CN103382223A - 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽 - Google Patents

针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽 Download PDF

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Abstract

一种多功能抗体多肽，包括：(a)第一功能域，其特异性识别在肿瘤细胞中暴露的EGFR的第287-302位氨基酸序列形成的隐蔽表位，如SEQ ID NO：1所示，(b)第二功能域，其特异性识别人T细胞表面抗原。

Description

针对表皮生长因子受体隐蔽表位和T细胞抗原的多功能抗体多肽
技术领域
本发明涉及生物医学领域。更具体地，本发明涉及能识别并结合表皮生长因子受体(EGFR)的隐蔽表位和T细胞抗原的多功能抗体多肽。本发明还涉及编码该抗体多肽的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的载体，含有所述载体的宿主细胞等。本发明还涉及所述多功能抗体多肽在制备抗肿瘤药物和制备诊断肿瘤的试剂盒中的应用。
背景技术
已有文献表明，表皮生长因子受体(EGFR)在多种类型的人类实体瘤中过表达。这些肿瘤包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、、食管癌、肝癌、肾癌和前列腺癌。开发针对表皮生长因子受体家族的抗体药物为治疗这些肿瘤提供了机会。
有至少两个针对EGFR的抗体药物已经用于临床肿瘤治疗中，例如爱必妥
Figure BSA00000695063700011
(Erbitux，又称Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab)。但是这些抗体的应用受到一些限制。这是因为一方面EGFR在很多人体实体脏器如皮肤和肝脏中均有表达，导致上述抗体药物可能在人体内给药后被这些脏器所吸收(Baselga J et al.Phase I studies of anti-epidermal growth factor receptor chimeric antibody C225 aloneand in combination with cisplatin.J.Clin.Oncol.2000Feb；18(4)：904-14.和Faillot T et al.A phase I study of ananti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody forthe treatment of malignant gliomas.Neurosurgery.1996Sep；39(3)：478-83.)。另一方面，这些抗体对正常表达EFGR的组织的非特异性作用，可能导致在使用抗体药物如Erbitux时，产生副作用如皮疹(Agero AL，et al，Dermatologic side effects associated with theepidermal growth factor receptor inhibitors.J Am Acad Dermatol.2006Oct；55(4)：657-70.)等，严重的可导致患者不得不停用药物。
为了减少现有EGFR抗体由于与正常组织的EGFR结合造成的副作用，人们筛选了多种针对肿瘤特异性EGFR表位的单克隆抗体，如针对de2-7EGFR(又称为EGFRvIII)由于缺失了EGFR的第2-7个外显子的267个氨基酸所产生的铰链(junction)部位LEEKKGNY的抗体，参见专利PCT/US2004/020295公开的抗体131；又如针对EGFR的隐蔽表位(cryptic epitope)的抗体mAb806，CH12等，参见美国专利申请US2011/0076232A1和WO/2011/035465。当EGFR被激活、过表达、或突变时，可能导致该隐蔽表位(287CGADSYEMEEDGVRKC302)的暴露并与针对该表位的抗体，如mAb806，结合(Garrett TP et al.Antibodies specifically targeting a locally misfolded region of tumorassociated EGFR.Proc Natl Acad Sci U S A.2009；106(13)：5082-7.)。这些抗体在动物实验中都显出一定的抗肿瘤效果，并且显示出比之前的抗EGFR抗体更好的肿瘤特异性。抗体mAb806抗体所衍生的人鼠嵌合抗体ch806在临床I期试验中表现出很强的肿瘤靶向性，而且没有观察到明显的皮肤毒性(Scott AM，Lee FT et al，A phase I clinical trial withmonoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutantepidermal growth factor receptors.ProcNatlAcadSci U S A.2007 Mar6；104(10)：4071-6.)。在5mg/m2的剂量下ch806就可以显示出在肿瘤部位的吸收。而之前的其它抗EGFR抗体要显示出在肿瘤部位的吸收大概需要10到20倍的剂量(Divgi CR et al.Phase I and imaging trial ofindium 111-labeled anti-epidermal growth factor receptor monoclonalantibody 225 in patients with squamous cell lung carcinoma.J Natl CancerInst.1991 Jan 16；83(2)：97-104.)。这表明mAb806的衍生抗体由于不与正常组织EGFR结合，所以有更好的药物学分布。但这并不代表它的用药最小剂量是5mg/m2。事实上，806抗体在动物药效学研究时，较有效的剂量是1mg/小鼠(该剂量约相当于50mg/kg)(RushikaM.Perera，etal.Treatment of Human Tumor XenograftswithMonoclonal Antibody 806 inCombinationwith a Prototypical Epidermal Growth Factor Receptor^Specific Antibody Generates Enhanced Antitumor Activity.Clin CancerRes 2005；11(17)6390-9)。此外针对上述表位的这些抗体，如CH12，对另外一些形式的表达EGFR(比如T790M突变的EGFR)的肿瘤却没有太明显效果。上述T790M突变经常出现在一种与EGFR相关的肺腺癌使用小分子酪氨酸酶抑制剂治疗一段时间后(Xu Y et.al，Acquiredresistance of lung adenocarcinoma to EGFR-tyrosine kinase inhibitorsgefitinib and erlotinib.Cancer Biol Ther.2010 Apr；9(8)：572-82.Epub 2010Apr 26)。
