FR2712604A1 - Cassette de clonage et d'expression, vecteurs d'expression et bactéries transformées comprenant le promoteur Frup de R. Capsulatus; leurs applications. - Google Patents
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Abstract
L'Invention est relative à une cassette de clonage et d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que constituants essentiels: - un fragment d'ADN (a) comprenant le promoteur frup de R. capsulatus, pourvu de ses séquences de régulation par le fructose; et en aval dudit promoteur, - un fragment d'ADN (b) comprenant au moins un site de restriction, permettant le clonage d'un gène sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. L'Invention englobe également des vecteurs recombinants portant ladite cassette, ainsi que des bactéries transformées contenant lesdits vecteurs. Le promoteur frup est utilisable pour l'expression inductible de gènes d'intérêt chez des bactéries photosynthétiques.
Description
CASSETTE DE CLONAGE ET D'EXPRESSION, VECTEURS
D'EXPRESSION ET BACTERIES TRANSFORMEES COMPRENANT LE
PROMOTEUR FRUP DE R. CAPSULATUS ; LEURS APPLICATIONS
La présente Invention est relative à un vecteur plasmidique permettant l'expression conditionnelle d'un gêne hétérologue dans une large gamme de bactérieshôtes, en particulier dans les bactéries photosynthétiques.
D'EXPRESSION ET BACTERIES TRANSFORMEES COMPRENANT LE
PROMOTEUR FRUP DE R. CAPSULATUS ; LEURS APPLICATIONS
La présente Invention est relative à un vecteur plasmidique permettant l'expression conditionnelle d'un gêne hétérologue dans une large gamme de bactérieshôtes, en particulier dans les bactéries photosynthétiques.
L'intérêt potentiel des bactéries photosynthétiques, dans divers secteurs de la biotechnologie a été souligné, Cf. par exemple une revue publiée par VIGNAIS et al. [Adv. Microbiol. Physiol., 26, 155-234, (1985)].
Les principales applications qui ont été proposées pour ces bactéries sont les suivantes
1) Conversion de l'énergie solaire en molécules riches en énergie, par exemple en H2, NH3 ou biomasse
2) Dépollution des eaux usées
3) Elimination des nitrates
4) Elimination des métaux lourds par biosorption.
1) Conversion de l'énergie solaire en molécules riches en énergie, par exemple en H2, NH3 ou biomasse
2) Dépollution des eaux usées
3) Elimination des nitrates
4) Elimination des métaux lourds par biosorption.
L'intérêt de l'emploi de bactéries photosynthétiques pourrait être encore accru en associant plusieurs de ces applications. Par exemple, la photoproduction d'hydrogène pourrait être couplée à la dépollution et à la production de biomasse pour l'alimentation animale ou à la biosorption de métaux lourds.
Dans ce cadre, un procédé de photoproduction couplé à la dénitrification a récemment été décrit, basé sur l'emploi d'une souche photosynthétique possédant une forte activité nitrate réductase [SHEN et HIRAYAMA,
J. Ferment. Bioeng., 72, 338-342, (1991)].
J. Ferment. Bioeng., 72, 338-342, (1991)].
Parmi les bactéries photosynthétiques,
Rhodobacter capsulatus est l'une des 2 ou 3 espèces les mieux étudiées au plan génétique. Elle a fait l'objet de recherches concernant des voies métaboliques variées telles que la photosynthèse, la fixation de l'azote, le métabolisme de l'hydrogène, et la fixation du gaz carbonique. Cette bactérie possède des facultés d'adaptation métabolique remarquable, qui lui permet de croître à la lumière comme à l'obscurité, et en aérobiose aussi bien qu'en anaérobiose.
Rhodobacter capsulatus est l'une des 2 ou 3 espèces les mieux étudiées au plan génétique. Elle a fait l'objet de recherches concernant des voies métaboliques variées telles que la photosynthèse, la fixation de l'azote, le métabolisme de l'hydrogène, et la fixation du gaz carbonique. Cette bactérie possède des facultés d'adaptation métabolique remarquable, qui lui permet de croître à la lumière comme à l'obscurité, et en aérobiose aussi bien qu'en anaérobiose.
R. capsulatus est l'une des bactéries les plus performantes pour ce qui est de la production d'hydrogène. Des travaux antérieurs de l'équipe des
Inventeurs ont montré que cette réaction est dépendante de la lumière et catalysée par la nitrogénase [JOUANNEAU et al., Arch. Microbiol., 139, 326-331 (1984)].
Inventeurs ont montré que cette réaction est dépendante de la lumière et catalysée par la nitrogénase [JOUANNEAU et al., Arch. Microbiol., 139, 326-331 (1984)].
En outre, cette bactérie est capable de métaboliser un grand nombre de substrats organiques (acides organiques, sucres, acides gras, etc...) et de les décomposer en H2 et CO2 avec des rendements de 60 à 90 %, ce qui a conduit à proposer son utilisation pour le traitement de déchets de l'industrie alimentaire (laiteries, sucreries, etc...).
R. capsulatus est capable de produire de l'hydrogène à partir de lactosérum, et ce bioprocédé peut être compétitif avec l'électrolyse de l'eau pour la production d'hydrogène [JOUANNEAU et al., In, HALL,
D. O. and PALZ W. (eds.) Photochemical,
Photoelectrochemical and Photobiological Process, 174-179, D. REIDEL PUBBLISH CO, Dordrecht, Boston,
London, (1982)], tout en contribuant à la dépollution.
