CN106676045A - 一株耐抗生素的六价铬还原菌及其应用 - Google Patents

一株耐抗生素的六价铬还原菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐抗生素的六价铬还原菌及其应用，属于环境污染物生物处理技术领域。本发明耐抗生素的六价铬还原菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2017018的赖氨酸芽孢杆菌WUST‑Cr1（Lysinibacillus sp.WUST‑Cr1）。本发明菌株能将水中和土壤中的六价铬通过酶促反应还原成低毒的三价铬，其对六价铬的还原速度较快，耐受浓度高，且耐抗生素，可用于铬污染治理，与炭混合治理铬污染效果更好。本发明菌株在废水和重金属污染土壤的生物修复中具有良好的应用前景。

Description

一株耐抗生素的六价铬还原菌及其应用
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株耐抗生素的六价铬还原菌及其应用。
背景技术
随着全球工业的快速发展，重金属污染问题已成为越来越重要的环境议题之一，而铬(Cr)作为一种重金属被应用于合金、电镀、制革印染等行业也带来了不可忽视的环境污染问题。铬在环境中主要以三价和六价两种形式存在。其中，三价铬为人体所必需微量元素，而六价铬对人体具有较强的毒害作用，具有潜在的致畸、致突变和致癌性。目前铬盐行业长期被列为我国严重污染行业之首。我国已经有许多地方相继报道因铬污染土壤和水体导致人们健康受到危害的事例，因此对铬污染环境的治理变得日益重要。
微生物修复技术是利用微生物自身的特性，通过吸附、固定、转化、分解和氧化还原机理来达到污染物治理的目的。由于其成本低、操作简便、不会带来二次污染等众多优点备受关注。
发明内容
本发明的目的旨在克服物理和化学法等现有技术除去六价铬的不足，提供一株耐抗生素的六价铬还原菌及其应用。本发明菌株通过对六价铬的还原，降低土壤中铬的毒性、减少植物对铬的吸收，丰富了微生物修复的技术方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株耐抗生素的六价铬还原菌，为赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1（Lysinibacillus sp.WUST-Cr1），该菌株于2017年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国. 武汉.武汉大学），其保藏编号为CCTCC NO：M 2017018。赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1源于武汉钢铁集团公司某轧钢厂附近长期受铬粉尘污染的土壤，该菌是以LB培养基进行富集培养，在含铬培养基中对土壤中的菌群进行驯化培养，并通过平板划线分离纯化筛选得到。所述的耐抗生素包括耐链霉素。
所述的六价铬还原菌WUST-Cr1为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，长为2.5～3μm，宽为0.8～1μm；该菌菌落呈圆形，中间隆起，菌落为乳黄色，表面湿润光滑。其16Sr RNA基因上有效长度约为1500kb的核苷酸序列，将该序列输入GenBank，用Blast软件与数据库序列进行比对分析及发育树分析，结果表明与Lysinibacillus_manganicus_Mn1-7的16S rDNA序列相似性较高，为99%。基于16S rDNA基因的系统发育分析结果，鉴定为赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）的一株新菌株。本发明菌株WUST-Cr1的16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。生理生化特性鉴定显示该菌明胶水解实验为阳性，吲哚实验、产硫化氢实验、甲基红实验和V-P 实验为阴性；不能利用木糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖，能够使用酒石酸钾钠、乳酸钠和乙酸钠作为碳源，有芽孢。
所述的六价铬还原菌WUST-Cr1较优的培养条件为：温度为35℃，初始pH为7～8，摇床转速为150～180r/min。
