CN109554298A

CN109554298A - 一种微生物菌群的富集方法及其在处理Cr重金属污染上的应用

Info

Publication number: CN109554298A
Application number: CN201910023980.XA
Authority: CN
Inventors: 吕育财; 杨涛; 祁正; 李平; 王奔腾; 向振; 史子瑶; 龚大春; 张耀平; 李宁; 郭金玲; 田毅红
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-04-02

Abstract

本发明提供一种微生物菌群的富集方法，以池塘底泥微生物为环境菌源，通过高浓度Cr（VI）的持续定向驯化和继代筛选，最终获得一组能够有效还原Cr（VI）的微生物菌群。该菌群能有效还原Cr（VI），49.5h内可将91μg/mL的Cr（VI）全部还原。可耐受435μg/mL的环境Cr（VI）浓度，并保持还原能力。在15℃‑45℃条件下具有还原Cr（VI）的能力，并在30℃和35℃条件下还原Cr（VI）的效率最好。

Description

一种微生物菌群的富集方法及其在处理Cr重金属污染上的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌群的富集培养方法，并将该微生物菌群应用于含Cr重金属污染的环境中，其中包括水环境、土壤环境、有机污染环境，属于生物技术领域。

背景技术

我国重金属污染较为严重，据统计，我国土壤重金属污染面积约为2×10⁷hm²，每年受污染的粮食多大1.2×10⁷t，经济损失达2×10¹⁰元（赵其国，等，土壤学报，2007，44（6）：1127-1134）。

铬是主要的重金属污染物之一。由于其是部分行业如电镀、木材防腐、染料、皮革制作、合金制造的重要原料，广泛应用于工业生产，并随着工业废水的排放，大量进入环境（董广霞, 等. 中国环境监测, 2015, 31⑶: 92-95）。统计表明，我国是铬生产大国，每年铬盐生产量超过16万吨，而我国每年排放的铬渣量约为35万-42万吨（江澜，重庆工商大学学报(自然科学版), 2006 , 23(2):132-135）。大量铬污染物被投放入环境，造成了我国Cr重金属污染现状较为严峻。我国土壤Cr的分布情况为，中国南部较高，由云南向东北方向直到江苏地区出现连续高值，各农田土壤铬含量最高的省份是上海市，已达79.78mg/kg，福建省土壤Cr平均值超出背景值2.80倍（张小敏，等. 环境科学，2014，35(02):692-703）。

通常Cr的毒性与其在环境中的形态有关。化合价为三价的Cr由于不易进入细胞，毒性较小，而化合价为六价的Cr容易进入细胞，并且在细胞内在谷肤甘肤等作用下还原为化合价为三价的Cr。在这个还原过程中会产生化合价为五价的Cr中间体及活性氧自由基或经基自由基，因而有很强的毒性。六价Cr比三价Cr毒性高出约100倍。

发明内容

基于上述问题，开发能够有效还原环境中Cr的方法，对我国改良我国农田土壤环境，保障人类健康具有重要意义。利用微生物来修复Cr污染，是生物修复里的一个重要分支。目前，已报道多种微生物，如芽孢杆菌(Bacillus sp. )、脱硫弧菌( Desulfovibriovulgaris )、希瓦氏菌(Shewanella sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp. )等具有还原Cr（VI）的能力。但不同菌株还原Cr（VI）的能力不同，且单一菌株在环境中的定殖能力较弱，影响生物修复的效果。

本发明以Cr（VI）还原能力作为筛选指标，注重微生物群体功能和菌间的协同关系。利用限制性培养和连续继代培养的方法，从环境中富集到一组微生物菌群，该菌群能有效还原Cr（VI）。

所述的微生物菌群的富集方法，

包括如下步骤：

（1）采集池塘底泥作为环境菌源，将池塘底泥装入培养瓶内，加入重铬酸钾，定容，封装后，静止培养25-32天，获得第一代富集菌群；

（2）将所获的第一代富集菌群，转接到新鲜的含Cr（VI）的PCS培养液，培养5-7天获得第二代富集菌群，如此方法转接n次获得第n代富集菌群。

所述的步骤（1）中池塘底泥的理化性质为，有机质25-35g/kg，总氮1-1.8g/kg，有效磷30-40mg/kg，含水量65-75%。

所述的步骤（1）中加入的重铬酸钾调整培养瓶中的Cr（VI）浓度为50μg/mL-200μg/mL，即获得第一代富集菌群。

进一步优选方案中所述加入的重铬酸钾调整培养瓶中的Cr（VI）浓度为100μg/mL。

所述的步骤（2）中所述的具体转接方法为：从第一代菌群的培养瓶中，取上清液震荡混匀后接种入装有PCS培养液的瓶中，于25-28℃的恒温静止培养5-7天，即获得第二代富集菌群；如此方法转接n代即可获得还原Cr（VI）的微生物菌群。

