FR2772785A1

FR2772785A1 - Nouvelle souche de champignon coriolus versicolor utile pour le traitement des materiels pollues

Info

Publication number: FR2772785A1
Application number: FR9716524A
Authority: FR
Inventors: Grasset Frederic Baud; Timothy Vogel
Original assignee: Rhone Poulenc Chimie SA
Current assignee: Rhodia Chimie SAS
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 1999-06-25
Anticipated expiration: 2017-12-24
Also published as: AU1883899A; FR2772785B1; WO1999033952A1

Abstract

Cette invention concerne une souche de champignon Coriolus versicolor déposée à la CNCM sous la référence I-1657, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, ainsi que son utilisation pour le traitement des matériels contaminés par des composés polluants récalcitrants.

Description

La présente invention concerne une nouvelle souche de champignon Coriolus versicolor ainsi que son utilisation pour le traitement des matériels contaminés par des composés polluants récalcitrants.

La dépollution des sites pollués, c'est-à-dire des sites sur lesquels une pollution d'origine industrielle du sol ou du sous-sol est susceptible de générer une nuisance ou un risque pérenne pour les personnes ou l'environnement, est un enjeu économique et scientifique actuel majeur.

La dépollution peut se faire par voie mécanique, par brûlage des terres, par voie chimique ou par voie biologique. La biorestauration ou bioréhabilitation peut être plus particuliérement utilisée. Cette technique met en oeuvre des microorganismes, tels que des bactéries ou des champignons; pour dégrader les composés polluants récalcitrants, c'est-à-dire des composés qui résistent à la dégradation dans l'environnement.

Parmi ces composés polluants récalcitrants, on peut citer notamment les halobenzoates tels que le chlorobenzoate et le bromobenzoate, et les composés nitrés tels que le 2,4,6-trinitrotoluéne (TNT) et autres explosifs tels que le PETN (penta-érythritol tétranitrate) et l'EGDN (éthylèneglycol dinitrate).

On peut citer également les halogénures organiques tels que notamment le DDT[1,1 -bis(4-chlorophényl)-2, 2-trichloroéthane], la 2,3,7,8- tétrachlorodibenzo-p-dioxine, le lindane (1, 5, ,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane), les composés biphényles polyhalogénés tels que notamment le 3,4,3',4'- tétrachlorobiphényle et le 2,4,5,2',4',5'-hexachlorobiphényle.

On peut enfin citer les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dont certains sont des composés mutagénes et cancérigènes.

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) constituent une part importante des goudrons résultant de la distillation de la houille. On en trouve aussi dans les goudrons de distillation du pétrole.

Les HAP sont les polluants systématiques du sol des anciennes usines à gaz et des cokeries (sidérurgie, carbochimie).

On les trouve aussi dispersés dans d'autres lieux en relation avec l'usage qui a été fait de ces goudrons : agglomération des poussières de charbon en boulets, fabrication des produits de traitement du bois appelés créosotes et usines de traitement du bois utilisant ces produits. Ils ont même pu être utilisés dans certains cas pour fabriquer des revêtements de route, ou comme produits d'étanchéité (enduits, bouchage de brèches, constitution de barrages).

Les HAP sont des produits hydrophobes qui adhèrent fortement aux solides. Ils présentent tous une très faible solubilité, mais cette solubilité est suffisante pour les déplacer et les diluer notablement dans le sol au fil du temps. Ce sont des produits très peu volatiles, à l'exception du naphtalène, mais ils émettent cependant une forte odeur désagréable caractéristique.

Le nombre de HAP que l'on peut trouver sur un site gazier est considérable. L'agence américaine pour la protection de l'environnement (EPA pour environmental protection agency) a édité une liste de 16 HAP contaminant les sols, cette liste faisant référence dans de nombreux pays. Ces 16 HAP sont considérés comme prioritaires et doivent être surveillés.

Le tableau i suivant présente la formule de ces 16 HAP.