所述的六价铬还原菌WUST-Cr1能将水中和土壤中的六价铬通过酶促反应还原成低毒的三价铬；该菌较宜生长在偏碱性的环境中，因此还原反应所生成的Cr(Ⅲ)与OH-结合生成Cr(OH)3可进一步降低环境中的毒性。该菌对六价铬的还原速度较快，耐受浓度高，可用于铬污染治理。
所述的六价铬还原菌WUST-Cr1的生长情况及对六价铬的还原效果在抗生素（链霉素）存在下影响不大。基于现在水体中抗生素污染问题严重存在，该菌较强的生长能力和对抗生素的抗性，对于含有抗生素的含铬废水的治理具有重要应用价值。
所述的六价铬还原菌WUST-Cr1优选与炭混合用于铬污染治理，更优选为与生物炭混合。所述的生物炭优选通过包括如下步骤的方法得到：以松木为原料，在500℃条件下烧制后研磨，过80目的筛子得到。将该菌株结合生物炭应用于受污染的水土环境中，提升了其耐铬能力，有利于细菌还原反应的进行。
本发明的优点和有益效果：本发明的六价铬还原菌赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1在废水和重金属污染土壤的生物修复中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为菌株WUST-Cr1在固体培养基上的菌落形态图和革兰氏染色结果图。
图2为菌株WUST-Cr1的扫描电子显微镜的照片。
图3为菌株WUST-Cr1的生长曲线图与对六价铬的还原情况图，对照为未加入菌液的六价铬浓度变化。
图4为不同培养温度对菌株WUST-Cr1还原六价铬的影响图。
图5为不同初始pH值对菌株WUST-Cr1还原六价铬的影响图。
图6为不同摇床转速对菌株WUST-Cr1还原六价铬的影响图。
图7为不同六价铬初始浓度对菌株WUST-Cr1还原六价铬的影响图。
图8为菌株WUST-Cr1在不同抗生素条件下的生长和对六价铬的还原能力图，对照为不加入抗生素的生长和还原特征。
图9为菌株WUST-Cr1和两种炭（生物炭BC和商用活性炭AC）结合应用还原六价铬的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步描述，并非对其保护范围的限制。
下述实施例中所述的六价铬Cr(VI)的存在形式均为K2CrO4。
实施例1：赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1的分离、鉴定及其对六价铬的还原性能
1、菌株的分离、纯化
（1）菌种来源：菌源取自武汉钢铁集团公司某电镀厂附近长期受铬粉尘污染的土壤，土壤较贫瘠。在不同地点共采集土壤样品5份。
（2）菌株的分离纯化：将采集的土壤样品加去离子水于30℃恒温振荡1h，静置后取10mL上清液接种于LB培养基（蛋白胨1wt%，氯化钠1wt%，酵母抽提物0.5wt%）中，置于30℃、150r/min的恒温摇床富集培养24h后。向富集液中加入K2CrO4溶液，使Cr(VI)的浓度为10mg/L。继续摇瓶培养24h后，吸取2mL富集的菌液，转接入新鲜的六价铬浓度更高的LB培养基中于30℃、150r/min下培养培养。重复转接多次，以此来驯化六价铬还原菌，培养基中的Cr(VI)的浓度分别为20、40、50、100mg/L。将六价铬浓度为100mg/L时的驯化液按梯度稀释，取10-4～10-7梯度稀释液分别均匀涂布于含有50mg/L Cr(VI)的LB平板上，30℃培养48h。挑取长势良好的菌落反复划线纯化，得到单一菌落。再将各个单菌落在一个平板上划线编号保存。再对各个单菌进行铬还原实验，确定各菌株的还原能力，将对六价铬还原效果最好的一株菌编号为WUST-Cr1，以甘油管保藏菌株。
2、菌株的鉴定
（1）铬还原菌株WUST-Cr1的菌落形态特征及生理生化特性：铬还原菌株WUST-Cr1菌落呈圆形，微凸，菌落为乳黄色，边缘整齐，中间微微隆起（图1）。在扫描电镜下观察，WUST-Cr1呈棒状，长度约为3 µm，宽度约为1 µm，聚集成紧密结合的簇（图2）生理生化特性鉴定显示该菌的明胶液化实验和葡萄糖水解实验为阳性，吲哚实验、淀粉水解，尿素水解，柠檬酸实验，产硫化氢实验、甲基红实验和V-P实验均为阴性。
（2）铬还原菌株WUST-Cr1的16S rDNA鉴定：对铬还原菌株WUST-Cr1的16S rDNA基因进行克隆、测序，然后在GenBank中进行Blast比对。结果显示，与其序列相似性达到99%的均为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sp.），其16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。结合菌株的生理生化特性，将其归属于赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）。
