CA2525314A1 - Procede de degradation du tbp par une souche bacterienne photosynthetique - Google Patents

Abstract

Procédé de traitement de déchets liquides (effluents industriels ou agricole s liquides ou sites aquatiques) chargés ou pollués en phosphate de tributyle (TBP), souches bactériennes modifiées susceptibles d'être utilisées dans led it procédé de traitement, procédé de surveillance de l'évolution de la pollutio n par le TBP ainsi que dispositif de mise en .oelig.uvre dudit procédé de traitement. Ledit procédé de traitement ou d'épuration de déchets liquides comprend essentiellement les étapes de (1) mise en contact desdits déchets liquides avec au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non- sulfureuse résistante au TBP sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris), Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum), Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) ou Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides) ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, dans des conditions permettant la dégradatio n du TBP présent dans lesdits déchets et ce quelle que soit la concentration initiale en TBP ; et (2) la récupération des effluents liquides purifiés.</S DOAB>

Description

PROCÉDÉ DE DÉGRADATION DU TBP PAR UNE SOUCHE BACTÉ-RIENNE PHOTOSYNTHÉTIQUE
La présente invention est relative à un procédé de traitement de déchets liquides (effluents industriels ou agricoles liquides ou sites aquatiques) chargés ou pollués en phosphate de tributyle (TBP), à des souches bactériennes modi-fiëes susceptibles d'être utilisées dans ledit procédé de traitement, à un procédé de surveillance de l'évolution de la pollution par le TBP ainsi qu'à un dispositif de mise en oeuvre dudit procédé de traitement.
Le phosphate de tributyle (TBP) est un composé organophosphoré
utilisé dans de nombreux domaines industriels et en particulier : comme solvant dans le recyclage des combustibles nucléaires et dans la purification des métaux rares ou dans la fabrication de plastifiants, de fluides hydrauliques, de pesticides, d'herbicides, d'agents anti-mousse ou d'agents anti-corrosion.
Toutes ces applications génèrent des quantités importantes de déchets, qui sont très peu biodégradables, car le TBP est peu ou pas dégradé
en milieu naturel : il est peu dégradé par les microorganismes indigènes et il est très peu sensible à la photolyse ou à l'hydrolyse naturelle.
Bien que le TBP ne soit pas toxique pour l'organisme humain, il est néanmoins toxique envers divers organismes aquatiques (truites, crevettes, algues, bactéries) ce qui peut conduire à un déséquilibre écologique au niveau des sites contaminés.
Il existe des doçuments qui décrivent des méthodes générales de dégradation de composés organiques dans des effluents liquides - le Brevet américain 6,472,19 décrit la dégradation de composés organiques chlorés, à l'aide de bactéries indigènes notamment de type méthanogène, acétogène, ou responsables de la deshalogénation ou de la dénitrification, ces bactéries fonctionnent soit en aérobiose, soit en anaérobiose. Un tel procédé n'est pas adapté à
la dégradation du TBP.
- le Brevet américain 6,106,719, décrit l'utilisation, pour le traite-ment des déchets liquides contenant à la fois des composés organiques et des compo-sés inorganiques contenant de l'azote ou du phosphore, d'une combinaison de bacté-ries sous la forme de granules solides, en anaérobiose et en présence de lumière ;

2 ladite combinaison de bactéries comprend (a) un mêlange de bactéries non-photo-synthétiques : bactéries à fermentation acide et/ou bactéries productrices de méthane et (b) un mélange de bactéries photosynthétiques (bactéries pourpres non-sulfureuses, bactéries pourpres sulfureuses et bactéries vertes sulfureuses, telles que Chrorobium limicola, Chromatium vinosum, Rhodopseudomoxaas palustris ou Rhodobacter capsulatus). Un teI traitement permet Ia digestion de Ia matiére organique, et celle des composés inorganiques comprenant de l'azote et/ou du phosphore. Dans le procédé
décrit dans ce Brevet, la disparition du phosphore inorganique est liée à la croissance des bactéries photosynthétiques. Un tel procédé n'est donc pas adapté au traitement du TBP.
. - Les Brevets américains 6,416,993 et 6,465,240 décrivent un procédé de dégradation de déchets organiques et inorganiques liquides, qui comprend deux étapes de traitement par des microorganismes photosynthétiqués : un premier traitement par un ou plusieurs procaryote(s) photosynthétiques) et de manière prêfé-rée un consortium de bactéries photosynthétiques (bactéries pourpres non-sulfu-reuses : Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Chromatium, Rubrivivax ou cyanobactéries), puis un second traitement par des algues photosynthétiques. De maniére plus précise, le procédé décrit permet de traiter des déchets contenant des concentrations êlevées en carbone organique total (TOC), en demande d'oxygène biochimique (BOD), en azote (y comprïs l'ammoniaque) et en phosphore (P, y compris les phosphates, les polyphosphates, les phosphates organiques) ainsi que d'autres substances organiques ou inorganiques. Toutefois, ces procédés ne sont pas adaptés à la dégradation du TBP qui peut être présent à des concentrations élevêes (de l'ordre de 100 mg/ml) ; en effet, les procédés décrits dans ces deux Brevets s'appliquent au traitement d'effluents agricoles, tels que le lisier, dans lequel on trouve peu ou pas de TBP. En outre, le TBP est réputé toxique pour les bactéries et les algues à de faibles concentrations (Nakamura A., 1991, International Progratn oh Chemical Safety-E~virofimental Health Critiria 112- Tri-h-Butyl Phosphate QV
627.
Wo~ld Health Organisation).
Les procédés de l'art antérieur visant au traitement de l'ensemble des produits organiques et inorganiques ne sont donc pas adaptés au traitement de

3 déchets comprenant du TBP, la croissance des algues et des bactéries non photo-synthétiques mises en oeuvre étant généralement inhibée par le TBP.
La dégradation du TBP par les microorganismes a fait l'objet de peu d'études ; elle met généralement en oeuvre des microorganismes qui agissent en aéro-biose - Le Brevet américain 5,453,375 décrit un procédé de dégradation du TBP, qui met en oeuvre la souche de bactérie Aci~etobactef° sp., en aérobiose.
- Dans d'autres études, l'équipe de R.A. THOMAS et al. [1, 2, 3, 4]
a décrit l'utilisation d'un mélange de microorganismes du genre Pseudomonas spp., pour dëgrader le TBP en aérobiose.
- Dans l'article au nom de S. OWEN et al. [5], l'utilisation de bacté-ries Citrobacter sp. est préconisée en aérobiose pour dégrader le TBP.
Les conditions (aérobiose) exposées dans ces documents présentent les inconvénients suivants - rendement de dégradation du TBP faible, - reproductibilité des procédés aléatoire.
En conséquence, l'ensemble des procédés de traitement des déchets organiques préconisés dans l'art antérieur ne sont donc pas adaptés au traitement du TBP, dans la mesure où aucun d'entre eux ne décrit un procédé à la fois stable, repro-ductible, efficace et à rendement élevé (> à 400 mgll) pour dégrader le TBP, présent dans des fourchettes de concentrations variables.
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un procédë de traitement des déchets liquides contenant du TBP, qui réponde mieux aixx besoins de la pratique que les procédés de l'art antérieur, notamment en ce qu'il permet effectivement de dégrader le TBP, avec un bon rendement et notamment, dans certaines conditions, un rendement supérieur à 400 mg/l, tout en étant reproductible.
La présente invention a pour objet un procédé de traitement ou d'épuration de déchets liquides chargés en TBP, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (1) mise en contact desdits déchets liquides avec au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP
sélec-tionnée dans le groupe constitué pax Rhodopseudomonas palustres (Rp.
palustres),