如何改造这些抗体，提高其抗肿瘤活性(即降低最小作用剂量)，并扩展其抗肿瘤作用的范围是有价值的。
一种感兴趣的提高抗体的抗肿瘤活性的方式是构建双功能抗体。能特异性识别EGFR和CD3抗原的双功能抗体在现有技术中已有描述，其一部分功能域特异性针对EGFR，另一部分功能域特异性针对T细胞的CD3抗原。采用Cetuximab或Panitumumab抗体与抗CD3抗体所构建的双功能抗体显示出很好的抗肿瘤活性，但是在灵长类动物实验中，发现这些双功能抗体较强的针对表达EGFR的正常细胞或组织的毒性作用(Lutterbuese R，Raum T et.al T cell-engaging BiTE antibodies specificfor EGFR potently eliminate KRAS-and BRAF-mutated colorectal cancercells.ProcNatlAcadSci U.S.A.2010；107(28)：12605-10.)。
在现有技术中尚未实现具有提高的抗肿瘤生物学活性，并且特异性识别肿瘤相关的EGFR和CD3抗原的双功能抗体。
发明内容
本申请的第一方面涉及一种多功能抗体多肽，其包括
(a)第一功能域，其特异性识别在肿瘤细胞中暴露的EGFR的第287-302位氨基酸序列形成的隐蔽表位，如SEQ ID NO：1所示，
(b)第二功能域，其特异性识别人T细胞表面抗原。
本申请的第二方面涉及一种编码所述多肽的核苷酸序列。
本申请的第三方面涉及一种包含所述核苷酸序列的载体。
本申请的第四方面涉及包含所述载体的真核宿主细胞或原核宿主细胞。
本申请的第五方面涉及所述的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本申请的第六方面涉及所述的多肽在制备诊断肿瘤的试剂中的应用。
附图说明
图1pH-806/CD3表达载体结构示意图
图2pH-7B3/CD3表达载体结构示意图
图3A纯化的双功能抗体多肽的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，M为分子量标记(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳小分子量标准蛋白质由上海升正生物技术有限公司提供)，第一栏为806/CD3，第二栏为7B3/CD3。
图3B纯化的双功能抗体多肽的蛋白质杂交检测第一栏为806/CD3，第二栏为7B3/CD3。
图4A通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与U87MG肿瘤细胞的特异性结合的测定
图4B通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与U87MG-EGFRvIII肿瘤细胞的特异性结合的测定
图4C通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与A431肿瘤细胞的特异性结合的测定
图4D通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与U87MG-de4EGFR肿瘤细胞的特异性结合的测定
图4E通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与NCI-H1650肿瘤细胞的特异性结合的测定
图4F通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与NCI-H1975肿瘤细胞的特异性结合的测定
图4G通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与Jurkat肿瘤细胞的特异性结合的测定
图4H通过荧光激活细胞分选仪(FACS)显示的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)与PBMC细胞的特异性结合的测定
图5A 806/CD3的抗原结合表位分析(ELISA)
图5B 7B3/CD3的抗原结合表位分析(ELISA)
图6A系列梯度稀释的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)诱导的T细胞对U87MG肿瘤细胞的杀伤率比较。
图6B系列梯度稀释的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)诱导的T细胞对U87MG-EGFRvIII肿瘤细胞的杀伤率比较。
图6C系列梯度稀释的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)诱导的T细胞对A431肿瘤细胞的杀伤率比较。
图6D系列梯度稀释的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)诱导的T细胞对U87MG-de4EGFR肿瘤细胞的杀伤率比较。
图6E系列梯度稀释的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)诱导的T细胞对NCI-H1650肿瘤细胞的杀伤率比较。
图6F系列梯度稀释的三种双功能单链抗体(NGR/CD3，7B3/CD3和806/CD3)诱导的T细胞对NCI-H1975肿瘤细胞的杀伤率比较。
图7NOD/SCID荷瘤(U87MG-EGFRvIII)小鼠模型显示的不同浓度双功能抗体(7B3/CD3和806/CD3)治疗组和对照组的抗肿瘤活性测定
图8NOD/SCID荷瘤(NCI-H1975)小鼠模型显示的不同浓度双功能抗体(7B3/CD3)治疗组和对照组的抗肿瘤活性测定
具体实施方式
本发明提供针对一系列肿瘤的多功能抗体，所述一系列肿瘤包括包含扩增的EGFR基因的肿瘤以及表达变异的EGFR，如表达缺失第2-7外显子的de2-7EGFR的肿瘤，包括但不限于肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌和前列腺癌。该多功能抗体包含一个特异性识别包含有扩增的EGFR基因或具有突变的EGFR基因的肿瘤表达的EGFR的第287-302位氨基酸序列形成的隐蔽表位，如SEQ ID NO：1所示，和一个识别人T细胞表面抗原的第二功能域。
本发明的多功能抗体能够在非常低的浓度，如100pg/mL-1ng/mL下在体外和体内诱导针对肿瘤细胞的T细胞杀伤毒性。即使在使用较低的效应细胞(E)：靶细胞(T)比率，如10∶1时，也观察到相关肿瘤细胞系的特异性裂解，而无需任何其他形式的T细胞预刺激。本发明针对的相关肿瘤细胞包括表达突变的EGFR如de2-7EGFR、表达扩增的EGFR的上述肿瘤细胞可以从商业来源获得，例如NCI-1650，NCI-1975，A431，得自美国典藏培养物中心(American Type Culture Collection，ATCC)，又例如U87MG-EGFRvIII，其是稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞系，其构建方法参见文献(Jiang H，J Biol.Chem.，2011，286(7)：5913-20)，U87MG也可以得自ATCC。
