CN103395893A - 赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp Cr-6的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种赖氨酸芽孢杆菌的应用，用于还原Cr⁶⁺，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。赖氨酸芽孢杆菌在厌氧环境下将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。赖氨酸芽孢杆菌在pH值为6～9的条件下，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。赖氨酸芽孢杆菌在存在Zn²⁺离子和Cu²⁺离子的条件下，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。所述的Zn²⁺离子浓度为1～10mg/L，所述的Cu²⁺离子的浓度为1～20mg/L。本发明解决了自然环境中六价铬的还原技术的问题，为六价铬的还原提供了降解菌。该菌株存活能力强，降解完全、所需时间短，而且微生物降解彻底，具有良好的社会、生态和经济效益。

Description

赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp Cr-6的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物的应用，具体涉及一种赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Cr-6在还原六价铬离子中的应用，属于微生物应用领域。

背景技术

六价铬为吞入性毒物/吸入性极毒物，皮肤接触可能导致敏感；更可能造成遗传性基因缺陷，吸入可能致癌，对环境有持久危险性。但这些是六价铬的特性，铬金属、三价或四价铬并不具有这些毒性。六价铬是很容易被人体吸收的，它可通过消化、呼吸道、皮肤及粘膜侵入人体。有报道，通过呼吸空气中含有不同浓度的铬酸酐时有不同程度的沙哑、鼻粘膜萎缩，严重时还可使鼻中隔穿孔和支气管扩张等。经消化道侵入时可引起呕吐、腹疼。经皮肤侵入时会产生皮炎和湿疹。危害最大的是长期或短期接触或吸入时有致癌危险。

目前针对六价铬的处理主要是将其还原成对人体危害较小的三价铬，污水中六价铬常用的处理方法有物理吸附法和化学还原法，物理吸附法需要提供吸附材料，而且吸附能力有限，化学还原法需要向污水中添加额外的具有还原性的化学物质，容易造成二次污染，费用较高。土壤中六价铬修复技术主要有固定化/稳定化技术、化学还原技术、化学淋洗技术、电动修复技术、植物修复技术等，这些方法中存在着耗时长、费用高、容易产生二次污染等缺点。

芽孢杆菌（Bacillaceae）是指能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌，一般为革兰氏阳性菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。赖氨酸芽孢杆菌是芽孢杆菌中的一种。

发明内容

本发明提供了一种赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Cr-6的应用，本发明解决了自然环境中六价铬的还原技术的问题，为六价铬的转化提供了还原菌。该菌株存活能力强，六价铬还原彻底、所需时间短，而且微生物降解彻底，具有良好的社会、生态和经济效益。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Cr-6的应用，用于还原Cr⁶⁺，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。

赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Cr-6在厌氧环境下将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。

赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Cr-6在pH值为6～9的条件下，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。

赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Cr-6在存在Zn²⁺离子和Cu²⁺离子的条件下，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。所述的Zn²⁺离子浓度为1～10mg/L，所述的Cu²⁺离子的浓度为1～20mg/L。

采用本发明所提供的技术方案，能够对处理六价铬工业污水，修复六价铬污染土壤。本发明所采用的菌株从自然环境土壤中分离得到，经过室内驯化及分离鉴定，得出其为赖氨酸芽孢杆菌。经实施例验证，该菌株在好氧条件下生长迅速，并在厌氧环境下对六价铬进行还原，能够耐受较高的六价铬浓度，在pH值为6~9范围内能够生长良好并对六价铬有较好的还原效果，添加电子供体能够大大提高该菌株对六价铬的还原效果，能够耐受一定浓度的Zn²⁺和Cu²⁺，而且较低浓度的Zn²⁺和Cu²⁺能够促进菌株对六价铬的还原。

附图说明

图1为菌株Cr-6在添加六价铬（10mg/L）和未添加六价铬条件下生长曲线图。

图2为pH值对菌株Cr-6还原六价铬的影响。

图3为溶液pH值随时间变化情况。

图4为充气及厌氧条件下菌株Cr-6生长情况。

图5充气及厌氧条件下菌株Cr-6对六价铬还原效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护内容并不局限于以下实施例。