D. O. and PALZ W. (eds.) Photochemical,
Photoelectrochemical and Photobiological Process, 174-179, D. REIDEL PUBBLISH CO, Dordrecht, Boston,
London, (1982)], tout en contribuant à la dépollution.
Ces propriétés de R. capsulatus, permettent d'envisager son utilisation dans une vaste gamme d'applications industrielles.
Il serait dans ce but particulièrement souhaitable d'accroître encore les performances de
R. capsula tus ou d'une espèce apparentée pour en étendre le champ d'application. Ceci pourrait être effectué en introduisant par génie génétique un ou plusieurs gènes dont l'expression résulte en une nouvelle fonction d'intérêt industriel.
R. capsula tus ou d'une espèce apparentée pour en étendre le champ d'application. Ceci pourrait être effectué en introduisant par génie génétique un ou plusieurs gènes dont l'expression résulte en une nouvelle fonction d'intérêt industriel.
Toutefois, bien qu'une large panoplie d'outils de génétique moléculaire [revue de SCOLNIK et MARRS, Ann.
Rev. Microbiol., 41, 703-726, (1987)] ait été développée dans le cadre des études théoriques sur le métabolisme de
R. capsulatus, il n'existe en revanche qu'un nombre très restreint de vecteurs permettant l'expression d'un gène hétérologue dans ce type de bactérie.
R. capsulatus, il n'existe en revanche qu'un nombre très restreint de vecteurs permettant l'expression d'un gène hétérologue dans ce type de bactérie.
A l'heure actuelle, seulement deux vecteurs d'expression fonctionnels dans R. capsulatus ont été décrits.
L'un d'eux, appelé pNF3, est un dérivé du plasmide pBR322 dans lequel ont été introduits, entre autres, le promoteur du gène nifH et un site de clonage multiple [POLLOCK et al., Gene, 65, 269-275, (1988)].
Le gène nifH code pour l'une des sous-unités de la nitrogénase, qui catalyse la fixation de l'azote.
Un mécanisme complexe de régulation contrôle l'expression de ce gène au niveau du promoteur et ne permet la synthèse de la nitrogénase que dans des conditions physiologiques restrictives, à savoir l'absence d'air d'une part, car l'oxygène agit comme répresseur, et d'autre part l'absence de substrat azoté (excepté N2) car ce type de substrat est également répresseur [KRANZ et
FOSTER-HARNETT, Mol. Microbiol., 4, 1793-1800, (1990)].
FOSTER-HARNETT, Mol. Microbiol., 4, 1793-1800, (1990)].
De plus, l'expression de nifH est également très dépendante de la lumière [JOUANNEAU et al., Biochim.
Biophys. Acta., 808, 149-155, (1985)]. Ainsi, bien que pNF3 permette d'exprimer efficacement des gènes, y compris des gènes eucaryotes tels qu'un cDNA de plante [BARTER et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 6532-6536, (1991)], les conditions requises pour le fonctionnement du promoteur nifHp limitent considérablement les applications potentielles de ce vecteur.
Un autre vecteur, dénommé pJAJ7/9 a été construit par insertion dans un dérivé du plasmide à large gamme d'hôtes pRK404 [DITTA et al., Plasmid, 13, 149-153, (1985)] d'un promoteur d'un gène appelé rxcA codant pour un composant du photosystème [JOHNSON et al.,
J. Bacteriol., 167, 604-610, (1986)]. Il a servi à exprimer dans R. capsula tus des gènes codant pour des cellulases.
J. Bacteriol., 167, 604-610, (1986)]. Il a servi à exprimer dans R. capsula tus des gènes codant pour des cellulases.
Toutefois, l'emploi de ce vecteur est malaisé, pour les raisons suivantes
Il s'agit d'une grosse molécule (-11 kb), présente à raison de 4 à 5 copies/bactérie seulement, et qui ne possède pas de site de clonage multiple.
Il s'agit d'une grosse molécule (-11 kb), présente à raison de 4 à 5 copies/bactérie seulement, et qui ne possède pas de site de clonage multiple.
D'autre part, le promoteur du gène rxcA n'a pas d'inducteur spécifique, et son activité n'est que partiellement régulée (par oxygène), de sorte que les possibilités de moduler l'expression génétique sont très réduites.
Enfin, les nombreux vecteurs mis au point pour d'autres bactéries-hôtes, par exemple Escherîchia colt, ne sont pas utilisables dans R. capsula tus, soit parce que ces vecteurs y sont instables, soit parce que leurs promoteurs ne sont pas reconnus.
La présente Invention a donc pour but l'obtention de vecteurs d'expression adaptés à
R. capsulatus et aux bactéries apparentées, et qui ne possèdent pas les inconvénients des vecteurs de l'Art antérieur mentionnés ci-dessus.
R. capsulatus et aux bactéries apparentées, et qui ne possèdent pas les inconvénients des vecteurs de l'Art antérieur mentionnés ci-dessus.
Pour créer de tels vecteurs, les Inventeurs ont tout d'abord entrepris la sélection d'un promoteur fort, aisément inductible, et dont l'activité soit négligeable en l'absence d'inducteur spécifique.
Les Inventeurs ont sélectionné, parmi les promoteurs inductibles de R. capsulatus, le promoteur de l'opéron fru comme candidat potentiel. Des études antérieures avaient montré que l'activité des enzymes codées par l'opéron fru, responsable de l'assimilation du fructose dans R. capsulatus, était induite d'environ 100 fois quand on ajoutait du fructose au milieu de culture [DANIELS et al., J. Bacteriol., 170, 1698-1703, (1988)].
