CN103393831A - 一种治疗血管性痴呆症的中药组合物及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗血管性痴呆症的中药组合物，所述中药组合物由下列重量配比的中药原料制成：制首乌400g-600g熟地黄400g-600g山茱萸300g-400g仙灵脾1200g-1500g锁阳300g-400g。本发明人将上述中药组合物进行了对反复脑缺血再灌注致血管性痴呆模型小鼠的影响试验，结果提示：反复脑缺血再灌注合并失血能够造成小鼠的学习记忆能力下降，本发明中药组合物能够改善类VD大鼠学习记忆能力，能够增强模型小鼠脑内ChAT活性、降低AChE活性，增加ACh含量，能够降低模型小鼠脑内SOD含量，增加SOD、GSHpx含量。因此，本发明中药组合物可用于制备治疗血管性痴呆症药物。本发明所用原料来源广泛，制备方法简单，适于工业化生产。临床应用时直接冲服、使用方便，有较大的临床应用价值和社会效益。

Description

一种治疗血管性痴呆症的中药组合物及其制备与应用

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及中药组合物，尤其涉及一种治疗血管性痴呆症的中药组合物及其制备与应用。

背景技术

血管性痴呆是由于急性或慢性脑血管病变引起的持续性脑功能障碍而产生的全面认知功能障碍，是以语言、记忆、视空间技能、情感、人格和计算力等认知功能受损的痴呆综合征，它以血管或循环病理引起的脑血管疾病作为唯一或主要的痴呆原因。中国血管性痴呆的患病率约为1.1%～8.8%，对血管性痴呆的干预治疗对减轻由脑血管病引起的社会负担有重要意义。目前临床上针对血管性痴呆的治疗措施除康复训练外，主要的治疗药物有多奈哌齐、尼莫地平、加兰他敏等。但经过大规模前瞻性临床试验的是多奈哌齐和尼莫地平。Wilkinson等的一项针对多奈哌齐在常染色体显性遗传病合并皮质下梗死和白质脑病的疗效和安全性观察的随机对照双盲试验中发现，多奈哌齐对患者执行功能有一定的改善作用（参考文献：Wilkinson D，Doody R，Helme R，et al.Donepezil in vasculardementia：a randomized placebo-controlled study[J].Neurology，2003，61(4)：479-486.），其最常见的不良反应主要是胆碱能性质的，包括恶心、腹泻、失眠、呕吐、肌痉挛、疲乏和厌食。Pantoni等的一项随机对照双盲研究资料表明，尼莫地平对皮质下痴呆型的血管性痴呆的改善有一定的作用（参考文献：Pantoni L，del Ser T，Soglian AG，et al.Efficacy and safety ofnimodipinein subcortical vascular dementia:a randomized placebocon-trolled trial［J］.Stroke，2005，36(3):619-624.），其常见的副作用为偶见面红、头晕、皮肤瘙痒、口唇麻木、皮疹等症状。这些药物对于血管性痴呆的治疗，以改善症状为主，但不能延缓病情的进展；对于采用中药治疗也有研究，但是多味药物混合煎煮，质量不稳定，并且尚无有效控制手段，因此，期待开发疗效好副作用小的中药治疗药。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计治疗血管性痴呆症的中药组合物。

本发明提供了一种治疗血管性痴呆症的中药组合物（戴蒙开颗粒），所述中药组合物由各中药原料按下列重量配比制成：

制首乌400g-600g熟地黄400g-600g山茱萸300g-400g仙灵脾1200g-1500g锁阳300g-400g。

优选的，本发明中药组合物由各中药原料按下列重量配比制成：

制首乌600g熟地黄400g山茱萸400g仙灵脾1200g锁阳400g。

本发明的中药组合物中制首乌的功效：补益精血，养肝安神，强筋骨，固肾乌须；熟地黄的功效：补血滋润；益精填髓；山茱萸的功效：补益肝肾，涩精固脱；仙灵脾的功效：补肾阳，强筋骨；锁阳的功效：补肾固精，强阴益髓；熟地为君药，补肾、益精、填髓；首乌、锁阳为臣药，育阴潜阳，强阴安神；山茱萸为佐药，以补肾气、添精髓；仙灵脾为使药，走肾经引导诸药直达病所。本发明的中药组合物为滋阴潜阳，补肾益精，填髓补脑。

