FR2854886A1 - Procede de degradation du tbp par une souche bacterienne photosynthetique - Google Patents

Abstract

Procédé de traitement de déchets liquides (effluents industriels ou agricoles liquides ou sites aquatiques) chargés ou pollués en phosphate de tributyle (TBP), souches bactériennes modifiées susceptibles d'être utilisées dans ledit procédé de traitement, procédé de surveillance de l'évolution de la pollution par le TBP ainsi que dispositif de mise en oeuvre dudit procédé de traitement.Ledit procédé de traitement ou d'épuration de déchets liquides comprend essentiellement les étapes de (1) mise en contact desdits déchets liquides avec au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris), Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum), Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) ou Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides) ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, dans des conditions permettant la dégradation du TBP présent dans lesdits déchets et ce quelle que soit la concentration initiale en TBP ; et (2) la récupération des effluents liquides purifiés.

Description

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La présente invention est relative à un procédé de traitement de déchets liquides (effluents industriels ou agricoles liquides ou sites aquatiques) chargés ou pollués en phosphate de tributyle (TBP), à des souches bactériennes modifiées susceptibles d'être utilisées dans ledit procédé de traitement, à un procédé de surveillance de l'évolution de la pollution par le TBP ainsi qu'à un dispositif de mise en #uvre dudit procédé de traitement.

Le phosphate de tributyle (TBP) est un composé organophosphoré utilisé dans de nombreux domaines industriels et en particulier : comme solvant dans le recyclage des combustibles nucléaires et dans la purification des métaux rares ou dans la fabrication de plastifiants, de fluides hydrauliques, de pesticides, d'herbicides, d'agents anti-mousse ou d'agents anti-corrosion.

Toutes ces applications génèrent des quantités importantes de déchets, qui sont très peu biodégradables, car le TBP est peu ou pas dégradé en milieu naturel : il est peu dégradé par les microorganismes indigènes et il est très peu sensible à la photolyse ou à l'hydrolyse naturelle.

Bien que le TBP ne soit pas toxique pour l'organisme humain, il est néanmoins toxique envers divers organismes aquatiques (truites, crevettes, algues, bactéries) ce qui peut conduire à un déséquilibre écologique au niveau des sites contaminés.

Il existe des documents qui décrivent des méthodes générales de dégradation de composés organiques dans des effluents liquides : - le Brevet américain 6,472,198 décrit la dégradation de composés organiques chlorés, à l'aide de bactéries indigènes notamment de type méthanogène, acétogène, ou responsables de la deshalogénation ou de la dénitrification, ces bactéries fonctionnent soit en aérobiose, soit en anaérobiose. Un tel procédé n'est pas adapté à la dégradation du TBP.

- le Brevet américain 6,106,719, décrit l'utilisation, pour le traitement des déchets liquides contenant à la fois des composés organiques et des composés inorganiques contenant de l'azote ou du phosphore, d'une combinaison de bactéries sous la forme de granules solides, en anaérobiose et en présence de lumière ; ladite combinaison de bactéries comprend (a) un mélange de bactéries non-photosynthétiques : bactéries à fermentation acide et/ou bactéries productrices de méthane

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et (b) un mélange de bactéries photosynthétiques (bactéries pourpres non-sulfureuses, bactéries pourpres sulfureuses et bactéries vertes sulfureuses, telles que Chrorobium limicola, Chromatium vinosum, Rhodopseudomonas palustris ou Rhodobacter capsulatus). Un tel traitement permet la digestion de la matière organique, et celle des composés inorganiques comprenant de l'azote et/ou du phosphore. Dans le procédé décrit dans ce Brevet, la disparition du phosphore inorganique est liée à la croissance des bactéries photosynthétiques. Un tel procédé n'est donc pas adapté au traitement du TBP.

- Les Brevets américains 6,416,993 et 6,465,240 décrivent un procédé de dégradation de déchets organiques et inorganiques liquides, qui comprend deux étapes de traitement par des microorganismes photosynthétiques : premier traitement par un ou plusieurs procaryote (s) et de manière préfé- rée un consortium de bactéries photosynthétiques (bactéries pourpres non-sulfu- reuses : Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Chromatium, Rubrivivax ou cyanobactéries), puis un second traitement par des algues photosynthétiques. De manière plus précise, le procédé décrit permet de traiter des déchets contenant des concentrations élevées en carbone organique total (TOC), en demande d'oxygène biochimique (BOD), en azote (y compris l'ammoniaque) et en phosphore (P, y compris les phosphates, les polyphosphates, les phosphates organiques) ainsi que d'autres substances organiques ou inorganiques. Toutefois, ces procédés ne sont pas adaptés à la dégradation du TBP qui peut être présent à des concentrations élevées (de l'ordre de 100 mg/ml) ; en effet, les procédés décrits dans ces deux Brevets s'appliquent au traitement d'effluents agricoles, tels que le lisier, dans lequel on trouve peu ou pas de TBP. En outre, le TBP est réputé toxique pour les bactéries et les algues à de faibles concentrations (Nakamura A., 1991, International Program on
Chemical Safety-Environmental Health Critiria 112- Tri-n-Butyl Phosphate QV 627.

World Health Organisation).

Les procédés de l'art antérieur visant au traitement de l'ensemble des produits organiques et inorganiques ne sont donc pas adaptés au traitement de déchets comprenant du TBP, la croissance des algues et des bactéries non photo- synthétiques mises en #uvre étant généralement inhibée par le TBP.