铬还原菌株WUST-Cr1于2017年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国. 武汉. 武汉大学），其保藏编号为CCTCC NO：M 2017018，命名为赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1（Lysinibacillus sp. WUST-Cr1）。
3、铬还原菌株WUST-Cr1的生长及其对Cr(VI)的还原效果
（1）菌株WUST-Cr1种子液的制备：用接种环从解冻的甘油管挑取一环WUST-Cr1在LB平板培养基划线分离培养，待24h平板长出单菌落后，挑取一个菌落接种到培养液中，于30℃、150r/min 条件下培养。连续监测培养液中细菌生物量的增长情况，直到培养液在600nm处的吸光值达到1.0。采用此时的菌液作为种子液，剩余的4℃保存短期内备用。
（2）菌株WUST-Cr1的生长与还原曲线：将菌株WUST-Cr1种子液接种于含100mg/LCr(VI)的LB培养基中，于35℃、150r/min和初始pH=7.0的条件下培养，测定细菌WUST-Cr1的菌密度（OD600）和六价铬的浓度，结果如图3所示：在0-4h内细菌对铬的还原还比较缓慢，4-16h铬的还原速度较快。而细菌的生长在0～16h内，生长速度很快，很快进入了对数期，呈指数型增长。说明细菌对六价铬环境具有一定的抗性，而且对数期的种子液活性较强，细菌能很快适应新的环境，没有表现出很明显的停滞期。16h后由于溶液中营养的消耗和有害物质的积累，细菌生长所需的碳源和能源减少，细菌进入平台期。说明了铬的还原与细菌的生长是密切相关的。菌株WUST-Cr1对Cr(VI)的还原与其生长趋势相一致，表明该菌能耐受一定浓度的铬并且对六价铬表现出良好的还原效果。
实施例2：环境条件对赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1还原能力的影响
1、培养温度的影响：在六价铬浓度为100mg/L，pH为7.0、摇床转速为150r/min和种子液接种量为2vol%时，温度对六价铬的还原影响如图4所示：在25～40℃范围内，菌株WUST-Cr1对六价铬均具有较好的还原效果，表明该菌对温度有较宽的适应范围。且在25～40℃之间时，随着温度的升高，六价铬的还原性能随之增大；但是从图形上看，40℃条件在16h后，菌株WUST-Cr1对六价铬的还原效果反而明显低于35℃时。表明赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1的最适温度为35℃。
2、初始pH值的影响：在六价铬浓度为100mg/L，温度为35℃、摇床转速为150r/min和种子液接种量为2vol%时，初始pH值对六价铬的还原影响如图5所示：pH=5时，24h后，菌株WUST-Cr1六价铬还原率仅为17.22%，后面铬浓度也维持稳定。说明该株菌在酸性条件下很难生长；在pH=6时，菌株在24小时内能将六价铬完全还原，明显低于ph=8时的效果。而当pH=7-9时，随着pH的继续增大还原效果又有所下降，其中pH=9时其对六价铬的还原并未完全。表明菌株WUST-Cr1对环境pH值比较敏感，其适宜的pH范围为7～8。
3、摇床转速的影响：在六价铬浓度为100mg/L，pH为7.0、温度为35℃和种子液接种量为2vol%时，摇床转速对六价铬还原的影响如图6所示：摇床转速为120r/min时，菌株WUST-Cr1对六价铬有一定的还原效率，但在24h内并未完全实现还原。当转速在150～180r/min时，随着转速的提高，其对六价铬的还原效率也变快。在20h内基本实现了完全还原。而随着转速的进一步增加，对六价铬的还原性能较150rpm时还要差。表明在高转速时对细胞造成了一定的损害，影响了其生长。因此确定摇床转速为150～180r/min时已能满足赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1对溶氧的需求，结合实际生产中的可行性和成本考虑，确定菌株WUST-Cr1的最佳摇床转速为150r/min。