所述的PCS培养液中每1L培养液含：蛋白胨4-5g，酵母浸粉0.8-1g，氯化钠4-5g，调整Cr（VI）浓度为50-200mg/L。

转接代数为4-6次，优选转接代数为5代。

采用上述方法获得的微生物菌群，该菌群包括细菌和古菌。

所述的细菌包括OTUs丰度的百分数为40-60% 的Burkholderiales，30-45%Clostridiales。

所述的古菌包括OTUs丰度的百分数为40-55% Methanobacteriales，15-30%Methanomicrobiales，10-15% Methanosarcinales。

进一步优选方案中所述的细菌包括OTUs丰度的百分数为59% 的Burkholderiales，40% Clostridiales。

进一步优选方案中所述的古菌包括OTUs丰度的百分数为54%Methanobacteriales，26% Methanomicrobiales，13% Methanosarcinales。

利用本发明的方法所获得的微生物菌群能有效还原Cr（VI），49.5h 内可将91μg/mL的Cr（VI）溶液全部还原。可耐受435μg/mL的环境Cr（VI）浓度，并保持还原能力。在15℃-45℃条件下具有还原Cr（VI）的能力，并在30℃和35℃条件下还原Cr（VI）的效率最好，在自然环境温度下，随着温度的升高，还原Cr（VI）的能力上升。

该微生物菌群在Cr重金属污染土壤的生物修复的应用。

该微生物菌群在Cr重金属污染水体的生物修复的应用。

该微生物菌群在Cr重金属污染的有机废弃物处理的应用。

附图说明

图1 菌群培养5天含Cr(VI)培养基颜色变化。

图2 菌群在pH=7和8的条件下还原Cr（VI）的能力。

图3 菌群在含Cr（VI）培养液中生物量的变化。

图4不同Cr（VI）浓度对菌群还原Cr（VI）能力的影响。

图5不同培养温度对菌群还原Cr（VI）能力的影响。

具体实施方式

实施例1

一种微生物菌群的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采集池塘泥底作为环境菌源，将池塘底泥装入培养瓶内，利用重铬酸钾调整培养瓶内Cr（VI）浓度，并定容至600mL，封装后，放置于28℃温度下静止培养30天，获得第一代富集菌群。

池塘底泥的理化性质为，有机质30.15g/kg，总氮1.33g/kg，有效磷35.4mg/kg，含水量71%。

（2）将所获的第一代富集菌群，转接到新鲜的含Cr（VI）的PCS培养液，28℃培养7天获得第二代富集菌群。如此方法转接5次获得第5代富集菌群。Cr（VI）转化能力稳定，一组转化Cr（VI）的菌群被成功获得。

所述的步骤（1）中所述的环境菌源获取方法为，采用三峡大学求索溪的池塘底泥，该池塘中含有污水，生长有包括水葫芦、荷叶、芦苇的水生植物。在池塘不同位置选取3-4个点，获取每个点0-15cm的底泥。所有底泥充分混合，作为环境菌源。

步骤（1）中所述的第一代菌群具体封装入培养瓶方法为：取2个1000ml培养瓶，分别称取作为环境菌源的池塘污泥400g，放入1000ml培养瓶中，自来水定容至600mL。调整培养瓶中的Cr（VI）浓度为100μg/mL，将2个封装好的培养瓶充分混合均匀后，放置于28℃的恒温培养箱，静止培养30天。即获得第一代富集菌群。

步骤（2）中所述的具体转接方法为：从第一代菌群的2个培养瓶中，选取上清液黄色褪色（初始培养液因含（Crab（VI）而呈现黄色）较快的培养瓶处理。将该处理培养液充分震荡混匀，吸取1ml的富集物，接种入装有100ml PCS培养液（1L培养液含：蛋白胨5g，酵母浸粉1g，氯化钠5g，调整Cr（VI）浓度为100mg/L）的100ml三角瓶中。接种5瓶即5个重复。将5个筛选单元放置于28℃的恒温培养箱，静止培养7天。即获得第二代富集菌群。从第二代富集菌群中，根据培养液黄色和菌液浑浊程度等，判断菌群还原Cr（VI）的能力。选取黄色褪色快，菌液浑浊明显的处理作为种子液进行第三代富集菌群的转接。每一个被选取的第二代富集菌群菌转接入2瓶新鲜含Cr（VI）PCS培养液，即做2个重复。28℃静止培养7天。如此方法转接5代获得有效还原Cr（VI）的微生物菌群。

采用上述方法获得的微生物菌群，该菌群包括细菌和古菌。所述的细菌包括OTUs丰度的百分数为59% 的Burkholderiales，40% Clostridiales。