Toutefois, on ignorait si cette induction obéissait à un mécanisme simple et était spécifiquement dépendante du fructose, ou si, comme dans le cas des promoteurs nifHp et rxcAp mentionnés ci-dessus, d'autres facteurs, plus difficiles à contrôler, intervenaient dans la régulation du promoteur frup.
Or les Inventeurs sont maintenant parvenus à isoler un fragment d'ADN portant frup et ses séquences de régulation, et à montrer que ce promoteur pouvait être régulé entièrement par la concentration de fructose dans le milieu de culture.
Ce promoteur peut ensuite être utilisé pour constituer une cassette de clonage et d'expression. Au sens de la présente Invention, on entend par cassette de clonage et d'expression une molécule d'ADN linéaire, contenant, outre le promoteur, différents éléments nécessaires au clonage du gène que l'on souhaite exprimer sous contrôle dudit promoteur.
La présente Invention a pour objet une cassette de clonage et d'expression, fonctionnelle chez
R. capsulatus, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que constituants essentiels
- un fragment d'ADN (a) comprenant le promoteur frup de R. capsula tus pourvu de ses séquences de régulation ; et en aval dudit promoteur,
- un fragment d'ADN (b) comprenant au moins un site de restriction et permettant le clonage d'un gène sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
R. capsulatus, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que constituants essentiels
- un fragment d'ADN (a) comprenant le promoteur frup de R. capsula tus pourvu de ses séquences de régulation ; et en aval dudit promoteur,
- un fragment d'ADN (b) comprenant au moins un site de restriction et permettant le clonage d'un gène sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, le fragment d'ADN (a) est un fragment de 660 pb, délimité en 3' par un site Ea8I et en 5' par un site XLQI.
Ce fragment NhQI-XQ I comprend 657 pb de séquence 5' non codante située en aval du codon d'initiation GTG du gène fruB, ainsi que deux des trois premières pb de la séquence codante dudit gène (le codon d'initiation GTG de fruB est remplacé par un ATG). Le gène fruB, qui est le premier gène de l'opéron fru de
R. capsulatus, a été cloné et séquencé par WU et al., [J.
R. capsulatus, a été cloné et séquencé par WU et al., [J.
Mol. Biol., 213, 687-703, (1990)].
Avantageusement, le fragment d'ADN (b) est un lieur multisite.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ladite cassette comprend en outre au moins un gène marqueur.
On entend par "gène marqueur" un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. I1 s'agit par exemple d'un gène conférant la résistance à un antibiotique.
La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Ces vecteurs résultent de l'insertion de ladite cassette dans un vecteur support.
Un vecteur recombinant conforme à l'invention est représenté par le plasmide pFRK-I. Une souche d'Escherichia coli DHSa dénommée ECYJ101, et contenant ce plasmide pFRK-I a été déposée le 30 Septembre 1993 auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) tenue par l'institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, sous le numéro de dépôt I-1367.
Les cassettes d'expression conformes à l'invention sont compatibles avec un grande variété de vecteurs supports. Le choix d'un vecteur support est guidé par celui de la bactérie-hôte et de l'utilisation envisagée.
Avantageusement, on choisira un vecteur support à large gamme d'hôtes ce qui permet d'obtenir un système d'une grande souplesse d'utilisation. Des vec teurs supports particulièrement appropriés sont par exemple le plasmide pBR322 et ses dérivés [BALBAS et al.,
Gene, 50, 3-40, (1986)] ; le plasmide RSF1010 [SCHOLZ et al. Gene, 75, 271-288, (1989)] et ses dérivés, tels que pKT231 [BAGDASARIAN et al., Gene, 16, 237-247, (1981)] le plasmide pRK290 et ses dérivés, dont pRK404 [DITTA et al., Plasmid, 13, 149-153, (1985)].
Gene, 50, 3-40, (1986)] ; le plasmide RSF1010 [SCHOLZ et al. Gene, 75, 271-288, (1989)] et ses dérivés, tels que pKT231 [BAGDASARIAN et al., Gene, 16, 237-247, (1981)] le plasmide pRK290 et ses dérivés, dont pRK404 [DITTA et al., Plasmid, 13, 149-153, (1985)].
L'Invention englobe également des bactéries transformées, comprenant au moins un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Ces bactéries transformées peuvent appartenir à n'importe quelle espèce permettant la réplication du vecteur support choisi.
Avantageusement, il s'agit de bactéries photosynthétiques : non seulement R. capsulatus, mais également toute autre espèce apparentée telle que Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, ainsi que les espèces bactériennes citées dans la revue de DILLS et al., [Microbiol. Rev., 44, 385-418, (1980)].
La cassette de clonage et d'expression conforme à l'invention et les vecteurs d'expression qui la comprennent représentent un nouvel outil permettant l'expression de gènes d'intérêt dans ces bactéries transformée.
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation du promoteur frup de R. capsulatus pour l'expression d'un gène hétérologue.
Au sens de la présente Invention on entend par "gène hétérologue" un gène qui n'est pas naturellement exprimé dans R. capsulatus sous contrôle dudit promoteur frup.
Le système d'expression conforme à 1'Invention permet, contrairement aux systèmes d'expression dans
R. capsulatus connus dans l'Art antérieur, une commutation aisée entre des conditions d'expression permissives (en présence de fructose), et non permissives (sans fructose).