本发明的另一目的是提供了上述一种治疗血管性痴呆症的中药组合物的制备方法，该方法为：

制首乌、熟地黄、山茱萸、仙灵脾和锁阳五味中药混合，每次加中药总重量10倍重量量水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，减压浓缩（70℃-80℃）至相对密度为1.20～1.25（80℃测）的清膏，放冷，加95%乙醇使含醇量为60%，静置12小时；上清液回收乙醇至无醇味，减压浓缩（70℃-80℃）至相对密度为1.25～1.30（80℃测）的清膏，减压干燥(60℃～70℃，真空度≥0.08)，将清膏粉碎成细粉（60目），加入等量糊精，制粒，铝箔袋分装，12.5g/袋，密封，即得。

本发明的又一目的是提供了上述中药组合物在制备治疗血管性痴呆症药物中的应用。

本发明人将上述中药组合物进行了对反复脑缺血再灌注致血管性痴呆模型小鼠的影响试验，选择体重为20±2g的KM小鼠，采用反复脑缺血再灌注合并失血法建立血管性痴呆模型；设置空白对照组、模型组、本发明中药组合物小剂量组（简称小剂量组）、本发明中药组合物中剂量组（简称中剂量组）、本发明中药组合物大剂量组（简称大剂量组）、西药组；观察本发明中药组合物对模型小鼠学习记忆能力，及脑内胆碱能系统（AChE、ChAT、ACh）及抗氧化能力（MDA、SOD、GSHpx）的影响。结果显示：与空白组比较，模型组的潜伏期均有延长，在第四天，第五天差异有统计学意义（P<0.05），模型组的平台穿越次数减少具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，中、大剂量组在第四天，小剂量组、西药组（多奈哌齐）在第五天的潜伏期缩短，有统计学意义（P<0.01，P<0.05）,其余剂量组则呈现潜伏期缩短趋势；各剂量本发明中药组合物及多奈哌齐均能增加小鼠的平台穿越次数，具有统计学意义（P<0.05）。结果提示：反复脑缺血再灌注合并失血能够造成小鼠的学习记忆能力下降，本发明中药组合物能够改善类VD大鼠学习记忆能力，能够增强模型小鼠脑内ChAT活性、降低AChE活性，增加ACh含量，能够降低模型小鼠脑内SOD含量，增加SOD、GSHpx含量。

因此，本发明中药组合物可用于制备治疗血管性痴呆症药物。

本发明所述中药组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成的口服制剂。

本发明所述中药组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成的口服颗粒剂。

所述中药组合物中作为活性成分的各中药原料为下列重量配比：

制首乌400g-600g熟地黄400g-600g山茱萸300g-400g仙灵脾1200g-1500g锁阳300g-400g。

优选的，本发明所述中药组合物中作为活性成分的各中药原料为下列重量配比：

制首乌600g熟地黄400g山茱萸400g仙灵脾1200g锁阳400g。

本发明中药组合物使用时，用开水冲服，每次12.5g，1日2次。1日服用量相当于药材75g（其中淫羊藿30g，制首乌15g山茱萸10g锁阳10g熟地黄10g）和糊精12.5g。每12周为一疗程。

本发明所用原料均为常见常用药材，来源广泛。制备方法简单，适于工业化生产。临床应用时直接冲服、使用方便，中药颗粒采用铝箔袋包装不易吸潮，利于携带和储存。本发明为治疗血管性痴呆提供了新的中药治疗方向，有较大的临床应用价值和社会效益。

具体实施方式

实施例1制备本发明中药组合物（戴蒙开颗粒）

淫羊藿：上海康桥中药饮片厂

制首乌：上海康桥中药饮片厂

山茱萸：上海徐汇中药饮片厂

熟地黄：上海康桥中药饮片厂

锁阳：上海徐汇中药饮片厂

均购自上海康桥中药有限公司

药材含量测定结果见表11。

表1药材含量测定

配方：

制首乌600g熟地黄400g山茱萸400g仙灵脾1200g锁阳400g

制备：

以上五味中药共计3kg，每次加水（30kg）煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，减压浓缩（70-80℃）至相对密度为1.20～1.25（80℃测）的清膏，放冷至室温，加95%乙醇，使含醇量为60%，静置12小时。上清液回收乙醇至无醇味，减压浓缩（70-80℃）至相对密度为1.25～1.30（80℃测）的清膏，减压干燥(60～70℃，真空度大于0.08)，将清膏（500g）粉碎成细粉（60目），加入等量（500g）糊精，FL-5型制粒机一步制粒，制成1000g，铝箔袋分装，12.5g/袋，密封，即得本发明中药组合物。

