30.8℃，发酵时间为58h；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，发酵液在3000r/min转速下离心10min，最后合并上清液，即获得含有内切型壳聚糖酶的粗酶液。
对步骤（4）所得的粗酶液进行酶活测定，结果表明，发酵液中内切型壳聚糖酶的酶活力为31.3U/mL。
实施例7  内切型壳聚糖酶降解壳聚糖制备壳寡糖
在1000mL烧杯内加入去离子水500mL，搅拌下加入壳聚糖25g，然后加入冰乙酸7.5mL，继续搅拌直至溶解成胶体，pH值控制在5.0～5.5。按内切型壳聚糖酶活力/壳聚糖=5U/g的比例关系加入实施例1发酵所得的粗酶液，混匀，酶解反应温度控制在45℃，酶解反应时间为5小时，最后用超滤膜过滤得酶解液。超滤后的酶解液经浓缩后进行喷雾干燥，得到壳寡糖产品，经高效液相色谱鉴定，壳寡糖产品的聚合度为2～10。
高效液相色谱条件为：
click maltose色谱柱，250×4.6 mm；
蒸发光散射检测器，检测器温度80℃，检测器通气量1.5L/min；
缓冲液甲酸-甲酸铵的pH为3.1，浓度为100mmol/L；
色谱柱温度30℃，进样量20μL，洗脱液流速1.0mL/min；
采用梯度洗脱，具体见表1：
表1  梯度洗脱程序（单位：体积百分比）
Figure 510917DEST_PATH_IMAGE001
。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，所述的微生物是浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
    （1）菌种活化：将保存的浅玫瑰色链霉菌Streptomyces roseolus DH接种于以胶体壳聚糖为唯一碳源的平板培养基，在30℃培养箱内倒置培养2～4天以活化菌株；所述的平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.51～1.0g，K2HPO4 0.21～0.5g，氯化钠0.51～1.0g，硫酸镁0.01～0.2g，胶体壳聚糖1.01～1.2g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0～7.2；
（2）种子液培养：挑取活化后的单菌落接种于液体种子培养基，在150r/min、30℃条件下进行摇床扩培菌株，培养至种子液的OD600达到0.8～1.0，待用；所述的种子培养基配方为：蛋白胨0.51～1.0g，葡萄糖0.21～0.5g，氯化钠0.8～1.0g，K2HPO4 0.02～1.0g，KH2PO4 0.01～0.05g，酵母粉0.2～1.0g，硫酸镁0.02～0.08g，加水至100mL，自然pH；
（3）发酵罐发酵产酶：发酵培养基按体积百分比40%～70%的装液量装入发酵罐中，将步骤（2）中的种子液按体积百分比2.1%～3%的接种量接入发酵培养基中，所述的发酵罐为平叶涡轮搅拌型发酵罐，发酵过程中保持罐压0.08～0.11MPa，搅拌速率为180～250r/min，控制空气流速1.2～2.0m3/h，发酵温度为30～31℃，发酵时间为50～60h；所述的发酵培养基配方为：胶体壳聚糖0.9～1.2g，氯化钠0.8～1.0g，K2HPO4 0.05～0.15g，KH2PO4 0.04～0.2g，硫酸镁0.03～0.1g，酵母提取物0.2～2.0g，蛋白胨0.2～2.0g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.0～7.2；
（4）粗酶液的收集：发酵完毕后收罐出料，离心发酵液后合并上清液，即获得内切型壳聚糖酶的粗酶液。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述的内切型壳聚糖酶水解壳聚糖的产物是聚合度为2～10的壳寡糖。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述的胶体壳聚糖的制备方法为：壳聚糖以1g/L的浓度溶解于0.1～2.0mol/L的HC1溶液，室温下搅拌过夜，加入等摩尔浓度的NaOH溶液，中和至pH 9.0～10.0，以300～400目纱绢过滤得絮状沉淀，并用水重复洗涤沉淀1～3次，直到pH为中性，最后用10000r/mim的速度匀浆处理沉淀8～15min，打匀后即得胶体壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的平板培养基配方为：(NH4)2SO4 0.6g，K2HPO4 0.3g，氯化钠0.52g，硫酸镁0.1g，胶体壳聚糖1.1g，琼脂2.0g，加水至100mL，pH 7.0。
5.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（2）中种子液的OD600为0.9～1.0。
6.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的种子培养基配方为：蛋白胨0.6g，葡萄糖0.3g，氯化钠0.8g，K2HPO4 0.07g，KH2PO4 0.03g，酵母粉0.5g，硫酸镁0.05g，加水至100mL，自然pH。
7.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵罐的体积为10升，发酵培养基按体积百分比60%的装液量装入发酵罐。
8.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（3）中种子液按体积百分比3%的接种量接入发酵培养基，所述的搅拌速率为200r/min，空气流速为1.4m3/h，发酵温度为30.5℃，罐压为0.1MPa。
9.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的发酵培养基配方为：胶体壳聚糖1.0g，氯化钠0.8g，K2HPO4 0.07g，KH2PO4 0.04g，硫酸镁0.05g，酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，加水至100mL，用2mol/L盐酸调pH至7.2。
10.根据权利要求1所述的微生物发酵制备内切型壳聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的离心条件为3000r/min转速下离心10min。
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