CN103370052A - 包括至少一种活性剂和至少两种聚电解质的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型纳米颗粒，该纳米颗粒包括至少一种活性剂和至少两种具有相反极性的聚电解质，其特征尤其在于，所述两种聚电解质中的至少一种聚电解质具有疏水侧基，且所述两种聚电解质中的至少一种聚电解质具有聚亚烷基二醇侧基，所述纳米颗粒的平均直径为10nm至100nm且含有的聚亚烷基二醇基团的用量满足：相对于聚合物总量，聚亚烷基二醇的重量比（wPAG）不低于0.05。

Description

包括至少一种活性剂和至少两种聚电解质的纳米颗粒
技术领域
本发明涉及一种通过至少两种相反极性的特定聚电解质和至少一种活性成分形成的新型纳米颗粒，且涉及包括所述纳米颗粒的制剂。
背景技术
活性成分的制剂必须符合一定数量的耐受性标准、具有足够浓度的活性成分、同时具有低粘度以便可以容易地注射通过具有较小直径的针头，例如，27-规格至31-规格的针。
在该领域中，如文献WO2008/135561中所述，申请人的公司已经成功地开发了具有低粘度的稳定的悬浮液，该悬浮液由装载有活性成分的微粒构成。能够在较长时期内释放活性成分的这些微粒，在特定条件下尤其由相反极性的两种聚电解质聚合物（PE1）和（PE2）的混合物制成，这两种聚电解质中的至少一种聚电解质聚合物具有疏水基。该混合物产生尺寸在1μm和100μm之间的微粒。
然而，微粒的制剂不适合静脉给药，并且，在通过皮下注射给药的情况下，该制剂会产生不耐受的问题。
因此，从通过肠胃外给药活性成分的观点来看（尤其是静脉注射或皮下注射），优选采用甚至更小尺寸的颗粒的悬浮液，且尤其是纳米尺度的颗粒的悬浮液。
此外，活性成分的皮下注射给药需要限制注射剂量的体积，例如，小于或等于1mL，因此需要充分浓缩活性成分的制剂。该限制尤其限于肽或一些小分子，其医用剂量通常较高。
此外，从稀释的悬浮液获得活性成分的颗粒的浓缩悬浮液是受限制的，尤其需要应用一个或多个浓缩阶段来产生可以给药到患者的剂量。
因此，仍然需要活性成分的纳米粒子的稳定制剂，其充分浓缩而具有低粘度，特别是适于通过肠胃外给药，尤其是通过静脉注射给药。
发明内容
本发明具体目的是提出一种新型纳米颗粒，以及含有该纳米颗粒的新型组合物，该新型纳米颗粒和新型组合物能够满足所有上述需要。
对于所有期望，发明人已经发现，从特定聚电解质的混合物可以获得装载活性成分的纳米颗粒的浓缩流体制剂。
更确切地，根据第一方面，本发明涉及一种通过至少一种活性成分和至少两种相反极性的聚电解质形成的新型纳米颗粒，该聚电解质具有聚氨基酸直链骨架且具有小于或等于2,000的聚合度，其特征在于：
-两种聚电解质中的至少一种聚电解质具有疏水侧基；
-两种聚电解质中的至少一种聚电解质具有聚亚烷基二醇侧基；
所述纳米颗粒具有从10nm至100nm的范围的平均直径且包括大量的聚亚烷基二醇基团使得，相对于聚合物总量，聚亚烷基二醇的质量比wPAG大于或等于0.05，尤其在0.05和0.75之间，尤其在0.05和0.6之间，尤其在0.05和0.5之间，且优选在0.05和0.3之间。
具体地，相对于聚合物总量，聚亚烷基二醇的质量比wPAG在0.1至0.75的范围内，尤其在0.15至0.6的范围内，尤其在0.15至0.5的范围内，且优选地在0.15到0.3的范围内。
有利地，根据本发明所考虑的聚电解质是生物相容性的。它们优选是耐受性的且快速降解，即，数天至数周的时间尺度上。
根据另一方面，本发明涉及一种组合物，尤其是药物组合物，该组合物至少包括如上文限定的纳米颗粒。
具体地，根据本发明的纳米颗粒作为用于蛋白质和肽活性成分和/或用于溶解低分子量的活性成分的载体证实是特别有利的。
此外，根据本发明的纳米颗粒能够有利地在较长时期内释放活性成分。
此外，本发明的纳米级尺寸的颗粒特别适于通过静脉途径或皮下途径给药活性成分的制剂。因此，关于用来治疗癌症的活性成分的肠胃外给药，本发明证实是特别有利的。
已经描述了聚电解质的各种制剂。
因此，Kabanov等在Macromolecules（1996，29，6797-6802）中描述了通过相反极性的两种聚电解质的络合形成的纳米颗粒，更确切地，作为阴离子聚电解质的二嵌段聚（甲基丙烯酸钠）-b-PEO和作为阳离子聚电解质的聚（溴化N-乙基-4-乙烯吡啶）。然而，难以构思该类型的不可生物降解的聚电解质的肠胃外给药。