4、六价铬（Cr(VI)）初始浓度的影响：在pH为7.0、培养温度35℃、摇床转速150r/min和种子液接种量为2vol%时，Cr(VI)初始浓度对细菌还原效果的影响如图7所示：菌株WUST-Cr1在12h内对50mg/L的Cr(VI)的还原率可达到90%以上，随着Cr(VI)浓度的增大，其对铬离子的完全还原的时间也越来越长；而在六价铬浓度大于200mg/L后，细菌对六价铬已不能实现完全还原。随着铬离子浓度的进一步提升，达到400mg/L时，细菌的生长基本停止，同时其对六价铬的还原也处于停止状态。说明菌株WUST-Cr1对一定浓度的Cr(VI)具有良好的还原性能，但过高浓度的Cr(VI)会抑制WUST-Cr1的生长。
实施例3：铬还原菌赖氨酸芽孢杆菌WUST-Cr1对抗生素的耐受性
在六价铬初始浓度为100mg/L，pH为7.0、培养温度35℃、摇床转速150r/min和接种量为2vol%时，添加不同的抗生素（氨卡青霉素50μg/L，氯霉素25μg/L，卡那霉素50μg/L，链霉素50μg/L，四环素50μg/L）对细菌还原六价铬的效果影响如图8所示：在六价铬浓度的曲线中，加入链霉素的曲线较未加入抗生素的空白对照要滞后一些；而且在细菌密度的曲线中，加入链霉素的细菌密度始终是低于空白对照的。说明了链霉素对细菌的生长期到了一定的抑制作用，但是抑制效果不大；而加入青霉素的实验组生物量的增长极少，且很快就进入了稳定期，对六价铬的还原率也只有3%。抗性研究表明，菌株WUST-Cr1对青霉素有较弱的抗性，而对链霉素抗性较好，对于其它三种抗生素则没有明显抗性。
实施例4：铬还原菌赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sp.）WUST-Cr1和炭的结合应用
商用活性炭AC：市购商品级活性炭；生物炭BC：以松木为原料，在500℃条件下烧制后研磨，过80目的筛子得到。
配制LB培养液，每瓶中分别分装97mL，进行5组实验，每组两个重复，其中1组和3组加入5%（质量百分比）的BC，2组和4组分别加入5%的AC，第5组不加炭。121℃条件下灭菌20min冷却后。然后分别向1、2、5组中加入2mL的WUST-Cr1种子液，向3、4组中加入等量的无菌水，控制每个瓶的总体积一致。最后加入K2CrO4确保溶液中Cr(VI)浓度为100mg/L。在150rpm、35℃下培养，检测其中的Cr(VI)浓度的变化。
结果见图9，从图9中可以看出，只加入BC的瓶中，BC对六价铬的吸附能力很差，而未改性的AC对六价铬有一定的吸附能力，但是并不能有效的完全吸附。而BC+菌和AC+菌的瓶中它们对六价铬的去除是两部分组成的：炭的吸附和细菌的还原。它们较只有炭和只有细菌的去除效果要好的多，最后溶液中游离的Cr(VI)很少。尤其是从第3组实验中可以看出其中BC对六价铬的吸附是很少很少的，但是BC+菌的第1组对六价铬的去除效果也是明显较只加菌的第5组要好。因此可能是加入BC和AC后所携带的一些元素或AC和BC丰富的孔隙环境对细菌的生长是有一定的促进作用的。抑或是炭对三价铬的吸附降低了溶液中三价铬的浓度，促进了反应的正向进行，从而有效地加快了六价铬的去除作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉科技大学
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<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> Lysinibacillus sp.
<400> 1
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gctgccgcac cc 1452

Claims (7)

1.一株耐抗生素的六价铬还原菌，其特征在于：保藏编号为CCTCC NO：M 2017018。
2.根据权利要求1所述的六价铬还原菌，其特征在于：所述的耐抗生素包括耐链霉素。
3.根据权利要求1所述的六价铬还原菌，其特征在于：其培养条件为：温度为35℃，初始pH为7～8，摇床转速为150～180r/min。
4.权利要求1所述的六价铬还原菌在铬污染治理中的应用。
5.权利要求1所述的六价铬还原菌与炭混合在铬污染治理中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的炭为生物炭。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的生物炭通过包括如下步骤的方法得到：以松木为原料，在500℃条件下烧制后研磨、过筛得到。
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