4 Rhodospirillufn rubruryz (Rs. rubrur~a), Rhodobacter capsulatus (Rb.
capsulatus) ou Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides) ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, dans des conditions permettant la dégradation du TBP présent dans lesdits déchets, et ce, quelle que soit la concentration initiale en TBP ; et (2) la récupération des effluents liquides purifiés.
Conformément à l'invention, pour une dégradation optimale, une source de carbone, soit endogène, soit exogène est nécessaire.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'étape (1) est réalisée en anaérobiose ou micro-anaérobiose.
De manière générale, selon les besoins en oxygène, on définit diffé-rentes conditions : aérobiose, micro-anaérobiose (ou micro-aérobiose ou microaéro-philie) et anaérobiose stricte, de la manière suivante - aérobiose : un microorganisme aérobie est un microorganisme qui peut utiliser l' oxygène comme accepteur final d' électrons ;
- micro-anaérobiose ou micro-aérobiose : un microorganisme capa-ble de se développer en conditions dites de micro-aérobiose ou micro-anaérobiose est un microorganisme incapable de croître lorsque les concentrations en oxygène attei-gnent celles rencontrées dans l'air (20 %) mais qui est néanmoins capable de croître en présence de taux faibles en oxygène (2 à 10 %) ; de tels microorganismes présen-tent de meilleures conditions de croissance en présence de petites quantités d'oxygène libre ; en particulier, ils se développent sous la surface dans un tube, au niveau où les concentrations en oxygène sont optimales pour leur croissance (Microbiology.
Principles and Applications, 1996, 3'a Edition, Black JG, Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, pages 144-148).
- anaérobiose stricte : un microorganisme anaérobie n'est capable de se développer qu'en l'absence d'oxygène moléculaire.
Au sens de Ia présente invention, le terme anaérobiose, appliqué aux bactéries photosynthétiques non-sulfureuses est équivalent au terme microaérophilie ou micro-anaérobiose, plus communément utilisé poux ces bactéries ; une bactérie est dite microaérophile lorsqu'elle ne requiert qu'une concentration faible en oxygène (de 2 à 10 %) pour sa croissance ; ce terme est également utilisé pour indiquer que les bactéries concernées ont une activité métabolique en conditions aérobies mais crois-sent mieux dans des conditions anaérobies non strictes ([02]>5 ~M et < 70 ~.M) (Biology of Microorganisms, 9'h Édition, 2000, MT Madigan, JM Martinko et J
Parker, Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey, pages 158-162). Pour ce qui

5 concerne les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses, l'anaérobiose (ou microaérophilie ou micro-anaérobiose ou micro-aérobiose), peut être obtenue soit en présence de lumière (lumiëre naturelle ou lumière artificielle, telle que lampe à incan-descence ayant un spectre d'émission compris entre 350 et 1100 nm) et une énergie comprise dans une gamme de 1 à 2000 moles de photonslm2/s et dans un milieu ayant subi un cycle de dégazage pour obtenir une concentration résiduelle en oxygène comprise entre 5 ~M et 70 ~M, soit en l'absence de lumière, mais en présence d'un accepteur d'électrons couramment utilisé pour les bactéries photosynthétiques, tel que le triméthylamine-N-oxyde (TMAO), les nitrates et le diméthyl sulfoxyde (DMSO).
En général, dans les bassins de décantation utilisés, les bactéries pourpres non-sulfureuses mises en oeuvre sont de préférence au fond dudit bassin (pourcentage en OZ de l'ordre de 2 à 10 %}.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, ladite souche de bactérie rësistante au TBP mise en oeuvre à l'étape (1) du procédé est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué par Rp. palustris et Rs.
rubrum, qui présentent une aptitude à dégrader le TBP, supérieure à 400 mg/1 et de préférence supérieure à 426 mg/l. En ce qui concerne Rp. palustris, sont également comprises dans l'invention, les souches dépourvues de plasmide endogène ; de telles souches sont dénommées ci-après souches ~pRpal. .
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'étape (1) comprend la mise en oeuvre d'un mélange de souches de bacté
ries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP comprenant au moins une souche sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum) et Rhodopseudomonas palustr°is (Rp. palustris) et au moins une autre souche sélection née dans le groupe constitué par Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) et Rhodo bacter sphaeroides (Rb. sphaeroides).
Conformément à l'invention, les souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP sont de préférence sélectionnées parmi les souches Rp.

6 palustYis CGA009 n°ATCC BAA-98, n°ATCC 17002, n°ATCC
17007, n°DSM 8283, n°DSM 126, n°DSM 7375, n°DSM 131, n°DSM 25, n°DSM 124 et n°DSM 130, la souche Rs. rubrurn S 1 n°ATCC 11170, la souche Rb. capsulatus Saint-Louis n°ATCC 23782 et la souche Rb. sphaef°oides 2.4.1. n°ATCC
17023.
De manière surprenante, les Inventeurs ont sélectionné des souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP, qui permettent d'obtenir des rendements de dégradation élevés, quelle que soit la concentration initiale en TBP et ce dans un procédé d'épuration en une seule étape ; le procédé selon l'invention est efficace et reproductible pour épurer et dépolluer l'environnement, et en particulier dégrader le TBP dans des déchets liquides et ce en raison de l'utilisation, de préfé-rence en micro-anaérobiose, d'une ou plusieurs souches pures de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP, qui seules au en mélange, permettent d'obtenir une dégradation du TBP au moins égal à 53 mg/1 et de préférence supérieur à
400 mg/I
d'effluents liquides.
Par o déchets liquides », on entend désigner les effluents et/ou les sites aquatiques pollués. Ces déchets liquides contiennent du TBP à dégrader mais peuvent aussi contenir d'autres composés organiques et inorganiques. Ils proviennent de l'industrie et notamment de l'industrie nucléaire.
On entend, au sens de la présente invention par souche de bactérie pourpre non-sulfureuse résistante au TBP, une souche dont la croissance n'est pas inhibée en présence de concentrations de TBP au moins dans la fourchette de concen-trations en TBP de 12-37 pM (Nakamura, précité) et bien entendu également à
des concentrations supérieures en TBP.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit pro-cédé, l'étape (1) est effectuée à une température comprise entre 10°C
et 37°C, de préférence à 30°C, à un pH compris entre 5,5 et 8,5, de préférence à
6,9 et pendant au moins 15 jours, de préférence entre 15 et 21 jours.
Conformément à l'invention, l'étape (1) est de préférence réalisée dans un bassin de dëcantation.
La période d'incubation ou de mise en contact doit être suffisante pour que la souche de bactérie ou le mélange de souches de bactéries puisse croitre de façon exponentielle, pour permettre la dégradation du TBP avec un rendement élevé.

7 Cette période d'incubation est de préférence entre plusieurs jours et plusieurs semai-nes, en fonction de la température d'incubation utilisée ; par exemple, une période d'incubation de 2I jours à une température de 30°C, permet d'obtenir un rendement supérieur à 400 mgll.
Selon un autre mode de mise en eeuvre avantageux dudit procédé, le taux de TBP dans lesdits déchets liquides avant traitement est compris entre 0,01 mM
et 1 M ; cette gamme de valeurs est suffisamment large pour correspondre aux condi-tions habituellement rencontrées dans les cas de pollution ; en effet, les relevés effec-tués dans des conditions de pollution donnent des valeurs de rejet en TBP de l'ordre de 100 mgll soit 0,375 mM. En conséquence, il n'est généralement pas nécessaire de diluer ou de concentrer l'échantillon à traiter avant sa mise en contact avec l'inoculum de bactéries. En outre, dans cette gamme de valeurs, le rendement de dégradation est particulièrement élevé. En effet, le procédé selon l'invention permet la dégradation de concentrations en TBP de l'ordre de 0,1 à 2 mM ; aucune inhibition de la croissance des bactéries n'ayant été observée à ces concentrations. En particulier, lorsque la concentration initiale en TBP est supérieure à I mM, on obtient une dégradation complète du TBP, dans les conditions de l'invention. Plus précisément, en utilisant le procédé selon la présente invention, il est possible d'obtenir après 3 semaines d'incubation des rendements de dégradation du TBP compris entre I et 1000 mg par litre de milieu ; la valeur la plus élevée correspondant à la solubilité
théorique maxi-male du TBP dans l'eau à 25°C.
Pour pouvoir obtenir un procédé efficace et reproductible avec des rendements de dégradation de TBP élevés selon l'invention, il convient d'inoculer une souche pure ou un mélange de bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfuréuses résistantes au TBP. Selon l'invention, il est préférable d'utiliser une souche pure de bactéries photosynthétiques, dans un but d'optimisation des conditions de traitement et ainsi du rendement de dégradation du TBP.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, les quantités de bactéries inoculées dans le milieu à traiter à l'étape (1), sont avanta-geusement comprises entre 104 et 10I° bactéries par ml de milieu à
traiter. Toutefois, elles dépendent des conditions générales mises en ouvre (température, luminosité...).
En conséquence, de manière générale, on entend par « quantité suffisante » de bacté-ô
ries à inoculer, la concentration d'ensemencement, c'est-à-dire le nombre initial de bactéries permettant, par croissance exponentielle, et dans des conditions adéquates, d'aboutir à une biomasse suffisante pour observer une dégradation du TBP.
Les souches de bactéries photosynthétiques résistantes au TBP, telles que mises en ceuvre dans la présente invention présentent comme avantage de fournir de bons rendements de biodégradation du TBP même après avoir été
soumises à un traitement ultérieur (nombre important de sous-cultures, par exemple).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, lorsque la source de carbone endogène n'est pas suffisante, on ajoute à
l'étape (1), une source de carbone supplémentaire, dans le milieu à traiter ;
cette source de carbone supplémentaire est avantageusement une solution tamponnée contenant un extrait de levure à une concentration comprise entre 0,1 et 10 g/1 (de pré-férence à 1 g/1), ou l'un des sels organiques suivants : succinate, glutamate, benzoate, malate ou fumarate à une concentration comprise entre 2 et 20 mM (de préférence à
10 mM), et des facteurs de croissance dont au minimum la biotine et l'acide para amino benzoïque à une concentration comprise entre 2 et 40 p,g/1 chacun.
Prëalablement à ladite mise en contact selon l'étape (1), les bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP sont sélectionnées par culture sur milieu contenant au moins 12 ~,M et de préférence au moins 1 mM de TBP, puis sont culti-vées selon des méthodes connues de l'homme du métier comme par exemple celles décrites dans Ber~gey's manual of systematic bactey~iology ; Williams &
Wilkins Édition ou dans o The photosyjzthetic bactenia u R.K. Claytoh et W. R.
Sistj°ozn ;
Plenum Pz-ess.
Dans le cadre de l'invention, le procédé est avantageusement mis en oeuvre en lagunage non aéré.
On entend par « lagunage non-aéré », un dispositif comprenant au minimum un bassin de décantation d'une profondeur allant de 0,5 à 1 mètre pour une surface en accord avec le débit des effluents, sachant que le temps de rétention doit être au minimum de 15-21 jours dans des conditions de température et d'éclairement optimales. La séparation ultérieure des bactéries et du milieu traité est favorisée par les conditions mises en oeuvre (micro-anaérobiose, bassin de décantation).

