CN103379903A - 具有相反电荷且其中一种具有剩余电荷的两种聚氨基酸的纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备直径小于或等于500nm的纳米颗粒的新方法，所述方法包括：使包括携带有疏水侧基的带电状态的第一聚电解质的纳米颗粒的溶液（1）和极性与所述第一聚电解质的极性相反的至少一种第二聚电解质（2）相接触，其特征在于，在两种聚电解质的混合物中的阳离子基团数相对于阴离子基团数的比率Z在0.1和0.75之间或者在1.3和2之间；以及在所述混合物中的聚电解质的总重量浓度C严格小于2mg/g。

Description

具有相反电荷且其中一种具有剩余电荷的两种聚氨基酸的纳米颗粒的制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于从相反极性的两种聚电解质的特定混合物制备纳米颗粒的新方法，聚电解质适当地结合活性成分。
背景技术
活性成分的制剂必须符合一定数量的耐受性标准、具有足够浓度的活性成分、同时具有低粘度以便可以容易地注射通过具有较小直径的针头，例如，27-规格至31-规格的针。
在该领域中，如文献WO2008/135561中所述，申请人的公司已经成功地开发了具有低粘度的稳定的悬浮液，该悬浮液由装载有活性成分的微粒构成。能够在较长时期内释放活性成分的这些微粒，在特定条件下尤其由相反极性的两种聚电解质聚合物（PE1）和（PE2）的混合物制成，这两种聚电解质中的至少一种聚电解质聚合物具有疏水基。该混合物产生尺寸在1μm和100μm之间的微粒。
然而，微粒的制剂不适合静脉给药，并且，在通过皮下注射给药的情况下，该制剂会产生不耐受的问题。
因此，从通过肠胃外给药活性成分的观点来看（尤其是静脉注射或皮下注射），优选地采用甚至更小尺寸的颗粒的悬浮液，且尤其是纳米尺度的微粒的悬浮液。
因此，仍然需要用于制备活性成分的纳米颗粒的稳定悬浮液的方法，其尤其适于肠胃外给药、尤其是静脉注射。
发明内容
具体地，本发明的目的在于提出可以获得这样的纳米颗粒的悬浮液的新方法。
意外地，发明人已经发现，在纳米颗粒适当地装载有活性成分的情况下，从特定聚电解质的特定的混合物可以获得纳米颗粒的流体制剂。
更确切地，根据第一方面，本发明涉及一种用于制备平均直径小于或等于500nm的纳米颗粒的方法，该方法至少包括下列步骤：
（1）制备包括携带疏水侧基的带电状态的第一聚电解质的纳米颗粒的水溶液；
（2）使所述溶液（1）和极性与所述第一聚电解质的极性相反的至少一种第二聚电解质一起相混合，其中阳离子聚电解质被加入到阴离子聚电解质的溶液中以形成带有过量负电荷的混合物；或者阴离子聚电解质被加入到阳离子聚电解质的溶液以形成带有过量正电荷的混合物；和
（3）由此形成纳米颗粒；
其中：
-所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质具有聚氨基酸直链骨架，不含有聚烷撑二醇侧基，且具有小于或等于2,000的聚合度；
-在两种聚电解质的混合物中的阳离子基团的数量与阴离子基团的数量的摩尔比Z在0.1和0.75之间或者在1.3和2之间；以及
-在所述混合物中的聚电解质的总质量浓度C严格小于2mg/g。
根据一个具体实施方式，本发明的方法包括，在步骤（3）之后，尤其是通过切向超滤或前置超滤、离心分离、蒸发或冻干而进行的一个或多个浓缩步骤（4）。
根据本发明的方法的实施方式变型，当Z在0.1和0.75之间，换句话说，当聚电解质的最终的混合物具有过量的负电荷时，步骤（1）包括制备阴离子聚电解质的纳米颗粒的水溶液。步骤（2）随后包括将尤其是水溶液形式的阳离子聚电解质添加到第一聚电解质的溶液（优选在温和搅拌的条件下放置）中。
相反地，当Z在1.3和2之间时，换句话说，当聚电解质的最终的混合物具有过量的正电荷时，步骤（1）包括制备阳离子聚电解质的纳米颗粒的水溶液。步骤（2）随后包括将尤其是水溶液形式的阴离子聚电解质添加到第一聚电解质的溶液（优选地在温和搅拌的条件下放置）中。
关于本发明的方法的步骤（2）的特征，本发明的方法对于防止形成不是根据本发明的颗粒（即，平均直径严格大于500nm的颗粒）是特别有利的。
根据一个特别有利的实施方式，步骤（1）的水溶液的纳米颗粒与活性成分非共价结合。
这样的活性成分的纳米颗粒的水溶液通过将活性成分添加到第一聚电解质的水性胶体溶液中而获得，所述活性成分与第一聚电解质的纳米颗粒非共价结合。
在本发明的方法的最后获得的纳米颗粒的制剂在多个方面证实是有利的。
首先，通过本发明的方法获得的纳米尺寸的颗粒尤其适用于通过静脉注射或皮下注射给药活性成分的制剂。至于用于治疗癌症的活性成分的肠胃外给药，本发明证实是特别有利的。
此外，本发明的方法中所用的聚电解质是生物相容性的。它们优选地是耐受性的且降解很快，即，在数天或数周的时间尺度上。
本发明的方法获得的结合活性成分的纳米颗粒对于运输活性成分（尤其是蛋白活性成分、肽活性成分）和/或溶解低分子量的活性成分是特别有利的。
具体地，这些纳米颗粒有利地能够在较长时期内释放活性成分。
根据本发明的方法获得的装载有活性成分的纳米颗粒有利地具有高密度。该密度通过空间屏障效应（基体效应）可以减慢释放，该空间屏障效应为除活性成分与聚电解质的纳米颗粒的非共价结合以外的效应。
此外，根据本发明的纳米颗粒的悬浮液有利地具有优异的稳定性。在本发明的方法的最后获得的混合物随后可以进行尤其是通过切向超滤或前置超滤、离心分离、蒸发或冻干的一个或多个浓缩步骤，而不会损害悬浮液的物化性能，尤其在粘度、粒径、胶体稳定性或化学稳定性方面的性能。因此，可以根据本发明获得纳米颗粒的稳定的悬浮液，该悬浮液是流体并且充分浓缩。
