CN102796718B

CN102796718B - 一种纤维素酶水解促进剂及其应用

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Publication number: CN102796718B
Application number: CN201210283056.3A
Authority: CN
Inventors: 蒋建新; 唐勇; 赵鹏翔; 朱莉伟
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-08-09
Also published as: CN102796718A

Abstract

本发明涉及一种纤维素酶水解促进剂及其应用。所述纤维素酶水解促进剂是将酵母或酵母废弃物加入到水中，混匀，调pH值，加热处理得到。本发明的纤维素酶水解促进剂制备工艺简单，易于实现，和现有工业具有良好兼容性，能明显提高酶水解效率，具有良好的生物兼容性，能同时作为发酵微生物优良的营养源，其能取代合成培养基，大大降低发酵培养基的成本，所用原料酵母价格低廉，来源广泛，能为生物转化过程提供碳源。本发明方法可降低酶水解木质纤维原料过程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同时较大程度降低下游转化过程化学品的消耗。

Description

一种纤维素酶水解促进剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种酶水解促进剂，尤其是一种纤维素酶水解促进剂及其应用。

背景技术

在化石能源即将消耗殆尽的今天，开发可再生能源是人类维持社会发展的必然趋势。燃料乙醇的使用能降低化石燃料的用量，减轻日益严重的化石环境污染问题，因此世界各国都在大力开发燃料乙醇生产技术。燃料乙醇作为目前应用最为广泛的可再生机动燃料，其商业化生产主要以淀粉和糖类作物为原料，如世界乙醇产量第一大国（巴西）就以甘蔗作为原料进行生产，美国则以玉米作为原料进行生产。近年来，商业化使用玉米等粮食作物进行生产导致粮食价格的上涨，加剧了世界粮食危机，迫使世界各国提倡以非粮食原料进行燃料乙醇的生产与开发。我国作为人口大国，粮食安全显得尤为重要，因此我国也明确强调开发使用非粮食原料进行乙醇生产。

木质纤维生物质作为地球储量最为丰富的生物质资源，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，纤维素和半纤维素通过化学法或者酶法可以降解为单体糖，这些单糖通过微生物酵母发酵可以转化为燃料乙醇。木质纤维原料转化为燃料乙醇过程，因为具有广泛原料来源，工艺环境友好，条件温和，是目前世界研究开发热点。木质纤维原料具有比淀粉类原料更为复杂的结构，纤维素被半纤维素和木质素包裹着，这种结构使得木质纤维原料具有更高的稳定性和抗生物降解性。实现生物转化首先要先将纤维素和半纤维素等多糖类物质降解为微生物能代谢的单糖物质，目前常用酸水解和酶水解。作为传统工艺，酸水解具有较高的效率，但是酸水解工艺对设备要求高，需要脱毒和中和过程，不符合绿色化工原则，不代表未来发展方向。酶水解具有条件温和，环境友好以及水解过程和后期发酵过程兼容性好等特点，是目前研究最多的工艺。植物纤维素资源是地球上最大的可利用的再生资源，有效地水解纤维素为葡萄糖进而发酵为乙醇等，将会减轻人类粮食和能源的压力。

但是，酶水解工艺目前还不具备规模化应用的可能，这由三方面的原因导致：1、酶生产成本居高，尽管研究致力于不断降低酶生产成本，04年美国的可再生能源实验室将酶生产成本降低到了原来的1/10，酶生产成本仍然达不到规模应用的要求；2、木质纤维原料复杂的结构降低了纤维素酶对纤维素的可及性，也就是降低了酶水解效率，增大酶用量；3、原料中木质素吸附部分纤维素酶组分，这也大大降低酶有效组分浓度。

目前，提高纤维素酶水解效率的方法如下：1）选育和开发能生产高效酶系的菌株，采用过程集成技术去消除酶浓缩成本从而降低酶生产成本；2）对原料进行预处理提高纤维素酶的可及性，或者采用一些工业废弃木质纤维素作为原料，这些原料通常在其产生过程中已经过了一些处理，具有疏松结构，易于被酶水解；3）采用表面活性剂降低木质素对酶组分的吸附，或者通过一定预处理降低原料中木质素的含量。木质素通过植物的光合作用产生，基本结构为苯丙烷，木质素的存在会阻碍酶与底物的接触，导致酶水解效率降低。

采用表面活性剂是行之有效且实用的一种方法，但化学合成表面活性剂合成成本高，同时其生物难降解性会增加下游生物转化和产物分离过程的负担。天然表面活性剂中蛋白类具有独特的优点，其能作为下游生物转化过程的潜在营养-氮源。尽管牛血清蛋白等精制的蛋白提高酶活的效果显著，但其不适合用作酶水解添加剂，因为其同样具有高的生产成本。因此，开发低廉有效的蛋白作为表面活性剂成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶水解促进剂及其在提高纤维素酶水解效率中的应用。