Lorsque la croissance bactérienne a atteint une valeur importante, et avant de relarguer les effluents purifiés dans l'environnement, il peut être utile de récupérer les bactéries .par filtration (en utilisant un filtre à diatomées par exemple) ou par centrifugation en continu avant de les réinjecter dans le système.
La présente invention a également pour objet un procédé de suivi ou de surveillance de la dégradation du TBP dans des déchets liquides, lequel procédé
comprend - la mise en oeuvre du procédé de traitement de dëchets liquides chargés en TBP, tel que défini ci-dessus, puis - le prélèvement d'un échantillon de milieu traité au moins au temps t+15 jours et la mesure dans ledit échantillon prélevé de la concentration de'TBP rési-duel ; cette mesure peut être réalisée manuellement ou automatisée lorsqu'il existe un grand nombre d'échantillons à analyser. L'étape de mesure du TBP résiduel (n'ayant pas été dégradé par les bactéries) peut s'effectuer par toute technique connue en chimie analytique couramment utilisée, et plus particuliërement dans le domaine des composés organophosphorés. Pour une mesure fiable et précise, on utilise générale-ment une technique chromatographique, et plus précisément la chromatographie liquide à haute performance couplée à un réfractomètre. Tout le procédé peut être automatisé.
La présente invention a également pour objet un coffret pour la mise en oeuvre du procédé de traitement selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP, choisie dans le groupe constitué par Rp. palustris, Rs. s°ubt-um, Rb, capsulatus ou Rb. sphaeroides ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, comme défini ci-dessus. Le mélange de souches comprend, de préférence, au moins la souche Rp. palustris ou la souche Rs. r~ubrum, comme précisé
ci-dessus. En ce qui concerne Rp. palustris, sont également comprises dans le cadre de l'invention, les souches dépourvues de plasmide endogène ; de telles souches sont dénommées ci-après souches ~pRpal.
La présente invention a également pour objet des souches de bacté-ries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses, caractérisées en ce qu'elles sont résistantes au TBP, en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué
par Rp.

palustris, Rs. rubrum, Rb. capsulatus ou Rb. sphaeroides et en ce que leur ADN
inclut au moins une copie supplémentaire du gène codant pour un cytochrome P450 homo-logue.
De telles souches, comprenant au moins une copie supplémentaire 5 d'un gène homologue codant pour un cytochrome P450 permettent une surexpression dudit cytochrome P450.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites souches, elles sont constituées par une souche de Rp. palustris CGA009 comprenant un gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. palustris, sous le contrôle du promoteur LHa/3e, décrit 10 dans Tadros M.H. et al. (10) (souche Rp. palustris LH5939). Le gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. palustris est notamment décrit dans la base de données d'Oak Ridge National Labof°atory (ORNL) sous le n° de gène 5939 (site http://,genome.ornl.~ov) ou sous le n° d'accès Genbank n°NZ
AAAF01000001.1.
La présente invention a également pour objet un dispositif d'épuration des déchets liquides chargés en TBP en mettant en oeuvre le procédé de dégradation tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un bassin de décantation adapté à la mise en contact des bactéries pourpres non-sulfu-reuses avec le milieu à traiter, de préférence en micro-anaérobiose. Un tel dispositif met notamment en oeuvre la technique de lagunage non-aérë, qui consiste à
faire pas-ser les effluents pollués, chargés en TBP dans une série de bassins à l'air libre dont le premier, appelé bassin de décantation, est spécifiquement ensemencé dans le cadre de l'invention par des bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP. Dans ce cas, la micro-anaérobiose se déroule au fond du bassin de tête oû se dépose les boues. Ledit bassin de décantation est, de préférence, d'une profondeur allant de 0,5 à 1 mètre pour une surface en accord avec le débit des effluents, sachant que le temps de rétention doit être au minimum de 15-21 jours dans les conditions de température et d'éclairement optimales telles que dëfinies ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit dispositif, il comprend outre ledit bassin de décantation, des moyens d'introduction desdits déchets liquides contenant du TBP dans ledit bassin de décantation, des moyens d'introduction de l'inoculum de bactéries, des moyens d'évacuation des effluents épurés en TBP vers l' extérieur ainsi que des moyens de récupération des bactéries à recycler.

Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit dispositif, ledit moyen de récupération des bactéries est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les filtres à diatomées et les centrifugeuses en continu.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d' autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfere à des exemples de mise en oeuvre de l'invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 représente la consommation de TBP (exprimëe en pourcentage) en aérobiose (barres hachurées) et en anaérobiose (barres avec pointillés) pour chacune des souches de bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuse testées (Rb. capsulatus Saint-Louis (ATCC 23782), Rb. sphaeroides 2.4.1 (ATCC
17023), Rs. rub~ufn S.l. (ATCC I 1170), et Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98)).
Le milieu de culture de Hutner non inoculé est utilisé comme témoin ;
_ la figure 2 représente la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) dans des conditions aérobies (A), photosynthétiques (micro-anaérobies) (B) et anaérobies (C) dans le milieu de culture de Hutner, en présence (ligne continue, (~)) et en l'absence (ligne discontinue, (~)) de TBP
2 mM
au cours de la croissance bactéxienne. A la figure 2A, l'échelle des ordonnées de gauche correspond à la densité optique de la culture mesurée à 660 nm.
L'échelle des ordonnées de droite correspond à la concentration en TBP (ligne continue, (~)). En aërobiose, la courbe de dégradation peut être transcrite par la fonction a.
et~°z~'nz + b avec a =28, b=0,55 et tl~z=l,l jour. En micro-anaérobiose, la courbe peut être transcrite par la fonction al.e'~°z~'I + a2. e'~°z~r2avec al=23, a2=77, et t1=13,5 jours. Les échelles de la figure 2B sont identiques à celles de la figure 2A.
- les figures 3A et 3B représentent respectivement la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) dans des conditions photosyn-thétiques (micro-anaérobiose) dans le milieu de culture de Hutner en présence de dif férentes concentrations de TBP, et une étude cinétique de la consommation de TBP
pour la souche Rp. palustr~is CGA009 (ATCC BAA-98) dans les mémes conditions.
Les échelles de la figure 3A sont identiques à celles de la figure 2. Celle de la figure 3B correspond à la concentration initiale en TBP exprimée en mM. Les concentrations en TBP sont 0 mM (astérisques), 0,1 mM (croix), 0,5 mM (triangles), 1 mM
(cercles), 1,5 mM (losanges), et 2 mM (carrés) ;
- la figure 4A représente la croissance de Serratia odorifera sp.
dans du milieu Tsb en aérobiose, en présence (cercles) et en l'absence de monoxyde de carbone dans le milieu de culture (carrés) ; la figure 4B représente la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98) exprimée en unités de densité
opti-que à 660 nm dans des conditions photosynthétiques dans le milieu de culture de Humer en présence (cercles) et en l'absence de monoxyde de carbone dans le milieu de culture (carrés). Toutes les bactéries sont incubées en présence (symboles remplis) et en l'absence (symboles vides) de TBP 2 mM ;
- la figure 5 représente la consommation de TBP exprimée en pourcentage de TBP résiduel par les souches Serratia odorifera sp. et Rp.
palustris CGA009 (ATCC BAA-98) après 24 heures et 3 semaines respectivement, en l'absence (barres en pointillés) et en présence (barres hachurées) de monoxyde de carbone dans le milieu de culture ;
- la figure 6 représente le plasmide pCB07 comprenant le gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. palustris n°5939 et le promoteur LHa[3e.
- la figure 7 représente la consommation en TBP (en mM) par des extraits cellulaires de souches de Rp. palustris, sur une durée de 20 heures à
40°C, la concentration initiale en TBP étant de 2 mM. Les échantillons étudiés sont des protéi-nes totales de : (1) : souche CGA009 non induite par du TBP en présence d'02 ;
(2) souche CGA009 non induite par du TBP en l'absence d'O2 ; (3) souche de CGA009 induite par du TBP en présence d' 02 et (4) : souche OpRpal. Les contrôles sont les suivants : (5) : tampon de réaction sans protéine ; (6) extrait brut bouilli de Rp.
palustris CGA009 et (7) : extrait brut d'E. coli DHSa. Les valeurs sont des moyennes ~ les déviations standard, à partir de trois expériences indépendantes.
- La figure 8 représente (A) : la cinétique de consommation de TBP, par des extraits cellulaires à 40°C en présence de différentes concentrations ini-tiales en TBP (en mM) ; les concentrations en TBP sont les suivantes : 0,05 mM
(-), 0,1 mM (*), 0,25 mM (+), 0,5 mM (x), 0,75 mM (~), 1 mM (~), 1,5 mM (~) et 2 mM
(~). Les valeurs sont des moyennes ~ les déviations standard, à partir de irois expé-riences indépendantes. (B) : la vitesse de dégradation initiale vs la concentration ini-tiale en TBP dans un extrait cellulaire brut (données obtenues en A). La ligne repré-sente la meilleure correspondance de l'équation de Michaelis-Menten. Un diagramme de Lineweaver-Burk est illustré dans l'incrustation.
- La figure 9 représente la dégradation en TBP par des extraits cellulaires dialysés ou non, sur une durée de 20 heures à 40°C, la concentration ini-tiale en TBP étant de 2 mM. Les cofacteurs sont ajoutés à une concentration finale de ~,M. Les valeurs sont des moyennes ~ les déviations standard, à partir de trois ex-périences indépendantes.
- La figure 10 illustre la quantité de TBP dégradé (à partir d'une 10 concentration initiale de 2 mM) sur une durée de 20 heures à 40°C, par différentes fractions d'extraits cellulaires : (1) : extrait brut ; (2) fraction soluble ;
(3) fraction protéinique faiblement associée à la membrane et (4) fraction protéinique liée à la membrane. Les valeurs sont fonction du poids de protéine présent dans chaque cas et sont des moyennes ~ les déviations standard, à partir de cinq expériences indépen-dames.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Comparaison du rendement de dégradation du TBP en aérobiose et en anaérobiose (micro-anaérobiose ou microaérophilie) par diverses bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses.
A. Matériel et méthodes Au cours de cette expérience, on mesure la concentration du TBP ré-siduel en aérobiose et en micro-anaérobiose après 3 semaines de culture par les bacté-ries photosynthétiques suivantes : Rb. capsulatus Saint-Louis (ATCC 23782), Rb.
sphaeroides 2.4.1 (ATCC 17023), Rs. rubr~um 5.1. (ATCC 11170) et Rp. palustris CGA009 (ATCC BAA-98).
Les bactéries photosynthétiques sont incubées dans un milieu de Humer [6] dans lequel le pH est compris entre 6,5 et 7,5, en présence de 2 mM
de TBP, soit en aérobiose, soit en micro-anaérobiose. En aérobiose, les bactéries sont incubées dans l'obscurité à une température de 30°C ; le milieu de culture étant sou-mis à une agitation (150 rpm).

En micro-anaérobiose, les bactéries sont incubées à la lumiëre (lampe à incandescence ayant un spectre d'émission compris entre 400 et 900 nm) à
30°C. La micro-anaérobiose est obtenue par dégazage du milieu avant l'inoculation par mise sous dépression du flacon à l'aide d'une pompe â vide, pour atteindre une S tension basse en oxygène de l'ordre de 70 ~.M.
Les milieux sont stérilisés par autoclavage à 120°C pendant 15 minutes. Le TBP est ajouté, après stérilisation, à une concentration finale de 2 mM, qui se situe au dessous du point de saturation du produit de solubilitë du TBP
dans l'eau qui est inférieur à 1g/1 (3,7 mM) â 25°C.
La croissance est suivie au spectrophotomètre à une densité optique (DO) de 660 nm et les échantillons sont prélevés régulièrement et stockés à -20°C
pour les mesures ultérieures du TBP résiduel.
On centrifuge la culture à 5000 g pendant 10 minutes pour séparer les bactéries du milieu de culture. On récupère alors le surnageant sur lequel on détermine la concentration du TBP résiduel. On ajoute au surnageant aqueux un volume égal de dichloroéthane et de phosphate de tripropyle (TPP). Le solvant permet d'extraire le TBP et les autres composés organiques hydrophobes, et le TPP est utilisé
en tant que standard interne pour quantifier l'efficacité d'extraction et pour calibrer les résultats lors des analyses ultérieures par chromatographie liquide à haute perfor-mance (CLHP ou HPLC pour High Pef fo~mance Liquid Chf~orrcatography). On mélange les échantillons par vortexage pendant 1 minute puis on laisse reposer pen-dant 30 minutes. Afin d'éliminer toute trace aqueuse, on filtre alors la phase organique (phase inférieure) sur un séparateur de phase (IPS, Whatman) suivie d'une évapora-tion pendant une nuit à 30°C, ou alternativement, on procède au passage d'un courant léger d'azote à température ambiante pendant 15 minutes. Les ëchantillons sont dilués dans du dodécane pour une analyse ultérieure par CLHP.
On procède alors à des mesures par analyses CLHP en utilisant une colonne Brownlee Spheri-5 aminée (Perkin Elmer) intégrée à une CLHP de modèle Waters 1525. On élue en utilisant un mélange d'heptane et d'acétate d'éthyle (75/25, vol/vol) avec un débit de 1 ml/min tel que décrit dans le brevet européen 0 578 579.
On mesure le TBP en utilisant un réfractomètre de type Waters 2414 et on analyse les profils de chromatographie en utilisant le logiciel Breeze (commercialisé par la société

Waters). On définit la concentration en TBP par le rapport entre les aires de pics des composés TBP et TPP.
Les composés TBP et TPP, dont la pureté est estimée supérieure à
99 %, ainsi que tous les produits chimiques précédemment cités qui sont utilisés pour 5 extraire le TBP et lors de l'analyse CLHP sont fournis par Sigma-Aldrich, B. Résultats Les résultats sont présentés dans la figure 1.
En aérobiose, les rendements de dégradation du TBP atteignent 13 à
22 % après 21 jours d'incubation. Ces valeurs sont similaires à celles obtenues avec 10 des isolats naturels tels que Ia souche Serratia odorifera sp..
Dans des conditions photosynthétiques (micro-anaérobiose), le rendement de dégradation est nettement amélioré chez certaines souches, atteignant presque 80 % pour Rp. palust~is et Rs. rubrurn après 3 semaines de culture. Ce rende ment est reproductible, quel que soit le traitement ultérieur auquel sont soumises 15 lesdites souches.
Exemple 2 : Croissance de la souche Rp. palustris CGA009 et cinétique de dégra-dation du TBP par la même souche soit en aérobiose, soit en micro-anaérobiose, soit en anaérobiose.
En raison des résultats obtenus à l'exemple 1, la souche Rp. palustris a plus particulièrement été étudiée.
A. Matériel et méthodes Souches et milieux Les souches et les milieux utilisés sont présentés dans le Tableau I
ci-après.