此外，通过简单地混合如上文所述制备的两种液体悬浮液，可以在给药时临时制备根据本发明的纳米颗粒的悬浮液。因此，可以容易地保存纳米颗粒的这些悬浮液，这可以构思在产业规模上限制生产成本。
最后，在水化法中使用活性成分，该水化法不需要过高的温度、、明显的剪切、表面活性剂或有机溶剂，其可有利地避免活性成分的任何潜在的降解。该特征对于一些活性成分（例如，肽和蛋白质）是特别有利的，当这些活性成分经受前述条件时可能降解。
通过阅读以下的描述，根据本发明的方法的其他特征、优点和实施方式将变得更加清楚。
在本文的其他部分，表述“包括在…和…之间”、“在…到…的范围中”和“从…到…之间变化”是等同的并且是指包括限值，除非另外说明。
聚电解质
如上文所述，本发明的方法利用至少两种相反极性的聚电解质的混合物，换句话说，至少一种阴离子聚电解质和至少一种阳离子聚电解质。
在本发明的含义内，“聚电解质”是指具有能够在水中离子化的基团的聚合物，尤其在从5至8范围内的pH下，该离子化在聚合物上产生电荷。因此，在诸如水的极性溶剂的溶液中，聚电解质离解，从而导致在其主链上出现电荷以及在溶液中出现抗衡离子。
例如，聚电解质的羧酸和胺官能团根据溶液的pH分别是-COOH或-COO-和NH2或NH3 +的形式，通过溶液中存在的抗衡阳离子和抗衡阴离子而确保中性。
在聚电解质包括酸基的情况下，化合物可以是盐的形式。盐的选择根据专业人员的能力来进行。例如，具体地，抗衡阳离子可以是一价金属阳离子，优选地是钠离子或钾离子。在聚电解质包括胺基的情况下，具体地，抗衡阴离子可以是氯离子、乙酸根离子或铵离子。
根据本发明的聚电解质可以包括一组相同或不同的电解质基团。
除非另外指明，在说明书的剩余部分中，所述聚电解质被描述为在本发明的方法的步骤（2）期间在阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物的pH值下出现的聚电解质。例如，作为“阳离子”或者作为“阴离子”的基团的描述根据在阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物的该pH值下该基团携带的电荷来考虑。类似地，聚电解质的极性根据在该pH值下由该聚电解质携带的总电荷来定义。
更具体地，“阴离子聚电解质”是指在两种聚电解质的混合物的pH值下具有负的总电荷的聚电解质。
类似地，“阳离子聚电解质”是指在两种聚电解质的混合物的pH值下具有正的总电荷的聚电解质。
聚电解质的“总电荷”是指通过该聚电解质携带的所有的正电荷和负电荷的代数和。
优选地，导致形成纳米颗粒的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物的pH值在从5至8的范围内、优选地从6至7.5的范围内。
具体地，根据一个特别优选的实施方式，水溶液（1）的pH值在5至8的范围内、尤其在6至7.5的范围内，且尤其大约是7。
根据一个具体实施方式，本发明的方法的步骤（2）至少包括：
-制备第二聚电解质的水溶液，该第二聚电解质的水溶液尤其具有在5至8范围内的pH值，且有利地具有与水溶液（1）的pH值相同的pH值；和
-将所述第二聚电解质的水溶液与所述水溶液（1）混合。
根据本发明的一个方面，第一聚电解质具有疏水侧基。当该聚电解质被分散在pH值在5至8范围内的的水性介质（尤其是水）中时，该聚电解质尤其能够自发地形成纳米颗粒。
不希望束缚于该理论，可以建议，疏水基的超分子结合形成疏水结构域导致纳米颗粒的形成。通过或多或少缩合在这些疏水结构域周围的一个或多个聚电解质链从而构成各个纳米颗粒。
优选地，通过具有疏水侧基的第一聚电解质形成的纳米颗粒的平均直径在10nm到100nm的范围内，尤其在10nm到70nm的范围内，尤其在10nm到50nm的范围内。
根据另一具体实施方式，本发明的方法的步骤（2）的第二聚电解质也具有疏水基。当该聚电解质被分散在pH值在5至8范围内的的水性介质（尤其是水）中时，该聚电解质也能够形成纳米颗粒。
聚氨基酸直链骨架
如上文所述，根据本发明考虑的聚电解质具有聚氨基酸直链骨架，即，包括氨基酸残基。
有利地，根据本发明的聚电解质是生物可降解的。
在本发明的含义内，术语“聚氨基酸”包括天然聚氨基酸和合成聚氨基酸两者。
聚氨基酸是直链聚合物，有利地由通过肽键连接的α氨基酸构成。
对于制备嵌段共聚物或无规共聚物、多链聚合物以及含有特定氨基酸序列的聚合物，存在大量的合成技术（参见Encyclopedia of Polymer Science andEngineering，第12卷，第786页；John Wiley & Sons）。
本领域的技术人员能够借助其知识实施这些技术以便获得适用于本发明的聚合物。具体地，还可以参考文献WO96/29991、WO03/104303、WO2006/079614、WO2008/135563和Kang等（Langmuir2001，17，7501-7506）的教导。
根据优选的实施方式变型，通过α-L-谷氨酸盐或α-L-谷氨酸的均聚物构成聚氨基酸链。
根据另一实施方式变型，通过α-L-天冬氨酸盐或α-L-天冬氨酸的均聚物构成聚氨基酸链。
根据另一实施方式变型，通过α-L-天冬氨酸盐/α-L-谷氨酸盐、α-L-天冬氨酸/α-L-谷氨酸、α/β-L-天冬氨酸盐或α/β-L-天冬氨酸的共聚物构成聚氨基酸链。
根据另一实施方式变型，通过聚-L-赖氨酸的均聚物构成聚氨基酸链。
在文献WO03/104303、WO2006/079614和WO2008/135563中具体地描述了这样的聚氨基酸，这些文献的内容以引用的方式并入本文。这些聚氨基酸还可以是专利申请WO00/30618中描述的那些聚氨基酸的类型。
这些聚合物可以通过本领域的技术人员已知的方法来获得。