服用时，本发明中药组合物颗粒用开水冲服，每次12.5g，1日2次。1日服用量相当于药材75g（其中淫羊藿30g，制首乌15g山茱萸10g锁阳10g熟地黄10g）和糊精12.5g。每12周为一疗程。

实施例2制备本发明中药组合物

配方：

制备：同实施例1。

实施例3制备方法研究试验

提取试验：

提取因素主要有浸泡时间、加水倍数、提取时间及次数。采用正交实验，以淫羊藿苷的提取量，连同得膏率的高低作为指标成分，优选水提的最佳条件。按L9（3⁴）正交表进行实验，因素水平表见表1。

表2正交试验因素水平表

按日服用量称量，按L9（3⁴）正交试验设计表确定的实验条件进行试验。提取液滤过，合并滤液，浓缩后用蒸馏水定容于500ml量桶中，搅拌均匀，放置四小时，取上层清液350ml备用。以测定淫羊藿苷的含量。另外精密移取50ml，作计算得膏率之用。各项数据及分析见表2～表4。

表3正交试验设计表

表4正交试验直观分析表（以淫羊藿苷含量为指标）

表5正交试验直观分析表（以得膏率为指标）

直观分析表明，以淫羊藿苷含量为指标，提取次数对淫羊藿苷的含量影响最大，其余因素按影响大小排序依次为：加水倍数、浸泡时间和提取时间。选取最优的水平组合为A2B1C2D3。以得膏率为指标，同样也是提取次数的影响最大，接下来是浸泡时间，然后为加水倍数，影响最小的是提取时间。选取最优的水平组合分别为A3B3C2D3、

由于用单指标不能完全反映实验结果，故采用综合评分法，即以淫羊藿苷和得膏率来综合判定结果。综合指标=淫羊藿苷×60％＋得膏率×40％。综合指标分析表见表5。

表6正交试验综合指标分析表

综合指标分析表表明，同样也是提取次数的影响最大，接下来是加水倍数，然后为浸泡时间，影响最小的是提取时间。选取最优的水平组合为A2B1C2D3。

表7正交实验方差分析表（淫羊藿苷）

表8正交实验方差分析表（得膏率）

表9正交实验方差分析表（综合指标）

方差分析表明：提取次数、浸泡时间、加水倍数和提取时间对有效成分的提取量均没有显著性影响；但提取次数影响远大于浸泡时间、加水倍数和提取时间的影响。

结合表6、表7的分析结果，优选的提取工艺是：加10倍量水，煎煮3次，每次1小时。因加水倍数、浸泡时间和提取时间对有效成分的提取量均无显著性差异，结合考虑节约生产时间及成本，选用加10倍量水，煎煮3次，每次1小时即可。

醇沉试验

醇沉提取液浓度：经试验，提取液浓度对醇沉后得膏率和指标成分并无显著影响，为保证溶液流动性，并降低乙醇用量，醇沉前溶液的浓度定为相对密度为1.20-1.22（80℃测）的清膏。乙醇浓度：由于已知的主要指标成分二苯乙烯苷、淫羊藿苷、马钱苷等均能溶于乙醇水溶液，为了降低服用量，可将湿浸膏进行醇沉。将湿浸膏中分别加入95%乙醇至含醇量达50%、60%、70%、80%，结果表明不同浓度的乙醇除杂质率近似，分别为45.38%、46.92%、47.99%、48.05%。但含醇量为50%时，上层溶液放置后仍显混浊，为使上层清液与沉淀分离容易，选用含醇量达60%的方法。减压浓缩回收乙醇浓缩至稠膏。稠膏进行真空干燥制得干浸膏。

制粒试验

采用常用的一步制粒法，并以干浸膏为粘合剂。取浸膏加70%乙醇溶液制成10%溶液，结果凝结性不强，无法制成颗粒；取浸膏加50%乙醇溶液制成20%溶液，结果制成颗粒色泽一致，颗粒均匀。

根据以上研究，最后确定戴蒙开颗粒的制法。

进行三批中试，以考察生产工艺的可行性、稳定性。

表10中试结果

结论：三批中试结果表明，本生产工艺稳定，易于控制，成品率高，适合工业化大生产用。

产品检测：（参考05版药典一部及药品注册管理办法）

【名称】实施例1产品（戴蒙开颗粒Daimengkai KeLi）

【性状】本品为棕色或褐色的颗粒；气微、味微苦。

【鉴别】（1）取本品4g，加甲醇10ml，超声处理（功率140w，频率42kHz）10分钟，过滤，取续滤液5ml，减压蒸干，加水和水饱和正丁醇各5ml，振摇使完全溶解，静置，取上层水饱和正丁醇溶液作为供试品溶液。另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（40∶5∶15∶0.5）溶液为展开剂（展开缸需氨气饱和），展开，取出，晾干，喷以香草醛-硫酸-冰醋酸-乙醇（5∶20∶10∶365）溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同紫红色的斑点。