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La dégradation du TBP par les microorganismes a fait l'objet de peu d'études ; elle met généralement en #uvre des microorganismes qui agissent en aérobiose : - Le Brevet américain 5,453,375 décrit un procédé de dégradation du TBP, qui met en #uvre la souche de bactérie Acinetobacter sp., en aérobiose.

- Dans d'autres études, l'équipe de R. A. THOMAS et al. [1, 2, 3, 4] a décrit l'utilisation d'un mélange de microorganismes du genre Pseudomonas spp., pour dégrader le TBP en aérobiose.

- Dans l'article au nom de S. OWEN et al. [5], l'utilisation de bactéries Citrobacter sp. est préconisée en aérobiose pour dégrader le TBP.

Les conditions (aérobiose) exposées dans ces documents présentent les inconvénients suivants : - rendement de dégradation du TBP faible, - reproductibilité des procédés aléatoire.

En conséquence, l'ensemble des procédés de traitement des déchets organiques préconisés dans l'art antérieur ne sont donc pas adaptés au traitement du TBP, dans la mesure où aucun d'entre eux ne décrit un procédé à la fois stable, reproductible, efficace et à rendement élevé (> à 400 mg/1) pour dégrader le TBP, présent dans des fourchettes de concentrations variables.

En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un procédé de traitement des déchets liquides contenant du TBP, qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les procédés de l'art antérieur, notamment en ce qu'il permet effectivement de dégrader le TBP, avec un bon rendement et notamment, dans certaines conditions, un rendement supérieur à 400 mg/1, tout en étant reproductible.

La présente invention a pour objet un procédé de traitement ou d'épuration de déchets liquides chargés en TBP, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (1) mise en contact desdits déchets liquides avec au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris), Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum), Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) ou Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides) ainsi que lesdites souches de bactéries

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modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, dans des conditions permettant la dégradation du TBP présent dans lesdits déchets, et ce, quelle que soit la concentration initiale en TBP ; (2) la récupération des effluents liquides purifiés.

Conformément à l'invention, pour une dégradation optimale, une source de carbone, soit endogène, soit exogène est nécessaire.

Selon un mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'étape (1) est réalisée en anaérobiose.

L'anaérobiose peut être obtenue en présence de lumière (lumière naturelle ou lumière artificielle, telle que lampe à incandescence ayant un spectre d'émission compris entre 350 et 1100 nm) et une énergie comprise dans une gamme de 1 à 2000 umoles de photons/m2/s, ou en l'absence de lumière, mais en présence d'un accepteur d'électrons couramment utilisé pour les bactéries photosynthétiques, tel que le triméthylamine-N-oxyde (TMAO), les nitrates et le diméthyl sulfoxyde (DMSO).

En général, dans les bassins de décantation utilisés, les bactéries pourpres non-sulfureuses mises en #uvre sont de préférence au fond dudit bassin, (oxygène plus rare) ; de ce fait, les bactéries, en l'absence de lumière, respirent suffisamment pour épuiser l'oxygène du milieu.

Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux de l'invention, ladite souche de bactérie résistante au TBP mise en #uvre à l'étape (1) du procédé est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué par Rp. palustris et Rs. rubrum, qui présentent une aptitude à dégrader le TBP, supérieure à 400 mg/1 et de préférence supérieure à 426 mg/1.

Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, l'étape (1) comprend la mise en #uvre d'un mélange de souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP comprenant au moins une souche sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum) et Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris) et au moins une autre souche sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) et Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides).

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Conformément à l'invention, les souches de bactéries pourpres nonsulfureuses résistantes au TBP sont de préférence sélectionnées parmi les souches Rp. palustris CGA009 n ATCC BAA-98, n ATCC 17002, n ATCC 17007, n DSM 8283, n DSM 126, n DSM 7375, n DSM 131, n DSM 25, n DSM 124 et n DSM 130, la souche Rs. rubrum SI n ATCC 11170, la souche Rb. capsulatus Saint-Louis n ATCC 23782 et la souche Rb. sphaeroides 2. 4.1. n ATCC 17023.

De manière surprenante, les Inventeurs ont sélectionné des souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP, qui permettent d'obtenir des rendements de dégradation élevés, quelle que soit la concentration initiale en TBP et ce dans un procédé d'épuration en une seule étape ; le procédé selon l'invention est efficace et reproductible pour épurer et dépolluer l'environnement, et en particulier dégrader le TBP dans des déchets liquides et ce en raison de l'utilisation, de préférence en anaérobiose, d'une ou plusieurs souches pures de bactéries pourpres nonsulfureuses résistantes au TBP, qui seules ou en mélange, permettent d'obtenir une dégradation du TBP au moins égal à 53 mg/1 et de préférence supérieur à 400 mg/1 d'effluents liquides.

Par déchets liquides , on entend désigner les effluents et/ou les sites aquatiques pollués. Ces déchets liquides contiennent du TBP à dégrader mais peuvent aussi contenir d'autres composés organiques et inorganiques. Ils proviennent de l'industrie et notamment de l'industrie nucléaire.

On entend, au sens de la présente invention par souche de bactérie pourpre non-sulfureuse résistante au TBP, une souche dont la croissance n'est pas inhibée en présence de concentrations de TBP au moins dans la fourchette de concentrations en TBP de 12-37 M (Nakamura, précité) et bien entendu également à des concentrations supérieures en TBP.

Selon encore un autre mode de mise en #uvre avantageux dudit procédé, l'étape (1) est effectuée à une température comprise entre 10 C et 37 C, de préférence à 30 C, à un pH compris entre 5,5 et 8,5, de préférence à 6,9 et pendant au moins 15 jours, de préférence entre 15 et 21 jours.