根据本发明可以使用的一定数量的聚合物，例如具有可变质量的聚（α-L-谷氨酸）、聚（α-D-谷氨酸）、聚（α-D,L-谷氨酸盐）、聚（γ-L-谷氨酸）和聚（L-赖氨酸）类型的聚合物是市售的。
根据专利申请FR2801226中描述的途径也可以合成聚（L-谷氨酸）。
根据一个特别有利的实施方式，根据本发明所考虑的阴离子聚电解质是以下分子式（I）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
Figure BDA0000367883190000071
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸酯基或如下文限定的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮进行结合的末端氨基酸残基，所述末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-，优选地为α-生育酚基-；
●s1对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，
p1可选地是0，
-聚合度DP1=（s1+p1），DP1小于或等于2,000，尤其小于700、尤其在从40到450的范围内、尤其在从40到250的范围内、尤其在从40到150的范围内，
-所述通式（I）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
根据本发明的特别优选的实施方式，通式（I）的阴离子聚电解质的具有疏水基的单体的摩尔分数为xP1，其中xP1=p1/（s1+p1），xP1在2%至22%之间变化、尤其在4%至12%之间变化。
根据本发明的第二具体实施方式，根据本发明所考虑的阴离子聚电解质是下式（I’）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
其中：
-G’表示选自下列基团的疏水基：辛基-、十二烷基-、十四烷基-、十六烷基-、十八烷基-、9-十八烯基-；
●s1=（s1′+s1″）对应于在中性pH值下非接枝的天冬氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1=（p1′+p1″）对应于具有疏水基G’的天冬氨酸盐单体的平均数，且可以可选地是0，
-聚合度DP1=（s1+p1）小于或等于2,000、尤其小于700、更尤其在20至450的范围内、尤其在20至250的范围内、尤其在20至150的范围内，
-所述通式（I’）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
根据本发明的第二特别优选的实施方式，通式（I’）的阴离子聚电解质的具有疏水基的单体的摩尔分数为xP1，其中xP1=p1/（s1+p1），xP1在2%至22%、尤其在4%至12%之间变化。
根据一个特别有利的实施方式，根据本发明的阳离子聚电解质是下式（II）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸盐基团或如下文定义的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮进行结合的末端氨基酸残基，所述末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-，优选地α-生育酚基-；
-R2表示阳离子基团，尤其通过胺官能团结合的精氨酰胺；
-R3表示选自羟乙基氨基-、通过胺官能团结合的二羟丙基氨基-的中性基团；
●s2对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p2对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，
●r2对应于具有阳离子基团R2的谷氨酸盐单体的平均数，和
●t2对应于具有中性基团R3的谷氨酸盐单体的平均数，
s2、p2和t2可选地是0，且
-聚合度DP2=（s2+p2+r2+t2）小于或等于2,000，尤其小于700、尤其在40至450之间变化、尤其在40至250之间变化、尤其在40至150之间变化，
-所述通式（II）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
当然，对应于通式（II）的阳离子聚电解质使得聚电解质（r2-s2）的总电荷是正的。
根据本发明的特别优选的实施方式，通式（II）的阳离子聚电解质的具有疏水基的单体的摩尔分数为xP2，其中xP2=p2/（s2+p2+r2+t2），xP2在2%至22%之间变化，尤其在4%至12%之间变化。
当然，在本发明的方法中利用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的性质满足两种聚电解质中的至少一种聚电解质具有疏水侧基G。
聚电解质的平均分子量和聚合度以及对应于各个单元的摩尔分数的测定
在本发明的含义范围内，通过连接到尺寸排阻色谱装置的静态光散射检测仪测量聚合物的平均分子量。所保留的平均分子量是峰值分子量（Mp）。
在接枝聚（谷氨酸）的情况下，在以下条件下进行分析：
在水溶液中的接枝聚（谷氨酸）的样品通过添加0.1N的盐酸被沉淀、冻干、随后溶解在N-甲基吡咯烷酮（NMP）中且分析。
通过与包括三个连续的聚苯乙烯-共-二乙烯基苯色谱柱
Figure BDA0000367883190000101
Figure BDA0000367883190000102
和