Kataoka等、Lee Y.和Kataoka K.在文献Soft Matter（2009，5，3810-17）以及Osada K.等在文献J.R.Soc.Interface（2009，6，S325-S339）中描述了多离子的微胶粒，该微胶粒特别是由聚（乙二醇）-聚氨基酸嵌段共聚物形成，用于活性成分的肠胃外给药，尤其是例如阿霉素的抗癌活性成分的肠胃外给药。
Sonaje等在Biomaterials（2010，31，3384-3394）中描述了通过壳聚糖与p-γ谷氨酸的络合、结合胰岛素获得的聚电解质络合物。
然而，就发明人所知，还没有提出符合本发明的上述特定需要的结合两种聚电解质的纳米颗粒。
根据另一方面，本发明涉及一种用于制备平均直径在从10nm至100nm的范围中的纳米颗粒的方法，其特征在于，所述方法至少包括下列步骤：
（1）制备包括第一聚电解质的纳米颗粒的水溶液，所述第一聚电解质为带电状态且具有疏水侧基，所述纳米颗粒非共价地结合活性成分；
（2）将所述溶液（1）和极性与所述第一聚电解质的极性相反的至少一种第二聚电解质混合到一起，以形成所述纳米颗粒；和
所述第一聚电解质和第二聚电解质中的至少一种具有聚亚烷基二醇侧基，所述聚亚烷基二醇基团的数量满足：聚亚烷基二醇相对于聚合物总量的质量比wPAG大于或等于0.05；
所述第一聚电解质和第二聚电解质具有聚氨基酸直链骨架，且具有小于或等于2,000的聚合度。
具体地，通过将活性成分添加到所述第一聚电解质的水性胶体溶液来获得所述水溶液（1），所述第一聚电解质的水性胶体溶液尤其具有从5到8之间范围的pH值，所述活性成分非共价地结合所述第一聚电解质的纳米颗粒。
根据本发明的活性成分的纳米颗粒的制剂还在多个方面证实是特别有利的。
首先，根据本发明的纳米颗粒的悬浮液有利地具有优异的稳定性。此外，混合可以在高浓度下来实施而无需损害悬浮液的物理化学性能（尤其是在粘度、颗粒尺寸、胶体或化学稳定性方面）。因此，根据本发明可以获得纳米颗粒的稳定悬浮液，该悬浮液是流体且被充分浓缩。具体地，根据本发明获得的悬浮液不需要应用随后的浓缩阶段。因此，本发明可以配置“待用”的流体悬浮液，尤其用于通过静脉注射给药。换句话说，该悬浮液可适于以在上述方法的最后获得的形式给药到患者。
此外，根据本发明的纳米颗粒的悬浮液容易有助于冻干且有助于水相重构，而不影响所获得的性能。
此外，通过简单地混合如上文所述制备的两种液体悬浮液，可以在给药时临时制备根据本发明的纳米颗粒的悬浮液。因此，可以容易地保存这些纳米颗粒的悬浮液，这可以构思在产业规模上限制生产成本。
最后，在水化法中使用活性成分，该水化法不需要过高的温度、明显的剪切、表面活性剂或有机溶剂，其可有利地避免活性成分的任何潜在的降解。该特征对于一些活性成分（例如，肽和蛋白质）是特别有利的，当这些活性成分经受前述条件时可能降解。
活性成分
关于活性成分，其可以是具有医疗、美容或预防用途的分子或者用于成像的分子。
该活性成分优选地选自包括以下物质的组：蛋白质、糖蛋白、共价结合到一个或多个聚亚烷基二醇链[优选聚乙二醇（PEG）]的蛋白质、肽、多糖、寡核苷酸、多核苷酸、合成药物以及它们的混合物。
更优选地，活性成分选自包括以下物质的子组：促红细胞生成素、交聚血红蛋白（haemoglobin raffimer）、其类似物或衍生物；催产素、后叶加压素、促肾上腺皮质激素、生长因子、血液因子、血红蛋白、细胞色素、白蛋白催乳素、促黄体素释放素（促黄体激素释放激素或LHRH）或其类似物（如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林、那法瑞林）；LHRH拮抗剂、LHRH竞争剂、人的生长激素、猪的生长激素或牛的生长激素（GH）、生长激素释放激素、胰岛素、生长激素抑制素、胰高血糖素，白细胞介素或其混合物，干扰素（例如α干扰素、α-2b干扰素、β干扰素、β-1a干扰素或γ干扰素）；胃泌激素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、胰泌素、降钙素、脑啡肽、内吗啡肽、血管紧张肽、促甲状腺激素释放因子（TRF）、肿瘤坏死因子（TNF）、神经生长因子（NGF）、生长因子（诸如本卡婆明（beclapermin）、曲弗明、安西司亭）、角质细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、肝素酶、骨形态发生蛋白（BMP）、人心房利钠肽(hANP)、胰高血糖素样肽（GLP-I）、其类似物和激动剂，尤其是艾塞那肽、VEG-F、重组乙型肝炎抗原（rHBsAg）、肾素、细胞因子、环孢菌素及其合成类似物、酶的药学上活性的修饰和片段、细胞因子的药学上活性的修饰和片段、抗体的药学上活性的修饰和片段、抗原的药学上活性的修饰和片段和疫苗的药学上活性的修饰和片段，抗体（诸如利妥昔单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、依法利珠单抗和西妥昔单抗）。