实施例1

采集郑州再生水回灌场地20~40cm土壤层样品，装入已灭菌锡纸包好，迅速带回实施例室，置于4℃冰箱保存，直至使用。

称取10g上述土壤样品至装有100mL已灭菌LB培养基的250mL锥形瓶中，加入已灭菌的重铬酸钾溶液（六价铬浓度为1000mg/L）1mL，置于30℃、100r/min条件下恒温振荡培养48h，所有使用物品均已在121℃条件下灭菌20min，所有操作在无菌净化工作台上完成。

将已培养48h的土壤悬液静置半小时，用无菌枪头吸取1mL至9mL无菌稀释水中，按此步骤作梯度逐级稀释至10^-9，分别移取10^-6～10^-9稀释液0.1mL至已经冷却的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用涂布棒均匀推开，然后将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养48h。待菌落长出后，选取不同形态菌落，用接种环挑取单个菌落划线于牛肉膏蛋白胨培养基平板，如此反复几次，确保菌种纯度后，将菌种划线接种至斜面培养基，待菌落长出后，置于4℃冰箱保存。

将已分离到的六价铬还原菌接种至LB培养基中30℃、100r/min条件下培养24h进行活化，然后转接至六价铬浓度为10mg/L的LB培养基中，30℃、100r/min条件下分别培养6h和24h，在10000rpm条件下4℃离心5min，收集上清液，取10mL直接测试培养液中六价铬浓度，另取10mL加入硝酸置于电热板上加热消解至澄清无色，定容至50mL容量瓶中，采用原子吸收分光光度计测消解液中总铬浓度，并换算至原培养液中总铬浓度。通过比较培养液中六价铬和总铬浓度，判断细菌是否对六价铬存在还原或吸附作用，或者只是对六价铬有一定的耐受能力，确保筛选出的最终菌株为六价铬还原菌，选取六价铬还原效果最好的菌株，将其命名为菌株Cr-6，将该菌株进行后续实施例。培养过程中设置平行和空白进行质量控制，结果如表1所示。

表1 菌株Cr-6培养后铬的分布特征单位：mg/L

注：培养条件为30℃、100r/min。

在6h和12h的时间内，上清液中总铬浓度基本上没有发生变化，与初始设定的六价铬浓度相差不大。细胞经过酸消解定容至50mL，经换算，样品中总铬浓度分别为0.05mg/L和0.07mg/L，对铬基本上没有吸附作用，因此可以判断菌株Cr-6对六价铬作用方式为还原作用，而且对铬不存在吸附作用，并表现出了较强的六价铬还原能力，在初始六价铬浓度为10mg/L的条件下，6h内已经将溶液中六价铬还原58%左右，12h内基本能够将溶液中六价铬全部还原。

实施例2

将实施例1中的菌株Cr-6进行革兰氏染色实施例，并采用透射电镜观察细胞形态，然后观察细菌平板生长菌落形态，对细菌的生理生化特征进行分析，最后分析其rDNA序列, 判断菌株Cr-6为赖氨酸芽孢杆菌。

将一定数量的菌株Cr-6接种于液体培养基，在一定条件下进行培养，以生长时间为横坐标，以细菌生长量为纵坐标绘制出生长曲线。本实施例中分别做出细菌在未添加六价铬和初始六价铬浓度为10mg/L条件下生长曲线，取过夜培养12h左右的细胞培养液，按照4%的比例接种至250mL已灭菌的LB培养基中，混匀后分装20mL至容积为100mL的玻璃瓶中，30℃、100r/min条件下振荡培养，分别在0h、2h、4h、6h、9h、12h、16h、20h、24h和30h时刻取出玻璃瓶，测定培养液光密度值。