Figure BDA0000367883190000103
的尺寸排阻色谱装置连接的18-角度（多角度）静态光散射检测仪，利用N-甲基吡咯烷来测量平均峰值分子量。
对应于构成聚电解质的各个单体单元（接枝或未接枝）AAi的摩尔分数xi在合适的溶剂中通过质子核磁共振（NMR）来测量。本领域的技术人员能够选择对于聚电解质的合适的溶剂以分析和确定分析条件。
在对应于式（I）的接枝聚（谷氨酸）的情况下，聚合物样品被冻干、溶解在含重氢的三氟乙酸中、随后通过配备有质子1H探针的300MHz的核磁共振波谱仪来分析。
具体地，通过这种方式确定对应于疏水基的平均摩尔接枝率的接枝有疏水基的单体单元的摩尔分数xp、阴离子单体单元的摩尔分数xa和阳离子单体单元的摩尔分数xc。
通过如上文所述的尺寸排阻色谱法测定的聚合物链的平均分子量除以聚电解质的单体单元的平均分子量MAAm来计算平均聚合度DP：DP=Mp/MAAm。
该单元的平均分子量是构成聚电解质的单元的分子量的平均值，每一分子量分别通过该单元的摩尔分数来衡量。因此，对于具有n个不同单体单元AAi的聚电解质来说（各个单元具有分子量MAAi和摩尔分数xi），平均分子量MAAm由下式给出：
MAAm=x1.MAA1+x2.MAA2+…+xn.MAAn
根据本发明的一个方面，在本发明的方法中利用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的数量和性质满足：在两种聚电解质的混合物中的阳离子基团的数量与阴离子基团的数量的摩尔比（以Z表示）在0.1和0.75之间或者在1.3和2之间。
优选地，摩尔比Z在0.3和0.75之间，尤其在0.5和0.75之间，或者在1.3和1.5之间。
关于在根据本发明的方法中制备纳米颗粒期间引入的聚电解质的数量和性质，可以通过下式来定义摩尔比Z：
Z = ( x c 2 . m 2 . C 2 . DP 2 / M 2 ) ( x a 1 . m 1 . C 1 . DP 1 / M 1 ) + ( x a 2 . m 2 . C 2 . DP 2 / M 2 )
其中：
-m1和m2分别表示在混合各自的聚合物质量浓度C1和C2（混合前）的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质之前的溶液的质量数；
-DP1和DP2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度；
-M1和M2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的摩尔质量；
-xc2表示阳离子聚电解质中具有阳离子基团的单体的摩尔分数；
-xa1和xa2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的具有阴离子基团的单体的摩尔分数。
根据本发明的另一方面，在本发明的方法中利用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的数量和性质满足：在混合物中的聚电解质的总质量浓度C严格小于2mg/g。
具体地，在混合物中的聚电解质的总质量浓度C在0.5mg/g和1.8mg/g之间，尤其在1mg/g和1.5mg/g之间。
在利用水溶液中的聚电解质的框架内，在本发明的方法的步骤（2）的最后获得的水溶液的根据本发明的聚电解质的总质量浓度C严格小于2mg/1g。
聚电解质的总质量浓度C定义如下：
C=（m1·C1+m2·C2）/（m1+m2），
其中，m1、m2、C1和C2如上文所限定。
根据第一实施方式，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度在50和220之间；
■阴离子聚电解质具有4%（摩尔百分比）至12%（摩尔百分比）的无规分布的疏水侧基。
根据第二实施方式，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度在50至220之间；
■t2是0，即，阳离子聚电解质没有中性基团；
■阳离子聚电解质和阴离子聚电解质都具有4%（摩尔百分比）至12%（摩尔百分比）的无规分布的疏水侧基。
根据第三实施方式，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度在50至220之间；
■阴离子聚电解质具有4%（摩尔百分比）至12%（摩尔百分比）的无规分布的疏水侧基；和
■阳离子聚电解质具有30%（摩尔百分比）至60%（摩尔百分比）的阳离子侧基，尤其是精氨酸。
根据第四实施方式，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度在50至220之间；
■阴离子聚电解质具有18%（摩尔百分比）至22%（摩尔百分比）的无规分布的疏水侧基。
纳米颗粒
如上文所述，根据本发明形成的纳米颗粒的平均直径小于或等于500nm。
优选地，纳米颗粒的尺寸可以在20nm至300nm之间变化、尤其在50nm至200nm之间变化。
纳米颗粒的尺寸通过准弹性光散射来测量。
通过准弹性光散射测量颗粒尺寸的测试
通过根据本领域的技术人员熟知的测量方法（例如使用ALV CGS-3类型的装置）获得的体积-平均流体力学直径表征颗粒尺寸。
通常，采用在0.15M NaCl介质中以1mg/g的浓度所制备且搅拌24小时的聚合物溶液进行测量。以0.8μm-0.2μm过滤这些溶液，然后通过动态光散射分析。
当使用ALV CGS-3类型的装置时，以波长为632.8nm的垂直偏振的He-Ne激光束操作，散射角是140°且信号采集时间是10分钟。对两个溶液样品重复测量三次。结果是6次测量的平均值。