供试品溶液制备方法同(1)。另取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(20∶2∶1)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛-硫酸-冰醋酸-乙醇（5∶20∶10∶365）溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色斑点。

供试品溶液制备方法同(1)。另取5-羟甲基糠醛对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述对照品溶液2.5μl，供试品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛-硫酸-冰醋酸-乙醇（5∶20∶10∶365）溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝色斑点。

【检查】应符合颗粒剂项下有关的各项规定(中国药典2005年一部附录I C)。

【含量测定】照高效液相色谱法（05年版药典一部附录ⅥD）测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（30∶70）为流动相；检测波长为270nm。理论塔板数按淫羊藿苷峰计应不低于4000。

对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品装量差异项下的本品约0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率140w，频率42kHz）10分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，混匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含淫羊藿以淫羊藿苷计，不得少于4.1mg。

三批样品测定结果见表11。

表11样品测定

依照《中国药典》2005年版一部附录IC颗粒剂项下的规定，对三批样品的粒度、溶化性、装量差异、水分检查、微生物限度和物理特性进行了检查，结果符合药典规定。

【吸湿性】：分别将三批样品放置于25℃，相对湿度75%的干燥器中，分别于1、5、10天取样检查，结果见表12：

表12三批样品吸湿性考察

实施例4药效学研究

对反复脑缺血再灌注致血管性痴呆模型小鼠的影响

选择体重为20±2g的KM小鼠，采用反复脑缺血再灌注合并失血法建立血管性痴呆模型；设置空白对照组、模型组、戴蒙开颗粒（实施例1制得）小剂量组（简称小剂量组）、戴蒙开颗粒中剂量组（简称中剂量组）、戴蒙开颗粒大剂量组（简称大剂量组）、西药组；观察戴蒙开颗粒对模型小鼠学习记忆能力，及脑内胆碱能系统（乙酰胆碱酯酶AChE、乙酰胆碱转移酶ChAT、乙酰胆碱Ach）及抗氧化能力（超氧化物歧化酶MDA、丙二醛SOD、谷胱甘肽-过氧化物酶GSH-PX）的影响。

实验动物

KM雄性小鼠60只，清洁级，体重（20±2）g，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物合格证号：SIVX（沪）2008-0016；动物自由饮食与饮水，室温18-22℃，日光灯辅助照明，维持每日光照12小时。

器材与试剂

Morris水迷宫：上海吉量软件科技有限公司

低温高速离心机：EPPENDORF公司

电子分析天平（MA110型）：上海良平仪器仪表有限公司

XHF-1高速分散器：上海金达生化仪器厂

酶标仪：BID-RAD

隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械一厂

盐酸多奈哌齐片：卫材（中国）药业有限公司

乙酰胆碱酯酶（AChE）试剂盒：南京建成生物工程研究所

乙酰胆碱转移酶（ChAT）试剂盒：南京建成生物工程研究所

乙酰胆碱（ACh）试剂盒：南京建成生物工程研究所

丙二醛（MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所

超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒：南京建成生物工程研究所

谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)测试盒：南京建成生物工程研究所方法

造模方法

术前10h禁食不禁水，小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉，待翻正反射消失后，仰位固定。颈部皮肤消毒，行颈部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，37℃夹闭10min、再通20min，反复如此3次，并使动物失血60μl（约5%的血容量），术后颈部创面点滴2～3滴（2.5×10⁴U/kg）庆大霉素，术间注意动物保温。（周光兴,高诚,许平,等.人类疾病动物模型复制方法学[M].上海科学技术文献出版社.2008年第1版:296.）

