FR2827299A1 - Nouvelles souches de champignons fusarium solani utiles pour le traitement des materiels pollues - Google Patents
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Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
- B09C1/105—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes using fungi or plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
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-
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-
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
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- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
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-
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Abstract
Cette invention concerne la souche de champignons telluriques Fusarium solani I-2257, ou de l'un de ses dérivés, capables de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, ainsi que leurs utilisations pour le traitement des matériels contaminés par des composés polluants récalcitrants.
Description
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La présente invention concerne une nouvelle souche de champignons telluriques à savoir la souche Fusarium solani ainsi que ses utilisations pour le traitement des matériels contaminés par des composés polluants récalcitrants.
La dépollution des sites pollués, c'est-à-dire des sites sur lesquels une pollution d'origine industrielle du sol ou du sous-sol est susceptible de générer une nuisance ou un risque pérenne pour les personnes ou l'environnement, est un enjeu économique et scientifique actuel majeur.
La dépollution peut se faire par voie mécanique, par brûlage des terres, par voie chimique ou par voie biologique. La biorestauration ou bioréhabilitation peut être plus particulièrement utilisée. Cette technique met en oeuvre des microorganismes, tels que des bactéries ou des champignons, pour dégrader les composés polluants récalcitrants, c'est-à-dire des composés qui résistent à la dégradation dans l'environnement.
Parmi ces composés polluants récalcitrants, on peut citer notamment
les halobenzoates tels que le chlorobenzoate et le bromobenzoate, et les composés nitrés tels que le 2,4, 6-trinitrotoluène (TNT) et autres explosifs tels que le PETN (penta-érythritol tétranitrate) et l'EGDN (éthylèneglycol dinitrate).
les halobenzoates tels que le chlorobenzoate et le bromobenzoate, et les composés nitrés tels que le 2,4, 6-trinitrotoluène (TNT) et autres explosifs tels que le PETN (penta-érythritol tétranitrate) et l'EGDN (éthylèneglycol dinitrate).
On peut citer également les halogénures organiques tels que notamment le DDT [1, 1-bis (4-chlorophényl) -2, 2, 2-trichloroéthane], la 2,3, 7,8- tétrachlorodibenzo-p-dioxine, le lindane (1,2, 3,4, 5, 6-hexachlorocyclohexane), les composés biphényles polyhalogénés tels que notamment le 3,4, 3', 4'tétrachlorobiphényle et le 2,4, 5, 2', 4', 5'-hexachlorobiphényle.
On peut enfin citer les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dont certains sont des composés mutagènes et cancérigènes.
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) constituent une part importante des goudrons résultant de la distillation de la houille. On en trouve aussi dans les goudrons de distillation du pétrole.
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Les HAP sont les polluants systématiques du sol des anciennes usines à gaz et des cokeries (sidérurgie, carbochimie).
On les trouve aussi dispersés dans d'autres lieux en relation avec l'usage qui a été fait de ces goudrons : agglomération des poussières de charbon en boulets, fabrication des produits de traitement du bois appelés créosotes et usines de traitement du bois utilisant ces produits. Ils ont même pu être utilisés dans certains cas pour fabriquer des revêtements de route, ou comme produits d'étanchéité (enduits, bouchage de brèches, constitution de barrages).
Les HAP sont des produits hydrophobes qui adhèrent fortement aux solides. Ils présentent tous une très faible solubilité, mais cette solubilité est suffisante pour les déplacer et les diluer notablement dans le sol au fil du temps. Ce sont des produits très peu volatiles, à l'exception du naphtalène, mais ils émettent cependant une forte odeur désagréable caractéristique.
Le nombre de HAP que l'on peut trouver sur un site gazier est considérable. L'agence américaine pour la protection de l'environnement (EPA pour environmental protection agency) a édité une liste de 16 HAP contaminant les sols, cette liste faisant référence dans de nombreux pays.
Ces 16 HAP sont considérés comme prioritaires et doivent être surveillés.
Le tableau 1 suivant présente la formule de ces 16 HAP.