所述纤维素酶水解促进剂是将酵母或酵母废弃物加入到水中，混匀，调pH值，加热处理得到。

上述酵母废弃物可进一步离心，取轻相部分处理。

其中，调pH值至2.0-7.5，所述加热处理的处理温度：100-121℃；处理时间：5-60min。

本发明还提供一种提高纤维素酶水解效率的方法，包括在纤维素原料中加入上述纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解。

具体地，包括以下步骤：

1）对糠醛渣水溶液进行碱中和、过滤，得到糠醛渣滤渣；

2）糖化：加入上述纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解，得酶水解液。

所述糠醛渣水溶液含有9-12%的糠醛渣，所述碱中和为用固体NaOH中和糠醛渣水溶液至pH5~6，所述糠醛渣滤渣含水量80~85%。

所述糖化为处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为3~9%糠醛渣（w/v），纤维素酶用量12-15FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度10g/l-30g/l，糖化温度为45-47℃，糖化时间48-96h。

其中，步骤2）中所述纤维素酶由适应性培养的拟康氏木霉得到。

所述拟康氏木霉的适应性培养的条件：在2%糠醛渣固体培养基上培养拟康氏木霉菌种的孢子；将孢子用生理盐水稀释；将孢子悬浮液接种到含糠醛渣的液体产酶培养基中培养，所述2%糠醛渣固体培养基组成为4g糠醛渣、200ml Mandels营养盐和4g琼脂，所述液体产酶培养基为马铃薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。

在步骤2）得到的酶水解液中进一步加入接种浓度1.25g/l的酵母或加入接种浓度3g/l的乳酸菌，温度为38-42℃，发酵72-120h，pH值5.5-6.5，进行发酵，得到乙醇或乳酸。

其中，所述酵母或乳酸菌经步骤1）中所述过滤得到的糠醛渣中和滤液进行适应性培养。

适应性培养条件为每kg活菌加入15L糠醛渣中和滤液，使乳酸菌或酵母在发酵使用前提前适应含抑制物发酵液环境。

所述乳酸菌的适应性培养的条件为培养温度为30-32℃，培养时间为32-45h，pH值6.0-6.5，培养基组成：KH₂PO₄ 0.5g/l，MgSO₄·7H₂O0.5g/l，NaCl 0.1g/l，固体CaCO₃ 2%(w/v)，糠醛渣中和滤液。

所述酵母的适应性培养的条件为培养温度为30-32℃，培养时间为18-24h，pH值4.5-6.0，培养基组成：KH₂PO₄0.5g/l，MgSO₄·7H₂O0.5g/l，糠醛渣中和滤液。

所述纤维素酶水解促进剂的活性组分主要是低分子量的蛋白质或肽类物质，通过酸热处理可使大分子酵母蛋白降解为低分子量物质。

本发明的有益效果：

（1）本发明酶水解促进剂原料酵母价格低廉，来源广泛，其能从工业废弃资源中获得。

（2）本发明酶水解促进剂制备工艺简单，易于实现，和现有工业具有良好兼容性。

（3）本发明酶水解促进剂能明显提高酶水解效率。

（4）本发明酶水解促进剂具有良好的生物兼容性，其加入基本对后期生物转化无抑制作用。

（5）本发明酶水解促进剂能同时作为发酵微生物优良的营养源，其能取代合成培养基，大大降低发酵培养基的成本。

（6）本发明原料酵母含有一定量的多糖（约20%），同样能为生物转化过程提供碳源，实现酵母组分的全利用。

（7）本发明原料可降低酶水解木质纤维原料过程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同时较大程度降低下游转化过程化学品的消耗。

附图说明

图1为本发明的工艺流程。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。质量体积比（w/v）为g/l，工业糠醛渣购自河北春蕾集团，含水量55~60%，pH值2~3。拟康氏木霉菌购自中国工业微生物保藏管理中心。酵母为耐高温型安琪活性干酵母，乳酸菌为嗜热乳杆菌，均为市售商品。

实施例1

1、糠醛渣预处理脱毒过程

向10%的糠醛渣水溶液中加入固体NaOH调pH5，搅拌0.5h后，进行过滤，得糠醛渣滤渣，滤渣含水量80~85%。

2、1）制备纤维素酶水解促进剂

按照6%（w/v）的比例将纯酵母加入水中，调节pH值为7.0，搅拌10min使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度：121℃；处理时间：10min，处理液备用。

2）制备纤维素酶

将在2%糠醛渣固体培养基（4g糠醛渣+200ml Mandels营养盐+4g琼脂）上培养好的拟康氏木霉菌种的孢子用无菌生理盐水稀释至孢子悬浮液的浓度为1×10⁸个/mL，将5mL孢子悬浮液接种到含50mL糠醛渣的液体产酶培养基（马铃薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然）的250mL的烧瓶中，并在32℃下，转速150r/min，pH4.8条件下放入恒温培养振荡器中培养15天得到。