其他活性成分是多糖（例如，肝素）和寡核苷酸或多聚核苷酸、DNA、RNA、iRNA、抗生素和活细胞、利培酮、珠氯噻醇、羟哌氟丙嗪、羟哌氯丙嗪、三氟噻吨、氟哌啶醇、氟斯必灵、喹硫平、氯氮平、氨磺必利、舒必利、齐拉西酮等。
更具体地，活性成分选自生长激素、胰岛素、降钙素、氟维司群和细胞因子。
聚电解质
如上文所述，根据本发明的纳米颗粒包括至少两种相反极性的聚电解质，换句话说，根据本发明的纳米颗粒包括至少一种阴离子聚电解质和至少一种阳离子聚电解质。
在本发明的含义内，“聚电解质”是指具有能够在水中离子化的基团的聚合物，尤其在从5至8范围内的pH下，该离子化在聚合物上产生电荷。因此，在诸如水的极性溶剂的溶液中，聚电解质离解，从而导致在其主链上出现电荷以及在溶液中出现抗衡离子。
例如，聚电解质的羧酸和胺官能团根据溶液的pH值分别是-COOH或-COO-和NH2或NH3 +的形式，通过溶液中存在的抗衡阳离子和抗衡阴离子而确保中性。
在聚电解质包括酸基的情况下，化合物可以是盐的形式。盐的选择根据专业人员的能力来进行。例如，具体地，抗衡阳离子可以是一价金属阳离子，优选地是钠离子或钾离子。在聚电解质包括胺基的情况下，具体地，抗衡阴离子可以是氯离子、乙酸根离子或铵离子。
根据本发明的聚电解质可以包括一组相同或不同的电解质基团。
除非另外指明，在说明书的剩余部分中，所述聚电解质被描述为在导致形成根据本发明的纳米颗粒的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物的pH值下出现的聚电解质。例如，作为“阳离子”或者作为“阴离子”的基团的描述根据在阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物的该pH值下该基团携带的电荷来考虑。类似地，聚电解质的极性根据在该pH值下由该聚电解质携带的总电荷来定义。
具体地，导致形成根据本发明的纳米颗粒的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物的pH值在从5至8的范围内、优选地在从6至7.5的范围内。
更具体地，“阴离子聚电解质”是指在两种聚电解质的混合物的pH值下具有负的总电荷的聚电解质。
类似地，“阳离子聚电解质”是指在两种聚电解质的混合物的pH值下具有正的总电荷的聚电解质。
聚电解质的“总电荷”是指通过该聚电解质携带的所有的正电荷和负电荷的代数和。
聚氨基酸直链骨架
如上文所述，根据本发明考虑的聚电解质具有聚氨基酸直链骨架，即，包括氨基酸残基。
有利地，根据本发明的聚电解质是生物可降解的。
在本发明的含义内，术语“聚氨基酸”包括天然聚氨基酸和合成聚氨基酸两者。
聚氨基酸是直链聚合物，有利地由通过肽键连接的α氨基酸构成。
对于制备嵌段共聚物或无规共聚物、多链聚合物以及含有特定氨基酸序列的聚合物，存在大量的合成技术（参见Encyclopedia of Polymer Science andEngineering，第12卷，第786页；John Wiley&Sons）。
本领域的技术人员能够借助其知识实施这些技术以便获得适用于本发明的聚合物。具体地，还可以参考文献WO96/29991、WO03/104303、WO2006/079614、WO2008/135563和Kang等（Langmuir2001，17，7501-7506）的教导。
根据优选的实施方式变型，通过α-L-谷氨酸盐或α-L-谷氨酸的均聚物构成聚氨基酸链。
根据另一实施方式变型，通过α-L-天冬氨酸盐或α-L-天冬氨酸的均聚物构成聚氨基酸链。
根据另一实施方式变型，通过α-L-天冬氨酸盐/α-L-谷氨酸盐、α-L-天冬氨酸/α-L-谷氨酸、α/β-L-天冬氨酸盐或α/β-L-天冬氨酸的共聚物构成聚氨基酸链。
根据另一实施方式变型，通过聚-L-赖氨酸的均聚物构成聚氨基酸链。
在文献WO03/104303、WO2006/079614和WO2008/135563中具体地描述了这样的聚氨基酸，这些文献的内容以引用的方式并入本文。这些聚氨基酸还可以是专利申请WO00/30618中描述的那些聚氨基酸的类型。
这些聚合物可以通过本领域的技术人员已知的方法来获得。