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<tb>
<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 1 <SEP> : <SEP> Formule <SEP> des <SEP> 16 <SEP> HAP
<tb> HAP <SEP> à <SEP> deux <SEP> cycles <SEP> Naphtalène
<tb> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> trois <SEP> cycles <SEP> Acénaphthylène <SEP> Acénaphtène <SEP> Fluorène <SEP> Phénanthrène <SEP> Anthracène
<tb> # <SEP> # <SEP> # <SEP> # <SEP> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> quatre <SEP> cycles <SEP> Fluoranthène <SEP> Pyrène <SEP> Benzo(a)anthracène <SEP> Chrysène
<tb> # <SEP> # <SEP> # <SEP> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> cinq <SEP> cycles <SEP> Benzo(b)fluoranthène <SEP> Benzo(k)fluoranthène <SEP> Benzo(a)pyrène <SEP> diben(a,h)anthracène
<tb> # <SEP> # <SEP> # <SEP> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> six <SEP> cycles <SEP> Benzo(g,h,i)perylène <SEP> Indenol(1,2,3-cd)pyrène
<tb> # <SEP> #
<tb>
<tb> HAP <SEP> à <SEP> deux <SEP> cycles <SEP> Naphtalène
<tb> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> trois <SEP> cycles <SEP> Acénaphthylène <SEP> Acénaphtène <SEP> Fluorène <SEP> Phénanthrène <SEP> Anthracène
<tb> # <SEP> # <SEP> # <SEP> # <SEP> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> quatre <SEP> cycles <SEP> Fluoranthène <SEP> Pyrène <SEP> Benzo(a)anthracène <SEP> Chrysène
<tb> # <SEP> # <SEP> # <SEP> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> cinq <SEP> cycles <SEP> Benzo(b)fluoranthène <SEP> Benzo(k)fluoranthène <SEP> Benzo(a)pyrène <SEP> diben(a,h)anthracène
<tb> # <SEP> # <SEP> # <SEP> #
<tb> HAP <SEP> à <SEP> six <SEP> cycles <SEP> Benzo(g,h,i)perylène <SEP> Indenol(1,2,3-cd)pyrène
<tb> # <SEP> #
<tb>
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Plusieurs champignons formant la pourriture blanche sur le bois sont connus pour leur action dégradatrice envers certains composés polluants récalcitrants. Toutefois ces champignons ne sont généralement mis en oeuvre que sous une forme supportée. En l'occurrence, on procède classiquement à un pré-développement de la souche considérée sur un support organique avant sa mise en contact avec le matériel contaminé. En outre, le support organique retenu doit, pour sa part, subir au préalable un traitement de manière à éliminer ses contaminants microbiologiques. L'ensemble de ces deux opérations est de toute évidence contraignant pour l'utilisateur.
Le demandeur a à présent découvert de nouvelles souches de champignons d'origine tellurique qui s'avèrent efficaces pour la dégradation des HAP et qui avantageusement ne nécessitent pas d'être supportés sur un support organique.
La présente invention a donc pour objet une souche de champignon tellurique caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Fusarium solani déposée à la CNCM [Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteurs sous le numéro d'ordre 1-2257, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant de deux à quatre cycles mais aussi les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1.
Par"dérivé", on entend une souche dérivée de l'une des souches précédentes par mutation, spontanée ou induite, et capable de dégrader non seulement les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant deux à quatre cycles, mais aussi les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles, notamment tous les HAP à cinq ou six cycles du tableau 1, ainsi que, en général, les HAP comprenant plus de six cycles.
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Plus préférentiellement, il s'agit de la souche Fusarium solani 1-2257.
Ci-après, on désignera la souche Fusarium solani 1-2257 ainsi que ses dérivés tels que définis ci-dessus par l'expression"Fusarium solanl" selon l'invention.
Ci-après, on désignera la souche Fusarium solani 1-2257 ainsi que ses dérivés tels que définis ci-dessus par l'expression"Fusarium solanl" selon l'invention.
La souche revendiquée ne présente aucune activité peroxydase. En revanche, une activité laccase a été mise en évidence dans les milieux de culture de cette souche.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins ladite souche Fusarium solani selon l'invention pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans des matériels contaminés.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins ladite souche Fusarium solani selon l'invention pour dégrader des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) pouvant être notamment choisis parmi les 16 HAP de la liste de l'EPA citée précédemment (tableau 1).
Elle vise notamment l'utilisation d'au moins cette souche pour dégrader des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) à au moins 5 cycles et/ou 6 cycles.
Elle a également en particulier pour objet l'utilisation d'au moins ladite souche selon l'invention pour dégrader des composés nitrés, des composés organohalogénés (notamment les halobenzoates, les halogénures organiques, les composés biphényles polyhalogénés), en particulier des composés organochlorés.
La présente invention a également pour objet un procédé de traitement d'un matériel contaminé par des polluants récalcitrants, dans lequel le champignon d'au moins ladite souche selon l'invention est mis en contact avec le matériel contaminé dans des conditions appropriées pour
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stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants.
Ce procédé peut notamment comprendre les étapes consistant à préparer un inoculum d'un champignon selon l'invention et introduire l'inoculum dans le matériel contaminé.
Ledit matériel contaminé peut être les sols, les sédiments aquatiques, les graviers, et autres matériels solides. Il peut également s'agir d'un matériel liquide comme l'eau de type effluents par exemple.