Tableau I : Descriptif des différents plasmides et souches utilisés Souche Caractristiquesa Source ou ou plasmide rfrence Souches E.
coli DHSa, phe F' ~80dlacZ~Ml S ~(lacZYA-argF)U169 recAl (8) e~dAl hsdRl7 (rK mK+) sup E44 7~- gyrA thi-1 relAl phe::Tnl OdCm HB101 F- 0(gpt proA)62 leuB6 supE44 ara-14 glal~2(7) IacYI ~(mcrC-mrr) rpsL20 (St') xyl-5 rntl-1 recAl3 Souches Rp.

palustris Souche CGA009, gnome totalement squenc soir Site prcit S2 LH5939 5939 S2 avec plasmide pCB07 Invention OpRpal Drive de la souche CGA009 ; ne comprend Invention pas de plas-mide endogne Plasmides pGEM-T~ Vecteur de clonage, Apr Promega pBBRIMCS2 Vecteur de clonage, Km' (9) pCB04 pGEM-T~ avec un fragment de 374 pb du promoteurInvention LHo~(3e, Apr pCB06 fragment HindIII +SacI du gne 5939 amplifiInvention par PCR et clon dans pBBRIMCS2 pCB07 fragment KpnI + HindIII de pCB04 clon dansInvention pCB06, Km' pMG105 Vecteur de clonage, I~mmr (11) pRpal Endogne, partir de Rp. palustris CGA009 (12) " Ap, ampicilline ; I~m, kanamycine.
Rp. palustt°is a été cultivé dans le milieu de Hutner (6) ou dans un milieu PM: 12,5 mM Na2HP04 ; 12,5 mM KH2P04 ; 7,5 mM (NH4) X504; 0,1 mM
Na2S203, SH20 14,5 mM d'acide p-aminobenzoïque ; 0,85 ~M EDTA ; 3,8 nM
ZnSO4; 7H20; 2,5 nM FeS04 ;7H20, 0,9 nM MnS04 ; 7H20, 0,16 ~M CuS04 ;
7H20, 86 nM Co(N03) Z ; 6 H20, 46 nM Na2BøO~, 10 H20 ; 0,1 mM d'acide nitrilo-triacétique ; 0.24 mM MgS04 anhydre; 45 ~M CaCl2 ; 15 nM (NH4)6Mo~024 ; 4 H20.
Les milieux ont été stérilisés par autoclavage à 120°C pendant 15 minutes. Une source de carbone (acide succinique stérile) et de Na2CO3 (unïquement dans les conditions de photosynthèse) ont chacun été ajoutés au milieu PM à
une concentration finale de 10 mM.
Pour cultiver ces bactéries sur des boîtes de milieu PM, une solution d'agar-agar 2X (34 g.1-1) a été mélangée, après autoclavage, avec du milieu PM
2X.

Pour les conditions de croissance photosynthétique, les boîtes ont été
incubées à 30°C, dans un GENbag Anaer (BIOMERIEUX, France) sous exposition lumineuse.
Lorsque du TBP était requis, il a été ajouté directement au milieu de culture, après stérilisation, à une concentration finale de 2 mM (la solubilité du TBP
dans l'eau est d'environ 2,5 mM). Les conditions de culture étaient soit celles de l'aérobiose (30°C, obscurité, sous agitation à 300 rpm), soit des conditions photosyn-thétiques (30°C, lumière, 75 ,moles de photons.m Z.s-1). Deux types de conditions photosynthétiques ont été utilisés conformément à la concentration en OZ
(1) La micro-anaérobiose a été obtenue par simple dégazage du milieu. La concentration résiduelle en 02 était d'environ 70 ~,M telle que mesurée par une électrode de Clark.
(2) L'anaérobiose a été obtenue en soumettant le milieu à 5 cycles de dégazage suivis d'une étape de barbotage à l'argon suffisante pour obtenir une concentration en oxygêne inférieure à 5 qM.
La croissance a été suivie par densité optique à 660 nm (D06so).
Pour les valeurs de DO6so > 0,8, les échantillons ont été dilués pour permettre une mesure précise. Des échantillons ont été prélevés périodiquement et stockés à -20°C
pour d'autres tests TBP.
P~épaf~atioh des échantillons poux le dosage de TBP
Les cultures ont été centrifugées pour éliminer les bactéries (10 minutes à 5 000 g) et le surnageant a été utilisé pour déterminer la concentration en TBP résiduel. Pour les extraits cellulaires, les dosages du TBP ont été
effectués direc-terrent sur le mélange protëique. Le triphosphylphosphate (TPP) a été utilisé
en tant que standard interne pour quantifier l'efficacité d'extraction et pour calibrer les résul-tats pour l'analyse de chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) subséquente. Le TBP a été extrait à partir des systèmes aqueux par l'addition d'un volume équivalent de dichloroéthane + TPP 2 mM aux surnageants aqueux. Les échantillons ont été mélangés vigoureusement au vortex pendant une minute.
Après 30 minutes sans agitation, la phase organique (phase inférieure) a été filtrée sur un sépa-rateur de phase (1PS, Whatman), pour éliminer toute trace de la phase aqueuse, et éva-porée une nuit à 30°C. Les échantillons secs ont alors été dilués dans du dodécane pour l'analyse HPLC.
Analyse HPLC
Les analyses HPLC ont été effectuées en utilisant une colonne Spheri-5 amino (Perkin Elmer) connectée à une HPLC de modèle Waters 1525, comme précisé à l'exemple 1. Pour l'élution, un mélange d'heptane et d'acétate d'éthyle (75/25, v/v) a été utilisé à un débit de 1 ml.miri' tel que décrit dans le Brevet européen 0 578 579. Le TBP et le TPP ont été détectés par réfractométrie (Waters Refractometer 2414) et les profils de chromatographie de réfraction ont été
analysés en utilisant le Software Waters Breeze. La concentration en TBP a été estimée à partir du rapport entre les aires des pics de TBP et de TPP. Dans ces conditions, le seuil de détection de TBP était d'environ 5 pM (voir également exemple 1).
Dosa e~ e~zymatigues Les extraits bruts et les protéines fractionnées ont été utilisés pour les études de dégradation du TBP. En tant que contrôle, du tampon stérile contenant 2 mM de TBP, des extraits bruts bouillis (10 minutes à 95°C) et des extraits bruts d'E.
coli DHSa ont été testés pour estimer la disparition abiotique du TBP. Les extraits bruts ont été dialysés avec le système Ultrafree Biomax 10 000 D (Millipore) de manière à abaisser la concentration en molécules de faible taille. FADHZ and ont été obtenus par réduction d'une solution de FMN et de FAD avec un faible excès de dithionite de sodium. Tous les cofacteurs utilisés ont été ajoutés aux extraits cellu-laires à une concentration finale de 10 ~.M.
Les dosages ont été effectués en testant la dégradation du TBP par les protéines dans 1 ml de Tris-HCl 400 mM pH 6,5 à 40°C. Les optimums de tempé-rature et de pH ont été déterminés. Le TBP résiduel a été dosé par HPLC.
B. Résultats Les résultats sont présentés dans la figure 2.
On mesure la croissance de la souche Rp. palustr~is en présence de TBP (2 mM) ou en l'absence de TBP. Aussi bien en aérobiose (figure 2A) qu'en micro-anaérobiose (figure 2B), la croissance de la souche commence après un délai, celui-ci étant plus court en aérobiose, puis la cinëtique de croissance s'accélère pour atteindre celle du témoin (absence de TBP). En aérobiose, la cinétique de dégradation est monophasique ; elle peut se traduire par une courbe exponentielle avec un tli2 de 1,l jours (28 % d'amplitude). Le taux de consommation initiale de TBP est de 13 ~mol/llh (Figure 2A).
En micro-anaérobiose, la cinétique de croissance est biphasique, elle peut se traduire par une série de deux courbes exponentielles avec un t»2 de 0,94 jour (23 % d'amplitude) et un tli2 de 13,5 jours (77 % d'amplitude). Le taux de consom-mation initial du TBP est de 15 ~,mol/1/h (Figure 2B).
Ces résultats démontrent l'existence de deux mécanismes différents un mécanisme rapide fonctionnant en aérobiose et en micro-anaérobiose, et un autre plus lent qui fonctionne seulement en micro-anaérobiose. Il est à noter que dans les deux conditions de culture, les phases rapides correspondent presque à la même courbe exponentielle suggérant la survenue de deux mécanismes similaires indépen-dant des conditions de culture, alors que la phase lente semble être liée à la micro-anaérobiose. Il est remarquable qu'en micro-anaérobiose, la phase rapide de dégrada-fion du TBP apparaisse de façon concomitante pendant le délai de croissance men-tionnée précédemment, alors que l' accélération nette de la croissance de la souche est accompagnée par un ralentissement de la cinétique de dégradation du TBP.
Par ailleurs, dans des conditions d'anaérobiose stricte, on n'observe aucune croissance en présence de TBP 2mM, tandis qu'en l'absence de TBP, on observe une croissance du méme type que celle observée dans les conditions de micro-anaérobiose (figure 2C).
Exemple 3 : Effet de différentes concentrations de TBP sur la croissance de la souche Rp. palustris CGA009 et la cinétique de dégradation du TBP par la même souche en micro-anaérobiose.
A. Matériel et méthodes Les conditions de culture et d'analyse du TBP sont identiques à
celles utilisées dans l'exemple 2.
B. Résultats Les résultats sont illustrés par la figure 3.
La souche Rp. palustris CGA009 est mise en culture en présence de concentrations variées de TBP : 2 ; 1,5 ; l, 0,5 et 0,1 mM en micro-anaérobiose.