Tableau 1 Formule des 16 HAP

<tb> HA' > <SEP> a <SEP> quatre <SEP> cycles <SEP> Fluoranthêne <SEP> Pyrène <SEP> Beiizo(a)ant1aoene <SEP> Chrysêne
<tb> <SEP> MM <SEP> MM
<tb> l-IAP <SEP> a <SEP> cinq <SEP> cyclcs <SEP> Ieiizo(b)fluoranthêua <SEP> I3cnzo(k)flttoranthên <SEP> [3ciii'.o(a <SEP> )pyrêiic <SEP> dibciz(,h)ntliracênc
<tb> <SEP> MMM
<tb> I <SEP> lAI > <SEP> a <SEP> si. <SEP> cycîcs <SEP> l3enzo(g,h,i)peên <SEP> lndciiol( <SEP> I <SEP> ,2,3 < d)pyrêl0c
<tb> <SEP> À
<tb>
Plusieurs champignons formant la pourriture blanche sur le bois sont connus pour leur action dégradatrice envers certains composés polluants récalcitrants.

Ces champignons de la pourriture, lorsqu'ils sont cultivés en conditions limitantes en nutriments (carence en azote par exemple) sont capables de dégrader la lignine ainsi que de nombreux autres composés organiques, y compris en particulier des HAP, grâce à un système enzymatique non spécifique à fort pouvoir oxydant (ligninases). Certains champignons de la pourriture sont également capables, lorsqu'ils sont cultivés en conditions non limitantes, de transformer certains HAP, tels que le phénanthrène, en trans-dihydrodiols à l'aide de monooxygénases selon un mécanisme proche de celui existant dans les autres familles de champignons:
Quelques champignons sont également capables de dégrader des HAP en trans-dihydrodiols ou en phénols.

Ainsi, par exemple, la souche Phanerochaete chrysosporium est utile pour dégrader notamment le TNT (WO 94/21394) et des HAP de 2 à 5 cycles tels que l'anthracène, le pyrène, le benzo(a)pyrène (Hammel et al., 1987, Les colloques de L'INFRA n" 40, INRA Ed., pp 45-49).

Cependant, aucune donnée de l'état de la technique ne met en évidence la biodégradation de tous les HAP à cinq et six cycles ni la biodégradation des HAP à plus de six cycles.

Le besoin existait donc de trouver une souche de microorganisme capable de dégrader un large spectre de composés polluants récalcitrants, en particulier les HAP de haut poids moléculaire (à 5 cycles aromatiques ou plus).

Le Demandeur a à présent découvert une nouvelle souche de champignon qui répond à ce besoin.

La présente invention a donc pour objet une souche de champignon Coriolus versicolor, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes à l'institut Pasteur) sous la référence 1-1657, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant de deux à quatre cycles mais aussi les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1.

Par "dérivé", on entend une souche dérivée de Coriolus versicolor 1-1657 par mutation, spontanée ou induite, et capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant deux à quatre cycles, mais aussi les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1, ainsi que, en général, les HAP comprenant plus de six cycles
Ci-après, on désignera la souche Coriolus versicolor 1-1657 ainsi que ses dérivés tels que définis ci-dessus par l'expression "souche Coriolus versicolor selon l'invention" ou "souche selon l'invention"
La présente invention a également pour objet l'utilisation de ladite souche Coriolus versicolor selon l'invention pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans des matériels contaminés.

Plus particulièrement, la présente invention a pour objet l'utilisation de la souche Coriolus versicolor selon l'invention pour dégrader des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) pouvant être notamment choisis parmi les 16 HAP de la liste de l'EPA citée précédemment (tableau 1).

La souche Coriolus versicolor selon l'invention s'est avérée particulièrement utile pour dégrader les HAP à au moins 6 cycles aromatiques tels que notamment le benzo(g,h,i)perylène et l'indénol ,2,3-cd)pyréne.

La présente invention a également pour objet un procédé de traitement d'un matériel contaminé par des polluants récalcitrants, dans lequel le champignon de souche Coriolus versicolor selon l'invention est mis en contact avec le matériel contaminé dans des conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants.

Ledit matériel contaminé peut être les sols, les sédiments aquatiques, les graviers, et autres matériels solides, ainsi que l'eau.