R. capsulatus connus dans l'Art antérieur, une commutation aisée entre des conditions d'expression permissives (en présence de fructose), et non permissives (sans fructose).
Il permet d'élargir les possibilités d'application des bactéries photosynthétiques, et en particulier de les utiliser dans le cadre de bioprocédés de dépollution, visant à la protection de l'environnement.
Par exemple, des bactéries recombinantes conformes à l'invention, exprimant un ou plusieurs gènes dont le produit participe à la biodégradation de molécules toxiques particulièrement résistantes, peuvent être utilisées dans ce but.
C'est ainsi que des vecteurs conformes à l'invention peuvent être utilisés pour construire des bactéries recombinantes exprimant, sous contrôle du promoteur inductible frup, des monoxygénases comme les hydroxylases à flavine, les cytochromes de type P-450 et les dioxygénases, qui participent à la dégradation ou la transformation de substances xénobiotiques, comme des composés aromatiques mono- et polycycliques.
En particulier, des bactéries photosynthétiques conformes à l'invention, porteuses d'un gène de cytochrome P450 sous contrôle du promoteur inductible frup, peuvent être utilisées dans un procédé de biodégradation de substances aromatiques.
Un cytochrome P-450 de Streptomyces griseus, appelé P450soyS utilise des substrats aromatiques variés tels que l'aniline, le diphényle, le benzène, le benzopyrène, le toluène, le naphtalène, etc ... Le gène soyC codant pour ce cytochrome P45Os0y a récemment été cloné et séquencé [TROWER et al., Mol. Microbiol., 6, 2125-2134, (1992)].
Ce gène soyC peut être exprimé dans
R. capsulatus, en utilisant le système d'expression conforme à l'invention.
R. capsulatus, en utilisant le système d'expression conforme à l'invention.
En outre, les cytochromes P450 des procaryotes ne sont fonctionnels que dans le cadre d'une chaîne de transport d'électrons comprenant deux autres protéines, une ferrédoxine et une ferrédoxine-réductase, qui fournissent les électrons nécessaires à la réduction de l'oxygène moléculaire. Or, Les Inventeurs ont identifié 6 ferrédoxines différentes dans R. capsulatus ; l'une de ces ferrédoxines (FdII) est d'ailleurs très semblable à une 7Fe ferrédoxine de S. griseus, qui sert de donneur d'électrons au cytochrome P450. Une autre ferrédoxine (FdVI) de R. capsulatus, découverte récemment par l'équipe des Inventeurs, est structuralement très proche de la putidorédoxine, donneur d'électrons du cytochrome P450Cam de Pseudomonas putida. Ceci garantit le fonctionnement correct du cytochrome P450s0y dans R. capsula tus.
Des bactéries recombinantes conformes à l'invention peuvent également exprimer, sous contrôle du promoteur inductible frup, des enzymes oxydatives (ligninases, cellulases) s'attaquant à des polymères organiques d'origine biologique (lignine, cellulose) ou chimique (déchets industriels).
Ce type d'enzymes catalyse aussi des réactions stéréo- ou régio-spécifiques et peut servir de biocatalyseur dans des procédés technologiques variés [pour revue, voir SARIASLANI, Crit. Rev. Biotechnol., 9, 171-257, (1989)].
Des bactéries transformées conformes à l'invention sont également utilisables pour la détection et le dosage spécifiques du fructose dans des milieux complexes.
Dans ce but, les Inventeurs ont construit des gènes chimériques en placant le gène rapporteur lacZ sous contrôle de frup, et les ont introduits dans
R. capsulatus. Les bactéries transformées sont ensuite cultivées sur un milieu dont on souhaite connaître la teneur en fructose.
R. capsulatus. Les bactéries transformées sont ensuite cultivées sur un milieu dont on souhaite connaître la teneur en fructose.
Cette construction permet par simple dosage de l'activité B-galactosidase, la détection spécifique du fructose, et ce jusqu'à des concentrations de l'ordre de -6 M.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de vecteurs recombinants conformes à l'invention, et de leur utilisation pour l'expression de gènes hétérologues dans R. capsula tus.
I1 va de soi toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
IxHMPLH i
Un fragment XhoI-PstI de 0,98 kb portant frup ainsi que l'extrémité 5' de la séquence codante du gène fruB a été obtenu à partir du plasmide p245, qui contient l'opéron fruBKA ; p245 est un dérivé du vecteur pBluescrip SK+, dans lequel a été cloné le fragment SstI-HindIII de 6,7 kg contenant cet opéron, comme cela a été décrit par WU et al. [J. Mol. Biol. 213, 687-703, (1990)]. Ce fragment XhnI-PstI a été sous-cloné dans les sites SalI et PstI de pUC18 [YANISCH-PERRON et al., Gene, 33, 103-119, (1985)]. Le plasmide obtenu est dénommé pCD37.
Un fragment XhoI-PstI de 0,98 kb portant frup ainsi que l'extrémité 5' de la séquence codante du gène fruB a été obtenu à partir du plasmide p245, qui contient l'opéron fruBKA ; p245 est un dérivé du vecteur pBluescrip SK+, dans lequel a été cloné le fragment SstI-HindIII de 6,7 kg contenant cet opéron, comme cela a été décrit par WU et al. [J. Mol. Biol. 213, 687-703, (1990)]. Ce fragment XhnI-PstI a été sous-cloné dans les sites SalI et PstI de pUC18 [YANISCH-PERRON et al., Gene, 33, 103-119, (1985)]. Le plasmide obtenu est dénommé pCD37.
