CN103404439B - 一种菊芋不定芽诱导及植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
一种菊芋不定芽诱导及植株再生的方法，该方法是诱导菊芋愈伤组织再分化生成不定芽并最终长成完整植株。主要步骤如下：将菊芋种子进行消毒处理后，接种到MS培养基上使其萌发，取幼苗的子叶和下胚轴作为外植体，接到诱导培养基上，诱导的愈伤组织形成不定芽，再转移至成熟培养基培养，当不定芽长至0.5-2cm时，从基部切下小芽并移到生根培养基上，使其长成完整植株。其中不定芽诱导率可以达到10%以上，本发明为以后的菊芋分子育种等现代育种工作奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地说，是涉及一种菊芋不定芽诱导及植株再生的方法。
背景技术
菊芋是菊科（Compositae）向日葵属中能形成地下块茎的栽培种，又称洋生姜、洋姜、鬼子姜等，学名HelianthustuberosusL，在全球的热带、温带、寒带以及干旱、半干旱地区都有菊芋的分布和栽培，菊芋适应性强，喜温暖，但耐寒；喜湿润，但耐旱；喜肥沃，但耐贫瘠，耐盐碱。菊芋被用于梯田和不牢固的沙地抗腐蚀保护植物篱，可以防护山体水土流失、固沙防风。菊芋块茎是工业、食品、保健品和饮料等行业的重要原料。据测定，鲜菊芋块茎中含水80%左右，其余是干物质，蛋白质1.0%，粗纤维16.6%，灰分2.8%及一定量的维生素。其中，干物质的70%~80%是碳水化合物，其主要成份是菊粉（Inulin）。菊芋块茎中含有人体必需的氨基酸占0.09%、苏氨酸占0.8%、异亮氨酸占0.09%、蛋氨酸占0.09%、色氨酸占0.24%、组氨酸占0.06%、精氨酸占0.12%、苯丙氨酸占0.13%。菊芋块茎可利用现代生物技术制成菊粉、低聚果糖和超高果糖浆，这些都是当今保健食品全新的、多功能配料，是一种全水溶性的膳食纤维，同时还是人体肠道中双歧杆菌的增殖因子，具有特殊的保健和抗癌作用。菊芋块茎性味甘平、无毒、能利水去湿、和中益胃，具有清热解毒的功效。它是糖尿病、高血压病、肥胖病等患者的良好食品。此外，菊芋块茎还可进行酒精发酵，是一种新兴的有潜力的能源植物和经济作物。
菊芋的繁殖方式有两种，一是像大多数被子植物一样通过双受精作用形成合子胚（种子），即有性繁殖，二是通过地下块茎的芽点进行无性繁殖。由于菊芋在自然条件下的结籽率和种子的萌发率极低，所以生产上通常使用块茎进行无性繁殖。但这种方式并不利于对菊芋的育种工作，因为菊芋种子很难获得，且发芽率极低，所以传统的杂交育种很难实现。随着现代生物技术的发展，体外诱变和基因工程等现代分子育种手段越来越多地应用于各种农作物中，然而菊芋是公认的难愈伤再生植物，很难从愈伤组织获得再生植株，这使得通过组织培养技术进行菊芋种质创新变得尤为困难。目前菊芋的组织培养进展依然缓慢，国外主要集中在向日葵和菊芋的杂交品种的组织培养体系的研究上，国内则主要是利用腋芽和茎尖进行扩繁以及用菊芋的块茎和茎尖进行体外诱变和多倍体诱变，但真正的通过愈伤组织诱导形成完整植株的菊芋组培体系还未见报道。
发明内容：
解决的技术问题：本发明的目的是提供一种能够诱导菊芋愈伤组织再分化生成不定芽并最终获得完整植株的方法。
技术方案：菊芋不定芽诱导及植株再生的方法，包括如下步骤：
(1)种子萌发：将菊芋种子去壳，消毒后接种到MS培养基上，先暗培养2-4天，再光照培养1-2天；
(2)不定芽诱导：以幼嫩的子叶和下胚轴作为外植体，接到不定芽诱导培养基上，暗培养2周，转移到成熟培养基上，暗培养2-4周，待愈伤组织分化出不定芽后，转到光照条件下培养；所述不定芽诱导培养基的成分是MS盐+5.0g/LKNO3+100mg/L肌醇+500mg/L水解酪蛋白+30-100g/L蔗糖+8.0g/L琼脂+0-0.1mg/LNAA+0.05-0.3mg/L6-BA，pH5.6-5.8；成熟培养基的成分是在MS盐+100mg/L肌醇+500mg/L水解酪蛋白+30-100g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH5.6-5.8；
(3)生根培养：当不定芽长到0.5-2cm时，从基部切下小芽转到生根培养基上，暗培养2-4天，再转到光照条件下进行生根培养，最终获得完整植株；所述生根培养基的成分是1/2MS盐+30mg/L蔗糖+7mg/L琼脂+0.03mg/LIBA，pH5.6-5.8。