动物分组与给药

药物

中药：实施例1产品（戴蒙开颗粒）蒸馏水配制。

西药：盐酸多奈哌齐片：卫材（中国）药业有限公司分装。

分组

所有动物随机分为6组，每组10只小鼠：

空白对照组（简称空白组）：每只灌胃0.2ml蒸馏水

模型组：反复脑缺血再灌注合并失血后，每只灌胃0.2ml蒸馏水

戴蒙开颗粒小剂量组（简称小剂量组）：反复脑缺血再灌注合并失血后，给予1.87g/kg（0.5倍等效量）戴蒙开颗粒溶液0.2ml灌胃

戴蒙开颗粒中剂量组（简称中剂量组）：反复脑缺血再灌注合并失血后，给予3.75g/kg（60Kg成人等效量）戴蒙开颗粒溶液0.2ml灌胃

戴蒙开颗粒大剂量组（简称大剂量组）：反复脑缺血再灌注合并失血后，给予7.50g/kg（2.0倍等效量）戴蒙开颗粒溶液0.2ml灌胃

西药组：反复脑缺血再灌注合并失血后，给予0.75mg/kg（60kg成人等效量）多奈哌齐溶液0.2ml灌胃。

Morris水迷宫检测方法

水迷宫圆形，直径1.6m，平台直径12cm。平台置于水迷宫西南象限，水面高出平台1.5cm，水温保持在19-20℃。小鼠连续测试6天，前5天，每天测试时小鼠分别从水迷宫正北和正东两个点放入，设定最长游泳时间为70秒，用摄像探头记录小鼠找到平台的时间即潜伏期；第6天撤掉平台，用摄像探头记录小鼠穿越平台所在位置的次数。

统计学处理

数据以X±S表示，应用SPSS19.0对数据进行统计分析。如果数据呈正态分布且方差齐，对组间比较进行方差分析；如果方差不齐则采用秩和检验。

结果

对模型小鼠行为学的影响

表13潜伏期（秒）

与空白组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05##P<0.01

表14穿越次数（次）

与空白组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05##P<0.01

结果显示：随着训练次数的增加，各组小鼠的平均潜伏期均逐渐缩短，说明小鼠在学习记忆过程中逐渐熟练。

与空白组比较，模型组的潜伏期均有延长，在第四天，第五天差异有统计学意义（P<0.05），模型组的平台穿越次数减少具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，中、大剂量组在第四天，小剂量组、西药组在第五天的潜伏期缩短，有统计学意义（P<0.01，P<0.05）,其余剂量组则呈现潜伏期缩短趋势；各剂量戴蒙开颗粒及多奈哌齐均能增加小鼠的平台穿越次数，具有统计学意义（P<0.05）。

结果提示：反复脑缺血再灌注合并失血能够造成小鼠的学习记忆能力下降，戴蒙开颗粒能够改善类VD大鼠学习记忆能力。

戴蒙开颗粒对模型小鼠脑内胆碱能系统（乙酰胆碱酯酶AChE、胆碱乙酰化转移酶ChAT和乙酰胆碱Ach）变化的影响

表15各组小鼠AChE、ChAT和Ach变化

与空白组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05##P<0.01

结果显示：与空白组比较，模型小鼠脑内AChE升高，ChAT及ACh降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，各剂量戴蒙开颗粒均能降低AChE活性，大剂量戴蒙开颗粒能够增加ChAT活性，小剂量和大剂量戴蒙开颗粒能够增加脑内ACh含量，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；多奈哌齐能够降低AChE，升高ChAT和ACh，差异具有统计学意义（P<0.01）。

结果提示：戴蒙开颗粒能够增强模型小鼠脑内ChAT活性、降低AChE活性，增加ACh含量。

对模型小鼠脑内（超氧化物歧化酶MDA、丙二醛SOD、谷胱甘肽-过氧化物酶GSH-PX）的影响

表16各组小鼠MDA、SOD、GSHpx变化变化

与空白组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05##P<0.01

结果显示：与空白组比较，模型组小鼠脑内GSHpx、SOD降低，MDA增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，中剂量戴蒙开颗粒能够降低MDA含量，大剂量戴蒙开颗粒能够增加SOD活性，小剂量戴蒙开颗粒能够增加GSHpx活性，差异具有统计学意义（P<0.01）；多奈哌齐能够增加SOD、GSHpx活性具有统计学意义（P<0.01）。

结果提示：戴蒙开颗粒能够降低模型小鼠脑内SOD含量，增加SOD、GSHpx含量。

对三种记忆障碍模型小鼠的影响

实验动物

选择体重20±2g的KM小鼠180只，雌雄各半分开饲养。由上海中医药大学动物实验中心提供。动物自由饮食与饮水，室温18-22℃，日光灯辅助照明，维持每日光照12小时。