L'extrémité du gène fruB a ensuite été éliminée comme suit
Un fragment d'ADN de 215 pb correspondant à la région immédiatement en amont de fruB a été synthétisé par PCR, en utilisant les amorces suivantes
5'-GCAACTCTGCCCCATGG-3' et 5' -ggcctgcagcatatgCCTCCTCGGCATCGGATGTG-3'
Le plasmide pCD37 a servi de matrice, et les lettres capitales indiquent les bases complémentaires de la matrice. L'une des amorces possède une portion, indiquée en lettres minuscules, ne s'appariant pas avec la matrice, et permettant d'introduire les sites NdeI et PstI à l'éxtrémité du fragment de PCR. La seconde amorce s'apparie à une séquence située 216 pb en amont du codon d'initiation de fruB.
Un fragment d'ADN de 215 pb correspondant à la région immédiatement en amont de fruB a été synthétisé par PCR, en utilisant les amorces suivantes
5'-GCAACTCTGCCCCATGG-3' et 5' -ggcctgcagcatatgCCTCCTCGGCATCGGATGTG-3'
Le plasmide pCD37 a servi de matrice, et les lettres capitales indiquent les bases complémentaires de la matrice. L'une des amorces possède une portion, indiquée en lettres minuscules, ne s'appariant pas avec la matrice, et permettant d'introduire les sites NdeI et PstI à l'éxtrémité du fragment de PCR. La seconde amorce s'apparie à une séquence située 216 pb en amont du codon d'initiation de fruB.
Le fragment de PCR a ensuite été digéré par
XhOI et PstI et le fragment de 145 pb obtenu a été inséré à la place du fragment XhoI-PstI de 0,5 kb de pCD37, ce qui a généré le plasmide pCD39. Par cette construction, le promoteur frup est fusionné au codon ATG du site NdeI, qui remplace le codon d'initiation GTG de fruB.
XhOI et PstI et le fragment de 145 pb obtenu a été inséré à la place du fragment XhoI-PstI de 0,5 kb de pCD37, ce qui a généré le plasmide pCD39. Par cette construction, le promoteur frup est fusionné au codon ATG du site NdeI, qui remplace le codon d'initiation GTG de fruB.
Les étapes de cette construction sont illustrées par la Figure 1 qui représente la carte du plasmide p245, et celles des plasmides dérivés pCD37 et pCD39.
Les sites de restrictions reportés sont
H, HindIII ; K, i ; N, i ; P, i ; S, XEhI
X, XhQI-
Lors d'une troisième étape (représentée aux
Figures 2a et 2b), un fragment EcoRI-HindIII de 2,9 kb isolé de pWKR189 [MORENO-VIVIAN et al., Mol. Gen. Genet., 216, 353-363, (1989)] et portant le gène de résistance à la gentamicine, a été cloné aux sites correspondants de pCD39, donnant le plasmide dénommé pCD40. Un dérivé de pCD40, dont les sites E=QRI et EmHI ont été successivement délétés par clivage suivi d'une digestion par la DNA polymérase I et d'une ligation à bouts francs, a été construit et appelé pCD41 (Figure 2a).
H, HindIII ; K, i ; N, i ; P, i ; S, XEhI
X, XhQI-
Lors d'une troisième étape (représentée aux
Figures 2a et 2b), un fragment EcoRI-HindIII de 2,9 kb isolé de pWKR189 [MORENO-VIVIAN et al., Mol. Gen. Genet., 216, 353-363, (1989)] et portant le gène de résistance à la gentamicine, a été cloné aux sites correspondants de pCD39, donnant le plasmide dénommé pCD40. Un dérivé de pCD40, dont les sites E=QRI et EmHI ont été successivement délétés par clivage suivi d'une digestion par la DNA polymérase I et d'une ligation à bouts francs, a été construit et appelé pCD41 (Figure 2a).
La réalisation de la cassette de clonage a été complétée par l'insertion de sites de clonage multiples en aval du promoteur frup (Figure 2b). Pour ce faire, le fragment HindIII de pCD41, d'environ 3,57 kb, a été inséré dans le plasmide pUC19, dérivé de pUC19 dont on a délété un fragment NdeI-SphI DE 260 pb. Le plasmide obtenu, dénommé pCD46, a un site unique NdeI contenant un codon d'initiation de la traduction ATG, ce dernier étant localisé en aval de frup et à une distance idéale de ce promoteur. Le site NdeI a été choisi pour introduire une séquence lieur multisite ainsi qu'un fragment de EssmHI de 1,7 kb issu de pUC4-KIXX [BARANY, Gene, 37, 111-123, (1985)], et porteur des gènes de réistance à la kanamycine (Kmr) et à la bléomycine (Bler).
Cette dernière phase de la construction comporte trois étapes
1) L'insertion d'un lieur multisite I-PI, dont la séquence est indiquée sur la Figure 2b, dans les sites correspondant de pUC19, ce qui donne le plasmide pUC19L.
1) L'insertion d'un lieur multisite I-PI, dont la séquence est indiquée sur la Figure 2b, dans les sites correspondant de pUC19, ce qui donne le plasmide pUC19L.
2) L'insertion d'un fragment BamHI de 1,7 kb porteur des marqueurs Kmr et Bler dans le site correspondant de pUC19L, ce qui donne le plasmide intermédiaire pUC19KI.