菌株Cr-6在30℃、100r/min、pH=7.0条件下生长曲线如图1所示。细菌在生长期内延迟期的长短与细菌的种类、菌龄、培养基成分和环境条件等有关，不同微生物延迟期长短不一，从几分钟至几个小时。由于本实施例是将处于对数期的细菌转接至成分相同的培养基，且培养条件相同，因此延迟期较短，然后直接进入对数生长期。

在对数期内，由于营养丰富，细菌活性最大，细胞组分合成迅速，生长代谢十分旺盛，细菌数量以几何级数增加，对于菌株Cr-6来讲，基本可以认为2~9h细菌处于对数期，在整个培养过程中该段时期内生长速率最大。

在稳定期内，由于营养物质逐渐耗尽，细菌生长率下降并出现部分菌体死亡，繁殖率与死亡率趋于平衡，活菌数量保持稳定，对于菌株Cr-6来讲，在未添加六价铬的条件下，在9h左右，进入稳定期，且16h左右达到最大光密度值，为2.97，而在添加六价铬的条件下，细菌数量仍在缓慢增加，最大光密度值出现在24h，为3.67。

细菌在稳定期之后进入衰亡期，由于营养物质的消耗，有毒物质的积累，使得细菌活力降低，死亡率有所增加，因此出现细菌数量逐渐降低的情形。

从两组生长曲线中可以看出，一定浓度六价铬的添加增加了细菌的活性，延长了细菌的稳定期，对其生长有一定的促进作用。处于对数期内的细菌生长迅速，细胞活性最大，因此在后续实施例中选取处于对数生长期的细胞进行研究对象，以期获得最佳六价铬还原效果。

实施例3

本实施例中研究pH值对六价铬还原的影响。

取过夜培养12h左右的细胞培养液0.5mL接种至装有20mL LB培养基的100mL玻璃瓶中，其中六价铬浓度为10mg/L，放入振荡器中以30℃、100r/min转速条件振荡培养，取样时间设置为0h、2h、4h、6h、9h、12h，在对应取样时间点取出玻璃瓶进行培养液pH值、细菌光密度值A₆₀₀及培养液中六价铬浓度测定，并计算六价铬还原率。初始pH值分别设为5、6、7、8和9，培养基配制后用10%氢氧化钠溶液和10%盐酸调节至相应pH值，随后进行灭菌。培养过程中设置平行和空白进行质量控制。

本实施例选取pH值范围为4～10， 体系中不同pH值对菌株Cr-6还原六价铬影响如图2所示。在初始pH值为7条件下，细菌对六价铬还原效果最好。整个培养过程中，在初始pH值为4和5条件下，细菌表现出了较低的六价铬还原效果，而且随着时间的延长，六价铬还原率缓慢增加，细菌最终对六价铬还原率分别为37.1%和43.4%。在初始pH值为8的条件下，细菌在0~6h内对六价铬还原速率低于初始pH值为6和7条件下，但在6~9h内，细菌表现出较高的六价铬还原速率，在9h时刻已经将溶液中六价铬全部还原，还原速率远大于同时段内生长较好、初始pH值为9条件下还原速率。另外，在培养6h后，虽然细菌在初始pH值为8条件下生长情况优于初始pH值为6条件下，但是后者条件下六价铬还原效果较好，这可能与细菌的六价铬还原酶在该条件下对六价铬还原效果较好有关。在初始pH值为9的条件下，细菌前期对六价铬还原效果较差，在后期对六价铬还原效果大大提高，并最终将溶液中六价铬全部还原。在初始pH值为10的条件下，细菌在2h时刻表现出了10%的还原率，但在整个过程中，六价铬还原率一直保持在10%，究其原因，可能在该条件下，六价铬对细菌的六价铬还原部位产生了一定的毒性，在抑制其生长的同时，也停止了细菌对六价铬的还原作用。

在该实施例过程中，对体系中pH值变化情况进行了监测，结果如图3所示。在初始pH值为4、5和10的条件下，整个培养过程中体系pH值没有变化。而在其他初始pH值条件下，体系中pH值趋于7，这可能与细菌在生长过程中的分泌物质有关，同时体系中pH值的改变也从另一方面说明了细菌对环境的适应能力。总体来讲，菌株Cr-6生长最适pH值为7，并在该pH值下具有较高的六价铬还原效果。