造模方法与分组

造模方法

记忆获得障碍模型：采用跳台法训练前10min腹腔注射东莨菪碱4mg/kg制备记忆获得障碍小鼠模型，24h后测试。

记忆巩固障碍模型：跳台法训练后皮下注射亚硝酸钠120mg/kg制备记忆巩固障碍小鼠模型，24h后测试。

记忆再现障碍模型：跳台法训练5min，24h后测试前30min灌胃40%乙醇0.1ml/10g制备记忆再现障碍小鼠模型。分组

每种模型均为6组，每组10只，雌雄各半。

空白对照组（简称空白组）：每只灌胃0.2ml蒸馏水

模型组：按照3.2.2.1方法制备模型后，每只灌胃0.2ml蒸馏水

戴蒙开颗粒（实施例1产品）小剂量组（简称小剂量组）：按照3.2.2.1方法制备模型后，给予1.87g/kg（0.5倍等效量）戴蒙开颗粒溶液0.2ml灌胃

戴蒙开颗粒中剂量组（简称中剂量组）：按照3.2.2.1方法制备模型后，给予3.75g/kg（60Kg成人等效量）戴蒙开颗粒溶液0.2ml灌胃

戴蒙开颗粒大剂量组（简称大剂量组）：按照3.2.2.1方法制备模型后，给予7.50g/kg（2.0倍等效量）戴蒙开颗粒溶液0.2ml灌胃

西药组：按照上述方法制备模型后，给予0.75mg/kg（60kg成人等效量）多奈哌齐溶液0.2ml灌胃。

跳台检测方法

测试时将小鼠放到跳台的平台上，接通电源，设定检测时间为5min，自动记录小鼠第一次掉落的时间为逃避潜伏期，掉落的次数为错误次数。

结果

对学习记忆获得障碍小鼠潜伏期和错误次数的影响

表17记忆获得障碍小鼠潜伏期和错误次数

与空白组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05△△P<0.01

结果显示：与空白组比较，记忆获得障碍模型（东莨菪碱）小鼠潜伏期缩短、错误次数增加（P<0.05）；与模型组比较，戴蒙开颗粒中剂量组潜伏期延长（P<0.05），西药组潜伏期延长、错误次数减少（P<0.05）。

对学习记忆巩固障碍小鼠潜伏期和错误次数的影响

表18记忆巩固障碍小鼠潜伏期和错误次数

与空白组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05△△P<0.01

结果显示：与空白组比较，记忆巩固障碍模型（亚硝酸钠）小鼠潜伏期明显缩短、错误次数明显增加（P<0.01）；与模型组相比，戴蒙开颗粒小剂量潜伏期延长（P<0.05），中、大剂量潜伏期明显延长、错误次数明显减少（P<0.01），西药组错误次数减少（P<0.05）。

对学习记忆再现障碍小鼠潜伏期和错误次数的影响

表19记忆再现障碍小鼠潜伏期和错误次数

与空白组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05△△P<0.01

结果显示：与空白组比较，记忆再现障碍模型（乙醇）小鼠潜伏期明显缩短、错误次数明显增加（P<0.01）；与模型组比较，戴蒙开颗粒小剂量组错误次数明显降低（P<0.01），中、大剂量组错误次数减少（P<0.05），西药组错误次数减少、潜伏期明显延长（P<0.01或P<0.05）。小结

1、戴蒙开颗粒对东莨菪碱导致的记忆获得障碍模型小鼠、亚硝酸钠导致的记忆巩固障碍模型小鼠、乙醇导致的记忆再现障碍模型小鼠的学习记忆能力有改善作用。

2、戴蒙开颗粒能够改善反复脑缺血再灌注合并失血所致血管性痴呆模型小鼠学习记忆能力。

3、戴蒙开颗粒能够降低模型小鼠脑内AChE活性，增加ChAT活性，提高ACh含量。

4、戴蒙开颗粒能够增强模型小鼠脑内SOD、GSHpx活性，提高其抗氧化能力。

实施例5毒理学研究

急性毒性试验

试验动物

ICR品系小白鼠，SPF级，雌雄各半，体重18-22g，许可证号SCXK（陕）2007-001，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，按性别分笼饲养，固体饲料，自由饮水。

试验药物

实施例1产品，每克纯药粉相当于生药7.14克，蒸馏水配制成所需浓度。

试验方法与结果

预试：

小鼠12只，雌雄各半，随机分为3组，每组4只。禁食12小时后，分别灌胃给予20%、40%、40%×2戴蒙开颗粒0.4ml/10g，一日2次，间隔8h。观察7天，结果无小鼠死亡，提示不能测定LD50，故测定小鼠一日最大给药量。

正式试验：

另取小鼠40只，雌雄各半，随机分为对照组和试药组，每组20只，禁食12h后，试药组灌胃40%（最大浓度）戴蒙开颗粒（纯药粉）0.4ml/10g，对照组灌胃给予等体积的蒸馏水，一日2次，间隔8h。一日内累计给药量1.8ml/10g，观察7天。