此外，本发明的单链双功能抗体几乎不会和EGFR没有扩增或没有突变的细胞(如U87MG)结合。由本发明的多功能抗体制备的抗肿瘤药物具有改善的体内肿瘤靶向性，降低对正常组织的杀伤。
本发明的第一功能域特异性识别如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列形成的隐蔽表位。特异性识别上述隐蔽表位(如人野生型EGFR第287-302位氨基酸所包含的表位)的抗体已有公开，例如美国专利申请US2011/0076232A1和WO/2011/035465所述mAb806，及其衍生抗体，和中国专利申请CN101602808A所述的12H23及其衍生抗体。此外，制备其他特异性针对上述隐蔽表位的抗体可以根据本领域已知的方法来进行。第一功能域能与含有多拷贝EGFR基因的肿瘤和表达变异的EGFR，如de2-7EGFR的肿瘤结合，但不结合SEQ ID NO.8所示的de2-7EGFR的铰链肽序列。
本发明的第二功能域包括特异性识别人T细胞抗原的抗体和抗体片段。所述T细胞表面抗原包括但不限于CD3，CD16，CD28。优选地，该T细胞表面抗原是CD3。CD3是T细胞表达的抗原。它是多分子T细胞受体复合物(T cell receptor complex，TCR)的一部分，含有三条不同链CD3ε，CD3δ，CD3γ。将CD3簇集于T细胞上(例如通过固定的抗CD3抗体)可导致T细胞活化，这类似于T细胞受体的结合，但不依赖于其克隆的类型特异性。实际上，大多数抗CD3抗体识别的是CD3ε链。这种双功能抗体杀伤肿瘤细胞主要是通过刺激免疫系统来完成的，而且不受主要组织相容性抗原(MHC)限制。当双功能抗体中的抗CD3抗体部分和T细胞表面的CD3结合时可以产生杀伤肿瘤细胞的效应。
本发明中所使用的术语的含义如下：
“功能域”指的是能够特异性识别抗原的抗体或抗体片段，包括完整抗体，单链抗体(scFV)，Fd片段，Fab片段，F(ab’)2片段，单结构域抗体片段，分离的CDR片段，及其衍生物。
“完整抗体”由两个同样的重链和轻链组成，各条链分别包含一个可变区(V区)和一个或多个恒定区(C区)。可变区负责与抗原结合，而恒定区主要负责结合效应分子。在各可变区有三个具有高度多样性的柔性的环，称作互补决定区(CDR)，其主要负责识别抗原。可变区的其他部分包含刚性的β片层并支持所谓的框架区(FRs)。CDR和FR间隔排列形成三明治结构。
“单链抗体(scFV)片段”指的是通过基因工程构建的抗体片段，其是有通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联以形成抗原结合位点。ScFV的大小一般是一个完整抗体的1/6。
“Fd片段”指的是由重链VH和CH1组成抗体片段。
“Fab片段”指的是由Fd片段(由重链VH和CH1组成)和整条轻链通过链间二硫键形成的异二聚物。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3，其只包含一个抗原结合位点。
“F(ab’)2片段“指的是包含两个相连的Fab片段的二价片段。
“单结构域抗体”由重链可变区或轻链可变区组成。由于该抗体片段只由一个结构域组成，所以得名。该片段的大小是一个完整抗体的1/12。
“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与EGFR或CD3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg，免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如WO 89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741，WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法。
本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。
本发明使用的抗体或抗体片段可以是人源化的，嵌合的或鼠源的。
在本发明的一个实施方案中，第一功能域包含至少一个具有选自如下序列SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的抗EGFR抗体重链可变区的互补决定区(CDR)。优选地，第一功能域是包含上述三个CDR的整个重链可变区。
在本发明的另一个实施方案中，第一功能域包含至少一个具有选自如下序列SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的抗EGFR抗体轻链可变区的互补决定区(CDR)。优选地，第一功能域是包含上述三个CDR的轻链可变区。更优选地，第一功能域是包含整个重链可变区和轻链可变区的单链抗EGFR单体。
在本发明的另一个实施方案中，其中第二功能域为单链抗CD3抗体。
本发明多功能抗体的两个功能域可以包含两个不同的单链抗体，因此该抗体又称作单链双功能抗体。在一个实施方案中，所述的双功能抗体多肽具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述的双功能抗体多肽具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中还包含位于所述第一和第二功能域之间或位于第一或第二功能域内部的不同互补决定区之间的接头。所述多肽接头优选包括几个亲水性肽键氨基酸，其长度足够跨越一个含所述结合位点的所述功能域的C末端和另一个含所述结合位点的所述功能域的N末端之间的距离，所以当本发明多功能抗体置于水溶液中时能呈现适合于结合的构象。优选的，所述多肽接头包括多个甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸残基。在本发明的一个特定优选例中，本发明多肽中的所述多肽接头的氨基酸序列(GlyGlyGlyGlySer)n，其中n为1到5的整数，优选n为1到3，更优选n为3。
当第一和第二功能域各自含两个和两个以上可变区(VH，VL)时，优选地，在这可变区之间通过上述多肽接头连接。本发明多肽中的连接所述多肽接头的氨基酸序列(Gly Gly Gly Gly Ser)n，其中n为1到5的整数，优选n为1到3，更优选n为1。
本发明抗体的所述第一和第二功能域可以是相同或不同抗体的一对VH-VL，VH-VH，或VL-VL功能域。VH和VL功能域的顺序对本发明不是确定的，当其顺序倒转，通常不会有产生功能损失。重要的是，VH和VL功能域的排列使抗原结合位点可以正确折叠，从而形成的多功能抗体具有特异性识别和结合多种抗原的功能。
在本发明多肽的一个优选例中，所述功能域的安排顺序为VLEGFR-VHEGFR-VHCD3-VLCD3。
在本发明的另一方面，涉及上述所述的多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，本方面涉及编码SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.10。在另一个实施方案中，本方面涉及编码SEQID NO.9所示的氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.11.