De manière préférentielle, ledit matériel contaminé est un sol.

Les principales mises en oeuvre de techniques de biorestauration d'un sol sont:
- le traitement in situ : le sol est traité sans être excavé
- le traitement sur site: le sol est excavé et traité sur place;
- le traitement ex situ : le sol est excavé et traité hors site.

Par "conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants", on entend des conditions d'aération, de température et d'humidité, du matériel contaminé, connues de l'homme du métier.

Lorsque le matériel contaminé est un sol, L'humidité de celui-ci peut être, de manière préférentielle, comprise entre 50 et 80 % de la teneur en eau utile suivant le type de sol. La température peut être comprise entre 10 et 40"C, une croissance du champignon étant cependant toujours possible même à une température plus basse. La teneur en azote dans le sol peut être telle que le rapport carbone/azote/phosphore soit égal à environ 100/10/1.

Le matériel contaminé peut également contenir de manière avantageuse des nutriments et des oligo-éléments.

L'aération peut être assurée par une circulation d'air forcée, par une diffusion naturelle d'air, ou par brassage mécanique du sol. Lorsque le matériel contaminé est un sol, un débit d'air d'environ 0,1 à 5 m3/h/tonne de sol est avantageux par exemple. L'aération peut être rendue plus homogène dans le sol en assurant un démottage ou un criblage préliminaire du sol. L'apport d'un support organique avec un inoculum permet également d'améliorer la structure du sol, et par conséquent son aération. Plus généralement,
I'homogénéisation du sol par démottage/criblage/brassage et le mélange avec le support organique de l'inoculum permettent d'améliorer les transferts de masse (eau, température, nutriments, air, enzymes) et par conséquent l'activité biochimique responsable de la dégradation des composants polluants.

La souche selon l'invention peut être mise en contact avec le matériel contaminé soit seule, soit en présence d'un support organique. La souche selon l'invention peut être mise en contact avec un tel support organique soit au moment de l'inoculation dans le matériel contaminé, soit préalablement à cette inoculation.

Ce dernier cas est préféré et permet le prédéveloppement de la souche sur le support organique avant mise en contact avec le matériel contaminé. L'inoculum peut alors être introduit dans le matériel contaminé à un taux compris entre 1 et 50 % en poids, de préférence entre 5 et 20 % en poids par rapport au poids de matériel contaminé. La mise en contact peut être réalisée notamment sur sol excavé ou sur sol destructuré.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel contaminé par des polluants récalcitrants est traité avec un inoculum de champignons de la souche Coriolus versicolor selon l'invention, ledit inoculum étant préparé par:
- traitement d'un support organique lignifié pouvant être choisi parmi des copeaux de bois, des écorces d'arbres, ou des rafles de maïs, de manière à éliminer les contaminants microbiologiques;
- inoculation dudit support organique lignifié ainsi traité, avec ladite souche de champignon, ladite souche pouvant être notamment sous la forme a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide tel que par exemple de la gélose, ou (ii) sur des grains de céréales (préculture sur grains de céréales)
- puis incubation dans des conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support organique lignifié.

Par "conditions appropriées à la croissance des champignons sur ledit support organique lignifié", on entend des conditions d'humidité, de température et d'aération connues de l'homme du métier.

Le support organique lignifié inoculé avec la souche de champignons peut être placé de manière avantageuse dans une chambre de culture saturée en humidité, à une température comprise entre 15 et 35"C, plus particuliérement entre 20 et 30"C.

De manière préférentielle, on choisit comme support organique lignifié des rafles de maïs ou des copeaux de bois.

Les copeaux de bois peuvent être calibrés ou du type "toutvenant", c'est-à-dire non calibrés.

Des copeaux de bois d'une granulométrie supérieure à 4,5 mm sont préférés, les copeaux de plus faible granulométrie freinant généralement la croissance du champignon du fait d'une mauvaise aération due au tassement des copeaux.

Les champignons étant sensibles aux contaminations microbiologiques, il est important de minimiser les risques de contamination.