Conformément à l'invention, l'étape (1) est de préférence réalisée dans un bassin de décantation.

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La période d'incubation ou de mise en contact doit être suffisante pour que la souche de bactérie ou le mélange de souches de bactéries puisse croître de façon exponentielle, pour permettre la dégradation du TBP avec un rendement élevé.

Cette période d'incubation est de préférence entre plusieurs jours et plusieurs semaines, en fonction de la température d'incubation utilisée ; par exemple, une période d'incubation de 21 jours à une température de 30 C, permet d'obtenir un rendement supérieur à 400 mg/1.

Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux dudit procédé, le taux de TBP dans lesdits déchets liquides avant traitement est compris entre 0,01 mM et 1 M ; gamme de valeurs est suffisamment large pour correspondre aux condi- tions habituellement rencontrées dans les cas de pollution ; en effet, les relevés effectués dans des conditions de pollution donnent des valeurs de rejet en TBP de l'ordre de 100 mg/1 soit 0,375 mM. En conséquence, il n'est généralement pas nécessaire de diluer ou de concentrer l'échantillon à traiter avant sa mise en contact avec l'inoculum de bactéries. En outre, dans cette gamme de valeurs, le rendement de dégradation est particulièrement élevé. En effet, le procédé selon l'invention permet la dégradation de concentrations en TBP de l'ordre de 0,1 à 2 mM ; inhibition de la croissance des bactéries n'ayant été observée à ces concentrations. En particulier, lorsque la concentration initiale en TBP est supérieure à 1 mM, on obtient une dégradation complète du TBP, dans les conditions de l'invention. Plus précisément, en utilisant le procédé selon la présente invention, il est possible d'obtenir après 3 semaines d'incubation des rendements de dégradation du TBP compris entre 1 et 1000 mg par litre de milieu ; la valeur la plus élevée correspondant à la solubilité théorique maximale du TBP dans l'eau à 25 C.

Pour pouvoir obtenir un procédé efficace et reproductible avec des rendements de dégradation de TBP élevés selon l'invention, il convient d'inoculer une souche pure ou un mélange de bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP. Selon l'invention, il est préférable d'utiliser une souche pure de bactéries photosynthétiques, dans un but d'optimisation des conditions de traitement et ainsi du rendement de dégradation du TBP.

Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux de l'invention, les quantités de bactéries inoculées dans le milieu à traiter à l'étape (1), sont avanta-

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geusement comprises entre 104 et 1010 bactéries par ml de milieu à traiter. Toutefois, elles dépendent des conditions générales mises en #uvre (température, luminosité...).

En conséquence, de manière générale, on entend par quantité suffisante de bactéries à inoculer, la concentration d'ensemencement, c'est-à-dire le nombre initial de bactéries permettant, par croissance exponentielle, et dans des conditions adéquates, d'aboutir à une biomasse suffisante pour observer une dégradation du TBP.

Les souches de bactéries photosynthétiques résistantes au TBP, telles que mises en #uvre dans la présente invention présentent comme avantage de fournir de bons rendements de biodégradation du TBP même après avoir été soumises à un traitement ultérieur (nombre important de sous-cultures, par exemple).

Selon un autre mode de mise en #uvre avantageux du procédé selon l'invention, lorsque la source de carbone endogène n'est pas suffisante, on ajoute à l'étape (1), une source de carbone supplémentaire, dans le milieu à traiter; cette source de carbone supplémentaire est avantageusement une solution tamponnée contenant un extrait de levure à une concentration comprise entre 0,1et 10 g/1 (de préférence à 1 g/1), ou l'un des sels organiques suivants : succinate, glutamate, benzoate, malate ou fumarate à une concentration comprise entre 2 et 20 mM (de préférence à 10 mM), et des facteurs de croissance dont au minimum la biotine et l'acide para amino benzoïque à une concentration comprise entre 2 et 40 g/l chacun.

Préalablement à ladite mise en contact selon l'étape (1), les bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP sont sélectionnées par culture sur milieu contenant au moins 12 M et de préférence au moins 1 mM de TBP, puis sont cultivées selon des méthodes connues de l'homme du métier comme par exemple dans Bergey's manual of systematic bacteriology ; Williams & Wilkins Edition ou dans The photosynthetic bacteria R.K. Clayton et W. R. Sistrom ; Plenum Press.

Dans le cadre de l'invention, le procédé est avantageusement mis en #uvre en lagunage non aéré.

On entend par lagunage non-aéré , un dispositif comprenant au minimum un bassin de décantation d'une profondeur allant de 0,5 à 1 mètre pour une surface en accord avec le débit des effluents, sachant que le temps de rétention doit être au minimum de 15-21 jours dans des conditions de température et d'éclairement

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optimales. La séparation ultérieure des bactéries et du milieu traité est favorisée par les conditions mises en #uvre (anaérobiose, bassin de décantation).

Lorsque la croissance bactérienne a atteint une valeur importante, et avant de relarguer les effluents purifiés dans l'environnement, il peut être utile de récupérer les bactéries par filtration (en utilisant un filtre à diatomées par exemple) ou par centrifugation en continu avant de les réinjecter dans le système.