De manière préférentielle, ledit matériel contaminé est un sol.
Les principales mises en oeuvre de techniques de biorestauration d'un sol, appropriées à l'utilisation d'une souche conforme à l'invention sont : - le traitement sur site : le sol est excavé et traité sur place ; - le traitement ex situ : le sol est excavé et traité hors site.
Par"conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants", on entend des conditions d'aération, de température et d'humidité, du matériel contaminé, connues de l'homme du métier.
Lorsque le matériel contaminé est un sol, l'humidité de celui-ci peut être, de manière préférentielle, comprise entre 50 et 80 % de la teneur en eau utile suivant le type de sol. La teneur en azote dans le sol peut être telle que le rapport carbone/azote/phosphore soit égal à environ 100/10/1.
Le matériel contaminé peut également contenir de manière avantageuse des nutriments et des oligo-éléments.
L'aération peut être assurée par une circulation d'air forcée, par une diffusion naturelle d'air, ou par brassage mécanique du sol. Lorsque le matériel contaminé est un sol, un débit d'air d'environ 0,1 à 5 m3/h/tonne de sol est avantageux par exemple. L'aération peut être rendue plus homogène dans le sol en assurant un démottage ou un criblage préliminaire du sol. L'apport d'un support organique avec un inoculum permet également
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d'améliorer la structure du sol, et par conséquent son aération. Plus généralement, l'homogénéisation du sol par démottage/criblage/brassage et le mélange avec le support organique de l'inoculum permettent d'améliorer les transferts de masse (eau, température, nutriments, air, enzymes) et par conséquent l'activité biochimique responsable de la dégradation des composants polluants.
L'inoculum peut être introduit dans le matériel contaminé à un taux d'au moins 104, de préférence d'au moins 106 spores/gramme de sol. La mise en contact peut être réalisée notamment sur sol excavé ou sur soi destructuré.
La souche revendiquée peut se présenter : a) sous la forme d'une solution de spores, de fragments de mycélium ou d'un mélange de spores et de fragments de mycélium, en suspension dans un milieu liquide, pouvant être préparée par exemple à partir de cultures de champignons sur un support solide, en particulier sur milieu gélifié solide, (notamment gélose) en tube ; la suspension peut ainsi être obtenue notamment en introduisant un volume déterminé de milieu de culture pour champignon, de type milieu de base de Bonnarme et al. (Bonnarme et al., 1994, FEMS Microbiol. lett. 120 : 155-162), puis en agitant vigoureusement le tube de façon à libérer les spores ; b) sous la forme de mycélium pré-développé en milieu liquide : le mycélium pré-développé peut être obtenu en mettant en culture dans du milieu de base une solution de spores en suspension ; dans ce cas, la culture est placée sous agitation en général pendant environ une semaine à 30 C et le milieu d'inoculation peut être utilisé tel quel. c) ou sous la forme de mycélium pré-développé sur un support solide (mycélium recouvrant des fragments de support solide), notamment sur un milieu gélifié solide, tel que par exemple de la gélose, qui peut être contenu dans une boîte de Pétri.
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Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans la limiter d'une quelconque façon.
LEGENDE DES FIGURES :
Figure 1 : teneur des 16 HAP dans les sols A, C, D et E.
Figure 1 : teneur des 16 HAP dans les sols A, C, D et E.
Figure 2 : Pourcentage de dégradation du B (a) P après 10 jours d'incubation.
MATERIE ET METHODE
A des fins de simplification, la souche revendiquée est identifiée ciaprès sous la définition suivante :
A3C5 : Fusarium solani, 1-2257.
A des fins de simplification, la souche revendiquée est identifiée ciaprès sous la définition suivante :
A3C5 : Fusarium solani, 1-2257.
- Production d'inoculum.
Pour la préparation d'un inoculum fongique, les spores sont utilisées.
Pour chaque isolat, 5 ml d'eau distillée stérile sont déposés sur une préculture de 15 jours sur milieu MEA en boîte de Pétri. La gélose est ensuite légèrement grattée avec l'extrémité d'un ensemenceur afin de mettre les spores en suspension. La suspension obtenue est ensuite filtrée sur laine de verre afin de retenir le mycélium et de récupérer les spores dans le filtrat. Après filtration, la laine de verre est rincée avec 3 à 4 ml d'eau distillée stérile. La suspension de spores, récupérée dans un tube à essai, est agitée au vortex afin de bien l'homogénéiser. La concentration en spores est estimée à l'aide d'une cellule de Malassez.