在本发明的另一方面，涉及包含有编码上述多肽的核苷酸序列的载体。所述载体可以是真核细胞载体或原核细胞载体，只要所述载体满足：(a)其编码序列包含复制起始的序列，使得该载体能够在宿主细胞中得以复制，(b)其包含有编码筛选标记的基因序列，该基因编码的蛋白是该宿主细胞在特定的选择培养基中生存和生长所必需的。在宿主细胞如果没有被转染或转化包含该基因的载体的情况下，宿主细胞不能在特定选择培养基中生存。典型的筛选标记基因编码的蛋白包括具有对抗生素或毒素具有耐受性的蛋白，抗生素或毒素包括例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等；补偿营养缺陷的相关蛋白，供应培养基中不存在的关键营养成分，例如编码D-丙氨酸消旋酶基因。采用抗性筛选的例子包括，通过转染包含新霉素抗性基因的外源载体，使宿主细胞获得在含有药物新霉素或G418的培养基的情况下，继续生存生长。另外一个例子是在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选标记，哺乳动物细胞宿主细胞是指DHFR缺陷型的细胞，不含二氢叶酸还原酶基因，不能合成核酸，必须在含有HT的培养基里生长。在利用载体转染宿主细胞时，可以通过上述培养基条件的选择筛选得到同时包含目的基因和DHFR基因的外源载体的阳性克隆。(c)其编码序列包含启动子的序列，(d)表达载体还可能包括其它组成序列，包括信号肽序列、转录终止序列、增强子序列等，优选地，本发明的载体为真核细胞载体。优选地，本发明的载体为来自用于抗体真核表达的的pH载体，其包含了CMV的启动子、内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site，IRES)、DHFR筛选标记等元件。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的抑制剂，可阻碍其作用。当细胞培养基内含有MTX时，DHFR被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带其上下游基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可提高目的蛋白的表达量。
在本发明的另一方面，涉及包含有所述载体的宿主细胞，用于表达所需的多功能抗体多肽。与使用的载体相适应，本发明的宿主细胞可以是任意的原核宿主细胞或真核宿主细胞。真核宿主细胞，包括酵母、昆虫细胞、植物细胞，哺乳动物细胞等可以是优选的，因为真核细胞存在复杂的目的蛋白的翻译后修饰(例如糖基化)，越来越多的被用于规模化的培养。常用的宿主细胞系包括猴肾细胞(COS-7ATCC CRL 1651)、人胚胎肾细胞293及其亚克隆细胞系，幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。优选地，本发明的真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
在本发明的另一方面，涉及所述的多功能抗体多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
在本发明的另一方面，涉及所述的多功能抗体多肽在制备诊断肿瘤的试剂中的应用。
实施例
实施例1
抗人EGFR第287-302位氨基酸的隐蔽表位的单链抗体序列和抗人CD3单链抗体序列的扩增
1.1抗人EGFR第287-302位氨基酸隐蔽表位的单链抗体VH和VL序列的扩增
抗人EGFR第287-302位氨基酸所包含的隐蔽表位的单链抗体可以是1)806抗体的VH和VL，其核苷酸序列分别如US7589180B2中的SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示，以及2)7B3抗体的VH和VL，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
806抗体的VL和VH基因分别通过PCR方法得到，VL基因是利用引物5’L806-2和3’L806；VH基因是利用引物5’H806和3’H806。
7B3抗体的VL或VH基因分别通过PCR方法得到，VL基因是利用引物5’L7B3-2和3’L7B3；VH基因是利用引物5’H7B3和3’H7B3。
扩增806抗体的VL区所用的引物
5’L806-2：gttgctttggtttccaggtgcaagatgtgacatcctgatgaccca(SEQ ID NO.15)
3’L806：ccgccagagccacctccgcctgaaccgcctccaccacgtttgatttccagcttgg(SEQ ID NO.16)
扩增806抗体的VH区所用的引物
5’H806：gcggaggtggctctggcggtggcggatcggccgatgtgcagcttcagga(SEQ ID NO.17)
3’H806：ggatccaccacctcctgcagagacagtgac(SEQ ID NO.18)
扩增7B3抗体的VL区所用的引物
5’L7B3-2：gttgctttggtttccaggtgcaagatgtgatattcagatgacc(SEQ ID NO.19)
3’L7B3：acctccgcctgaaccgcctccacctgaacgtttaatttccac(SEQ ID NO.21)
扩增7B3抗体的VH区所用的引物
5’H7B3：ttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggatgtgcagctg(SEQ ID NO.22)
3’H7B3：ggatccaccacctccgctgctcacggtcac(SEQ ID NO.23)
1.2抗人CD3单链抗体VH和VL序列的扩增
鼠抗人CD3抗体的VH和VL基因的核苷酸序列得自US7112324B1中所示的序列SEQ ID NO.9(847-1203)和SEQ ID NO.9(1258-1575)通过PCR方法扩增抗人CD3抗体的VL和VH结构域的核苷酸序列，使用的引物如下。