3、糖化

处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为3%糠醛渣滤渣（w/v），纤维素酶用量12FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，加水至酶水解体系1L，糖化温度为45℃，糖化时间48h。

实施例2

步骤同实施例1，不同之处在于纤维素酶水解促进剂浓度为20g/l。

实施例3

步骤同实施例1，不同之处在于纤维素酶水解促进剂浓度为30g/l。

实施例4

步骤同实施例1，不同之处在酵母溶液进行加热处理的处理时间：60min。

实施例5（对照例）

步骤同实施例1，不同之处在糖化步骤中未加纤维素酶水解促进剂。

实施例6

1、糠醛渣预处理脱毒过程：向10%的糠醛渣水溶液中加入固体NaOH至pH6，搅拌0.5h后，进行过滤，得糠醛渣滤渣。滤液用于乳酸菌的适应性培养，培养时每公斤活菌加入15L糠醛渣中和滤液。

2、1）纤维素酶水解促进剂：按照6%（w/v）的比例将酵母废弃物加入水中，调节pH值为7.0，搅拌10min使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度：121℃；处理时间：30min，离心，取轻相部分得到处理液备用。

2）制备纤维素酶：同实施例1。

3）乳酸菌适应性培养：培养温度为32℃，培养时间为36h，pH值6.0，培养基组成：KH₂PO₄ 0.5g/l，MgSO₄·7H₂O 0.5g/l，NaCl 0.1g/l，固体CaCO₃ 2%(w/v)，糠醛渣中和滤液。

3、分步糖化发酵：处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为5%糠醛渣（w/v），不加发酵培养基，加固体CaCO₃5%(w/v)，纤维素酶用量15FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，加水至酶水解体系1L，糖化温度为45℃，糖化时间48h。加入适应性培养过的乳酸菌，乳酸菌接种浓度1.25g/l，温度为42℃，发酵72h，pH值5.5，进行发酵。

实施例7

2、1）纤维素酶水解促进剂：按照6%（w/v）的比例将酵母废弃物加入水中，调节pH值为2.0，搅拌10min使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度：121℃；处理时间：30min，离心，取轻相部分得到处理液备用。

2）制备纤维素酶：同实施例1。

3、分步糖化发酵：处理后的糠醛渣滤渣经过灭菌装入糖化罐，糖化条件为9%糠醛渣（w/v），不加发酵培养基，加固体CaCO₃5%(w/v)，纤维素酶用量15FPU/g糠醛渣滤渣，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，加水至酶水解体系1L，糖化温度为47℃，糖化时间96h。加入适应性培养过的乳酸菌，乳酸菌接种浓度1.25g/l，温度为42℃，发酵72h，pH值5.5，进行发酵。

实施例8（对照例）

步骤同实施例6，不同之处在于未加纤维素酶水解促进剂。

实施例9（对照例）

步骤同实施例6，不同之处在于未加纤维素酶水解促进剂，步骤3中加入发酵培养基，成分：KH₂PO₄ 0.5g/l；MgSO₄·7H₂O 0.5g/l；NaCl0.1g/l；牛肉膏5g/l。

实施例10

1、糠醛渣预处理脱毒过程：同实施例6。

2、1）纤维素酶水解促进剂：按照6%（w/v）的比例将纯酵母加入水中，调节pH值为7.0，搅拌10min使酵母分散均匀，之后对酵母溶液进行加热处理，处理温度：121℃；处理时间：30min，处理液备用。

2）制备纤维素酶：同实施例6。

3）乳酸菌适应性培养：同实施例6。

3、葡萄糖发酵：67g/l葡萄糖（w/v），加入适应性培养过的乳酸菌，加固体CaCO₃ 70g/l，加入纤维素酶水解促进剂浓度为10g/l，乳酸菌接种浓度1.25g/l，温度为42℃，发酵96h，pH值5.5，进行发酵。

实施例11

步骤同实施例9，不同之处在于酵母加热处理时间30min。

实施例12

步骤同实施例9，不同之处在于酵母加热处理时间60min。

实施例13

步骤同实施例9，不同之处在于酵母加热处理温度100℃。

实施例14（对照例）

步骤同实施例9，不同之处在于未加纤维素酶水解促进剂。

实施例15（对照例）

步骤同实施例9，不同之处在于，未加纤维素酶水解促进剂，在步骤3中加入发酵培养基，成分：KH₂PO₄ 0.5g/l；MgSO₄·7H₂O 0.5g/l；NaCl 0.1g/l；牛肉膏5g/l。