A cet effet, le support organique lignifié est traité avant inoculation par la souche de champignon de façon à éliminer les contaminants microbiologiques. Ce traitement peut s'effectuer par séchage entre 450 et 550"C, par exemple à 500"C pendant quelques secondes ou par pasteurisation pendant 1 ou 2 cycles chacun de 8 à 30 heures, de préférence 16 heures, chacun à une température comprise entre 50 et 100"C, de préférence entre environ 65 et environ 85"C, ou par stérilisation (autoclavage) entre 110 et 130"C, de préférence à environ 120"C, pendant 20 à 240 minutes, de préférence pendant 20 à 60 minutes. Le support organique lignifié peut être humidifié de préférence à saturation, avant le traitement destiné à éliminer les contaminants microbiologiques. De manière préférentielle, ledit traitement est réalisé par pasteurisation.

Le support organique lignifié peut être ensuite inoculé avec la souche Coriolus versicolor selon l'invention, qui peut se présenter:
a) sous la forme d'une solution de spores, de fragments de mycélium ou d'un mélange de spores et de fragments de mycélium, en suspension dans un milieu liquide, pouvant être préparée par exemple à partir de cultures de champignons sur un support solide, en particulier sur milieu gélifié solide, (notamment gélose) en tube, ou sur grains de céréales , la suspension peut ainsi être obtenue notamment en introduisant un volume déterminé de milieu de culture CH tel que décrit dans Kirk et al., 1978,
Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete
Chrysosporium. Anch. Microbiol. 117, 277-285, puis en agitant vigoureusement le tube de façon à libérer les spores;
b) sous la forme de mycélium prédéveloppé en milieu liquide le mycélium prédéveloppé peut être obtenu en mettant en culture dans du milieu
CH (Kirk et al., 1978) une solution de spores en suspension , dans ce cas la culture est placée sous agitation en général pendant environ une semaine à 30"C , en fin d'incubation, les pelotes de mycélium formées sont récupérées puis utilisées comme inoculum
c) ou sous la forme de mycélium prédéveloppé sur un support solide (mycélium recouvrant des fragments de support solide), notamment (i) sur un milieu gélifié solide, tel que par exemple de la gélose, qui peut être contenu dans une boîte de Pétri, ou (ii) sur des grains de céréales (préculture sur grains de céréales).

De manière préférentielle, le support organique lignifié est inoculé avec des champignons de la souche Coriolus versicolor selon l'invention précultivés sur des grains de céréales, tels que des grains de blé, de seigle ou de millet notamment.

Ledit support organique lignifié peut être inoculé avec des grains de céréales colonisés par le champignon, préférentiellement à un taux d'environ 1% à environ 20 %, de préférence encore de 2 à 10 % (poids de grains/poids du support organique lignifié).

Les grains de céréales utilisés sont alors de préférence des grains non traités qui sont stérilisés selon le protocole suivant: trempage dans l'eau puis cuisson aux environs de 100"C pendant 30 à 60 minutes, de préférence 45 minutes et finalement autoclavage de 110 à 130"C, de préférence à environ 1200C pendant 20 à 240 minutes, de préférence 100 à 200 minutes. Un agent abrasif facilitant la séparation des grains entre eux ainsi qu'une source de nutriment peuvent être ajoutés de manière avantageuse. Le plâtre, le carbonate de calcium, la craie ou le talc peuvent par exemple jouer à la fois le rôle de nutriment (source de calcium) et d'agent abrasif. Du plâtre peut ainsi être ajouté aux grains de céréales immédiatement avant autoclavage à une concentration comprise par exemple entre environ 0,5 et environ 10 % (masse/masse). Les grains sont ensuite inoculés par exemple à l'aide a) d'une solution de spores et/ou de fragments de mycélium en suspension dans un milieu liquide, b) de mycélium prédéveloppé en milieu liquide, ou c) de mycélium prédéveloppé sur un support solide, notamment (i) sur un milieu gélifié solide tel que, par exemple de la gélose, qui peut être contenu dans une boîte de Pétri ou (ii) sur des grains de céréales, puis généralement placés en bocaux stériles ou dans des sacs stériles équipés de membranes microporeuses.