结果表明，给药后小鼠毛发光泽，活动、进食和饮水正常，二便正常，未见异常反应。7天后动物体重增加，对照组由19.38±0.92g增加到22.59±0.89g，试药组由19.94±0.96增加到22.59±1.30g，两组小鼠体重增长无差异，试药组无一死亡。实验结束时，颈椎脱臼处死小鼠，解剖肉眼观察主要脏器颜色及形态学改变，结果两组小鼠心肝脾肺肾胃肠等主要脏器未见明显异常改变。据此，戴蒙开颗粒小鼠灌胃给药一日最大给药量为228.48g生药/kg，未见明显急性毒性反应。

小结

戴蒙开颗粒小鼠灌胃给药后，未发现明显急性毒性，小鼠一日最大给药量为228.48g生药/kg，相当于临床成人每日拟用量198倍（成人日拟用量=2次/日×10g/次（含浸膏粉5.25g）×7.14g生药/g÷65kg=1.1534g生药/kg/日）。

长期毒性试验

试验动物

SD品系大白鼠，SPF级，雌雄各半，体重60-80g，许可证号SCXK（陕）2007-001，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，按性别分笼饲养，固体饲料，自由饮水。

试验药物

实施例1产品，每克纯药粉相当于生药7.14克，蒸馏水配制成所需浓度。

4.2.3试验给药及分组

口服给药（灌胃）2ml/100g，每天2次，每周6天，每周根据体重调整给药量一次。

第一组：大剂量，48.45%浓度，9.69g/kg，折合69.2生药/kg（相当于临床成人拟用量的60倍）。

第二组：中剂量，24.23%浓度，4.85g/kg，折合34.6生药/kg（相当于临床成人拟用量的30倍）。

第三组：小剂量，12.11%浓度，2.42g/kg，折合17.3生药/kg（相当于临床成人拟用量的15倍）。

试验周期

6个月（180天）。连续给药3个月后每组处死10只，做长期毒性给药中期检查；连续给药6个月后每组处死10只，做长期毒性给药末期检查；其余动物停药2周后处死做恢复期检查。

观察指标

一般表现

外观体征、毛发、行为活动、腺体分泌、二便、呼吸、食量及体重变化等，食量和体重每周测量1次。

血液学指标

红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、红细胞容积（HCT）、平均红细胞容积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、白细胞（WBC）及分类、血小板（Pt）、凝血时间。

血液生化指标

尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总胆固醇（T-CHOL）、总胆红素（T-BIL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、甘油三酯（TG）、钠离子（Na+）、氯离子（Cl-）、钾离子（K+）。

心电图

标准Ⅱ导联

尿常规

大体解剖

肉眼尸检心、肝、脾、肺、肾、气管、大脑、小脑、脊髓、垂体、肾上腺、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、主动脉、食管、胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺、膀胱、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、肠系膜淋巴结、胸骨（骨髓）、坐骨神经、视神经。

脏器指数

心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢。

组织病理学检查

心、肝、脾、肺、肾、气管、脑、脊髓、垂体、肾上腺、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、主动脉、食管、胃、小肠、结肠、胰腺、膀胱、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、肠系膜淋巴结、胸骨（骨髓）、坐骨神经、视神经。

统计处理

进行组间比较t检验统计学处理。

试验结果

对大鼠一般状况及体重的影响

大鼠用药期间外观、毛发、活动、食量、饮水量未见异常，粪便正常，无分泌物及呼吸困难等病理改变。

血液学检查

动物处死后立即采血，用KX-21N全自动血球分析仪（日本东亚公司生产）做血液学检查。结果表明，给药3个月、6个月后，各剂量大鼠血液学指标在正常值范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠血液学指标无明显影响。停药2周后各剂量组大鼠血液学指标仍在正常范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠血液学指标无延迟性毒性反应。

凝血时间检查

动物处死后立即采血，用玻片法做凝血时间检查。结果表明，给药3个月、6个月后，各剂量大鼠凝血时间在正常值范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠凝血时间无明显影响。停药2周后各剂量组大鼠凝血时间仍在正常范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠凝血时间无延迟性毒性反应。血液生化学检查