La présente invention a également pour objet un procédé de suivi ou de surveillance de la dégradation du TBP dans des déchets liquides, lequel procédé comprend : - la mise en #uvre du procédé de traitement de déchets liquides chargés en TBP, tel que défini ci-dessus, puis - le prélèvement d'un échantillon de milieu traité au moins au temps t+15 jours et la mesure dans ledit échantillon prélevé de la concentration de TBP résiduel ; cette mesure peut être réalisée manuellement ou automatisée lorsqu'il existe un grand nombre d'échantillons à analyser. L'étape de mesure du TBP résiduel (n'ayant pas été dégradé par les bactéries) peut s'effectuer par toute technique connue en chimie analytique couramment utilisée, et plus particulièrement dans le domaine des composés organophosphorés. Pour une mesure fiable et précise, on utilise généralement une technique chromatographique, et plus précisément la chromatographie liquide à haute performance couplée à un réfractomètre. Tout le procédé peut être automatisé.

La présente invention a également pour objet un coffret pour la mise en #uvre du procédé de traitement selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP, choisie dans le groupe constitué par Rp. palustris, Rs. rubrum, Rb. capsulatus ou Rb. sphaeroides ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, comme défini ci-dessus. Le mélange de souches comprend, de préférence, au moins la souche Rp. palustris ou la souche Rs. rubrum, comme précisé ci-dessus.

La présente invention a également pour objet des souches de bactéries, sélectionnées dans le groupe constitué par les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP, choisies dans le groupe constitué par Rp.

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palustris, Rs. rubrum, Rb. capsulatus ou Rb. Sphaeroides, caractérisées en ce que leur ADN inclut au moins une copie du gène codant pour un cytochrome P450.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites souches, elles sont constituées par une souche de Rp. palustris CGA009 comprenant un gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. palustris, sous le contrôle du promoteur LHa(3e, décrit dans Tadros M.H. et al. (10) (souche Rp. palustris LH5939). Le gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. Palustris est notamment décrit dans la base de données d'Oak Ridge National Laboratory (ORNL) sous le n de gène 5939 (site :

http://genome.ornl.gov) ou sous le n d'accès Genbank n NZ AAAFO1000001.1.

La présente invention a également pour objet un dispositif d'épuration des déchets liquides chargés en TBP en mettant en #uvre le procédé de dégradation tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un bassin de décantation adapté à la mise en contact des bactéries pourpres non-sulfureuses avec le milieu à traiter, de préférence en anaérobiose. Un tel dispositif met notamment en #uvre la technique de lagunage non-aéré, qui consiste à faire passer les effluents pollués, chargés en TBP dans une série de bassins à l'air libre dont le premier, appelé bassin de décantation, est spécifiquement ensemencé dans le cadre de l'invention par des bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP. Dans ce cas, l'anaérobiose se déroule au fond du bassin de tête où se dépose les boues. Ledit bassin de décantation est, de préférence, d'une profondeur allant de 0,5 à 1 mètre pour une surface en accord avec le débit des effluents, sachant que le temps de rétention doit être au minimum de 15-21 jours dans les conditions de température et d'éclairement optimales telles que définies ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit dispositif, il comprend outre ledit bassin de décantation, des moyens d'introduction desdits déchets liquides contenant du TBP dans ledit bassin de décantation, des moyens d'introduction de l'inoculum de bactéries, des moyens d'évacuation des effluents épurés en TBP vers l'extérieur ainsi que des moyens de récupération des bactéries à recycler.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit dispositif, ledit moyen de récupération des bactéries est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les filtres à diatomées et les centrifugeuses en continu.

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Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre de l'invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente la consommation de TBP (exprimée en pourcentage) en aérobiose (barres hachurées) et en anaérobiose (barres avec pointillés) pour chacune des souches de bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuse testées (Rb. capsulatus Saint-Louis (ATCC 23782), Rb. sphaeroides 2. 4.1 (ATCC 17023), Rs. rubrum S.l. (ATCC 11170), et Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98)).

Le milieu de culture de Hutner non inoculé est utilisé comme témoin ; la figure 2 représente la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) dans des conditions aérobies (A) et photosynthétiques (B) dans le milieu de culture de Hutner, en présence (cercles remplis) et en l'absence (cercles vides) de TBP 2 mM et des concentrations en TBP dans un milieu de culture (carrés remplis) au cours de la croissance bactérienne. A la figure 2A, l'échelle des ordonnées de gauche correspond à la densité optique de la culture mesurée à 660 nm.

L'échelle des ordonnées de droite correspond au pourcentage de TBP par rapport à la quantité ajoutée initialement (2 mM). En aérobiose, la courbe de dégradation peut être transcrite par la fonction a.etln2/t1/2 + b avec a =28, b=0,55 et t1/2=1,1 jour. En anaé-

robiose, la courbe peut être transcrite par la fonction a.e 2r' + a2. e 2zavec a, =23, a2=77, et t1=13,5 jours. Les échelles de la figure 2B sont identiques à celles de la figure 2A.