Les supports inoculés peuvent ensuite être placés en sacs de culture permettant les échanges gazeux. Des fermenteurs en phase solide de capacité élevée peuvent également être utilisés à la place des sacs.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on choisit comme support organique des rafles de maïs ou des copeaux de bois, qui préalablement à l'ensachage sont mélangés intimement aux grains de céréales colonisés par le champignon à un taux d'environ 1 % à 20 %, de préférence de 2 à 10 % (poids de grains/poids de copeaux ou de rafles). Le mélange est ensuite incubé à une température optimale pour la croissance de la souche de champignon utilisée (en général 25-30 C). Cette technique permet d'obtenir une culture homogène et très bien développée. Des générations successives d'inoculum peuvent être produites en rediluant soit les grains inoculés dans un volume de grains stériles, soit l'inoculum arrivé à maturité dans un volume de supports lignifiés stériles.

A titre d'exemple, des copeaux pourront être humidifiés à l'aide d'une solution minérale (comprenant des suppléments nutritifs pour le champignon) comprenant pour un litre de solution: KH2PO4: 29
MgSO4: 0,5 g
CaCI2: 0,1 g
Tartrate d'ammonium : 0,2 g
Eau : en quantité suffisante pour 1 I de solution.

Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans la limiter d'une quelconque façon.

LEGENDE DES FIGURES:
La figure 1 représente un essai comparatif de la capacité de quatre souches différentes de Coriolus versicolor à dégrader quatre HAP
BAN (benzo(a)anthracène), BPY (benzo(a)pyrène), BKF (benzo(k)fluoranthène) et DBA (dibenzo(a,h)anthracène). Les niveaux de biodégradation sont donnés semi-quantitativement . 0=0-9 %, 1=10-24 %, 2=25-49 %, 3=50-74 %, 4=75-100 %.

La figure 2 représente les pourcentages de biodégradation en
HAP totaux et en fonction du nombre de cycle après quatre semaines. Le pilote avec Coriolus versicolor 1-1657, 20 % est comparé au témoin microflore indigène.

La figure 3 représente les pourcentages de biodégradation en
HAP totaux et en fonction du nombre de cycles. Le pilote avec Coriolus versicolus 1-1657, 10 % (après 5 semaines) est comparé au témoin (microflore indigène, 8 semaines).

La figure 4 représente les pourcentages de biodégradation en
HAP totaux et en fonction du nombre de cycle après huit semaines. Le pilote avec Coriolus versicolor 1-1657, 10 % est comparé au témoin microflore indigène.

La figure 5 représente les pourcentages de biodégradation de quelques HAP à cinq et six cycles dans un sol contenant initialement 7602 mg
HAP/kg de sol et après huit semaines d'incubation.

EXEMPLE 1 :
Activité dégradatrice de la souche Coriolus versicolor 1-1657 envers les HAP.

Les abréviations suivantes ont été utilisées pour chaque HAP naphtalène (NA), acénaphtylène (ACY), acénaphtène (ACE), fluorène (FL), phénanthrène (PH), anthracène (AN), fluoranthène (FLH), pyréne (PY), benzo(a)anthracène (BAN), chrysène (CH), benzo(b)fluoranthène (B BF), benzo(k)fluoranthène (BKF), benzo(a)pyrène (BAP), dibenzo(a, h)anthracène (DBA), benzo(g,h, i)perylène (BPE) et indénol ,2,3,cd)pyrène (INP).
a) Méthodes analytiques:
Extraction :
L'extraction est effectuée sur la totalité du volume d'essai. Un solvant organique est ajouté dans chaque flacon à raison de 40 ml d'acétonitrile. Puis les flacons sont agités pendant une heure à 200 tpm avant leur passage dans une cuve à ultrasons pendant 5 minutes. Les rendements d'extraction ont été mesurés au préalable et sont supérieurs à 95 %.