所述暗培养的温度为25-28℃；光照培养条件为：25-28℃，光照12-16h/d，光照强度1500-1800Lux。
去壳种子的消毒包括如下步骤：在超净台里先用无菌水冲洗3遍，再用75%vt酒精消毒30秒，无菌水冲洗2遍，再用4%wt次氯酸钠消毒6-7分钟，无菌水冲洗5-6遍，最后用无菌滤纸吸干水分。
有益效果：本发明所提供的菊芋不定芽诱导及植株再生的方法，具有如下优点和积极效果：
1)本发明是诱导菊芋的愈伤组织生成不定芽并最终获得完整植株，不同于以带有生长点的茎尖和腋芽为材料的扩繁体系，是真正的菊芋组织培养体系，为之后的菊芋基因工程育种工作奠定了基础。
2)本发明适用于多个菊芋品种，只要能获得可以萌发的种子，均可用本方法得到完整的愈伤组织再生植株，但其中以南芋九号品种的实验结果最好，不定芽诱导率可以达到10%以上，且重复性较好。
附图说明
图1为菊芋愈伤组织上诱导出的不定芽；
图2为转到光照培养后，不定芽成熟变绿；
图3为经生根培养后最终获得的完整植株；
图4为经生根培养后最终获得的完整植株的根系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的MS培养基和1/2MS培养基均购买自青岛高科园海博生物技术有限公司的成品粉末试剂，组织培养容器购买自上海稼丰园艺有限公司，直径约7.5cm，高度有6.5cm和9cm（生根用）两种，PE材质，其他材料、试剂等如无特殊说明，也均可从商业途径得到。
实施例1：
方法中所使用的菊芋品种为南芋九号，由南京农业大学资环学院海洋滩涂资源实验室提供，栽种于江苏省盐城大丰市金海农场，11月份块茎收获时从地上秸秆的花中搜集籽粒饱满的种子，置于4℃冰箱中保存。
1）菊芋种子萌发：将菊芋种子去壳，在超净台里先用无菌水冲洗3遍，再用75%vt酒精消毒30秒，无菌水冲洗2遍，再用4%wt次氯酸钠消毒7分钟，最后无菌水冲洗6遍，在滤纸上将水分吸干，接种到含有MS培养基的培养皿上，暗培养4天。
2）外植体制备：选择幼苗的子叶和下胚轴作为外植体，其中子叶选择已经伸展开来，较厚且颜色为绿色的最好，用无菌镊子和手术刀切下子叶，并去掉叶尖部分，在切取子叶和下胚轴的过程中，注意避免外植体上带有茎尖或腋芽的生长点。
3）不定芽诱导培养基的制备：在MS培养基的基础上进行改良，每升MS培养基添加500mg水解酪蛋白、50g蔗糖、47μgNAA、60μg6-BA，将配好的培养基进行116℃，30min的高温高压灭菌后，分装于灭菌的组织培养容器中，每个容器装大约50mL培养基。
4）不定芽诱导培养：将外植体接到不定芽诱导培养基上，每个培养罐接3个，暗培养20天后，转到光照条件下培养1周。可以观察到不定芽从外植体上直接长出，愈伤组织很小或无法肉眼观察到。试验统计不定芽的诱导率=总的不定芽个数/总的外植体个数=14.3%。
5）生根培养基制备：生根培养基是在1/2MS培养基的基础上添加30μg/LIBA，将配好的培养基116℃，30min高温高压灭菌后分装于组织培养容器中，每个容器装大约70mL培养基。
6）生根培养：当不定芽长到0.5-2cm时，从基部切下小芽转到生根培养基上，每个容器接1-2个无根苗，暗培养3天后，转到光照条件下培养1-2周，最终获得完整植株。
实施例2：实验所用的菊芋种子材料同实施例1中的相同。
1）菊芋种子萌发：将菊芋种子去壳，在超净台里先用无菌水冲洗3遍，再用75%vt酒精消毒30秒，无菌水冲洗2遍，再用4%wt次氯酸钠消毒6-7分钟，最后无菌水冲洗5-6遍。消毒后接种到MS培养基上，先暗培养2天，再光照培养1天。
2）外植体制备：选择幼苗的子叶和下胚轴作为外植体，其中子叶选择已经伸展开来，较厚且颜色为绿色的最好，用无菌镊子和手术刀切下子叶，并去掉叶尖部分，在切取子叶和下胚轴的过程中，注意避免外植体上带有茎尖或腋芽的生长点。
3）不定芽诱导培养基和成熟培养基的制备：两种培养基都是在MS培养基的基础上进行改良，其中不定芽诱导培养基中每升MS培养基添加5.0gKNO3、100mg肌醇、500mg水解酪蛋白、50g蔗糖、1.0g琼脂、47μgNAA、235μg6-BA，成熟培养基是在每升MS培养基中添加100mg肌醇、500mg水解酪蛋白、50g蔗糖、1.0g琼脂。将配好的两种培养基进行116℃，30min的高温高压灭菌后，分装于灭菌的组织培养容器中，每个容器装大约50mL培养基。