扩增抗人CD3抗体的VH区所用的引物
5’HCD3：ggaggtggtggatccgatatcaaactgcagc(SEQ ID NO.24)
3’HCD3：cacttccaccagaacctccacttccaccttcgactgaggagactgtgag(SEQ ID NO.25)
扩增抗人CD3抗体的VL区所用的引物
5’LCD3：ctggtggaagtggaggttcaggtggagtcgacgacattcagc(SEQ ID NO.26)
3’LCD3：ctatgcggccgcctaatgatgatggtgatgatgtttcagctcca(SEQ ID NO.27)
实施例2
包含编码806/CD3单链双功能抗体的核苷酸序列的表达载体的构建
上述PCR扩增得到的806抗体VH和VL区以及抗人CD3抗体VH和VL区的核苷酸序列与编码接头氨基酸(GlyGlyGlyGlySer)3的核苷酸序列通过融合PCR(fusion-PCR)方式分别扩增得到VL806-接头-VH806及VHCD3-接头-VLCD3。然后将上述扩增产物再通过融合PCR方式扩增得到单链双功能抗体的核苷酸序列，其连接顺序如下：
[VL806-接头-VH806-接头-VHCD3-接头-VLCD3]
然后通过如下的引物对上述接头连接后的序列([VL806-接头-VH806-接头-VHCD3-接头-VLCD3])进行第三轮扩增，以在N末端添加信号肽序列和引入限制性内切酶NheI的位点，以及在C末端添加组氨酸标签并引入限制性内切酶NotI位点。
5’L806-1：ctagctagccaccatggtgtccacagctcagttccttgcattcttgttgctttggtttc(SEQ ID NO.28)
3’LCD3：ctatgcggccgcctaatgatgatggtgatgatgtttcagctcca(SEQ ID NO.27)
扩增得到的序列SEQ ID NO：10用限制性内切酶NheI/NotI-HF同时酶切，按照酶供应商(New England Biolabs，NEB)建议的反应条件在缓冲液2中进行双酶切。表达pH载体(参见WO/2011/035465实施例7和图15)也用限制性内切酶NheI/NotI-HF进行同样的酶切。然后按照酶供应商(NEB)建议的反应条件用T4 DNA连接酶连接双酶切后SEQID NO：10的片段和pH/DHFR载体片段。由此得到编码806/CD3单链双功能抗体多肽的核苷酸序列被克隆到载体中。所得含有806/CD3单链双功能抗体多肽的新载体命名为pH/806/CD3，其详细结构如图1所示。
实施例3
包含编码双功能抗体7B3/CD3的核苷酸序列的表达载体的构建
上述实施例1中扩增得到的7B3抗体VH和VL区的核苷酸序列与编码接头氨基酸(GlyGlyGlyGlySer)3的核苷酸序列通过融合PCR(fusion-PCR)方式连接，其连接顺序为[VL7B3-接头-VH7B3-接头]。
然后通过如SEQ ID NO：20和29所示的引物对上述连接好的序列[VL7B3-接头-VH7B3-接头]进一步扩增以在N末端添加引入信号肽序列和NheI位点，和在C端引入BamHI位点。该进一步扩增的序列SEQ IDNO：12通过NheI和BamHI酶切，按照酶供应商(NEB)建议的反应条件在缓冲液2中进行。
5’L7B3-1：ctagctagccaccatggtgtccacagctcagttccttgcattcttgttgctttggtttc(SEQ ID NO.20)
3’H7B3-2：tcttgccagttcagcccctgactgctgcagtttgatatcggatccaccacctccg(SEQ ID NO.29)
上述实施例2中构建的载体pH-806/CD3通过同样的NheI和BamHI酶切反应。将酶切后得到的长片段与SEQ ID NO：12连接，由此编码7B3/CD3单链双功能抗体多肽的核苷酸序列SEQ ID NO：11被克隆到载体中，新载体命名为pH-7B3/CD3，其详细结构如图2所示
实施例4
单链双功能抗体806/CD3和7B3/CD3的表达和纯化
表达载体pH-806/CD3和pH-7B3/CD3分别根据FreeStyle MAXReagent转染试剂(来自Invitrogen)说明书操作步骤转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，然后根据OptiCHOTM蛋白表达试剂盒(来自Invitrogen)筛选稳定的克隆。分别转染有上述表达载体之一的CHO细胞的稳定克隆在摇瓶中37℃，130rpm培养7天，所用培养基为CDOptiCHO(来自Gibco)。通过离心获得培养上清，然后储存于-20℃。
按照生产商提供的方法步骤，采用组氨酸亲和层析柱(His TrapHP column，来自GE Healthcare)进行蛋白纯化。具体而言，层析柱用缓冲液A(20mM sodium phosphate pH 7.4，0.4M NaCl)平衡，然后PBS透析后的将细胞培养上清(500mL上清)加入到层析柱上(1mL)，流速为3ml/min。然后用5倍体积的缓冲液A和10倍体积的含有50mM咪唑的缓冲液A清洗柱子，以去除杂蛋白。结合的目的蛋白用添加250mM咪唑的同样缓冲液A进行洗脱。所有的纯化步骤都在4℃下操作。
纯化的806/CD3和7B3/CD3蛋白通过还原性SDS-PAGE进行检测，如图3A所示这两个单链双功能抗体分子的分子量均在60kD左右，符合根据氨基酸序列计算得到的806/CD3和7B3/CD3的分子量。
另外通过抗组氨酸抗体对纯化的蛋白进行蛋白杂交(Westernblot)，其结果如图3B表明得到的蛋白都具有组氨酸标记，其分子量均在60kD左右。
经ELISA检测转染的CHO细胞上清中806/CD3和7B3/CD3的浓度约为3mg/L。在280nm波长下检测纯化的蛋白浓度为0.5mg/L。