Dosages:
Les HAP sont dosés par chromatographie liquide haute pression GlLSON/détection UV JASCO, équipée d'une colonne Lichrospher 100 Cl 8 de longueur 250 mm et de diamètre 4 mm. L'éluant utilisé est isocratique (800 ml acétonitrile + 200 ml eau). La longueur d'onde du détecteur est de 254 nm.

Cette méthode de dosage permet la séparation et la quantification des pics correspondants aux 16 HAP étudiés.
b) Méthode d'étude de la biodéciradation
Les études de dégradation ont été réalisées dans des flacons sérum de 100 ml, fermés de façon étanche.

Chaque flacon d'essai contient 20 ml de milieu de culture permettant le bon développement du champignon. Le milieu de culture utilisé est un milieu enrichi en azote ou carencé en azote et provoquant la stimulation de son activité enzymatique extra-cellulaire (sécrétion des ligninases) suivant les cas. Sa composition (décrite par Kirk et al., 1978, Influence of culture parameters on lignin Metabolism by Phanerochaete Chrysosporium. Anch.

Microbiol. 117, 277-285) est la suivante:
Milieu de culture: milieu basal III medium
KH2PO4: 20 g/l
MgSO4: 5 g/l
CaCl2: 1 g/l
Composition de la culture:
Les produits suivants sont ajoutés par litre de cultures:
Milieu basal III (stérilisé par filtration), 100 ml
10 % glucose (passé à l'autoclave), 100 ml
0,1 M 2,2-méthylsuccinate, pH 4,2 (passé à l'autoclave), 100 ml
Thiamine (100 mg/litre de solution mère stérilisé par filtration) 10 ml
Tartrate d'ammonium (8 g/litre de solution mère, passé à l'autoclave), 25 ml
Spores (absorbance à 650 nm = 0,5), 100 ml.

Les champignons ont été apportés dans le milieu d'essai sous forme d'une solution de spores en suspension, préparée à partir de tubes de cultures en pente. Les substances testées ont été apportées sous forme solubilisée dans un solvant organique à une concentration finale en HAP dans les flacons d'essai comprise entre 6 et 50 mg/l. Cependant, la concentration testée a été en général de 6 mg/l afin de limiter la toxicité de la substance et les quantités de solvant apportées. Dans tous les cas, les quantités totales de solvant apportées dans le milieu d'essai n'ont jamais excédé 1 % et les flacons ont été, le cas échéant, laissés ouverts le temps nécessaire pour l'évaporation du solvant. De l'oxygène a été introduit en début d'essai dans les flacons, puis, si nécessaire, régulièrement au cours du temps. La quantité initiale d'oxygène pur ajouté a été de 50 ml.

L'essai a été conduit en phase statique et les flacons ont été incubés pendant un mois à l'obscurité et à 30"C. En fin d'essai une extraction à l'acétonitrile a été effectuée sur la totalité du volume de milieu d'essai après 30 jours d'incubation. Des dosages spécifiques ont ensuite été effectués par
HPLC.
c) Résultats
Le paramètre mesuré a été la disparition de la substance étudiée.

Les résultats obtenus pour chacun des 16 HAP sont présentés dans le tableau 2. Ces résultats sont présentés semi-quantitativement 0=0-9 1= 10-24 % ; 2=25-49 % ; 3=50-74 % ; 4=75-100 % (%=pourcentages de biodégradation après un mois d'incubation).

Tableau 2:

<tb> <SEP> Niveau <SEP> de <SEP> biodégradation
<tb> <SEP> NA <SEP> 4
<tb> ACY <SEP> 4
<tb> ACE <SEP> 4
<tb> <SEP> FL <SEP> 3
<tb> <SEP> PH <SEP> 3
<tb> <SEP> AN <SEP> 2
<tb> FLH <SEP> 2
<tb> <SEP> PY <SEP> <SEP> t <SEP>
<tb> BAN <SEP> 2
<tb> <SEP> CH <SEP> 2
<tb> BBF <SEP> 2
<tb> BKF
<tb> BAP <SEP> 1
<tb> DBA
<tb> BPE <SEP> <SEP> t <SEP>
<tb> INP <SEP> 2
<tb> Conclusion
La souche Coriolus versicolor 1-1657 est capable de dégrader l'ensemble des 16 HAP. La comparaison de la souche Coriolus versicolor I1657 et de trois autres souches de Coriolus versicolor (Coriolus versicolor
ATCC 34578, ATCC 34671, ATCC 32745) a mis en évidence l'avantage significatif de la souche Coriolus versicolor 1-1657 selon l'invention par rapport aux trois autres Coriolus versicolor (voir figure 1) pour dégrader les HAP lourds.