3) Enfin, l'insertion du fragment NedI-aEhI de 1,7 kb, obtenu par digestion partielle de pUC19KI, dans les sites correspondant de pCD46. Comme pCD46 possède 2 sites XEhI, deux vecteurs en résultent, dénommés pFRK-I et pFRK-II.
Le plasmide pFRK-II peut être obtenu à partir de pFRK-I de la manière suivante : pFRK-I est digéré partiellement par SDhI de façon à en isoler 2 fragments complémentaires de 3,15 kb et de 3,95 kb. Par ligation de ces 2 fragments, on obtient à parts égales, pFRK-II et pFRK-I.
Les plasmides pFRK-I et pFRK-II sont représentés à la Figure 3 : ils possèdent tous deux une cassette de clonage et d'expression portée par un fragment HindIII de 4,7 kb et possédant les trois éléments suivants : le promoteur inductible frup, un segment Km/Ble flanqué de 8 sites de clonage, et enfin le gène marqueur de résistance à la gentamicine (GmR).
Amp et plac désignent respectivement, le gène de résistance à l'ampicilline et le promoteur lac provenant de pUC18.
Pour exprimer un gène X dans R. capsulatus, on l'insère d'abord à la place du segment KmR/BleR, puis dans une seconde étape, on isole le fragment HindIII portant la cassette de clonage et d'expression et on l'introduit dans le vecteur support choisi. Le vecteur recombinant contenant la cassette de clonage et d'expression conforme à l'invention est aisément sélectionné grâce au marqueur GmR et peut être introduit dans
R. capsulatus ou une autre bactérie-hôte par conjugaison.
R. capsulatus ou une autre bactérie-hôte par conjugaison.
EXEMPLE a: - Expression d'un gène hétérologue dans
R. capsulatus: gène lacZ
Le gène lacZ de E. coli a été obtenu à partir des plasmides pPHU234 et pPHU235 [HUBNER et al., J.
R. capsulatus: gène lacZ
Le gène lacZ de E. coli a été obtenu à partir des plasmides pPHU234 et pPHU235 [HUBNER et al., J.
Bacteriol., 173, 2993-2999, (1991)]. Les copies de lacZ portées par ces plasmides n'ont pas de codon d'initiation et sont précédées par plusieurs sites de restriction. La seule différence entre pPHU234 et pPHU235 est un écart de 2 paires de bases de la distance séparant les sites de restriction du début de lacZ.
Une copie de lacZ provenant de pPHU240 (fragment HindIII-SalI de de 3,2 kb de pPHU235 ) a été introduite après digestion des extrémités par 1'ADN polymérase de Klenow, dans le site SmaI de pUC18, ce qui a donné le plasmide intermédiaire pUC40. Le fragment EamHI-EcoRI de pUC40 portant lacZ a été inséré entre les sites correspondants de pFRK-II. La séquence codante de lacZ est alors en phase avec le codon d'initiation ATG présent dans le site EgI de pFRK-II. Le plasmide obtenu de la sorte, dénommé pFRGal-2, possède ainsi un gène de fusion lacZ fonctionnel.
En guise de contrôle, la même construction a été effectuée avec la copie de lacZ obtenue à partir de pPHU234. Le plasmide pFRGal-1 obtenu de la sorte, possède un gène de fusion lacZ non fonctionnel, l'ATG de NdeI étant déphasé par rapport à la séquence de lacZ.
La Figure 4 représente la carte des plasmides pFRGal-1 et pFRGal-2:
L'expression de lacZ dans R. capsulatus a été obtenue avec le plasmide pFRGal-4, obtenu par clonage du fragment HindIII de 6,2 kb de pFRGal-2 dans pRK404 [DITTA et al., Plasmid, 13, 149-153 (1985)].
L'expression de lacZ dans R. capsulatus a été obtenue avec le plasmide pFRGal-4, obtenu par clonage du fragment HindIII de 6,2 kb de pFRGal-2 dans pRK404 [DITTA et al., Plasmid, 13, 149-153 (1985)].
Le plasmide pFRGal-3 issu du clonage du fragment HindIII de pFRGal-l dans pRK404 possède une copie non fonctionnelle de lacZ et a servi de contrôle négatif dans les dosages de B-gal.
Ces plasmides ont alors été introduits par conjugaison dans R. capsulatus selon le protocole décrit par WILLISON et al. [J. Gen, Microbiol., 131, 3001-3015, (1985)]
Des cultures des souches portant les plasmides pFRGal-3 et pFRGal-4 ont été incubées à la lumière dans un milieu minéral RCV [WEAVER et al., Arch. Microbiol., 105, 207-216, (1975)], additionné de DL-lactate (20 mM), et de tétracycline (0,5 mg/l), jusqu'à ce qu'elles atteignent la phase exponentielle de croissance (DO660 = 0,86). A ce moment, pour chacun des plasmides, la moitié des cultures transformées a reçu du fructose, 11 mM (g) et 1autre non (O).
Des cultures des souches portant les plasmides pFRGal-3 et pFRGal-4 ont été incubées à la lumière dans un milieu minéral RCV [WEAVER et al., Arch. Microbiol., 105, 207-216, (1975)], additionné de DL-lactate (20 mM), et de tétracycline (0,5 mg/l), jusqu'à ce qu'elles atteignent la phase exponentielle de croissance (DO660 = 0,86). A ce moment, pour chacun des plasmides, la moitié des cultures transformées a reçu du fructose, 11 mM (g) et 1autre non (O).