实施例4

本实施例中研究充气及厌氧条件下菌株Cr-6对六价铬的还原情况。

取过夜培养12h左右的细胞培养液0.5mL接种至装有20mL、pH为7.0 LB培养基的100mL玻璃瓶中，其中六价铬浓度为10mg/L，充气条件下进行培养的装有培养基的玻璃瓶放入振荡器中以30℃、100r/min转速条件振荡培养，厌氧条件下进行培养的装有培养基的玻璃瓶放入30℃培养箱中静置培养。取样时间设置为0h、2h、4h、6h、9h、12h，在对应取样时间点取出玻璃瓶进行培养液溶解氧、细菌光密度值A₆₀₀及培养液中六价铬浓度测定，并计算六价铬还原率。培养过程中设置平行和空白进行质量控制。

本实验通过充空气和氮气来保证好氧和厌氧条件，两种条件下，细菌的生长情况如图4所示。在充气条件下，前4h内，细菌生长光密度值达到0.3左右，与前期未充气、仅振荡培养的细菌生长情况接近，但在后期，细菌表现出了较快的生长速率，在4h～6h、6h～9h、9h～12h期间，光密度值有了明显增加，从0.30增长至7.08、10.25和16.35，这与前期实验中微生物生长速率相比有了很大的提高。在厌氧条件下，细菌的生长受到了一定的抑制作用，整个培养过程中，光密度值基本保持在0.07左右，未表现出生长迹象。上述结论表明该菌为好氧菌，在厌氧条件下停止生长，由于通气对培养液中氧气远比振荡培养充足，而且在充气条件下细菌光密度值远大于振荡培养，表明前期在振荡培养中细菌随时消耗振荡带入到溶液中的溶解氧，并使溶液处于缺氧状态，从而对六价铬进行还原。

在充气及厌氧条件下细菌对六价铬的还原效果如图5所示。从图中可以看出，在充气条件下，由于氧气的存在，细菌在将氧气消耗完毕之后，对六价铬进行缓慢还原，培养12h后还原率仅为24%。在厌氧条件下，虽然细菌生长基本停止，但是由于没有氧气与六价铬竞争电子，最终六价铬还原率为44%。因此，从总体上来讲，厌氧条件下六价铬还原效果要好于充气条件下六价铬还原效果。

实施例5

本实施例中研究重金属离子的添加对菌株Cr-6还原六价铬的影响。

本实施例中选择添加的重金属离子为Zn²⁺和Cu²⁺。取过夜培养12h左右的细胞培养液0.5mL接种至装有20mL、pH为7.0 LB培养基的100mL玻璃瓶中，分别添加不同浓度Zn²⁺和Cu²⁺，其中六价铬浓度为10mg/L，放入振荡器中以100r/min转速振荡培养，培养6h后取出玻璃瓶，进行细菌光密度值A₆₀₀及培养液中六价铬浓度测定，并计算六价铬还原率。为了更清楚地表明添加Zn²⁺ 和Cu²⁺对细菌生长的影响，在此，提出光密度值变化率，表明对细菌生长的抑制或促进作用，计算公式如下：

其中，A₆₀₀*代表了添加Zn²⁺ 或Cu²⁺的培养液光密度值，A₆₀₀代表未添加Zn²⁺ 或Cu²⁺、其他培养条件与A₆₀₀*相同的培养液光密度值。若该值大于0，表明添加Zn²⁺ 或Cu²⁺促进了细菌的生长；若该值小于0，表明添加Zn²⁺ 或Cu²⁺抑制了细菌的生长。