实施例5
双功能抗体的抗原结合特异性及表位分析
5.1抗原特异性分析
通过荧光激活细胞分选仪(FACS，通常又称为流式细胞仪)(FACScalibur，由BD公司提供)分析单链双功能抗体7B3/CD3和806/CD3各自与EGFR的结合能力。
具体方法如下：
1.取对数生长期的如表1所列各肿瘤细胞接种到6cm平皿中，接种细胞密度约为90％，37℃孵箱过夜培养。
2.使用10mM的EDTA消化细胞，200g×5min离心收集细胞。以1×106～1×107/mL的浓度重悬于1％含小牛血清的磷酸盐缓冲液(NBS PBS)中，按100ul/管的量加入流式专用管中。
3.200g×5min离心，弃上清。
4.两个实验组分别加入待测抗体7B3/CD3和806/CD3，同时一个对照组加入抗体NGR/CD3作为阴性对照，另一个对照组为不加抗体的PBS空白对照。各抗体的终浓度均为20μg/ml，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
5.每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。
6.弃上清，加入1∶50稀释的小鼠抗组氨酸标签抗体(来自上海睿星基因技术有限公司)，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
7.每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。
8.弃上清，加入1∶50稀释的FITC荧光标记的羊抗小鼠抗体(来自上海康成生物工程有限公司)，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
9.每管加入2ml 1％NBS PBS，以200g×5min离心，共二遍。
10.弃上清，重悬于300ul 1％NBS PBS中，流式细胞仪检测。
11.应用流式细胞仪数据分析软件WinMDI 2.9分析数据。
如图4B-4C所示，本发明的绿色所显示的双功能抗体7B3/CD3的荧光峰和蓝色所显示的双功能抗体806/CD3的荧光峰，与阴性对照(NGR/CD3)和空白对照(PBS)相比有显著的差异，表明其均具有和U87 MG-EGFRvIII以及A431细胞高效结合的能力。如图4D-4F所示，本发明的两个双功能抗体也能和U87 MG-de4 EGFR，NCI-1650及NCI-1975结合，但效率不如与U87 MG-EGFRvIII或A431的结合。
如图4A所示，这两个抗体(7B3/CD3和806/CD3)都几乎不能与U87 MG细胞结合。这些结果表明7B3/CD3和806/CD3可以特异性地和突变的人EGFR及过表达的EGFR的肿瘤细胞结合，而几乎不与正常表达EGFR的组织结合。
图4G显示，本发明的双功能抗体(7B3/CD3和806/CD3)和阴性对照抗体(NGR/CD3)以基本相同的水平与表达有CD3的Jurkat细胞(人外周血白血病T细胞)高效结合。图4H显示，本发明的双功能抗体(7B3/CD3和806/CD3)和阴性对照抗体(NGR/CD3)以相似的水平与人外周血单核细胞(PBMC)高效结合。图4G和4H表明本发明的7B3/CD3和806/CD3双功能抗体可以特异性地与T细胞表面的CD3抗原结合。
综上所述，图4A-4H显示出本发明的双功能抗体(7B3/CD3和806/CD3)特异性地与表达突变的人EGFR及过表达的EGFR的肿瘤细胞结合的能力，同时能够特异性地与表达CD3的效应细胞(T细胞)结合。
5.2抗原表位分析
根据已有文献已经表明806单克隆抗体(mAb 806)可以与EGFR的隐蔽表位CC16多肽(287CKGYEDSRVMEAGDEC302)(Johns TG，et al.，J.Biol.Chem.2004；279(29)：30375-84.)结合。一般认为单克隆抗体转变成单链抗体应该不会改变其抗原结合表位特异性，为了进一步验证本发明的双功能抗体可以与该隐蔽表位结合，本实验利用含有该表位的两个重组蛋白作为抗原，进行ELISA检测。
实验步骤如下：
1)蛋白包被：三种抗原rEGFRvIIIex(EGFRvIII的胞外结构域蛋白，其制备方法参见专利WO/2011/035465)，N12-CC16重组蛋白(M13噬菌体pIII蛋白的结构域N1N2与CC16的融合多肽，其制备方法参见Jiang H，et al.，J Biol.Chem.，2011，286(7)：5913-20)及BSA(购自上海生物工程有限公司)对照蛋白，分别以50ng/孔(1ng/μl，50μl/孔)的量被用于包被96孔板的各孔，在37℃下孵育2h。
2)封闭：用0.1M的磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，然后加入5％PBS脱脂奶粉(光明乳业股份有限公司)在37℃封闭2h。
3)将待检测抗体806/CD3、7B3/CD3用5％PBS脱脂奶粉稀释成2ng/μl，每孔50μl，37℃孵育1h。
4)PBST(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入以1∶1000稀释至50μl/孔的抗6×His-鼠单抗(购自上海睿星基因技术有限公司)，在37℃孵育1h。
5)PBST洗涤3次，加入以1∶2000稀释的羊抗鼠IgG-HRP(购自Santa Cruz公司)，在37℃孵育1h。
6)显色：PBST洗涤5次，加ABTS显色液100μL/孔，37℃避光显色10min。
检测：使用Bio-Rad Model 680酶标仪，在波长405nm下检测吸光度值。
结果：
如图5A-5B所示：双功能抗体806/CD3及7B3/CD3分别都可以与N12-CC16(CC16多肽融合表达于M13噬菌体pIII蛋白的N1N2结构域的羧基端)及rEGFRvIIIex特异性结合。这两个抗体与上述两个抗原的结合强度比其与BSA的非特异性结合有非常显著的差异。