在本发明的含义范围内，“阴离子纳米颗粒”是指在中性pH值下总电荷是负的纳米颗粒，“阳离子纳米颗粒”是指在中性pH值下总电荷是正的纳米颗粒。
活性成分
如上文所述，本发明的方法还可以利用至少一种活性成分。
因此，为了输送活性成分，可利用通过本发明的方法获得的纳米颗粒的制剂。
根据一个特别优选的实施方式，活性成分用在步骤（1）的水溶液中。有利地，活性成分非共价结合步骤（1）的水溶液中的纳米颗粒。
用来描述在一种或多种活性成分和聚电解质之间的关系的术语“结合”或“被结合”是指，活性成分通过非共价键物理相互作用、尤其是疏水相互作用、和/或静电相互作用和/或氢键和/或通过聚电解质的空间封装与聚电解质结合。
活性成分可以是具有医疗、美容或预防用途的分子或者用于成像方面的分子。
该活性成分优选地选自包括以下物质的组：蛋白质、糖蛋白、共价结合到一个或多个聚烷撑二醇链[优选聚乙二醇（PEG）]的蛋白质、肽、多糖、寡核苷酸、多核苷酸、合成药物以及它们的混合物。
更优选地，活性成分选自包括以下物质的子组：促红细胞生成素、交聚血红蛋白（haemoglobin raffimer）、它们的类似物或衍生物；催产素、后叶加压素、促肾上腺皮质激素、生长因子、血液因子、血红蛋白、细胞色素、白蛋白催乳素、促黄体素释放素（促黄体素释放激素或LHRH）或其类似物（如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、那法瑞林）；LHRH拮抗剂、LHRH竞争剂、人的生长激素、猪的生长激素或牛的生长激素（GH）、生长激素释放激素、胰岛素、生长激素抑制素、胰高血糖素，白细胞介素或其混合物，干扰素（例如α干扰素、α-2b干扰素、β干扰素、β-1a干扰素或γ干扰素）；胃泌激素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、胰泌素、降钙素、脑啡肽、内吗啡肽、血管紧张素、促甲状腺激素释放因子（TRF）、肿瘤坏死因子（TNF）、神经生长因子（NGF）、诸如本卡婆明（beclapermin）、曲弗明、安西司亭的生长因子、角质细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、肝素酶、骨形态发生蛋白（BMP）、人心房利钠肽(hANP)、胰高血糖素样肽（GLP-I）、其类似物和激动剂，尤其艾塞那肽、VEG-F、重组乙型肝炎抗原（rHBsAg）、肾素、细胞因子、缓激肽、杆菌肽素、多粘菌素、粘菌素、短杆菌酪肽、依那西普、伊米苷酶、除栓素（drotrecogin）α、环孢菌素及其合成类似物、酶的药学上活性的修饰和片段、细胞因子的药学上活性的修饰和片段、抗体的药学上活性的修饰和片段、抗原的药学上活性的修饰和片段和疫苗的药学上活性的修饰和片段，抗体（诸如利妥昔单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、依法利珠单抗和西妥昔单抗）。
其他活性成分是多糖（例如，肝素）和寡核苷酸或多聚核苷酸、DNA、RNA、iRNA、抗生素和活细胞、利培酮、珠氯噻醇、羟哌氟丙嗪、羟哌氯丙嗪、三氟噻吨、氟哌啶醇、氟斯必灵、喹硫平、氯氮平、氨磺必利、舒必利、齐拉西酮等。
更具体地，活性成分选自生长激素、α干扰素、降钙素和氟维司群。
有利地，根据本发明的方法获得的纳米颗粒的悬浮液适于通过肠胃外途径给药，尤其通过静脉注射。
优选地，纳米颗粒的悬浮液在20℃下且在10s-1的剪切速率下测量的粘度在在1mPa·s至500mPa·s、优选地从2mPa·s至200mPa·s的范围内。
使用标准设备，例如，具有锥板型的几何形状的加压流变仪（Gemini，Bohlin）（4cm和角度为2°），按照制造商的说明书在20℃下测量粘度。
根据一个具体实施方式，根据本发明的上文所述方法的步骤（2）的最后获得的纳米颗粒的悬浮液经受尤其是通过切向超滤或前置超滤、离心分离、蒸发或冻干的一个或多个浓缩步骤。
根据另一实施方式变型，根据本发明的方法可以包括对获得的颗粒的悬浮液脱水的步骤（例如，通过冻干或雾化），以便获得干粉末形式的颗粒。
有利地，以冻干形式的根据本发明的纳米颗粒是稳定的。此外，它们在冻干之后易于再分散。因此，根据本发明获得的纳米颗粒的悬浮液可以被冻干随后在水溶液中重构，而不影响获得的纳米颗粒的性能。
本发明的方法因此可以从根据本发明的组合物制备新的药学上的、植物检疫的食品、美容或营养制剂。
因此，本发明的步骤（2）的最后获得的纳米颗粒的悬浮液可以经历一个或多个随后的转化步骤，以便制备粉末、溶液、悬浮液、药片或明胶胶囊形式的组合物。
本发明的方法的最后获得的组合物尤其可以用来制备药剂。
组合物可以用于通过口服途径或肠胃外途径、尤其通过肠胃外途径和更具体地通过皮下途径来给药。
具体实施方式
通过以下实施例将更好地解释本发明，这些实施例仅通过例证方式给出。
实施例
实施例1
阴离子聚电解质PA的合成：
接枝有维生素E的聚谷氨酸盐（PA1至PA5）
在申请人的国际申请WO03/104303中特别描述了这样的聚合物的合成。接枝有十二烷醇的聚谷氨酸盐（PA6）
在申请人的国际申请WO00/30618中特别描述了这样的聚合物的合成。接枝有十八胺的聚天冬氨酸盐（PA7）
步骤1：通过使用L-天冬氨酸，根据与在Polymer（1997，38（18），4733-4736）中描述的方案类似的方案来制备聚琥珀酰亚胺。
步骤2：根据Langmuir（2001，17，7501）中描述的方案类似的方案，用十八胺氨解随后水解剩余的聚琥珀酰亚胺基团。
下文的表1描述了阴离子聚电解质PA的特征（符号p1和s1参考说明书的式（I）和式（I’）；符号xp1、xa1、DP1如说明书中的限定）。