D'après ces résultats, on note un raccourcissement du délai de crois-sance lorsque la concentration du TBP est réduite. De plus, à une concentration infé-rieure à 1 mM, la croissance de la souche est similaire à celle observée dans le milieu dépourvu de TBP (Figure 3A). Les rendements de dégradation en TBP s'améliorent 5 lorsque la concentration en TBP est inférieure à 1 mM ; le TBP est alors presque entièrement dégradé en 21 jours (Figure 3B).
On n'observe aucune inhibition de la dégradation du TBP par un métabolite secondaire avec la souche Rp. palustres CGA009, en conditions de micro-anaérobiose.
10 Exemple 4 : Rôle du cytochrome P450 par l'étude de Yeffet d'un inhibiteur du cytochrome P450, le monoxyde de carbone (CO} sur la croissance de la souche Rp. palustres en présence ou en l'absence de TBP.
Afin de démontrer qu'un ou plusieurs cytochromes) participent activement à la dégradation du TBP par la souche Rp. palustres CGA009, on incube 15 cette souche de bactéries en présence de monoxyde de carbone (CO), qui est un inhi-biteur du cytochrome P450, en présence (2 mM) ou en l'absence de TBP. Il est possi-ble de procéder au traitement par le CO, préalablement à l'inoculation de la culture, de deux manières différentes: soit par bullage léger, soit par addition d'un milieu de culture déjà saturé en CO.
20 Une souche S. odorifera, qui ne peut croître qu'en condition aérobie dans un milieu Tryptic soy broth (Tsb ; Sigma-Aldrich), est utilisée à titre de comparaison ; cette souche étant capable de dégrader le TBP mais avec un rendement global plus faible.
Les conditions de culture et de mesure du TBP sont identiques à
celles utilisées dans l'exemple 2.
Les résultats sont illustrés par la figure 4.
Comme le montrent les figures 4A et 4B, respectivement, la présence du CO dans le milieu n'affecte pas la croissance de chacune des deux souches lorsque le TBP est absent du milieu, et également pour la souche S.
odorifera lorsqu'elle est mise en présence de TBP. De plus, la croissance de la souche Rp.
palustres est fortement réduite en présence de CO (Figure 4B). Ainsi, la croissance de R. palustres est réellement réduite par l'inhibition des cytochromes P450 lorsque le TBP est présent. Le dosage de la concentration du TBP résiduel après 21 jours de culture montre une diminution importante de la dégradation du TBP (Figure 5).
Ceci suggère l'existence d'une corrélation entre l'inhibition des cytochromes P450 et le rendement faible de dégradation du TBP. Cette corrélation n'existe pas avec la souche S. odorifera pour laquelle le traitement au CO ne modifie pas d'une façon significative le rendement de la dégradation en TBP.
Exemple 5 : Construction d'une souche de Rp. palustris surexprimant le cyto-chrome P450 d'une façon constitutive.
Le gène 5939 de Rp. palustris CG009 (toutes Ies informations concernant ce gène peuvent être trouvées sur le site http://~enome.ornl.gov) codant pour le cytochrome P450 a été introduit dans la même souche.
Pour ce faire, on réalise une fusion transcriptionnelle du promoteur du cluster génique du complexe de récupération de la lumiëre II (LH) a(3e et du gëne 5939 de façon à obtenir une expression constitutive du gène en question. Le promo-teur LHa(3e est amplifié par PCR à partir de 300 pb en amont du codon de départ jusqu'â 68 pb en aval de celui-ci en utilisant l'ADN génomique de Rp.
palustris CG009 comme matrice (10), avec les amorces suivantes 5'-GGGGTACCCCTGGGATGTCCGGTATGACA-3' (SEQ ID
NO:l) contenant un site de restriction Kpnl (indiqué dans la séquence en gras), et 5'-CCCAAGCTTGGGTTGTGGAGCTCTTCCGTTC-3' (SEQ ID
N0:2) contenant un site de restriction HindIII (indiqué dans la séquence en gras).
Le fragment amplifié par PCR est cloné dans Ie vecteur de clonage pGEM-TTM (Proméga) pour donner le plasmide pCB04. On amplifie ensuite le gène 5939 entier en utilisant les amorces suivantes 5'-CCCAAGCTTGGGTGAACAACAACGAGGGAGTG-3' (SEQ
ID N0:3) contenant un site de restriction HindIII (indiqué dans la séquence en gras), et 5'-CCCGAGCTCGGGCTATGGCGTGGAAATGGA-3' (SEQ ID
N0:4) contenant un site de restriction SacI (indiqué dans la sëquence en gras).
Le fragment amplifié par PCR est digéré par HindIII et SacI et liga-turé dans le plasmide pBBRIMCS2 (Kovach et al., 1994) aux mêmes sites, ce qui permet d' obtenir le plasmide pCB06.

Le plasmide pCB04 est digéré par KpnI et HindIII et cloné dans le plasmide pCB06 digëré par ces mêmes enzymes de restriction, pour obtenir le plas-mide pCB07. La carte du plasmide pCB07 est indiquée dans la figure 6.
Afin de surexprimer le cytochrome P450 dans la souche Rp. palus-tris CG009, le plasmide pCB07 contenant le gène 5939 sous contrôle du promo teur LHa(3e est transféré par conjugaison tri-parentale à partir des souches E. coli DHSa phe (Eraso, et al., 1994) et de HB101 (Boyer et al., 1969) dans la souche Rp.
palustris CG009 pour obtenir la souche Rp. palustris LH5939 surexprimant le cyto chrome~ P450 (clones positifs). Ces clones positifs sont sélectionnés dans un milieu contenant de la kanamycine à une concentration comprise entre 20 et 100 ~.g/ml.
Exemple 6 : Etude comparative de la dégradation du TBP par différents extraits cellulaires.
A. Matériels et méthodes Extraction et.fractiofafaemefzt des protéines La souche de Rp. palustris, cultivée sur du milieu de Hutner en présence ou en l'absence de 2 mM de TBP, a été récoltée à la fin de la phase expo-nentielle de croissance par centrifugation pendant 10 minutes à 8 000 g à
4°C. Les culots ont été lavés deux fois dans du tampon phosphate pH 7,2 et remis en suspension dans 20 ml du même tampon conténant un cocktail d'inhibiteurs de protéases (P8849, Sigma-Aldrich). Les cellules ont été cassées mécaniquement par trois passages à
travers une presse cellulaire à 16000 psi et le lysat bactérien a été
centrifugé pendant 20 minutes à 10 000 g pour enlever les débris cellulaires et les cellules intactes.
L'extrait brut a été divisé en 3 fractions. Une centrifugation de 90 minutes à
200 000 g à 4°C a été effectuée pour sédimenter les membranes. Le surnageant a constitué la fraction des protéines solubles. De façon à dissocier les protéines faiblement associées à la membrane, le culot a été remis en suspension dans 2 ml de tampon 2M NaBr, mM saccharose, 50 mM glycylglycine, à pH 6 et additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases, puis extrait par une agitation douce durant 30 minutes à
4°C ; le surnageant a constitué la fraction enrichie en protëines faiblement associées à
la membrane. Le culot, contenant les protéines fortement associées à la membrane, a été remis en suspension dans 2 ml de tampon 50 mM Tris-HCl pH 8, lauryl-diaminooxyde (LDAO) 0,5% (vol/lvol) et additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéases. Les protéines ont été solubilisées par une agitation douce pendant minutes à 4°C. L'extrait résultant a été centrifugé pendant 90 minutes à 200 000 g à
4°C pour culotter les matériaux insolubles. Le surnageant constitue la fraction des protéines membranaires. La concentration en protéines dans chaque extrait a été
déterminée par la méthode du biuret selon le kit BCA Pt°oteiyZ Assay Reagent (Uptima) en utilisant l'albumine sérique bovine comme standard.
B. Résultats Les tests de dégradation du TBP ont été réalisés avec des protéines extraites de Rp. palustf°is CGA009. Les conditions optimales du test sont les suivan-tes : pH 6,5 et 40°C.
Les extraits cellulaires sont obtenus dans les conditions exposées ci-dessus au chapitre Matériel et méthodes ; ils sont en particulier obtenus par extraction des protéines à partir de la souche Rp. palustr°is cultivée en conditions micro-anaéro-hies, dans du milieu de Hutner en présence (cultures induites) ou en l'absence (cultures non induites) de 2 mM de TBP.
La figure 7 montre que 70 % de TBP est dégradé par des extraits cellulaires à 40°C dans des conditions aérobies pendant 20 heures, indépendamment de la présence éventuelle de TBP dans le milieu de culture (figure 7 : (1) et (3)). Une expérience a également été réalisée dans de conditions anaérobies. Dans ce cas, on n'observe aucune dégradation (figure 7 : (2)) ; ceci implique que l'oxygène est néces-safre pour dégrader le TBP, et ce, comme pour les cellules entières.
Les essais de dëgradation du TBP ont été comparés aux résultats obtenus avec différents contrôles : tampon de réaction sans protéine, extrait brut bouilli de Rp. palustris CGA009 et extrait brut d'E coli DHSa (figure 7 : (5), (6) et (7)).
Ces résultats montrent - que la dégradation se fait par un processus enzymatique ; en effet, on n'observe aucune dëgradation dans un certain nombre de tests (voir figure 7) ainsi qu'aucune accumulation significative de TBP dans les cellules pendant une période de culture de 21 jours : il n'y a donc pas de séquestration du composé non dégradé.
- le processus de dégradation est dépendant de l'oxygène à la fois in vitro et in vivo. Cependant, il n'existe clairement aucune corrëlation stoechiométrique entre la quantité d'oxygène et la quantité de TBP dégradé. La concentration initiale en 02 optimale est d'environ 70 ~M, dans le milieu micro-anaérobie sélectionné.
- la dégradation de TBP est un mécanisme constitutif de la cellule, dans la mesure où les extraits cellulaires de bactéries mis en culture en présence ou en l'absence de TBP ont la même efficacité ; en outre, une sous-culture obtenue à
partir d'une souche préalablement mise en culture dans un milieu contenant du TBP
présente le même profil qu'une sous-culture obtenue à partir d'une culture non induite (croissance dans un milieu en l'absence de TBP) : les cinétiques de dégradation sont identiques.
Exemule 7 : Etude comparative de la cinétique de dégradation du TBP en présence de différentes concentrations en TBP et par différents extraits cellulai-res.
A. Matériel et méthodes Analyses eifzétigues Les paramètres cinétiques de la dégradation du TBP ont été calculés Vm[S] [ ] où V corres ond à la à partir de l'équation de Michaelis-Menten, V= jKm+ S p vitesse de dégradation du TBP et S à la concentration en TBP. Cette équation a été
utilisée pour ajuster les différentes données expérimentales de V= f([S]) en utilisant une méthode d'ajustement non-linéaire (SigmaPlot). Cette approche est plus précise que l'ajustement linéaire du point double inverse (Lineweaver-Burk), du fait de la taille variable des barres d'erreurs dans cette dernière. Comme l'activité
enzymatique a été dosée dans un système d'extrait brut, les paramètres cinétiques ont été
exprimés en tant que concentration apparente de TBP pour la moitié de l'activité
maximale (Kmap) et pour la vitesse maximale apparente ( IrnaQp).
B. Résultats La figure 8A montre la cinétique de dégradation du TBP par des extraits cellulaires en fonction de différentes concentrations en TBP : 2, 1,5, l, 0,75, 0,5, 0,25, 0,1 et 0,05 mM.
La figure 8B montre la meilleure correspondance de l'équation de Michaelis-Menten avec des valeurs de Vmap et de Kmap respectivement de 0,48~0,04 mM.h-1 et 2,6~0,4 mM.