Deux types d'inoculum sont préparés : e Un inoculum constitué d'une suspension de spores (de concentration égale à 104 spores 1 g de sol) préparée selon la méthode décrite précédemment. L'inoculum peut être apporté en même temps qu'un
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substrat carboné : glucose et saccharose dont la quantité équivaut à 0, 5% (en g/g de sol) pour chaque composé. Ce type d'inoculum est nommé TO.
'Un inoculum constitué d'une suspension de spores prégermées.
Pour chaque isolat, une suspension de spores (de concentration égale à 104 spores/g de soi) est produite comme précédemment. Les différentes suspensions de spores subissent tout d'abord, avant d'être inoculées dans les sols, une préculture de 36 h en milieu liquide en présence d'un substrat carboné à une température de 25 C, ceci dans le but d'induire la germination des spores avant l'inoculation. Le milieu de préculture contient l'eau nécessaire pour obtenir les 70% de la capacité au champ dans laquelle sont dissoutes les quantités de glucose et de saccharose satisfaisantes pour obtenir une concentration équivalente à 0,5% (en g/g de sol) pour chaque composé. Dans ce cas, l'inoculum porte le nom de T36.
- Ensemencement des échantillons de terre pollués par les inocula fongiques.
Chaque souche fongique est testée individuellement. Pour cela, une fraction de la suspension de spores préalablement obtenue est ajoutée à l'échantillon de terre afin d'obtenir une concentration de 104 spores 1 g de sol sec. Chaque inoculum est apporté en même temps que la quantité d'eau nécessaire à maintenir une humidité égale à 70% de la capacité au champ des échantillons de terre. Les cultures sont ensuite bien mélangées afin d'obtenir une bonne répartition de l'inoculum dans l'échantillon de sol.
- Etude de la dégradation des HAP en microcosmes.
Dans certains essais, les cultures de deux isolats fongiques sont effectuées dans de plus importantes quantités de sol et pour une durée d'incubation de plusieurs mois.
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a) Préparation des microcosmes.
L'étude de la dégradation des HAP par l'isolat fongique considéré est effectuée dans des microcosmes (cuve en plastique : 35x25x20 cm). Avant son transfert dans les microcosmes, le sol est préalablement débarrassé des particules de diamètre supérieur à 1 cm. La quantité de sol contenue dans chaque microcosme est de 5 kg. Pour la mise en oeuvre de ces microcosmes, différents paramètres sont pris en compte. L'oxygénation et l'humidité des sols sont maintenues par un système d'aération (pompe à air d'aquariophile réglée pour un débit de 40 mi/min en continu). L'air injecté est humidifié par son passage dans une couche d'eau se trouvant à quelques centimètres sous l'échantillon de sol. b) Ensemencement des microcosmes.
L'inoculation des différents microcosmes est effectuée par l'apport d'une suspension de spores prégermées (T36) de concentration égale à 104 spores/g de sol pour l'isolat considéré. L'inoculum est apporté en même temps que l'eau nécessaire pour obtenir une humidité équivalente à 70% de la capacité au champ. Deux cultures sont réalisées par traitement. c) Conditions de cultures.
Une fois inoculé, chaque microcosme est recouvert d'une feuille d'aluminium qui permet de maintenir une atmosphère humide au-dessus de l'échantillon de sol.
Les différents microcosmes ainsi préparés sont incubés à la température ambiante d'une salle non chauffée subissant de ce fait les fluctuations de la température extérieure. La durée d'incubation des microcosmes est de 150 jours. d) Prélèvement des échantillons de sol.
Les prélèvements d'échantillons de sol sont effectués à différents temps de culture : 0,15, 30,60, 90,120 et 150 jours.
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Ces prélèvements sont effectués par carottage sur toute la profondeur. De cette manière, il est possible d'estimer au mieux la dégradation des HAP ainsi que le suivi des souches inoculées dans l'ensemble du microcosme.
Trois échantillons de 20g de sol sont prélevés dans chaque microcosme. e) Extraction et dosage des HAP
Les échantillons de 20 g sont homogénéisés et une quantité de 10 g est ensuite prélevée. Chaque aliquote ainsi récupéré est séché puis pulvérisé. L'extraction des HAP et leur dosage sont réalisés sur 5 g de sol pulvérisé selon la méthode décrite ci-après.
Les échantillons de 20 g sont homogénéisés et une quantité de 10 g est ensuite prélevée. Chaque aliquote ainsi récupéré est séché puis pulvérisé. L'extraction des HAP et leur dosage sont réalisés sur 5 g de sol pulvérisé selon la méthode décrite ci-après.
- Paramètres physico-chimiques des sols étudiés.
Les quatre sols utilisés pour cette étude sont les sols A, C, D et E présentant respectivement une teneur total en HAP de 782,1081, 2778 et 1778 mg/kg de sol.