表1
特征 DP1 M1（g/mol） xp1（%） xa1（%）
PA1（p1=5，s1=95） 220 37540 5 95
PA2（p1=5，s1=95） 100 17064 5 95
PA3（p1=2.5，s1=47.5） 50 8532 5 95
PA4（p1=10，s1=90） 100 19017 10 90
PA5（p1=20，s1=80） 100 22924 20 80
PA6（p1=17，6，s1=202，4） 220 35817 8 92
PA7（p1=2，s1=18） 20 3200 10 90
实施例2
阳离子聚电解质PC的合成：
接枝有维生素E和精氨酸的聚谷氨酸盐（PC1，PC2和PC3）
在申请人的国际申请WO2008/135563中特别描述了这些聚合物的合成。接枝有维生素E、精氨酸和乙醇胺的聚谷氨酸盐（PC4和PC5）
该聚合物的合成类似于聚合物PC1、PC2和PC3的合成，且额外包括乙醇胺接枝的步骤。在申请人的国际申请WO2006/079614中描述了该接枝步骤。
聚赖氨酸（PC6）
该产品可以购买、并且尤其来自Sigma Aldrich的编号P2658。
以下表2描述了阳离子聚电解质PC的特征（符号p2、r2、s2和t2参考说明书的式（II）；符号DP2、M2、xp2、xa2和xc2如说明书中上文所限定）。
表2
Figure BDA0000367883190000171
Figure BDA0000367883190000181
（a）t2是指在该情况下的中性羟乙氨基-接枝
实施例3
基于不同Z值的两种聚电解质PA和PC制备颗粒
阴离子聚电解质PA以10mM的NaCl溶液稀释以便获得浓度为C1的溶液。
阳离子聚电解质PC以10mM的NaCl溶液稀释以便获得浓度为C2的溶液。
根据所寻求的混合物是否具有过量的负电荷或过量的正电荷，该方法从而区别于加入的次序：
-对于寻求具有过量负电荷的混合物（在下表中的测试e1.1至测试e1.9），质量m1的浓度C1的阴离子聚电解质PA在温和搅拌条件下被置入烧杯中，随后加入质量m2的浓度C2的阳离子聚电解质PC。
-对于寻求具有过量正电荷的混合物（在下表中的测试e1.10至测试e1.11），质量m2的浓度C2的阳离子聚电解质PC在温和搅拌条件下被置入烧杯中，随后加入质量m1的浓度C1的阴离子聚电解质PA。
通过如上文所述的准弹性光散射测量所获得的纳米颗粒的直径。
通过测量中性pH值下的ζ电势来测量总的ζ电荷。
在下表3中示出了比率Z（阳离子基团/阴离子基团摩尔比）、在混合物中的聚电解质的总质量浓度C、直径和对于两种聚电解质PA和PC的溶液的不同的混合物形成的纳米颗粒的电势ζ的不同的值。
表3
Figure BDA0000367883190000191
结果表明，从根据本发明的阴离子聚电解质PA和阳离子聚电解质PC的混合物可以获得根据本发明的尺寸小于或等于500nm的纳米颗粒。
实施例4（比较）
具有在混合后的大于2mg/g的总聚合物浓度或具有严格大于0.75且严格小于1.3的电荷摩尔比Z的制剂
所用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质选自上文所述的聚电解质。
将m1用量的在10mM的NaCl溶液中浓度C1的实施例1中描述的阴离子聚电解质PA的溶液的加入到m2用量的在10mM的NaCl溶液中预先稀释到浓度C2的实施例2中描述的阳离子聚电解质。
表4
结果清楚地表明，在混合不是根据本发明的比率Z或浓度C的聚电解质之后获得的纳米颗粒大于500nm（不是根据本发明）。
实施例5
通过超滤法浓缩的根据本发明的制剂
总聚合物浓度为1.65mg/g的实施例3的制剂e1.9在具有10kDa截留分子量的膜上通过前置超滤以大约8的系数被浓缩。获取的最终的聚合物浓度（通过干提取物测量）是13.4mg/g。在浓缩之后的颗粒的尺寸（平均体积直径）是332nm且ζ电势是-37mV。
因此，该实施例表明，通过超滤可以浓缩获得的制剂而不会明显改变构成该制剂的颗粒的尺寸和ζ电势。
实施例6
根据本发明的包含作为活性成分的鲑降钙素（sCT）的制剂
sCT首先与阴离子聚电解质PA混合，由此获得的PA/sCT复合物随后与阳离子聚电解质PC混合。
更确切地，阴离子聚电解质PA以10mM的磷酸盐缓冲溶液进行稀释并且与含有10mg/g的sCT（Polypeptide Laboratories AB）的溶液混合，以便获得具有浓度C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp1的蛋白质sCT的PA/sCT混合物。该混合物在环境温度下温和搅拌1小时。
预先被稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC被添加到保持温和搅拌的质量m1的先前的PA/sCT混合物中。
最终的混合物具有总的聚合物浓度C和蛋白质浓度Cp。
通过在具有30kDa截留分子量的超滤器上超速离心分离和通过HPLC对滤液分析之后，确定没有结合到聚电解质的活性成分的浓度。在所有的情况中该浓度严格地小于5%。
在实施例1和实施例2中描述了用于该实施例的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的特征。
表5
Figure BDA0000367883190000211
结果表明，根据本发明的包含鲑降钙素和根据本发明的聚电解质的制剂由小于500nm的纳米颗粒组成。
实施例7
根据本发明的包含作为活性成分的鲑降钙素（sCT）的制剂。
sCT首先与阴离子聚电解质PA混合，随后所获得的PA/sCT络合物与阳离子聚电解质PC混合。