L'analyse de la cinétique de dégradation réalisée à 1,'aide d'extraits cellulaires est consistante avec l'équation de Michaelis-Menten. Ceci permet d'estimer le KmaP et la Vm~p, bien que la vitesse maximale ne puisse pas être atteinte dans les conditions d'expérimentations (solubilité faible du TBP dans l'eau).
5 Un Ktrzap de 2,6 mM indique une affinité apparente modérée du sys-tème enzymatique pour le TBP. La Ymap était de 0,48 mM.h'1.
Pour des concentrations en TBP comprises entre 2 et 0,5 mM, la cinétique présente un ralentissement significatif, au bout d'un moment, ce qui est pro-bablement dû à une inhibition par le produit (courbe biphasique). Pour des concentra-10 tions en TBP inférieures à 0,5 mM, la cinétique suit une courbe monophasique (voir également exemple 2).
Exemple 8 : Influence de cofacteurs sur la dégradation du TBP par des extraits cellulaires.
Un extrait brut, obtenu dans les conditions décrites à l'exemple 6 est 1 S dialysé de manière à réduire la concentration en molécules de bas poids moléculaire.
Après la dialyse, le dégradation du TBP est diminuée d'un facteur 3, en comparaison avec le contrôle non dialysé (figure 9, (1) et (2)). Dans ces conditions, l'effet de diffé-rents cofacteurs a été testé : NADH, NADPH, FMNH2 et FADH2. Sur des extraits cellulaires non dialysés, l'addition de ces cofacteurs n'améliore pas de manière signi-20 ficative la dégradation du TBP. Par contre, la dégradation par des échantillons dialysés est augmentée par l'addition de NADPH ou de FMNH2 (figure 9, (4) et (6)). La com-binaison de ces deux cofacteurs restaure complètement l'activité de dégradation observée avec les échantillons non dialysés (figure 9, (11)).
Exemple 9 : Dégradation du TBP par des fractions de protéines 25 Pour être en mesure de localiser l'activité enzymatique impliquée dans la dégradation du TBP par Rp. palustris, un extrait brut est fractionné
en trois fractions de protéines : fraction soluble, fraction faiblement associée à la membrane et fraction liée à la membrane ; ces différentes fractions sont obtenues dans les condi tions exposées à l'exemple 6. Les tests de dégradation du TBP sont effectués dans les conditions exposées à l'exemple 2.
La figure 10 montre que l'activité de dégradation est plus particulié-rement localisée dans la fraction de protéines faiblement associées à la membrane, avec 3,5 ~M de TBP dégradé.mg de protéines', comparé aux quantités dégradées res-pectivement par la fraction de protéines totales (1,2 ~tM de TBP dégradé.mg de pro-téines I), la fraction soluble (2 ~M de TBP dégradé.mg de protéines ~) et la fraction liée à la membrane (1,65 ~M de TBP dégradë.mg de protéines I).
Les protéines impliquées dans la dégradation du TBP sont faible-ment associées à la membrane. L'activité est dépendante à la fois du NADPH et du FMNH2 et confirme le rôle du cytochrome P450 dans l'activité de dégradation du TBP.
Exemple 10 : Activité d'une souche de Rp. palustris dépourvue du plasmide en-dogène pRpal A. Matériels et méthodes Technigues moléculaires L'isolement des plasmides a été réalisé à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel) en suivant les instructions du fabricant. L'isolement de l'ADN génomique a été effectué à l'aide du kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) en suivant les instructions du fabricant.
Durant les processus de conjugaison, les plasmides ont été obtenus par croisement tri-parental à partir des souches d'E. coli DHSa phe (donneur), conte-nant le plasmide pMG105, et HB101 (helper) vers la souche Rp. palustris (accepteur).
Les cellules d'E. coli ont été cultivées dans du milieu LB + Km jusqu'à ce que la va-leur de D066o atteigne 1,5, et les cellules de Rp. palustris ont été cultivées sur le milieu de Hutner jusqu'à ce que la valeur de DOs6o atteigne 1 (cultures pendant une nuit). Les bactéries « donneur, helper et accepteur » (100 ~,I, 10 ~,I et 1 ml respective-ment) ont été lavées et regroupées sur une boîte de milieu de Hutner. Cette boite a été
incubée pendant 16 heures à 30°C. Les bactéries ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu PM, étalées sur des boîtes PM + Km et incubées 4 jours, soit dans des conditions aérobies, soit dans des conditions de micro-aérobiose.
Expériences d'élimination de plasmides Pour éliminer le plasmide pRpal, le plasmide pMG105 (11), un vecteur de clonage présentant un gène de résistance à Km, qui possède la même ori-gine de réplication que pRpal a été introduit par croisement chez R.
palustris. Les transconjugants porteur de pMG105 ont été sélectionnés sur des boîtes PM + Km.