La figure 1 illustre la teneur des 16 HAP dans ces 4 sols et le tableau 1 ci-après, énumère les caractéristiques physico-chimiques pour 3 d'entre eux.
<Desc/Clms Page number 12>
TABLEAU 1
<tb>
<tb> Sol <SEP> A <SEP> Sol <SEP> C <SEP> Sol <SEP> D
<tb> Granulométrie <SEP> g/kg
<tb> Argile <SEP> 135 <SEP> 86 <SEP> 37
<tb> Limon <SEP> 228 <SEP> 306 <SEP> 24
<tb> Sable <SEP> 637 <SEP> 608 <SEP> 939
<tb> Carbone <SEP> organique <SEP> g/kg
<tb> Carbone <SEP> organique <SEP> 46,1 <SEP> 42,4 <SEP> 27,3
<tb> Matière <SEP> organique <SEP> 79,3 <SEP> 72,9 <SEP> 47
<tb> Azote <SEP> organique <SEP> total <SEP> g/kg <SEP> 2,11 <SEP> 1,94 <SEP> 0,48
<tb> Rapport <SEP> carbone <SEP> organique/21, <SEP> 85 <SEP> 21,86 <SEP> 56,88
<tb> Azote <SEP> Organique
<tb> Phosphore <SEP> g/kg <SEP> 0,126 <SEP> 0,112 <SEP> 0,026
<tb> Cuivre <SEP> mg/kg <SEP> 64, <SEP> 9 <SEP> 47, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 7
<tb> Zinc <SEP> mg/kg <SEP> 317 <SEP> 152,2 <SEP> 10,4
<tb> Chrome <SEP> mg/kg <SEP> 226 <SEP> 36,9 <SEP> 10,7
<tb> Nicke1 <SEP> mg/kg <SEP> 46, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 8
<tb> Plomb <SEP> mg/kg <SEP> 270, <SEP> 8 <SEP> 260 <SEP> 7, <SEP> 9
<tb> Cadmiummg/kg <SEP> 0,720 <SEP> 0, <SEP> 315 <SEP> 0, <SEP> 163
<tb> Mercure <SEP> mg/kg <SEP> 1, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> Sélénium <SEP> mg/kg <SEP> < 5 <SEP> < 0,1 <SEP> 0,11
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 1
<tb> Capacité <SEP> de <SEP> rétention <SEP> en <SEP> eau <SEP> 40 <SEP> 55 <SEP> 34
<tb> (en <SEP> %)
<tb>
<tb> Sol <SEP> A <SEP> Sol <SEP> C <SEP> Sol <SEP> D
<tb> Granulométrie <SEP> g/kg
<tb> Argile <SEP> 135 <SEP> 86 <SEP> 37
<tb> Limon <SEP> 228 <SEP> 306 <SEP> 24
<tb> Sable <SEP> 637 <SEP> 608 <SEP> 939
<tb> Carbone <SEP> organique <SEP> g/kg
<tb> Carbone <SEP> organique <SEP> 46,1 <SEP> 42,4 <SEP> 27,3
<tb> Matière <SEP> organique <SEP> 79,3 <SEP> 72,9 <SEP> 47
<tb> Azote <SEP> organique <SEP> total <SEP> g/kg <SEP> 2,11 <SEP> 1,94 <SEP> 0,48
<tb> Rapport <SEP> carbone <SEP> organique/21, <SEP> 85 <SEP> 21,86 <SEP> 56,88
<tb> Azote <SEP> Organique
<tb> Phosphore <SEP> g/kg <SEP> 0,126 <SEP> 0,112 <SEP> 0,026
<tb> Cuivre <SEP> mg/kg <SEP> 64, <SEP> 9 <SEP> 47, <SEP> 4 <SEP> 2, <SEP> 7
<tb> Zinc <SEP> mg/kg <SEP> 317 <SEP> 152,2 <SEP> 10,4
<tb> Chrome <SEP> mg/kg <SEP> 226 <SEP> 36,9 <SEP> 10,7
<tb> Nicke1 <SEP> mg/kg <SEP> 46, <SEP> 1 <SEP> 24, <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 8
<tb> Plomb <SEP> mg/kg <SEP> 270, <SEP> 8 <SEP> 260 <SEP> 7, <SEP> 9
<tb> Cadmiummg/kg <SEP> 0,720 <SEP> 0, <SEP> 315 <SEP> 0, <SEP> 163
<tb> Mercure <SEP> mg/kg <SEP> 1, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 03
<tb> Sélénium <SEP> mg/kg <SEP> < 5 <SEP> < 0,1 <SEP> 0,11
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 8, <SEP> 1
<tb> Capacité <SEP> de <SEP> rétention <SEP> en <SEP> eau <SEP> 40 <SEP> 55 <SEP> 34
<tb> (en <SEP> %)
<tb>
L'étude de l'aptitude de la souche pure isolée à dégrader les HAP est effectuée dans des sols pulvérisés à l'aide d'un broyeur à tamis (Pulverisette 14, Fritsch) afin d'obtenir des particules de terre dont la taille n'excède pas 120 J. m. Ces sols pulvérisés sont ensuite répartis en différentes fractions de
<Desc/Clms Page number 13>
20 g +/-0, 1 g et placés dans des petits pots en verre avant l'ensemencement.