更确切地，阴离子聚电解质PA以10mM的NaCl溶液进行稀释并且与含有10mg/g sCT（Polypeptide Laboratories AB）的溶液混合以便获得具有浓度C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp1的sCT蛋白质的PA/sCT混合物。该混合物在环境温度下保持温和搅拌1小时。
将以10mM NaCl溶液预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC添加到保持温和搅拌的质量m1的先前的PA/sCT混合物。
最终的混合物具有总聚合物浓度C和蛋白质浓度Cp。
通过在具有30kDa截留分子量的超滤器上超速离心分离和通过HPLC对滤液分析之后，确定没有结合到聚电解质的活性成分的浓度。在所有的情况中该浓度严格地小于5%。
在实施例1和实施例2中描述了用于该实施例所用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的特征。
表6
Figure BDA0000367883190000221
结果表明，根据本发明的包含鲑降钙素和根据本发明的聚电解质的制剂由小于500nm的纳米颗粒组成。
实施例8
根据本发明的包含作为活性成分的干扰素α-2b（IFNα）的制剂
IFNα首先与阴离子聚电解质PA混合，随后获得的PA/IFNα络合物与阳离子聚电解质PC混合。更确切地：
阴离子聚电解质PA以10mM的NaCl溶液进行稀释。随后添加含有2.3mg/g的IFNα（Biosidus）的溶液以获得具有浓度C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp1的IFNα蛋白质的PA/IFNα混合物。该混合物在环境温度下保持温和搅拌14小时。
以10mM的NaCl溶液预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC被添加到保持搅拌的质量m1的先前的PA/IFNα混合物中。随后搅拌该混合物1小时。
最终的混合物具有总聚合物浓度C和蛋白质浓度Cp。
在实施例1和实施例2中描述了对于该实施例所用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的特征。
表7
Figure BDA0000367883190000231
结果表明，根据本发明的包含IFNα和根据本发明的聚电解质的制剂由小于200nm的纳米颗粒组成。
实施例9
根据本发明的包含氟维司群的制剂
氟维司群首先与阴离子聚电解质PA5混合，随后获得的PA5/氟维司群复合物与阳离子聚电解质PC1混合。
更确切地，阴离子聚电解质PA5以10mM的NaCl溶液进行稀释并且与粉末形式的氟维司群（ScimoPharm台湾）混合以便获得具有浓度C1的阴离子聚电解质PA5和浓度Cp的活性成分的PA5/氟维司群混合物。该混合物在30℃下保持温和搅拌24小时。
以10mM的NaCl溶液预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC被添加到保持温和搅拌的质量m1的先前的PA5/氟维司群混合物中。
最终的混合物具有总的聚合物浓度C和活性成分浓度Cp。
表8
Figure BDA0000367883190000241

Claims (15)

1.一种用于制备平均直径小于或等于500nm的纳米颗粒的方法，所述方法至少包括以下步骤：
1）制备包括携带疏水侧基的带电状态的第一聚电解质的纳米颗粒的水溶液；
2）使所述溶液（1）和极性与所述第一聚电解质的极性相反的至少一种第二聚电解质相混合，其中阳离子聚电解质被加入到阴离子聚电解质的溶液中以形成带有过量负电荷的混合物；或者阴离子聚电解质被加入到阳离子聚电解质的溶液中以形成带有过量正电荷的混合物；和
3）形成纳米颗粒；
其中：
-所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质具有聚氨基酸直链骨架，不含有聚烷撑二醇侧基，且具有小于或等于2,000的聚合度；
-在所述两种聚电解质的混合物中的阳离子基团的数量与阴离子基团数量的摩尔比Z在0.1和0.75之间或者在1.3和2之间；以及
-在所述混合物中的聚电解质的总质量浓度C严格小于2mg/g。
2.根据前一项权利要求所述的方法，其特征在于，在所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物中的阳离子基团的数量与阴离子基团的数量的摩尔比Z在0.3和0.75之间、尤其在0.5和0.75之间、或者在1.3和1.5之间。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述混合物中的聚电解质的总质量浓度C在0.5mg/g和1.8mg/g之间、尤其在1mg/g和1.5mg/g之间。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在5至8范围内的pH下制备所述混合物，尤其在6至7.5范围内的pH值下制备所述混合物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2）至少包括：
-制备所述第二聚电解质的水溶液，所述第二聚电解质的水溶液尤其具有5至8范围内的pH值，以及有利地具有与步骤1）的水溶液的pH值相同的pH值；和