4）不定芽诱导培养：将外植体接到不定芽诱导培养基上，每个培养罐接种3个，暗培养2周，可以观察到外植体经诱导脱分化形成了愈伤组织，转移到成熟培养基上，暗培养2-3周后，愈伤组织再分化出不定芽，转到光照条件下培养。试验统计不定芽的诱导率=总的不定芽个数/总的外植体个数=16.7%。
5）生根培养基制备：生根培养基是在1/2MS培养基的基础上添加30μg/LIBA，将配好的培养基116℃，30min高温高压灭菌后分装于组织培养容器中，每个容器装大约70mL培养基。
6）生根培养：当不定芽长到0.5-2cm时，从基部切下小芽转到生根培养基上，每个容器接1-2个无根苗，暗培养3天后，转到光照条件下培养1-2周，最终获得完整植株。
对比实验
与陆杰硕士学位论文“菊芋高效再生体系的建立”（学位授予单位黑龙江大学，下面称为文献）比较情况如下：
1）文献中的外植体是2种来源，薯块外植体是直接由菊芋小薯上切取，带节的幼嫩茎段外植体是由茎尖脱毒培养后的幼嫩小苗上截取，而本发明是将菊芋种子去壳，消毒后接种到MS培养基上，先暗培养2-4天，再光照培养1-2天，然后选择幼苗的子叶和下胚轴作为外植体，其中子叶选择已经伸展开来，较厚且颜色为绿色的最好，在切取子叶和下胚轴的过程中，注意避免外植体上带有茎尖或腋芽的生长点。
2）文献表述影响不定芽诱导的主要因素是激素水平和外植体的接种方式，其研究结果为茎段为最佳的组织培养快速繁殖的外植体材料，不定芽诱导最适宜培养基配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIBA，pH5.8，采用正接的接种方式，诱导率可达93%。而本发明中是以幼嫩的子叶和下胚轴作为外植体，接到不定芽诱导培养基上，暗培养2周，转移到成熟培养基上，暗培养2-4周，待愈伤组织分化出不定芽后，转到光照条件下培养；所述不定芽诱导培养基的成分是MS盐+5.0g/LKNO3+100mg/L肌醇+500mg/L水解酪蛋白+30-100g/L蔗糖+8.0g/L琼脂+0-0.1mg/LNAA+0.05-0.3mg/L6-BA，pH5.6-5.8；成熟培养基的成分是在MS盐+100mg/L肌醇+500mg/L水解酪蛋白+30-100g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH5.6-5.8。
3）文献中表述影响生根的主要因素是NAA浓度，生根适宜培养基为MS+0.2mg/LNAA，pH5.8，生根率可达100%。而本发明中是当不定芽长到0.5-2cm时，从基部切下小芽转到生根培养基上，暗培养2-4天，再转到光照条件下进行生根培养，最终获得完整植株；所述生根培养基的成分是1/2MS盐+30mg/L蔗糖+7mg/L琼脂+0.03mg/LIBA，pH5.6-5.8。其中所述暗培养的温度为25-28℃，光照培养条件为：25-28℃，光照12-16h/d，光照强度1500-1800Lux。
Claims (1)
1.菊芋不定芽诱导及植株再生的方法，其特征在于包括如下步骤：
种子萌发：将南芋九号菊芋种子去壳，消毒后接种到MS培养基上，先暗培养2-4天，再光照培养1-2天；暗培养的温度为25-28℃；光照培养条件为：25-28℃，光照12-16h/d，光照强度1500-1800Lux；去壳种子的消毒包括如下步骤：在超净台里先用无菌水冲洗3遍，再用75vt%酒精消毒30秒，无菌水冲洗2遍，再用4wt%次氯酸钠消毒6-7分钟，无菌水冲洗5-6遍，最后用无菌滤纸吸干水分；
不定芽诱导：以幼嫩的子叶和下胚轴作为外植体，接到不定芽诱导培养基上，暗培养2周，转移到成熟培养基上，暗培养2-4周，待愈伤组织分化出不定芽后，转到光照条件下培养；所述不定芽诱导培养基的成分是MS盐+5.0g/LKNO3+100mg/L肌醇+500mg/L水解酪蛋白+30-100g/L蔗糖+8.0g/L琼脂+0-0.1mg/LNAA+0.05-0.3mg/L6-BA，pH5.6-5.8；成熟培养基的成分是在MS盐+100mg/L肌醇+500mg/L水解酪蛋白+30-100g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH5.6-5.8；
生根培养：当不定芽长到0.5-2cm时，从基部切下小芽转到生根培养基上，暗培养2-4天，再转到光照条件下进行生根培养，最终获得完整植株；所述生根培养基的成分是1/2MS盐+30mg/L蔗糖+7mg/L琼脂+0.03mg/LIBA，pH5.6-5.8。
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