Généralement, les bactéries Km résistantes ont perdu pRpal. Les souches porteuses de pMG105 ont été cultivées sur un milieu sans Km pour expulser ce plasmide après plusieurs sous-cultures et la souche résultante sans plasmide est conservée en tant que Rp. palustf°is dpRpal. Chaque étape de l'expérience d'élimination est contrôlée par un isolement du plasmide. Les bactéries R. palustris ~pRpal sont testées pour leur capa-cité à dégrader le TBP.
B. Résultats Une extraction de plasmide a montré que Rp. palustris comprend un plasmide endogène (pRpal, 9,8 lcb). Cette caractéristique a été confirmée par le séquençage du génome de Rp. palust~is (12).
La croissance, la forme morphologique ainsi que la pigmentation des colonies sont identique dans la souche dpRpal et dans la souche sauvage. Rp.
palustris est naturellement résistant à 1a gentamycine (50 ~.g.ml-i) et la souche sans plasmide croit en présence de cet antibiotique, comme la souche sauvage. La souche sans plas-mide croit également dans un milieu contenant du TBP, comme la souche sauvage, et présente une cinétique de dégradation du TBP similaire à celle de la souche sauvage.
Ceci indique que les enzymes impliquées dans la dégradation du TBP par Rppalustris ne sont pas codées par des gènes portés par le plasmide endogène mais plutôt par l'ADN chromosomique.
Rp. palustf~is est efficace dans le processus de dépollution et la sou-che sans plasmide également ; cette dernière peut en outre constituer un outil pour déterminer la localisation plasmidique ou chromosomique de gènes impliqués dans d'autres voies de dégradation.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Thomas R. A. et al.,. Appl Microbiol Biotechnol., 1998, 49, 202-209.
2. Thomas R. A. P. et al., Biotechnol Techn., 1997, 11, 781-785.
3. Thomas, R. A. P. et al., E%ZVi¿°0%2. Sci. a>zd Biotechuol., 1996, 30, 2371-2375.
4. Thomas R. A. P. et al., FEMS Mict~obiology Lett., 1997,155, 155-159.
5. Owen S. et al., Appl Bioclzezzz Biotechnol., 1992, 34/35, 693-707.
6. Clayton R., K., Biochim. Biophys. Acta., 1960, 37, 503-512.
7. Boyer H.W. et al., J. Mol. Biol., 1969, 41, 459-72.

8. Eraso J.M. et al., J. Bacteriol., 1994, 176, 32-43.

9 PCT/FR2004/001165 9. I~ovach M.E. et al., Biotechniques, 1994, 16, 800-2.

10. Tadros M.H. et al., Eur. J. Bioclzem., 1993, 217, 867-75.

11. Inui M et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66, 54-63

12. Larimer F. et al., Nat. Biotechnol., 2004, 22, 55-61 0263-095-SEQ.ST25 SEQUENCE LISTING
<110> COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE
GARCIA,.Daniel BERNE, Cécile <1Z0> PROCEDE DE DEGRADATION DU TBP PAR UNE SOUCHE BACTERIENNE
PHOTOSYNTHETIQUE
<130> BLOcp263/95ExT
<150> FR 03/05762 <152> 2003-05-14 <160> 4 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 29 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 1 ggggtacccc tgggatgtcc ggtatgaca 2g <210> 2 <211> 31 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 2 Page l 0263-095-SEQ.ST25 cccaagcttg ggttgtggag ctcttccgtt c 31 <210> 3 <211> 32 <212> DNA
<213> Artificiel sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 3 cccaagcttg ggtgaacaac aacgagggag tg 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA
<213> Artificiel sequence <220>
<223> Amorce PCR
<400> 4 cccgagctcg ggctatggcg tggaaatgga 30

Claims (20)

1°) Procédé de traitement ou d'épuration de déchets liquides chargés en phosphate de tributyle (TBP), caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes de:
(1) mise en contact desdits déchets liquides avec au moins une sou-che de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP
sélection-née dans le groupe constitué par Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris), Rhodospirillum rubrum (Rs. rubrum), Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) ou Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides) ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, dans des conditions permettant la dégradation du TBP présent dans lesdits déchets et ce quelle que soit la concentration initiale en TBP ; et (2) la récupération des effluents liquides purifiés.

2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (1) de mise en contact est mise oeuvre en micro-anaérobiose.

3°) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caracté-risé en ce que ladite souche de bactérie résistante au TBP mise en oeuvre à
l'étape (1) du procédé est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué par Rp.
palustris et Rs.rubrum.

4°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, carac-térisé en ce que l'étape (1) comprend la mise en oeuvre d'un mélange de souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP comprenant au moins une sou-che sélectionnée dans le groupe constitué par Rhodospirillum rubrurn (Rs.
rubrum) et Rhodopseudomonas palustris (Rp. palustris) et au moins une autre souche sélec-tionnée dans le groupe constitué par Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus) et Rhodobacter sphaeroides (Rb. sphaeroides).

5°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, carac-térisé en ce que les souches de bactéries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP
sont sélectionnées dans le groupe constitué par les souches de Rp. palustris n°ATCC BAA-98, n°ATCC 17002, n°ATCC 17007, n°DSM
8283, n°DSM 126, n°DSM 7375, n°DSM 131, n°DSM 25, n°DSM 124 et n°DSM 130, la souche Rs.

rubrurn S1 n°ATCC 11170, la souche Rb. capsulatus Saint-Louis n°ATCC 23782 et la souche Rb. sphaeroides 2.4.1. n°ATCC 17023.

6°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, carac-térisé en ce que l'étape (1) de mise en contact est effectuée à une température com-prise entre 10°C et 37°C, de préférence à 30°C, à un pH
compris entre 5,5 et 8,5, de préférence à 6,9 et pendant au moins 15 jours, de préférence entre 15 et 21 jours.

7°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le taux de TBP dans lesdits déchets liquides avant traitement est compris entre 0,01 mM et 1 M.

8°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, carac-térisé en ce que les quantités de bactéries inoculées dans le milieu à traiter à l'étape (1) sont avantageusement comprises entre 104 et 101° bactéries par ml de milieu à traiter.

9°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, carac-térisé en ce qu'au cours de l'étape (1), on ajoute une source de carbone supplémen-taire, dans le milieu â traiter.

10°) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite source de carbone supplémentaire est avantageusement une solution tamponnée contenant un extrait de levure à une concentration comprise entre 0,1 et 10 gll ou l'un des sels organiques suivants : succinate, glutamate, benzoate, malate ou fumarate à
une concentration comprise entre 2 et 20 mM (de préférence à 10 mM), et des fac-teurs de croissance dont au minimum la biotine et l'acide para amino benzoïque à une concentration comprise entre 2 et 40 µg/l chacun.

11°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ca-ractérisé en ce que préalablement à ladite mise en contact selon l'étape (1), les bacté-ries pourpres non-sulfureuses résistantes au TBP sont sélectionnées par culture sur milieu contenant au moins 22 µM et de préférence au moins 1 mM de TBP.

12°) Procédé de suivi ou de surveillance de la dégradation du TBP
dans des déchets liquides, lequel procédé comprend :
- la mise en oeuvre du procédé de traitement de déchets liquides chargés en TBP selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, puis - le prélèvement d'un échantillon de milieu traité au moins au temps t+15 jours et la mesure dans ledit échantillon prélevé de la concentration de TBP rési-duel.

13~) Coffret pour la mise en oeuvre du procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse résistante au TBP, choisie dans le groupe constitué par Rp. palustris, Rs. rubrum, Rb. capsulatus ou Rb.
sphaeroides ainsi que lesdites souches de bactéries modifiées pour surexprimer le cytochrome P450, telles que définies aux revendications 1, 3, 4 ou 5.

14~) Souches de bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses, caractérisées en ce qu'elles sont résistantes au TBP, en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par Rp. palustris, Rs. rubrum, Rb.
capsulatus et Rb. sphaeroides, et en ce que leur ADN inclut au moins une copie supplémentaire du gène codant pour un cytochrome P450 homologue.

15~) Souche de bactéries selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de Rp. palustris CGA009 n o ATCC BAA-98 comprenant un gène codant pour le cytochrome P450 de Rp. palustris, sous le contrôle du promo-teur LH.alpha..beta.e.

16~) Souche de bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse, caractérisée en ce qu'elle est résistante au TBP et en ce qu'elle est constituée par une souche de Rp. palustris dépourvue de plasmide endogène.

17~) Dispositif d'épuration des déchets liquides chargés en TBP, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un bassin de décantation adapté à la mise en contact des bactéries pourpres non-sulfureuses avec le milieu à traiter, de préfé-rence en anaérobiose ou micro-anaérobiose.

18~) Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit bassin de décantation est, de préférence, d'une profondeur allant de 0,5 à 1 mètre pour une surface en accord avec le débit des effluents, sachant que le temps de rétention doit être au minimum de 15-21 jours.

19~) Dispositif selon la revendication 17 ou la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend outre ledit bassin de décantation, des moyens d'introduction desdits déchets liquides contenant du TBP dans ledit bassin de décan-tation, des moyens d'introduction de l'inoculum de bactéries, des moyens d'évacuation des effluents épurés en TBP vers l'extérieur ainsi que des moyens de récupération des bactéries à recycler.

20~) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que ledit moyen de récupération des bactéries est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les filtres à diatomées et les centrifugeuses en continu.