- Activité dégradatrice des souches revendiquées envers les HAP.
Les abréviations suivantes ont été utilisées pour chaque HAP : naphtalène (NA), acénaphtylène (ACY), acénaphtène (ACE), fluorène (FL), phénanthrène (PH), anthracène (AN), fluoranthène (FLH), pyrène (PY), benzo (a) anthracène (BAN), chrysène (CH), benzo (b) fluoranthène (BBF), benzo (k) fluoranthène (BKF), benzo (a) pyrène (BAP), dibenzo (a, h) anthracène (DBA), benzo (g, h, i) perylène (BPE) et indénol (1,2, 3, cd) pyrène (INP).
- Extraction des HAP.
Après incubation des cultures, les HAP résiduels sont extraits par l'appareil de Sohxlet. Les échantillons de sol sont séchés dans une étuve à 30 C pendant une nuit. L'extraction des HAP est effectuée sur un échantillon de 5 g de sol sec pulvérisé avec 170 ml de dichlorométhane (DCM) pendant 16 heures. Après extraction, le dichlorométhane est évaporé sous vide à une température de 400C à l'aide d'un évaporateur rotatif. Les HAP sont ensuite dissous dans 25 ml de DCM. Un aliquote de 1 mi est alors séché et conservé, avant le dosage, à 4 C.
- Dosage des HAP par chromatographie en phase gazeuse (CPG).
Les HAP de chaque échantillon sont dissous dans 0,5 ml de DCM. A
80jJ t1 de l'échantillon sont ajoutés 20). t1 d'hexachlorobenzène (de concentration égale à 4 mg/ml) utilisé comme standard interne.
80jJ t1 de l'échantillon sont ajoutés 20). t1 d'hexachlorobenzène (de concentration égale à 4 mg/ml) utilisé comme standard interne.
Les analyses sont réalisées sur un chromatographe en phase gazeuse de marque PERKIN ELMER. La colonne utilisée est une colonne capillaire Restek XTI-5 (30m x 0,53 mm). Le gaz vecteur est l'hydrogène.
L'injecteur utilisé est de type"on column"et le détecteur est un détecteur à ionisation de flamme (FID).
<Desc/Clms Page number 14>
<tb>
<tb>
<tb>
Les <SEP> conditions <SEP> choisies <SEP> sont <SEP> :
<tb> - <SEP> Température <SEP> initiale <SEP> du <SEP> four <SEP> : <SEP> 90 C
<tb> - <SEP> Température <SEP> finale <SEP> du <SEP> four <SEP> : <SEP> 310 C
<tb> - <SEP> Taux <SEP> de <SEP> montée <SEP> en <SEP> température <SEP> : <SEP> 4 C/min
<tb> - <SEP> Température <SEP> du <SEP> détecteur <SEP> : <SEP> 320 C
<tb> - <SEP> Débit <SEP> du <SEP> gaz <SEP> vecteur <SEP> (H2) <SEP> réglé <SEP> à <SEP> 15 <SEP> ml/min.
<tb>
<tb> - <SEP> Température <SEP> initiale <SEP> du <SEP> four <SEP> : <SEP> 90 C
<tb> - <SEP> Température <SEP> finale <SEP> du <SEP> four <SEP> : <SEP> 310 C
<tb> - <SEP> Taux <SEP> de <SEP> montée <SEP> en <SEP> température <SEP> : <SEP> 4 C/min
<tb> - <SEP> Température <SEP> du <SEP> détecteur <SEP> : <SEP> 320 C
<tb> - <SEP> Débit <SEP> du <SEP> gaz <SEP> vecteur <SEP> (H2) <SEP> réglé <SEP> à <SEP> 15 <SEP> ml/min.
<tb>
- Analyse des résultats.
Pour chaque analyse effectuée, l'intégration des pics obtenus est faite manuellement. Les HAP sont identifiés par comparaison de leur temps de rétention avec celui de standards connus : les 16 HAP de l'EPA (Restek MXT-5, SV Calibration Mix # 5).
La quantification de ces différents HAP est obtenue à partir du dosage d'une gamme étalon des 16 HAP de l'EPA en présence d'un standard interne : l'hexachlorobenzène.