-将所述第二聚电解质的所述水溶液与步骤1）的所述水溶液混合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒的尺寸在20nm至300nm之间变化、优选地在50nm至200nm之间变化。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，当具有疏水侧基的所述聚电解质被分散在pH在5至8范围中的水性介质中时，所述聚电解质能够自发地形成纳米颗粒，所述水性介质尤其是水。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子聚电解质是以下分子式（I）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2酰基至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸酯基或如下文限定的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮进行结合的末端氨基酸残基，所述末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基，或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-R1表示氢原子或一价金属阳离子，优选地为钠离子或钾离子，
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-，优选地为α-生育酚基；
●s1对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，
p1可选地是0，
-聚合度DP1=（s1+p1）小于或等于2,000，尤其小于700、尤其在40到450的范围中、尤其在40到250的范围中、尤其在40到150的范围中，
-所述通式（I）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子聚电解质是下式（I’）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
Figure FDA0000367883180000031
其中：
-G’表示选自下列基团的疏水基：辛基-、十二烷基-、十四烷基-、十六烷基-、十八烷基-、9-十八烯基-；
●s1=（s1'+s1″）对应于在中性pH值下非接枝的天冬氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1=（p1'+p1″）对应于具有疏水基G’的天冬氨酸盐单体的平均数且能够可选地为0，
p1可选地是0，
-聚合度DP1=（s1+p1）小于或等于2,000、尤其小于700、尤其在20至450的范围中，尤其在20至250的范围中、尤其在20至150的范围中，
-所述通式（I’）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述阳离子聚电解质是下式（II）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
Figure FDA0000367883180000041
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸盐基团或如下文定义的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮进行结合的末端氨基酸残基，所述末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-，优选地α-生育酚基-；
-R2表示阳离子基团，尤其是精氨酸；
-R3表示选自羟乙基氨基-、二羟丙基氨基-的中性基团；
●s2对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p2对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，和
●r2对应于具有阳离子基团R2的谷氨酸盐单体的平均数，
●t2对应于具有中性基团R3的谷氨酸盐单体的平均数，
s2、p2和t2可选地是0，且
-聚合度DP2=（s2+p2+r2+t2）小于或等于2,000，尤其小于700，尤其在40至450之间变化、尤其在40至250之间变化、尤其在40至150之间变化，
-所述通式（II）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述水溶液（1）的所述第一聚电解质的所述纳米颗粒与活性成分非共价结合。
12.根据前一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述活性成分是具有治疗、美容或预防用途的分子或者用于成像的分子。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，通过将所述活性成分添加到所述第一聚电解质的水性胶体溶液中来获得所述水溶液（1），所述水溶液尤其具有5到8范围内的pH值，所述活性成分非共价结合所述第一聚电解质的所述纳米颗粒。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤3）之后包括尤其是通过切向超滤或前置超滤、离心分离、蒸发或冻干而进行的一个或多个浓缩步骤。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤3）之后包括尤其是通过冻干或雾化对获得的颗粒的悬浮液进行脱水的步骤。
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