所述的古菌包括OTUs丰度的百分数为54% Methanobacteriales，26%Methanomicrobiales，13% Methanosarcinales。

本发明菌群接种于100ml的PCS培养液（含有100μg/mL的Crab（VI）），30℃静止培养。图1显示，菌群在培养5天后，培养液明显由黄色（Cr（VI）颜色）转为灰色或浅色，表明Cr（VI）被还原。

实施例2

将菌群培养于含Cr（VI）的PCS培养液中，调整培养液的初始pH，考查不同pH条件下菌群还原Cr（VI）的能力。结果如图2所示，当pH=7和pH=8时，菌群能够有效的还原培养液中的Cr（VI）。当pH=7时，培养73小时，培养液中的Cr（VI）浓度从初始培养的92.15μg/mL下降到2.19μg/mL， 97.6%的Cr（VI）被还原转化。而当pH=8时，经过73小时培养，培养液中的Cr（VI）浓度为0μg/mL，还原率达到100%。

实施例3

将菌群培养于约100μg/mL的Cr（VI）的PCS培养液中，调整pH=8,检测培养过程中菌群OD600的变化，结果如图3。OD600可以反应微生物生长过程的生物量变化。由图3可以发现。菌群在含Cr（VI）溶液中能够启动生长，培养24h，OD达到0.41，且随着培养时间的增加菌群生物量也随之增长，并在92.5h达到0.83OD。

实施例4

Cr（VI）对生物体具有毒害作用，为了探索高浓度Cr（VI）对发明菌群的抑制作用，将菌群分别培养于初始Cr（VI）浓度为91μg/mL，181μg/mL，269μg/mL，355μg/mL，435μg/mL的培养液中，检测菌群还原Cr（VI）的能力，结果如图4。在91μg/mL的培养液中，25.5h，Cr（VI）被还原97.2%，49.5h，全部被还原。当Cr（VI）浓度提高至181μg/mL，Cr（VI）在49.5h内全部被还原。随着Cr（VI）浓度的提高，逐渐显示Cr（VI）对菌群还原Cr（VI）能力的抑制作用。当Cr（VI）为435 μg/mL时，49.5h 后Cr（VI）的还原率为27.7%。可见，该菌群能够在含Cr（VI）浓度400μg/mL以上是仍具有还原Cr（VI）的能力。表现较好的对高浓度Cr（VI）的耐受性。

实施例5

微生物的活性受温度影响较为显著。为探索本发明菌群在不同温度下还原Cr（VI）的能力。将菌群培养于含约100μg/mL Cr（VI）浓度的PCS培养液中，并分别放置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下培养。菌群还原Crab（VI）的能力见图5。结果表明，菌群在15℃-45℃条件下均能还原Cr（VI），并在30℃和35℃条件下转化Cr（VI）的能力最强，36h可将Cr（VI）全部还原。菌群在15℃至25℃的低温环境相对与40℃以上的高温环境表现出相对较好的还原能力。标明，菌群能够适应环境温度，在自然环境中还原Cr（VI），修复污染。并随自然环境中温度的升高，还原Cr（VI）。

Claims

1.一种微生物菌群的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的微生物菌群的富集方法，其特征在于，池塘底泥的理化性质为，有机质25-35g/kg，总氮1-1.8g/kg，有效磷30-40mg/kg，含水量65-75%。

3.根据权利要求1所述的微生物菌群的富集方法，其特征在于，

步骤（1）中加入的重铬酸钾调整培养瓶中的Cr（VI）浓度为50μg/mL-200μg/mL，即获得第一代富集菌群。

4.根据权利要求1所述的微生物菌群的富集方法，其特征在于，

步骤（1）中加入的重铬酸钾调整培养瓶中的Cr（VI）浓度为100μg/mL。

5.根据权利要求1所述的微生物菌群的富集方法，其特征在于，步骤（2）中所述的具体转接方法为：第一代菌群的培养瓶中的培养液震荡混匀，取上清液接种入装有PCS培养液的瓶中，于25-28℃的恒温静止培养5-7天，即获得第二代富集菌群；如此方法转接n代即可获得还原Cr（VI）的微生物菌群。

6.根据权利要求5所述的微生物菌群的富集方法，其特征在于，所述的PCS培养液中每1L培养液含：蛋白胨4-5g，酵母浸粉0.8-1g，氯化钠4-5g，调整Cr（VI）浓度为50-200mg/L。

7.根据权利要求1或5所述的微生物菌群的富集方法，其特征在于，转接代数为4-6次。

8.根据权利要求1所富集的微生物菌群在Cr重金属污染土壤的生物修复的应用。

9.根据权利要求1所富集的微生物菌群在Cr重金属污染水体的生物修复的应用。

10.根据权利要求1所富集的微生物菌群在Cr重金属污染的有机废弃物处理的应用。