EXEMPLE 1.
Influence de la dose d'inoculum.
Les essais sont effectués dans des échantillons de sol stérile, c'est-àdire en absence de la microflore endogène. L'objectif de cet essai est de déterminer l'aptitude propre de l'isolat fongique à dégrader les HAP, en absence de la microflore endogène. L'isolat fongique précédemment sélectionné est inoculé dans des échantillons de sol A préalablement stérilisés. La stérilisation est effectuée par trois passages à l'autoclave (120 C pendant 20 min) avec 24 heures d'intervalle entre chaque passage.
Les conditions de culture retenues pour cette étude sont les conditions optimales de préparation du sol. Par ailleurs, il a été étudié l'influence de la dose d'inoculum en apportant les deux types d'inoculum, TO et T36 à des doses de 104, 105 et 106 spores 1 g de sol. Deux cultures sont réalisées par condition de culture (dose et type de l'inoculum).
<Desc/Clms Page number 15>
En tableau Il, sont récapitulés les résultats obtenus.
Les résultats révèlent une influence de l'inoculum sur les taux de dégradation des HAP.
<Desc/Clms Page number 16>
TABLEAU Il
<tb>
<tb> P. <SEP> TO <SEP> P. <SEP> T36 <SEP> T. <SEP> TO <SEP> T. <SEP> T36
<tb> 2 <SEP> et <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6
<tb> Souches <SEP> total <SEP> total <SEP> total <SEP> Total
<tb> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles
<tb> A3. <SEP> C5 <SEP> 23, <SEP> 1 <SEP> 28, <SEP> 4 <SEP> 21, <SEP> 6 <SEP> 23, <SEP> 5 <SEP> 21, <SEP> 8 <SEP> 15, <SEP> 8 <SEP> 23, <SEP> 6'21, <SEP> 4 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 26, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 15, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 32, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 9
<tb>
P. TO : Sol pulvérisé, spores plus solution carbonée TO T. TO : Sol tamisé, spores plus solution carbonée TO P. T36 : Sol pulvérisé, spores prégermées T36 T. T36 : Sol tamisé, spores prégermées T36 Total : pourcentage de dégradation des HAP totaux.
<tb> P. <SEP> TO <SEP> P. <SEP> T36 <SEP> T. <SEP> TO <SEP> T. <SEP> T36
<tb> 2 <SEP> et <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 6
<tb> Souches <SEP> total <SEP> total <SEP> total <SEP> Total
<tb> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles <SEP> cycles
<tb> A3. <SEP> C5 <SEP> 23, <SEP> 1 <SEP> 28, <SEP> 4 <SEP> 21, <SEP> 6 <SEP> 23, <SEP> 5 <SEP> 21, <SEP> 8 <SEP> 15, <SEP> 8 <SEP> 23, <SEP> 6'21, <SEP> 4 <SEP> 11, <SEP> 6 <SEP> 26, <SEP> 7 <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> 15, <SEP> 9 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 32, <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 2, <SEP> 9
<tb>
P. TO : Sol pulvérisé, spores plus solution carbonée TO T. TO : Sol tamisé, spores plus solution carbonée TO P. T36 : Sol pulvérisé, spores prégermées T36 T. T36 : Sol tamisé, spores prégermées T36 Total : pourcentage de dégradation des HAP totaux.
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EXEMPLE 2
Influence de la dose d'inoculum.
Influence de la dose d'inoculum.
L'influence de la dose d'inoculum a été étudiée. Pour cela, l'inocula est introduit à des doses croissantes de 104, 105 et 106 spores/mg de sol.
De plus, les deux types d'inoculum (RO et T36) ont été utilisés.
L'estimation des pertes abiotiques en HAP est effectuée à partir de cultures témoins "sol stérile" (Tst). Dans ce traitement, une solution de glucose-saccharose (1% g/g de sol sec) est apportée en même temps que l'eau nécessaire pour obtenir les 70% de la capacité au champ. L'apport de ce substrat carboné permet en outre de vérifier si la stérilisation des différents échantillons de sol est bien effectuée. En même temps, un autre témoin "sol non stérile" (TNst) est aussi préparé dans les mêmes conditions afin d'évaluer les pertes en HAP dues à la microflore indigène.
Aucune dégradation des HAP n'est observée dans ces différents échantillons témoins. En effet, les teneurs résiduelles en HAP des cultures témoins"soi stérile"et témoins"sol non stérile"observées sont identiques à celles des échantillons de sol originel (respectivement de 728 et 735 mg/kg de sol sec contre 727 mg/kg de sol sec pour le sol Ori). De ce fait, si des pertes en HAP sont observées dans les cultures inoculées, la biodégradation de ces composés est alors due à l'aptitude de la souche testée.