由于这两个抗原共有的EGFR氨基酸序列只有CC16多肽序列，因此双特异性抗体806/CD3及7B3/CD3结合的表位都是CC16多肽，即(287CKGYEDSRVMEAGDEC302)。
实施例6
单链双功能抗体806/CD3和7B3/CD3的生物学活性分析-对各种肿瘤细胞的细胞毒活性
外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll(来自Biochrom)密度梯度离心方法，按照标准步骤从健康人供主的血液中分离。离心后，用浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞然后重悬于RPMI 1640完全培养基(Gibco)，将细胞浓度调整到5×105/mL。PBMC用作细胞毒性实验中的效应细胞。不同的肿瘤细胞作为靶细胞(target cells)。用RPMI1640完全培养基将靶细胞浓度调整到5×104/mL。同样体积的靶细胞和效应细胞混合，使效应细胞∶靶细胞(E∶T)比值为10∶1。
将混合后的细胞悬液以75μL/孔的体积加到96孔板中。然后各孔分别添加25μL从1000ng/mL到0.1ng/mL的十倍系列梯度稀释的下列试剂：
1)7B3/CD3单链双功能抗体
2)806/CD3单链双功能抗体
3)RPMI 1640完全培养基(背景对照)
4)NGR/CD3单链双功能抗体(阴性对照，NGR为新生血管靶向肽，其与EGFR没有交叉结合位点。其根据常规方法制备)
在37℃，5％CO2的培养箱中孵育40小时后，根据生产商的操作说明，用
Figure BSA00000695063700171
非放射性细胞毒性检测试剂盒(Non-RadioactiveCytotoxicity Assay kit，来自Promega)检测抗体的细胞毒作用。
Figure BSA00000695063700172
非放射性细胞毒性检测是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。
Figure BSA00000695063700181
检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。
如下表1所列举的六种与EGFR有关的肿瘤细胞被用来分别分析两种双功能抗体7B3/CD3和806/CD3介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
肿瘤细胞的杀伤率(即，细胞毒性％)是根据非放射性细胞毒性检测G1780产品使用说明书提供的下列公式计算的：
其中：
“实验”指的是加入抗体/效应细胞/靶细胞的实验孔所产生的LDH释放值，
“效应细胞自发”指的是效应细胞自发产生的LDH释放，
“靶细胞自发”是指细胞不受其他因素处理时产生的LDH释放，
“靶细胞最大”是用0.8％Triton X-100处理后靶细胞完全裂解所产生的LDH释放，
“靶细胞最大-靶细胞自发”代表着细胞受外界处理后完全裂解所产生的LDH释放。
表1
Figure BSA00000695063700184
上述表1的结果表明表达突变的EGFR和/或过表达EGFR的肿瘤细胞，如A431，U87 MG-de4 EGFR等，都会被双功能特异性抗体7B3/CD3或806/CD3导向的T细胞特异性杀伤。在7B3/CD3处理的上述肿瘤细胞组中，最小的特异性细胞毒性％为23.3，最大的为75.2；在806/CD3处理的上述肿瘤细胞组中，最小的特异性细胞毒性％为28.7，最大的为97.9。
而上述双功能特异性抗体7B3/CD3或806/CD3对表达低水平内源性正常EGFR的肿瘤细胞，如U87 MG，的T细胞特异性杀伤率非常低，显著低于对上述表达突变EGFR和/或过表达EGFR的肿瘤细胞的最小细胞毒性％。
更具体的，7B3/CD3，806/CD3和对照抗体NGR/CD3在不同浓度下对各肿瘤的细胞杀伤率结果如下列表2-7所示。
表2
表3
Figure BSA00000695063700201
表4
Figure BSA00000695063700202
表5
Figure BSA00000695063700203
表6
Figure BSA00000695063700204
表7
据上述表2-7和图6A-6F的细胞杀伤％数据和所使用的双功能抗体的浓度，采用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software inc.，SanDiego，USA)分析程序计算得到各双功能抗体针对肿瘤细胞杀伤的EC50值。
例如，对U87 MG-EGFRvIII细胞而言，7B3/CD3单链双功能抗体的EC50值为2.15ng/ml，而806/CD3单链双功能抗体的EC50值为0.29ng/ml。
对NCI-H1975细胞而言，7B3/CD3单链双功能抗体的EC50值为53.6ng/ml，而806/CD3单链双功能抗体的EC50值为1000ng/ml。
上述结果表明本发明的双功能抗体有比已知的EGFR抗体显著提高的生物学活性。
实施例7
双功能抗体的荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性
6-10周龄的免疫缺陷的NOD/SCID小鼠(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)用于构建人EGFR相关肿瘤的异种移植模型，其遗传学特征是缺乏T细胞，B细胞，NK细胞以及巨噬细胞功能。
治疗组(n＝6)小鼠右侧皮下接种混合细胞悬液，该悬液由1∶1体积比例混合的细胞浓度为1×106的U87 MG-EGFRvIII或NCI-H1975肿瘤细胞与细胞浓度为1×106的未刺激的PBMC制成。
在U87 MG-EGFRvIII/PBMC接种1小时后，小鼠被分别静脉内给药0.4mg/kg/d和0.04mg/kg/d的7B3/CD3以及0.04mg/kg 806/CD3，该给药重复连续5天。