- les figures 3A et 3B représentent respectivement la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) dans des conditions photosynthétiques dans le milieu de culture de Hutner en présence de différentes concentrations de TBP, et une étude cinétique de la consommation de TBP pour la souche Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) dans les mêmes conditions. Les échelles de la figure 3A sont identiques à celles de la figure 2. Celle de la figure 3B correspond à la concentration initiale en TBP exprimée en mM. Les concentrations en TBP sont 0 mM (astérisques), 0,1 mM (croix), 0,5 mM (triangles), 1 mM (cercles), 1,5 mM (losanges), et 2 mM (carrés) ;

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la figure 4A représente la croissance de Serratia odorifera sp. dans du milieu Tsb en aérobiose, en présence (cercles) et en l'absence de monoxyde de carbone dans le milieu de culture (carrés) ; la figure 4B représente la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) exprimée en unités de densité optique à 660 nm dans des conditions photosynthétiques dans le milieu de culture de Hutner en présence (cercles) et en l'absence de monoxyde de carbone dans le milieu de culture (carrés). Toutes les bactéries sont incubées en présence (symboles remplis) et en l'absence (symboles vides) de TBP 2 mM ; - la figure 5 représente la consommation de TBP exprimée en pourcentage de TBP résiduel par les souches Serratia odorifera sp. et Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) après 24 heures et 3 semaines respectivement, en l'absence (barres en pointillés) et en présence (barres hachurées) de monoxyde de carbone dans le milieu de culture ; - la figure 6 représente le plasmide pCB07 comprenant le gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. palustris n 5939 et le promoteur LHape.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Exemple 1 : Comparaison du rendement de dégradation du TBP en aérobiose et en anaérobiose par diverses bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses .

A. Matériel et méthodes
Au cours de cette expérience, on mesure la concentration du TBP résiduel en aérobiose et en anaérobiose après 3 semaines de culture par les bactéries photosynthétiques suivantes : Rb. capsulatus Saint-Louis (ATCC 23782), Rb. sphaeroides 2. 4.1 (ATCC 17023), Rs. rubrum S.l. (ATCC 11170) et Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98).

Les bactéries photosynthétiques sont incubées dans un milieu de Hutner [6] dans lequel le pH est compris entre 6,5 et 7,5, en présence de 2 mM de TBP, soit en aérobiose, soit en anaérobiose. En aérobiose, les bactéries sont incubées dans l'obscurité à une température de 30 C ; le milieu de culture étant soumis à une agitation (150 rpm).

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En anaérobiose, les bactéries sont incubées à la lumière (lampe à incandescence ayant un spectre d'émission compris entre 400 et 900 nm) à 30 C.

L'anaérobiose est obtenue par dégazage du milieu avant l'inoculation par mise sous dépression du flacon à l'aide d'une pompe à vide ou par bullage d'un gaz neutre dans le milieu (azote ou argon) ou alors par remplissage complet du flacon qui après inoculation est placé à l'obscurité pendant 1 heure de façon à ce que les bactéries épuisent l'oxygène du milieu par la respiration.

Les milieux sont stérilisés par autoclavage à 120 C pendant 15 minutes. Le TBP est ajouté, après stérilisation, à une concentration finale de 2 mM, qui se situe au dessous du point de saturation du produit de solubilité du TBP dans l'eau qui est inférieur à lg/1 (3,7 mM) à 25 C.

La croissance est suivie au spectrophotomètre à une densité optique (DO) de 660 nm et les échantillons sont prélevés régulièrement et stockés à -20 C pour les mesures ultérieures du TBP résiduel.

On centrifuge la culture à 5000 g pendant 10 minutes pour séparer les bactéries du milieu de culture. On récupère alors le surnageant sur lequel on détermine la concentration du TBP résiduel. On ajoute au surnageant aqueux un volume égal de dichloroéthane et de phosphate de tripropyle (TPP). Le solvant permet d'extraire le TBP et les autres composés organiques hydrophobiques, et le TPP est utilisé en tant que standard interne pour quantifier l'efficacité d'extraction et pour calibrer les résultats lors des analyses ultérieures par chromatographie liquide à haute performance (CLHP ou HPLC pour High Performance Liquid Chromatography). On mélange les échantillons par vortexage pendant 1 minute puis on laisse reposer pendant 30 minutes. Afin d'éliminer toute trace aqueuse, on filtre alors la phase organique (phase inférieure) sur un séparateur de phase (IPS, Whatman) suivie d'une évaporation pendant une nuit à 30 C, ou alternativement, on procède au passage d'un courant léger d'azote à température ambiante pendant 15 minutes. Les échantillons sont dilués dans du dodécane pour une analyse ultérieure par CLHP.

On procède alors à des mesures par analyses CLHP en utilisant une colonne Brownlee Spheri-5 aminée (Perkin Elmer) intégrée à une CLHP de modèle Waters 1525. On élue en utilisant un mélange d'heptane et d'acétate d'éthyle (75/25, vol/vol) avec un débit de 1 ml/min tel que décrit dans EP-A-0,578,579. On mesure le

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TBP en utilisant un réfractomètre de type Waters 2414 et on analyse les profils de chromatographie en utilisant le logiciel Breeze (commercialisé par la société Waters).

On définit la concentration en TBP par le rapport entre les aires de pics des composés TBP et TPP.

Les composés TBP et TPP, dont la pureté est estimée supérieure à 99 %, ainsi que tous les produits chimiques précédemment cités qui sont utilisés pour extraire le TBP et lors de l'analyse CLHP sont fournis par Sigma-Aldrich.

B. Résultats
Les résultats sont présentés dans la figure 1.

En aérobiose, les rendements de dégradation du TBP atteignent 13 à 22 % après 21 jours d'incubation. Ces valeurs sont similaires à celles obtenues avec des isolats naturels tels que la souche Serratia odorifera sp..

Dans des conditions photosynthétiques (anaérobiose), le rendement de dégradation est nettement amélioré chez certaines souches, atteignant presque 80 % pour Rp. palustris et Rs. rubrum après 3 semaines de culture. Ce rendement est reproductible, quel que soit le traitement ultérieur auquel sont soumises lesdites souches.

Exemple 2 : de la souche Rp. palustris CGA009 et cinétique de dégra- dation du TBP par la même souche soit en aérobiose, soit en anaérobiose.