（1）Zn²⁺的添加对微生物生长及六价铬还原的影响

在实验过程中，向培养液中添加一定浓度的Zn²⁺对细菌生长及六价铬还原效果的影响如表2所示，培养液中Zn²⁺浓度分别为5mg/L、10mg/L、30mg/L和50mg/L，含Zn²⁺原溶液用ZnSO₄·7H₂O配制，浓度为1000mg/L。可以看出，Zn²⁺的添加对细菌的生长产生了一定的抑制作用，而且培养液Zn²⁺浓度越高，对细菌生长抑制作用越明显。随着添加Zn²⁺浓度的增加，细菌光密度值分别降低了11.10%、10.09%、21.69%和35.18%。然而，添加10mg/L Zn²⁺条件下细菌光密度值比添加5mg/L Zn²⁺条件下细菌光密度值略有增加。

Zn²⁺的添加对细菌还原六价铬的影响随着Zn浓度的不同略有差异。在Zn²⁺浓度为5mg/L的培养液中，六价铬还原率为77.53%，比未添加Zn²⁺的培养液中六价铬还原率高出了3.07%。与添加Zn对细菌光密度值的影响进行对比，在Zn²⁺浓度为5mg/L条件下，细菌生长情况比未添加Zn²⁺的培养液略差，但是六价铬还原率反而略有增加，这表明添加适量的Zn²⁺能够促进细菌对六价铬的还原，但却对细菌的生长略有抑制。在其他较高Zn²⁺浓度条件下，细菌还原六价铬效果随着Zn²⁺浓度的增加而有所降低。与Zn²⁺浓度为5mg/L条件下相比，虽然Zn²⁺浓度为10mg/L条件下，细菌浓度较高，但是较高的Zn²⁺浓度抑制了细菌对六价铬的还原作用，六价铬还原率与Zn²⁺浓度为5mg/L条件下相比反而降低了9.52%。在Zn²⁺浓度为30mg/L和50mg/L的条件下，与未添加Zn²⁺培养下相比，细菌对六价铬还原率分别降低了15.50%和29.24%。上述结果表明，较高浓度的Zn²⁺会对该菌产生一定的毒性，不但抑制了其生长，同时也降低了六价铬还原效果。

表2  添加不同浓度Zn²⁺条件下菌株Cr-6生长情况及六价铬还原率

注：培养条件为30℃，100r/min，pH=7.0，培养时间为6h。表中“-”代表以该条件下数值为基准，变化率为0。

（2）Cu²⁺的添加对微生物生长及六价铬还原的影响

在实验过程中，向培养液中添加一定浓度的Cu²⁺对细菌生长及六价铬还原效果的影响如表3所示，培养液中Cu²⁺浓度分别为1mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L，含Cu²⁺原溶液用CuCl₂·2H₂O配制，浓度为1000mg/L。从表中可以看出，总体上来讲，Cu²⁺的添加对细菌的生长产生了一定的促进作用，与未添加Cu²⁺的培养液相比，光密度值分别增加了12%、17%、19%和11%，在本实验所采用Cu²⁺浓度范围内，随着培养液中Cu²⁺浓度越高，对细菌生长促进作用越明显，在Cu²⁺浓度为10mg/L时，细菌光密度值达到最大，随后在Cu²⁺浓度为20mg/L，细菌光密度值有所降低。

添加一定浓度的Cu²⁺对溶液中六价铬的还原效果也产生了一定的促进作用。从表3-6中可以看出，在30℃、100r/min条件下经过6h的培养，未添加Cu²⁺的培养液中六价铬还原率达到了86%，而同时刻添加Cu²⁺浓度分别为1mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L的条件下，培养液中六价铬已经被全部还原。

表3 添加不同浓度Cu²⁺条件下菌株Cr-6生长情况及六价铬还原率

注：培养条件为30℃，100r/min，pH=7.0，培养时间为6h。表中“-”代表以该条件下数值为基准，变化率为0。

Claims (5)

1.一种赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Cr-6的应用，其特征在于：用于还原Cr⁶⁺，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在厌氧环境下将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在pH值为6～9的条件下，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在存在Zn²⁺离子和Cu²⁺离子的条件下，将Cr⁶⁺还原成Cr³⁺。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的Zn²⁺离子浓度为1～10mg/L，所述的Cu²⁺离子的浓度为1～20mg/L。

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