在NCI-H1975/PBMC接种1小时后，小鼠被分别静脉内给药0.4mg/kg/d和0.04mg/kg/d的7B3/CD3，该给药重复连续10天。
对照组包括两个PBS介质给药的组，即对照组1，只注射肿瘤细胞的组；和对照组2，注射肿瘤细胞和PBMC的组，以评估PBMC效应细胞诱导的非特异性杀伤效果。
在指定日用卡尺测量肿瘤的大小，肿瘤体积是根据下列公式计算：
Figure BSA00000695063700221
小鼠模型中肿瘤体积的减小被设定为各单链双功能抗体的肿瘤抑制效果的依据。下表中对各肿瘤的抑制率的计算是根据如下公式：
Figure BSA00000695063700222
表7
Figure BSA00000695063700223
如图7所示，在U87 MG-EGFRvIII荷瘤小鼠模型中，对照组2(即只注射人类外周血淋巴细胞和肿瘤细胞，而没有双特异抗体的组中)的小鼠与对照组1(即只注射肿瘤细胞的组)相比，没有观察到有显著干预U87 MG-EGFRvIII肿瘤的生长。
而806/CD3抗体在浓度0.04mg/kg/d和7B3/CD3在浓度0.4mg/kg/d时都表现出强烈抑制U87 MG-EGFRvIII生长的能力，在细胞接种后的第23天，它们的抑制率分别为74％和80％(和对照组2相比，p＜0.05)。而在较低剂量的7B3/CD3(0.04mg/kg/d)，肿瘤生长抑制率为35.3％(和对照组2相比)。
如图8显示，在NCI-1975荷瘤小鼠模型中，观察到对照组2与对照组1相比，有一定的干预NCI-1975肿瘤生长的效果，但效果低于0.04mg/kg/d剂量7B3/CD3治疗的小鼠，和明显低于0.4mg/kg/d剂量7B3/CD3治疗的小鼠。
7B3/CD3治疗的小鼠与对照组1和2相比，表现出剂量依赖性的抗肿瘤生长的效应。在接受0.4mg/kg/d剂量组的6只小鼠中有1只在细胞接种后第30天还没有成瘤，而0.04mg/kg/d剂量组的小鼠全部成瘤。和对照组2相比，这两组的肿瘤抑制效果分别为：0.4mg/kg/d剂量组，87％(p＜0.05)和0.04mg/kg/d剂量组，35％(p＜0.05)。
表8本发明氨基酸序列和核苷酸序列描述：
Figure BSA00000695063700241
Figure ISA00000695063900011
Figure ISA00000695063900021
Figure ISA00000695063900031
Figure ISA00000695063900041
Figure ISA00000695063900051
Figure ISA00000695063900061
Figure ISA00000695063900071
Figure ISA00000695063900081
Figure ISA00000695063900111
Figure ISA00000695063900131

Claims (21)

1.一种多功能抗体多肽，包括：
(a)第一功能域，其特异性识别在肿瘤细胞中暴露的EGFR的第287-302位氨基酸序列形成的隐蔽表位，如SEQ ID NO：1所示，
(b)第二功能域，其特异性识别人T细胞表面抗原。
2.权利要求1所述的多肽，其中第一功能域包含至少一个具有选自如下序列SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的抗EGFR抗体重链可变区的互补决定区(CDR)。
3.权利要求1或2所述的多肽，其中第一功能域包含至少一个具有选自如下序列SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的抗EGFR抗体轻链可变区的互补决定区(CDR)。
4.权利要求1所述的多肽，其中第二功能域为单链抗CD3抗体。
5.权利要求1所述的多肽，还包含位于所述第一和第二功能域之间或位于第一或第二功能域内部互补决定区之间的接头。
6.权利要求5所述的多肽，其中所述接头的序列为(GlyGlyGlyGlySer)n，其中n为1到5的整数。
7.权利要求6所述的多肽，其中n＝3。
8.权利要求1-7之一所述的多肽，其中第一或第二功能域选自完整抗体，单链抗体(scFV)，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)2片段和其衍生物。
9.权利要求1所述的多肽，其中第一和/或第二功能域是人源化的，嵌合的或鼠源的。
10.权利要求1所述的多肽，具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
11.权利要求1所述的多肽，具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
12.编码权利要求1-11任一所述的多肽的核苷酸序列。
13.编码权利要求10所述的多肽的核苷酸，其具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
14.编码权利要求11所述的多肽的核苷酸，其具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列。
15.包含有权利要求12-14之一所述核苷酸序列的载体。
16.权利要求15所述的载体，其为带有DHFR营养缺陷性选择标记的载体。
17.权利要求16所述的载体，其为pH载体。
18.包含有权利要求15或16所述的载体的真核宿主细胞或原核宿主细胞。
19.权利要求18所述的真核宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢细胞。
20.权利要求1-11任一所述的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
21.权利要求1-11任一所述的多肽在制备诊断肿瘤的试剂中的应用。
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