En raison des résultats obtenus à l'exemplel, la souche Rp. palustris a plus particulièrement été étudiée.

Les conditions de culture et d'analyse du TBP sont identiques à celles utilisées dans l'exemple 1.

Les résultats sont présentés dans la figure 2.

On mesure la croissance de la souche Rp. palustris en présence de TBP (2 mM) ou en l'absence de TBP. Aussi bien en aérobiose (figure 2A) qu'en anaérobiose (figure 2B), la croissance de la souche commence après un délai, celui-ci étant plus court en aérobiose, puis la cinétique de croissance s'accélère pour atteindre celle du témoin (absence de TBP). En aérobiose, la cinétique de dégradation est monophasique ; elle peut se traduire par une courbe exponentielle avec un tl/2 de 1,1 jours (28 % d'amplitude). Le taux de consommation initiale de TBP est de 13 mol/l/h (Figure 2A).

<Desc/Clms Page number 14>

En anaérobiose, la cinétique de croissance est biphasique, elle peut se traduire par une série de deux courbes exponentielles avec un t1/2 de 0,94 jour (23 % d'amplitude) et un t1/2 de 13,5 jours (77 % d'amplitude). Le taux de consommation initial du TBP est de 15 mol/l/h (Figure 2B). Ces résultats démontrent l'existence de deux mécanismes différents : un mécanisme rapide fonctionnant en aérobiose et en anaérobiose, et un autre plus lent qui fonctionne seulement en anaérobiose. Il est à noter que dans les deux conditions de culture, les phases rapides correspondent presque à la même courbe exponentielle suggérant la survenue de deux mécanismes similaires indépendant des conditions de culture, alors que la phase lente semble être liée à l'anaérobiose. Il est remarquable qu'en anaérobiose, la phase rapide de dégradation du TBP apparaisse de façon concomitante avec la fin du délai de croissance mentionnée précédemment, alors que l'accélération nette de la croissance de la souche est accompagnée par un ralentissement de la cinétique de dégradation du TBP.

Exemple 3 : Effet de différentes concentrations de TBP sur la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 et la cinétique de dégradation du TBP par la même souche en anaérobiose.

Les conditions de culture et d'analyse du TBP sont identiques à celles utilisées dans l'exemple 1.

Les résultats sont illustrés par la figure 3.

La souche Rp. palustris CGA009 est mise en culture en présence de concentrations variées de TBP : 1,5 ; 1, 0,5 et 0,1 mM en anaérobiose.

D'après ces résultats, on note un raccourcissement du délai de croissance lorsque la concentration du TBP est réduite. De plus, à une concentration inférieure à 1 mM, la croissance de la souche est similaire à celle observée dans le milieu dépourvu de TBP (Figure 3A). Les rendements de dégradation en TBP s'améliore lorsque la concentration en TBP est supérieure à 1 mM ; le TBP est alors presque entièrement dégradé (Figure 3B).

On n'observe aucune inhibition de la dégradation du TBP par un métabolite secondaire avec la souche Rp. palustris CGA009.

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Exemple 4 : Rôle du cytochrome P450 par l'étude de l'effet d'un inhibiteur du cytochrome P450, le monoxyde de carbone (CO) sur la croissance de la souche Rp. palustris en présence ou en l'absence de TBP.

Afin de démontrer qu'un ou plusieurs cytochrome (s) activement à la dégradation du TBP par la souche Rp. palustris CGA009, on incube cette souche de bactéries en présence de monoxyde de carbone (CO), qui est un inhibiteur du cytochrome P450, en présence (2mM) ou en l'absence de TBP. Il est possible de procéder au traitement par le CO, préalablement à l'inoculation de la culture, de deux manières différentes : par bullage léger, soit par addition d'un milieu de culture déjà saturé en CO.

Une souche S. odorifera, qui ne peut croître qu'en condition aérobie dans un milieu Tryptic soy broth (Tsb ; Sigma-Aldrich), est utilisée à titre de comparaison ; cette souche étant capable de dégrader le TBP mais avec un rendement global plus faible.

Les conditions de culture et de mesure du TBP sont identiques à celles utilisées dans l'exemple 1.

Les résultats sont illustrés par la figure 4.

Comme le montrent les figures 4A et 4B, respectivement, la présence du CO dans le milieu n'affecte pas la croissance de chacune des deux souches lorsque le TBP est absent du milieu, et également pour la souche S. odorifera lorsqu'elle est mise en présence de TBP. De plus, la croissance de la souche R. palustris est fortement réduite en présence de CO (Figure 4B). Ainsi, la croissance de R. palustris est réellement réduite par l'inhibition des cytochromes P450 lorsque le TBP est présent. Le dosage de la concentration du TBP résiduel après 21 jours de culture montre une diminution importante de la dégradation du TBP (Figure 5). Ceci suggère l'existence d'une corrélation entre l'inhibition des cytochromes P450 et le rendement faible de dégradation du TBP. Cette corrélation n'existe pas avec la souche S. odorifera pour laquelle le traitement au CO ne modifie pas d'une façon significative le rendement de la dégradation en TBP.

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Exemple 5 : Construction d'une souche de Rp. palustris surexprimant le cytochrome P450 d'une façon constitutive.

Le gène 5939 de Rp. palustris CG009 (toutes les informations concernant ce gène peuvent être trouvées sur le site http://genome.ornl.gov) codant pour le cytochrome P450 a été introduit dans la même souche.