实施例16纤维素酶活性分析

1、3%糠醛渣的酶水解生产葡糖糖，如表1。

表1 3%糠醛渣酶水解的葡萄糖产量

处理组

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

葡萄糖浓度g/l

14.8

15.6

16.9

16.2

9.48

由表1可以看出纤维素酶水解糠醛渣时，葡萄糖产量随纤维素酶水解促进剂浓度的增加，产量增高；随纤维素酶水解促进剂作用时间的延长，产量增高。

2、5-9%糖醛渣分步糖化发酵生产乳酸，计算基准为糠醛渣的纤维素，结果如表2。

表2 5-9%糖醛渣分步糖化发酵的乳酸产量

处理组	实施例6	实施例7	实施例8	实施例9
					乳酸g/l	24.23	23.9	16.3	23.7
产率%	98.9	97.1%	66.6	96.7

由表2看出：分步糖化发酵生产乳酸时，营养源的加入能提高乳酸产率；当使用纤维素酶水解促进剂替代合成培养基加入时，乳酸产量增加。

3、葡萄糖发酵生产乳酸

表3 67g/l葡萄糖发酵的乳酸产量

处理组	实施例10	实施例11	实施例12	实施例13	实施例14	实施例15
							乳酸g/l	63.0	65.7	63.3	62.2	21.8	55.9

由表3看出：1）当使用葡萄糖发酵生产乳酸时，加入培养基能大幅度提高乳酸产量；加入纤维素酶水解促进剂，乳酸产量高于加入培养基时的产量；2）121℃处理的处理液具有比100℃处理的处理液更好的效果；121℃下，随时间的增加，乳酸产量先增后减，处理时间为30min时乳酸产量最大。

实施例17酵母处理液的表面张力

水中加入一定处理条件下处理的纤维素酶水解促进剂，使其浓度达到10g/l，水体系的表面张力的改变。

1、未加纤维素酶水解促进剂的水体系；

2、加入在处理条件（121℃，10min，pH=7.0）下处理得到的纤维素酶水解促进剂的水体系；

3、加入在处理条件（121℃，30min，pH=7.0）下处理得到的纤维素酶水解促进剂的水体系；

4、加入在处理条件（121℃，60min，pH=7.0）下处理得到的纤维素酶水解促进剂的水体系；

5、加入在处理条件（100℃，60min，pH=7.0）下处理得到的纤维素酶水解促进剂的水体系；

6、加入在处理条件（100℃，30min，pH=7.0）下处理得到的纤维素酶水解促进剂的水体系；

7、加入在处理条件（100℃，10min，pH=7.0）下处理得到的纤维素酶水解促进剂的水体系。

表4 不同处理条件的纤维素酶水解促进剂表面张力

处理组	1	2	3	4	5	6	7
								表面张力Nm/m	72	50.39	52.13	49.03	60.11	58.17	66.14

由表4看出：纤维素酶水解促进剂具有表面活性的蛋白组分，纤维素酶水解促进剂能明显将低水体系的表面张力；随着处理温度的上升，纤维素酶水解促进剂表面活性增加；随着处理时间的增加，纤维素酶水解促进剂表面活性增加。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种纤维素酶水解促进剂，其特征在于，按照6%（w/v）的比例将酵母加入到水中，混匀，调pH值为7.0，100-121℃加热处理10-60min得到；其中，所述酵母为耐高温型安琪活性干酵母，所述纤维素酶水解促进剂在水中浓度为10g/l时，水体系的表面张力为49.03-72Nm/m。

2.一种提高纤维素酶水解效率的方法，其特征在于，在纤维素原料中加入权利要求1所述的纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解；

其中，所述纤维素酶由拟康氏木霉经适应性培养得到，适应性培养的条件为：

1）在2%糠醛渣固体培养基上培养拟康氏木霉菌种的孢子；

2）将孢子用生理盐水稀释；

3）将孢子悬浮液接种到含糠醛渣的液体产酶培养基中培养；

所述2%糠醛渣固体培养基为4g糠醛渣、200ml Mandels营养盐和4g琼脂；所述液体产酶培养基为马铃薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）纤维素原料处理：对糠醛渣水溶液进行碱中和、过滤，得到糠醛渣滤渣；

2）糖化：加入所述纤维素酶水解促进剂、纤维素酶进行酶水解，得酶水解液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述糖化的条件：糠醛渣滤渣浓度3～9%（w/v），纤维素酶用量12-15FPU/g糠醛渣滤渣，纤维素酶水解促进剂浓度10g/l-30g/l，糖化温度为45-47℃，糖化时间48-96h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，酶水解液进一步加入酵母生产乙醇或乳酸菌生产乳酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母或乳酸菌经步骤1）中所述过滤得到的糠醛渣中和滤液适应性培养，配比为15L滤液：1kg活菌。

7.权利要求1所述纤维素酶水解促进剂在提高纤维素酶水解效率中的应用。