Inoculée sous forme de spores à raison de 106 spores/gramme de sol en présence d'un substrat carboné, la souche A3C5 assure une dégradation de 7% de la teneur en HAP totaux. Il semblerait donc que le taux de dégradation s'accroisse avec la dose de l'inoculum apportée contre 1 % pour 104 spores/gramme de sol.
Cette observation concerne aussi l'inoculum T36. En effet, les taux de dégradation obtenus à partir des cultures effectuées avec cet isolat fongique, inoculé sous forme de spores prégermées, augmentent significativement.
<Desc/Clms Page number 18>
Les taux de dégradation sont de 1% pour un inoculum de 104 spores/g de sol, de 8% pour 105 spores/g de sol et de 14% pour un inoculum de 106 spores/g de sol.
En ce qui concerne la classe des HAP de 4 cycles, la souche A3C5 présente des taux de dégradation pour ces quatre HAP (fluoranthène, pyrène, benz (a) anthracène et chrysène) supérieurs à 15%.
EXEMPLE 3
Aptitude de l'isolat fongique sélectionné à dégrader le benzo (a) pyrène.
Aptitude de l'isolat fongique sélectionné à dégrader le benzo (a) pyrène.
L'objectif de cette étude est d'estimer l'aptitude de cet isolat fongique à dégrader le benzo (a) pyrène in vitro en présence d'un autre substrat carboné. Pour cela, l'isolat A3C5 est inoculé d'une part dans un milieu contenant du B (a) P à raison de 10-3 moles/litre et d'autre part dans le même milieu de culture sans B (a) P. Afin de comparer leur aptitude avec celle de champignons de la pourriture blanche, une souche de Phanerochaete chrysosporium est inoculée dans les mêmes conditions.
Après un temps d'incubation de 10 jours, l'extraction et le dosage du B (a) P résiduel sont effectués selon la méthode décrite dans la partie matériels et méthodes.
L'estimation de la dégradation du B (a) P dans les différentes cultures est effectuée par comparaison des teneurs résiduelles du B (a) P dans chaque culture par rapport à la teneur moyenne des trois échantillons témoins abiotiques. La figure 2 illustre les taux de disparition du B (a) P dans le milieu de culture, obtenus à partir des cultures effectuées avec les isolats fongiques sélectionnés.
L'analyse des résultats de cette étude, révèle que la souche testée engendre des taux de dégradation important du B (a) P, compris entre 24 et 30%, dans le milieu de culture.
Claims (11)
1. Souche de champignon tellurique, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Fusarium solani déposée à la CNCM [Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Institut Pasteurs sous le numéro d'ordre 1- 2257, ou de l'un de ses dérivés, capable de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comprenant au moins cinq cycles, dont tous les HAP comprenant cinq ou six cycles.
2. Souche de champignon tellurique caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche Fusarium solani 1-2257.
3. Utilisation d'une souche selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 pour dégrader des composés polluants récalcitrants contenus dans un matériel contaminé.
4. Utilisation selon la revendication 3 dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).
5. Utilisation selon l'une des revendications 3 et 4, dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques polycycliques choisis parmi le naphtalène, l'acénaphtylène, l'acénaphtène, le
fluorène, le phénanthrène, l'anthracène, le fluoranthène, le pyrène, le benzo (a) anthracène, le chrysène, le benzo (b) fluoranthène, le benzo (k) fluoranthène, le benzo (a) pyrène, le dibenzo (a, h) anthracène, le benzo (g, h, i) perylène et l'indénol (1,2, 3, cd) pyrène.
6. Utilisation selon l'une des revendications 3 et 4, dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des hydrocarbures aromatiques à au moins cinq cycles.
<Desc/Clms Page number 20>
7. Utilisation selon la revendication 3, dans laquelle les composés polluants récalcitrants sont des composés nitrés ou des composés organohalogénés en particulier des composés organochlorés.
8. Procédé de traitement d'un matériel contaminé par des polluants récalcitrants dans lequel la souche selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 est mise en contact avec le matériel contaminé dans des conditions appropriées pour stimuler la croissance dudit champignon dans le matériel contaminé et garantir l'activité dégradatrice des polluants récalcitrants.
9. Procédé selon la revendication 8 comprenant les étapes consistant à : a) préparer un inoculum d'un champignon selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 ; b) introduire l'inoculum dans le matériel contaminé.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'inoculum est introduit dans le matériel contaminé à un taux au moins égal à 104 et de préférence à 106 spores par gramme de sol.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel ledit matériel contaminé est un sol.
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| FR2827300A1 (fr) | 2003-01-17 |
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