Pour ce faire, on réalise une fusion transcriptionnelle du promoteur du cluster génique du complexe de récupération de la lumière II (LH) [alpha]sse et du gène 5939 de façon à obtenir une expression constitutive du gène en question. Le promoteur LH[alpha]sse est amplifié par PCR à partir de 300 pb en amont du codon de départ jusqu'à 68 pb en aval de celui-ci en utilisant l'ADN génomique de Rp. palustris CG009 comme matrice (10), avec les amorces suivantes :
5'-GGGGTACCCCTGGGATGTCCGGTATGACA-3' (SEQ ID NO:1) contenant un site de restriction KpnI (indiqué dans la séquence en gras), et
5'-CCCAAGCTTGGGTTGTGGAGCTCTTCCGTTC-3' (SEQ ID NO:2) contenant un site de restriction HindIII (indiqué dans la séquence en gras).

Le fragment amplifié par PCR est cloné dans le vecteur de clonage pGEM-T (Proméga) pour donner le plasmide pCB04. On amplifie ensuite le gène 5939 entier en utilisant les amorces suivantes :
5'-CCCAAGCTTGGGTGAACAACAACGAGGGAGTG-3' (SEQ ID NO:3) contenant un site de restriction HindIII (indiqué dans la séquence en gras), et
5'-CCCGAGCTCGGGCTATGGCGTGGAAATGGA-3' (SEQ ID NO:4) contenant un site de restriction SacI (indiqué dans la séquence en gras).

Le fragment amplifié par PCR est digéré par HindIII et SacI et ligaturé dans le plasmide pBBRIMCS2 (Kovach et al., 1994) aux mêmes sites, ce qui permet d'obtenir le plasmide pCB06.

Le plasmide pCB04 est digéré par KpnI et HindIII et cloné dans le plasmide pCB06 digéré par ces mêmes enzymes de restriction, pour obtenir le plasmide pCB07. La carte du plasmide pCB07 est indiquée dans la figure 6.

Afin de surexprimer le cytochrome P450 dans la souche Rp. palustris CG009, le plasmide pCB07 contenant le gène 5939 sous contrôle du promoteur LHape est transféré par conjugaison tri-parentale à partir des souches E.coli

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DH5[alpha] phe (Eraso, et al., 1994) et de HB101 (Boyer et al., 1969) dans la souche Rp. palustris CG009 pour obtenir la souche Rp. palustris LH5939 surexprimant le cytochrome P450 (clones positifs). Ces clones positifs sont sélectionnés dans un milieu contenant de la kanamycine à une concentration comprise entre 20 et 100 g/ml.

<tb>
<tb>

Descriptif <SEP> des <SEP> différents <SEP> plasmides <SEP> et <SEP> souches <SEP> utilisés <SEP> : <SEP>
<tb> Souche <SEP> Caractéristiques' <SEP> Source <SEP> ou
<tb> ou <SEP> plasmide <SEP> référence
<tb> Souches <SEP> E. <SEP> coli
<tb> DH5aphe <SEP> F- <SEP> <D80d/acZAM15 <SEP> #(lacZYA-argF)U169 <SEP> recAl <SEP> endAl <SEP> hsdR17 <SEP> (8)
<tb> (rk-mk+) <SEP> sup <SEP> E44 <SEP> #- <SEP> gyrA <SEP> thi-l <SEP> relAl <SEP> phe::Tn10dCm
<tb> HB <SEP> 101 <SEP> F- <SEP> #(gpt-proA)62 <SEP> leuB6 <SEP> supE44 <SEP> ara-14 <SEP> glaK2 <SEP> lacYI <SEP> A(mcrC- <SEP> (7)
<tb> mrr) <SEP> rpsL20 <SEP> (St <SEP> xyl-5 <SEP> mtl-l <SEP> recA13
<tb> Souches <SEP> R.
<tb> palustris
<tb> wt <SEP> Souche <SEP> CGA009, <SEP> génome <SEP> totalement <SEP> séquence <SEP> voir <SEP> site
<tb> Q <SEP> LH5939 <SEP> 5939 <SEP> Q <SEP> avec <SEP> plasmide <SEP> pCB07 <SEP> précité
<tb> Invention
<tb> Plasmides
<tb> pGEM-T <SEP> Vecteur <SEP> de <SEP> clonage, <SEP> Apr
<tb> pBBRIMCS2 <SEP> Vecteur <SEP> de <SEP> clonage, <SEP> Kmr <SEP> Promega
<tb> pCB04 <SEP> pGEM-T <SEP> avec <SEP> un <SEP> fragment <SEP> de <SEP> 374 <SEP> pb <SEP> du <SEP> promoteur <SEP> (9)
<tb> LHape, <SEP> Apr <SEP> Invention
<tb> pCB06 <SEP> fragment <SEP> HindIII <SEP> + <SEP> SacI <SEP> du <SEP> gène <SEP> 5939 <SEP> amplifié <SEP> par <SEP> PCR <SEP> et
<tb> cloné <SEP> dans <SEP> pBBRIMCS2 <SEP> Invention
<tb> pCB07 <SEP> fragment <SEP> KpnI <SEP> + <SEP> Hindlll <SEP> de <SEP> pCB04 <SEP> cloné <SEP> dans <SEP> pCB06, <SEP> Kmr
<tb> Invention
<tb> a <SEP> Ap, <SEP> ampicilline <SEP> ; <SEP> Km, <SEP> kanamycine.
<tb>

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Thomas R. A. et al.,. Appl Microbiol Biotechnol., 1998, 49, 202-209.