L'activité B-gal a été dosée comme décrit par
DUPORT et al. [Mol. Gen. Genet., 231, 323-328, (1992)].
DUPORT et al. [Mol. Gen. Genet., 231, 323-328, (1992)].
Dans les conditions de culture décrites ci-dessus, R. capsula tus portant pFRGal-4 présente une activité B-gal comprise entre 600 et 1500 U/mg protéine alors que la souche contrôle portant pFRGal-3 n'a pas d'activité appréciable ( < 10 U/mg protéine).
Comme le montre la figure 5, l'activité B-gal est strictement fructose-dépendante. L'adjonction du fructose déclenche l'apparition de l'activité B-gal avec un temps de réponse rapide puisque l'activité atteint 508 du maximum en 30 mn environ.
Des expériences d'induction en fonction de la concentration de fructose ont également été effectuées une culture a été incubée comme décrit ci-dessus. Puis des fractions de 1 ml de cette culture ont été incubées pendant une heure avec des concentrations variables de fructose. L'activité B-gal a alors été dosée.
Les résultats sont représentés à la Figure 6.
L'activité B-gal figure en ordonnée en % de l'activité maximale ; la concentration en fructose est en abscisse.
Ces expériences montrent que frup est activé et sensible à des concentrations en fructose de l'ordre de 10-6 M.
Des expériences d'induction réalisées en parallèle avec du glucose montrent que ce sucre est également capable d'induire l'expression de frup-lacZ, mais avec une efficacité moindre.
EXEMPLE 3 : Détection du fructose dans des milieux complexes
Cette détection a été effectuée de deux manières différentes, en utilisant des bactéries
R. capsulatus transformées par le vecteur pFRGal-4.
Cette détection a été effectuée de deux manières différentes, en utilisant des bactéries
R. capsulatus transformées par le vecteur pFRGal-4.
1) Détection sur boîtes de milieu gélosé.
Ce test comporte 3 étapes
a) On étale la substance ou le mélange complexe à analyser sur boîte de milieu minéral RCV gélosé [WEAVER et al., Arch. Microbiol., 105, 207-216 (1975)] apte à la croissance de R. capsulatus, et contenant du 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-ss-D-galactopyrano- side (X-Gal) qui est un analogue chromogénique du lactose.
b) On étale ensuite un inoculat (104 bactéries/ml) de bactéries R. capsulatus, cultivées sur milieu minéral RCV, et portant pFRGal-4.
c) Après croissance des bactéries, on procède à la lecture du résultat. Les colonies sont bleues si le mélange à analyser contient du fructose, rouges dans le cas contraire.
a) On étale la substance ou le mélange complexe à analyser sur boîte de milieu minéral RCV gélosé [WEAVER et al., Arch. Microbiol., 105, 207-216 (1975)] apte à la croissance de R. capsulatus, et contenant du 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-ss-D-galactopyrano- side (X-Gal) qui est un analogue chromogénique du lactose.
b) On étale ensuite un inoculat (104 bactéries/ml) de bactéries R. capsulatus, cultivées sur milieu minéral RCV, et portant pFRGal-4.
c) Après croissance des bactéries, on procède à la lecture du résultat. Les colonies sont bleues si le mélange à analyser contient du fructose, rouges dans le cas contraire.
Un test plus quantitatif peut être effectué de la manière suivante : on dépose au centre de la boîte de milieu gélosé une goutte de l'échantillon à analyser et on laisse diffuser de manière radiale dans la gélose, ce qui crée un gradient de concentration.
Après les étapes b) et c) réalisées comme cidessus, on peut apprécier la concentration de fructose de l'échantillon, en mesurant la distance radiale à laquelle les bactéries passent du bleu au rouge.
2) Détection sur plaques de microtitration
Dans ce test, l'activité B-gal est dosée à l'aide d'un autre analogue chromogénique du lactose, l'o-nitrophényl-ss-D-galactoside (ONPG), effectuant les étapes suivantes
a) les échantillons à analyser sont distribués dans des plaques de microtitration à 96 puits
b) On ajoute un volume de culture (milieu minéral RCV 109 à 1010 bactéries/ml) de R. capsula tus (pFRGal-4) dans chaque puits et on procéde à l'incubation pendant 1h à 30C
c) Les bactéries sont perméabilisées par ajout de toluène (1/100 en volume)
d) On ajoute le tampon de réaction et le substrat (ONPG) de la B-gal, et l'on procède à l'incubation 15 mn à 30C
e) La réaction enzymatique est arrétée par ajout de carbonate de sodium
f) L'activité B-gal est déterminée par lecture de l'absorption à 420 nm.
Dans ce test, l'activité B-gal est dosée à l'aide d'un autre analogue chromogénique du lactose, l'o-nitrophényl-ss-D-galactoside (ONPG), effectuant les étapes suivantes
a) les échantillons à analyser sont distribués dans des plaques de microtitration à 96 puits
b) On ajoute un volume de culture (milieu minéral RCV 109 à 1010 bactéries/ml) de R. capsula tus (pFRGal-4) dans chaque puits et on procéde à l'incubation pendant 1h à 30C
c) Les bactéries sont perméabilisées par ajout de toluène (1/100 en volume)
d) On ajoute le tampon de réaction et le substrat (ONPG) de la B-gal, et l'on procède à l'incubation 15 mn à 30C
e) La réaction enzymatique est arrétée par ajout de carbonate de sodium
f) L'activité B-gal est déterminée par lecture de l'absorption à 420 nm.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'
Claims (16)
1) Cassette de clonage et d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que constituants essentiels
- un fragment d'ADN (a) comprenant le promoteur frup de R. capsulatus, pourvu de ses séquences de régulation par le fructose ; et en aval dudit promoteur,
- un fragment d'ADN (b) comprenant au moins un site de restriction.