动物处死后立即采血，分离血清，用CL-8000全自动生化分析仪（日本生产）曾定血清生化指标。结果表明，给药3个月后，小剂量组大鼠血清总蛋白升高，与空白组比较有显著性差异（P<0.01）；大剂量组血清总蛋白升高、ALP降低，与空白组比较有显著性差异（P<0.01）。给药6个月后，除小剂量组大鼠血清白蛋白升高（P<0.01）外，其他指标未见异常。停药2周后，小剂量组大鼠血清BUN降低，与空白组比较有显著性差异（P<0.05）；中、大剂量组大鼠血清甘油三酯降低，与空白组比较有显著性差异（P<0.01或P<0.05）；其他指标未见异常。上述生化指标的改变虽有统计学意义，但无明显剂量依赖性，且均在正常生理值范围内，因而无毒理学意义。结果表明该药对大鼠血液生化指标无明显影响。心电图检查

试验3个月末、6个月末及停药2周末给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠0.1ml/100g麻醉，每组10只，记录Ⅱ导联心电图。结果表明该药对大鼠心电图无明显影响。

尿常规检查

动物处死后剪开膀胱，立即用目测八联试剂带（广州越秀区东方科技研究所）测定尿中尿胆原、胆红素、酮体、隐血、蛋白质、亚硝酸盐、葡萄糖、PH。结果表明，给药3个月、6个月后，各剂量大鼠尿常规指标在正常值范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠尿常规指标无明显影响。停药2周后各剂量组大鼠凝血时间仍在正常范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠尿常规指标无延迟性毒性反应。

脏器指数测定

动物处死后，迅速剖取各脏器，滤纸吸去血液，称其湿重，求脏器指数。结果表明，给药3个月、6个月后，各剂量大鼠脏器指数在正常值范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠脏器指数无明显影响。停药2周后各剂量组大鼠脏器指数仍在正常范围内，各给药组和空白组比较无显著性差异（P>0.05），说明该药对大鼠脏器指数无延迟性毒性反应。

系统解剖

动物处死后，肉眼观察各组大鼠主要脏器，均未见有颜色及形态异常，肉眼未见病理改变。

组织病理学检查

动物处死后，剖取各脏器，用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下做病理学检查。结果显示，给药3个月、6个月后，未见戴蒙开颗粒用药组大鼠的器官组织有与用药相关的病理变化。停药2周后，亦未见戴蒙开颗粒用药组大鼠的器官组织有与用药相关的病理变化。

小结

戴蒙开颗粒大鼠6个月灌胃给药后的长期毒性试验结果表明，大鼠在给药期间各剂量组动物的一般情况良好，血液及血液生化学指标正常，尿常规和心电图未见异常，脏器指数义务异常，系统解剖及组织病理学检查未发现戴蒙开颗粒的病理性致损作用。说明概要在大鼠长期毒性试验中，未见明显毒性反应，亦无延迟性毒性反应，提供大鼠无毒性反应剂量为69.2g生药/kg/日。

Claims (9)

1.一种治疗血管性痴呆症的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由各中药原料按下列重量配比制成：

制首乌400g-600g熟地黄400g-600g山茱萸300g-400g仙灵脾1200g-1500g锁阳300g-400g。

2.一种治疗血管性痴呆症的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由各中药原料按下列重量配比制成：

制首乌600g熟地黄400g山茱萸400g仙灵脾1200g锁阳400g。

3.制备如权利要求1所述一种治疗血管性痴呆症的中药组合物的方法，其特征在于，

中药原料配方：

制首乌400g-600g熟地黄400g-600g山茱萸300g-400g仙灵脾1200g-1500g锁阳300g-400g；

该方法为：

制首乌、熟地黄、山茱萸、仙灵脾和锁阳五味中药混合，每次加中药总重量10倍重量量水煎煮三次，每次1小时，合并煎液，滤过，减压浓缩70℃-80℃至相对密度为1.20～1.2580℃测的清膏，放冷，加95%乙醇使含醇量为60%，静置12小时；上清液回收乙醇至无醇味，减压浓缩70℃-80℃至相对密度为1.25～1.3080℃测的清膏，减压干燥60℃～70℃，真空度≥0.08，将清膏粉碎成细粉60目，加入等量糊精，制粒，分装即得。

4.如权利要求1所述一种治疗血管性痴呆症的中药组合物在制备治疗血管性痴呆症药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述中药组合物由中药原料作为活性成分与药用辅料组成。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述中药组合物中作为活性成分的各中药原料为下列重量配比：

制首乌400g-600g熟地黄400g-600g山茱萸300g-400g仙灵脾1200g-1500g锁阳300g-400g。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述中药组合物中作为活性成分的各中药原料为下列重量配比：

制首乌600g熟地黄400g山茱萸400g仙灵脾1200g锁阳400g。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述中药组合物为口服制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述中药组合物为口服颗粒剂。