2. Thomas R. A. P. et al., Biotechnol Techn., 1997, 11, 781-785.

3. Thomas, R. A. P. et al., Environ. Sci. and Biotechnol., 1996, 30, 2371-2375.

4. Thomas R. A. P. et al., FEMS Microbiology Lett., 1997,155,155-159.

5. Owen S. et al., Appl Biochem Biotechnol., 1992,34/35, 693-707.

6. Clayton R., K., Biochim. Biophys. Acta., 1960,37, 503-512.

7. Boyer H.W. et al., J. Mol. Biol., 1969, 41, 459-72.

8. Eraso J. M. et al., J. Bacteriol., 1994, 176, 32-43.

<Desc/Clms Page number 18>

9. Kovach M. E. et al., Biotechniques, 1994, 16, 800-2.

10. Tadros M. H. et al., Eur. J. Biochem., 1993,217, 867-75.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1 ) Procédé de traitement ou d'épuration de déchets liquides chargés en phosphate de tributyle (TBP), caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes de : (1) mise en contact desdits déchets liquides avec au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris), Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum), Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) ou Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides) ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, dans des conditions permettant la dégradation du TBP présent dans lesdits déchets et ce quelle que soit la concentration initiale en TBP ; et (2) la récupération des effluents liquides purifiés.

2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (1) de mise en contact est mise #uvre en anaérobiose.

3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ladite souche de bactérie résistante au TBP mise en #uvre à l'étape (1) du procédé est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué par Rp. palustris et Rs. rubrum.

4 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape (1) comprend la mise en #uvre d'un mélange de souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP comprenant au moins une souche sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum) et Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris) et au moins une autre souche sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) et Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides).

5 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP sont sélectionnées dans le groupe constitué par les souches de Rp. palustris CGA009 n ATCC BAA-98, n ATCC 17002, n ATCC 17007, n DSM 8283, n DSM 126, n DSM7375, n DSM 131, n DSM 25, n DSM 124 et n DSM 130, la souche Rs.

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rubrum SI n ATCC 11170, la souche Rb. capsulatus Saint-Louis n ATCC 23782 et la souche Rb. sphaeroides 2.4.1. n ATCC 17023.

6 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape (1) de mise en contact est effectuée à une température comprise entre 10 C et 37 C, de préférence à 30 C, à un pH compris entre 5,5 et 8,5, de préférence à 6,9 et pendant au moins 15 jours, de préférence entre 15 et 21 jours.

7 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le taux de TBP dans lesdits déchets liquides avant traitement est compris entre 0,01 mM et 1 M.

8 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les quantités de bactéries inoculées dans le milieu à traiter à l'étape (1) sont avantageusement comprises entre 104et 1010 bactéries par ml de milieu à traiter.

9 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'au cours de l'étape (1), on ajoute une source de carbone supplémentaire, dans le milieu à traiter.

10 ) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite source de carbone supplémentaire est avantageusement une solution tamponnée contenant un extrait de levure à une concentration comprise entre 0,1et 10 g/1 ou l'un des sels organiques suivants : succinate, glutamate, benzoate, malate ou fumarate à une concentration comprise entre 2 et 20 mM (de préférence à 10 mM), et des facteurs de croissance dont au minimum la biotine et l'acide para amino benzoïque à une concentration comprise entre 2 et 40 g/l chacun.

Il') Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que préalablement à ladite mise en contact selon l'étape (1), les bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP sont sélectionnées par culture sur milieu contenant au moins 12 M et de préférence au moins 1 mM de TBP.

12 ) Procédé de suivi ou de surveillance de la dégradation du TBP dans des déchets liquides, lequel procédé comprend : - la mise en #uvre du procédé de traitement de déchets liquides chargés en TBP selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, puis

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- le prélèvement d'un échantillon de milieu traité au moins au temps t+ 15 jours et la mesure dans ledit échantillon prélevé de la concentration de TBP résiduel.

13 ) Coffret pour la mise en #uvre du procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP, choisie dans le groupe constitué par Rp. palustris, Rs. rubrum, Rb. capsulatus ou Rb. sphaeroides ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, telles que définies aux revendications 1, 3, 4 ou 5.

14 ) Souches de bactéries, sélectionnées dans le groupe constitué par les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP, choisies dans le groupe constitué par Rp. palustris, Rs. rubrum, Rb. capsulatus et Rb. sphaeroides, caractérisées en ce que leur ADN inclut au moins une copie du gène codant pour un cytochrome P450.

15 ) Souche de bactéries selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Rp. palustris CGA009 n ATCC BAA-98 comprenant un gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. palustris, sous le contrôle du promoteur LHape.

16 ) Dispositif d'épuration des déchets liquides chargés en TBP, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un bassin de décantation adapté à la mise en contact des bactéries pourpres non-sulfureuses avec le milieu à traiter, de préférence en anaérobiose.

17 ) Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit bassin de décantation est, de préférence, d'une profondeur allant de 0,5 à 1 mètre pour une surface en accord avec le débit des effluents, sachant que le temps de rétention doit être au minimum de 15-21 jours.

18 ) Dispositif selon la revendication 16 ou la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend outre ledit bassin de décantation, des moyens d'introduction desdits déchets liquides contenant du TBP dans ledit bassin de décantation, des moyens d'introduction de l'inoculum de bactéries, des moyens d'évacuation des effluents épurés en TBP vers l'extérieur ainsi que des moyens de récupération des bactéries à recycler.

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19 ) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que ledit moyen de récupération des bactéries est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les filtres à diatomées et les centrifugeuses en continu.