2) Cassette de clonage et d'expression, selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fragment d'ADN (a) est constitué par un fragment XhoI-NdeI de 660 pb.
3) Cassette de clonage et d'expression, selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le fragment d'ADN (b) est un lieur multisite.
4) Cassette de clonage et d'expression, selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un gène marqueur.
5) Cassette de clonage et d'expression, selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée par le fragment HindIII de 4,7kb du plasmide pFRK-I.
6) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette de clonage et d'expression selon une quelconque des revendications 1 à 5.
7) Vecteur recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pFRK-I, déposé le 30 Septembre 1993 auprès de la CNCM sous le numéro de dépôt I-1367.
8) Bactérie transformée, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7.
9) Bactérie transformée selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie photosynthétique.
10) Bactérie transformée selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle appartient à l'espèce
R. capsulatus.
11) Utilisation du promoteur frup de R. capsulatus pour contrôler l'expression d'un gène hétérologue.
12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit gène est choisi dans le groupe constitué par les gènes codant pour les hydroxylases à flavine, les cytochromes de type P-450 et les dioxygénases.
13) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit gène est choisi dans le groupe constitué par les gènes codant pour des ligninases, et des cellulases.
14) Utilisation d'une bactérie transformée selon une quelconque des revendications 7 à 10, et exprimant un gène codant pour un cytochrome P450 sous contrôle du promoteur frup de R. capsulatus, pour la biodégradation de substances aromatiques.
15) Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le gène exprimé sous contrôle du promoteur frup de R. capsulatus est le gène soyC de Streptomyces griseus.
16) Utilisation d'une bactérie transformée selon une quelconque des revendications 7 à 10, et exprimant un gène lacZ de E. coli sous contrôle du promoteur frup de R. capsulatus, pour la détection et le dosage du fructose dans des milieux complexes.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9313559A FR2712604B1 (fr) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | Cassette de clonage et d'expression, vecteurs d'expression et bactéries transformées comprenant le promoteur Frup de R. Capsulatus; leurs applications. |
| EP95901485A EP0730654A1 (fr) | 1993-11-15 | 1994-11-15 | CASSETTE DE CLONAGE ET D'EXPRESSION, VECTEURS D'EXPRESSION ET BACTERIES TRANSFORMEES COMPRENANT LE PROMOTEUR $i(FRUP) DE $i(R. CAPSULATUS); LEURS APPLICATIONS |
| PCT/FR1994/001326 WO1995014097A1 (fr) | 1993-11-15 | 1994-11-15 | Cassette de clonage et d'expression, vecteurs d'expression et bacteries transformees comprenant le promoteur frup de r. capsulatus; leurs applications |
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| FR9313559A FR2712604B1 (fr) | 1993-11-15 | 1993-11-15 | Cassette de clonage et d'expression, vecteurs d'expression et bactéries transformées comprenant le promoteur Frup de R. Capsulatus; leurs applications. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2712604A1 true FR2712604A1 (fr) | 1995-05-24 |
| FR2712604B1 FR2712604B1 (fr) | 1996-02-02 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0730654A1 (fr) |
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| WO (1) | WO1995014097A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2854886A1 (fr) * | 2003-05-14 | 2004-11-19 | Commissariat Energie Atomique | Procede de degradation du tbp par une souche bacterienne photosynthetique |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991005054A1 (fr) * | 1989-09-29 | 1991-04-18 | Advanced Technologies (Cambridge) Ltd. | Promoteur de plantes a activation par la lumiere |
-
1993
- 1993-11-15 FR FR9313559A patent/FR2712604B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-11-15 WO PCT/FR1994/001326 patent/WO1995014097A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1994-11-15 EP EP95901485A patent/EP0730654A1/fr not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991005054A1 (fr) * | 1989-09-29 | 1991-04-18 | Advanced Technologies (Cambridge) Ltd. | Promoteur de plantes a activation par la lumiere |
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| POLLOCK, D. ET AL.: "Transcription of the Rhodobacter capsulatus nifHDK operon is modulated by the nitrogen source. Construction of plasmid expression vectors based on the nifHDK promoter", GENE, vol. 65, 1988, AMSTERDAM NL, pages 269 - 275 * |
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| FR2854886A1 (fr) * | 2003-05-14 | 2004-11-19 | Commissariat Energie Atomique | Procede de degradation du tbp par une souche bacterienne photosynthetique |
| WO2004101449A2 (fr) * | 2003-05-14 | 2004-11-25 | Commissariat A L'energie Atomique | Procede de degradation du tbp par une souche bacterienne photosynthetique. |
| WO2004101449A3 (fr) * | 2003-05-14 | 2005-02-03 | Commissariat Energie Atomique | Procede de degradation du tbp par une souche bacterienne photosynthetique. |
| US9029127B2 (en) | 2003-05-14 | 2015-05-12 | Commissariat A L'energie Atomique | Method of degrading TBP using a photosynthetic bacterial strain |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0730654A1 (fr) | 1996-09-11 |
| FR2712604B1 (fr) | 1996-02-02 |
| WO1995014097A1 (fr) | 1995-05-26 |
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