EXEMPLE 2 :
Procédé de traitement biologique de sols contaminés par des substances organiques récalcitrantes
L'efficacité de la souche Coriolus versicolor selon l'invention a été vérifiée lors d'essais pilote conduits sur des sols pollués historiquement par des HAP. Leur inoculation dans le sol a permis d'améliorer significativement la biodégradation de composés réputés récalcitrants. Les champignons sont introduits dans les sols sur leur support organique (copeaux de bois) à un taux de 20 % (exemple 2a) et 10 % (exemples 2b et 2c).

Le support organique a été inoculé avec du mycélium prédéveloppé sur des grains de céréales (I'inoculation des grains ayant été effectuée initialement par de la gélose solide recouverte de champignons (mycélium prédéveloppé sur de la gélose solide)).
a) Des expérimentations ont été conduites en pilotes de 50 litres sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usine à gaz. L'efficacité de la souche de champignons selon l'invention a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration initiale en HAP totaux de 1596 mg/kg répartis de la façon suivante: 431 mg/kg pour les HAP à trois cycles, 774 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 274 mg/kg pour les HAP à cinq cycles et 117 mg/kg pour les HAP à six cycles. Les champignons ont été inoculés à un taux de 20 % et les paramètres environnementaux (humidité, température et, éventuellement, apport de nutriments) ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Des pourcentages de biodégradation égaux à 73 % pour les HAP à trois cycles, 47 % pour les HAP à quatre cycles, 15 % pour les HAP à cinq cycles et 25 % pour les HAP à six cycles ont été obtenus après seulement un mois d'incubation en pilote en présence de Coriolus versicolor 1-1657 (voir figure 2).

La biodégradation des HAP totaux a représenté environ 50 % après un mois de traitement. Dans le même temps, la microflore indigène en étant pourtant stimulée n'avait dégradé que très faiblement les HAP, la concentration finale atteinte n'étant pas significativement différente de la concentration initiale en
HAP totaux. Dans ce cas, seuls les HAP à trois et quatre cycles ont été dégradés, mais leurs pourcentages de disparition n'ont été que de 19 et 16 % respectivement.

Les méthodes analytiques utilisées pour tous nos essais ont été validées préalablement et ont classiquement consisté pour cet exemple en une extraction au CO2 supercritique suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse.
b) Des essais ont été conduits en pilotes de 50 kg sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usines à gaz. L'efficacité de souches de champignons a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration de 1092 mg/kg répartis de la façon suivante 122 mg/kg pour les HAP à trois cycles, 652 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 318 mg/kg pour les HAP à cinq et six cycles. La souche de champignon Coriolus versicolor 1-1657 a été apportée à un taux de 10 % (poids/poids). Les paramètres environnementaux ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Pour cela, la température a été maintenue aux alentours de 30"C et l'humidité du sol n'avaient guère évolué, avec des pourcentages de biodégradation de 18, 21, 6 et 17 % pour respectivement les deux et trois cycles, les quatre cycles, les cinq et six cycles et les HAP totaux. II est important de noter que le pilote témoin microflore indigène avait également été inoculé avec des copeaux stériles identiques à ceux utilisés pour la préparation de l'inoculum de champignon et cela à un taux de 10 % (poids/poids).

Les méthodes analytiques utilisées pour ces essais ont été validées préalablement et ont consisté pour cet exemple en une extraction au solvant sous pression à l'aide d'un appareillage DIONEX ASE 200 suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse ou chromatographie liquide haute pression/détection UV. L'efficacité du champignon par rapport aux microorganismes indigènes (bactéries et champignons) est la plus marquée pour les HAP lourds à cinq et six cycles qui sont les plus difficiles à biodégrader.
c) Des essais ont été conduits en pilotes de laboratoire de 2 kg sur des sols contaminés historiquement par des HAP provenant d'anciens sites d'usines à gaz. L'efficacité de souches de champignons a été évaluée et comparée à l'activité de la microflore indigène du sol dans le cas d'un sol contaminé par des HAP à une concentration initiale en HAP totaux de 7602 mg/kg répartis de la façon suivante 3903 mg/kg pour les HAP à deux et trois cycles, 3233 mg/kg pour les HAP à quatre cycles, 466 mg/kg pour les HAP à cinq et six cycles. La souche de champignons Coriolus versicolor 1-1657 a été apportée à un taux de 10 % (poids/poids). Les paramètres environnementaux ont été optimisés afin d'accélérer la croissance des champignons et leur activité enzymatique. Pour cela, la température a été maintenue aux alentours de 30"C et l'humidité du sol à 70 % de la teneur en eau utile du sol. Des pourcentages de biodégradation égaux à 49 % pour les trois cycles, 26 % pour les quatre cycles, 34 % pour les cinq et six cycles dont 44 % pour le benzo(a)pyrène, ont été obtenus après seulement huit semaines d'incubation en présence de la souche Coriolus versicolor 1-1657. La biodégradation en
HAP totaux a atteint 38 % après huit semaines d'incubation. Dans le même temps, la microflore indigène biostimulée n'a dégradé que très faiblement les
HAP, le pourcentage de biodégradation atteint en fin d'essai étant équivalent à 25, 9, 0 et 16 % pour respectivement les deux et trois cycles, les quatre cycles, les cinq et six cycles et les HAP totaux (voir figure 4).

Les méthodes analytiques utilisées pour ces essais ont été validées préalablement et ont consisté pour cet exemple en une extraction au solvant sous pression à l'aide d'un appareillage DIONEXASE 200 suivie d'une analyse par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse ou chromatographie liquide haute pression/détection UV. L'efficacité du champignon par rapport aux autres microorganismes est la plus marquée pour les HAP lourds à cinq et six cycles qui sont les plus difficiles à biodégrader (voir figure 5).

Claims

REVENDICATIONS

1. Souche de champignon Coriolus versicolor, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM sous la référence 1-1657, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles.

2. Souche de champignon Coriolus versicolor, déposée le 19 janvier 1996 à la CNCM sous la référence 1-1657.

3. Utilisation de la souche selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans un matériel contaminé.

4. Utilisation selon la revendication 3 dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).

5. Utilisation selon l'une des revendications 3 et 4, dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques choisis parmi le naphtalène, I'acénaphtylène, I'acénaphtène, le fluorène, le phénanthrène, I'anthracène, le fluoranthène, le pyrène, le benzo(a)anthracène, le chrysène, le benzo (b) fluoranthène, le benzo (k) fluoranthène, le benzo(a)pyrène, le dibenzo(a,h)anthracéne, le benzo(g,h, i)perylène et l'indénol(1 ,2,3,cd)pyrène.

6. Utilisation selon l'une des revendications 3 et 4, dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques à au moins cinq cycles.

7. Procédé de traitement d'un matériel contaminé par des polluants récalcitrants dans lequel la souche selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 est mise en contact avec le matériel contaminé dans des conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel contaminé et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants.

8. Procédé selon la revendication 7 comprenant les étapes consistant à

a) préparer un inoculum de champignon selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 sur un support organique lignifié, ledit support étant préalablement traité de manière à éliminer les contaminants microbiologiques, inoculé avec ladite souche de champignon, puis incubé dans des conditions appropriées à la croissance du champignon;

b) introduire l'inoculum dans le matériel contaminé.

9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l'inoculum est introduit dans le matériel contaminé à un taux compris entre 1 et 50 %, de préférence entre 5 et 20 %, en poids.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel ledit matériel contaminé est un sol.