根据本发明可以使用的一定数量的聚合物，例如具有可变质量的聚（α-L-谷氨酸）、聚（α-D-谷氨酸）、聚（α-D,L-谷氨酸盐）、聚（γ-L-谷氨酸）和聚（L-赖氨酸）类型的聚合物是市售的。
根据专利申请FR2801226中描述的途径也可以合成聚（L-谷氨酸）。
根据一个特别有利的实施方式，根据本发明所考虑的阴离子聚电解质是以下分子式（I）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸酯基或如下文限定的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮结合的末端氨基酸残基，该末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-，优选地为α-生育酚基-；
-PAG表示聚亚烷基二醇，优选为摩尔质量在1,800g/mol至6,000g/mol范围内的聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇，尤其是摩尔质量在2,000g/mol至6,000g/mol范围内的聚乙二醇；
●s1对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，
●q1对应于具有聚亚烷基二醇基团的谷氨酸盐单体的平均数，
p1和q1可选地是0，
-聚合度DP1=（s1+p1+q1），DP1小于或等于2,000，尤其小于700、尤其在从40到450的范围中，尤其在从40到250的范围中、尤其在从40到150的范围中，
-所述通式（I）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
根据本发明的特别优选的实施方式，通式（I）的阴离子聚电解质的具有疏水基的单体的摩尔分数xP1满足xP1=p1/（s1+p1+q1），xP1从2%至22%变化、尤其从4%至12%变化，且甚至从4%至6%变化。
根据本发明的第二具体实施方式，根据本发明所考虑的阴离子聚电解质是下式（I’）的聚电解质或者其药学上可接受的盐的一种，
Figure BDA0000367925920000091
其中：
-G’表示选自辛基-、十二烷基-、十四烷基-、十六烷基-、十八烷基-、9-十八烯基-的疏水基；
●s1=（s1′+s1″）对应于在中性pH值下非接枝的天冬氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1=（p1′+p1″）对应于具有疏水基G’的天冬氨酸盐单体的平均数，且可以可选地为0，
-聚合度DP1=（s1+p1）小于或等于2,000、尤其小于700、更尤其在20至450的范围内、尤其在20至250的范围内、尤其在20至150的范围内，
-所述通式（I’）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
根据本发明的第二特别优选的实施方式，通式（I’）的阴离子聚电解质的具有疏水基的单体的摩尔分数xP1满足xP1=p1/（s1+p1），xP1从2%至22%变化、尤其从4%至12%变化。
根据一个特别有利的实施方式，根据本发明的阳离子聚电解质是下式（II）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸酯基或如下文定义的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮结合的末端氨基酸残基，该末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-，优选地α-生育酚基-；
-PAG表示聚亚烷基二醇，优选是摩尔质量在1,800g/mol至6,000g/mol范围内的聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇，尤其是摩尔质量在2,000g/mol至6,000g/mol范围内的聚乙二醇；
-R2表示阳离子基团，尤其通过胺官能团结合的精氨酰胺；
-R3表示选自羟乙基氨基-、通过胺官能团结合的二羟丙基氨基-的中性基团；
●s2对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p2对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，
●q2对应于具有聚亚烷基二醇基团的谷氨酸盐单体的平均值，
●r2对应于具有阳离子基团R2的谷氨酸盐单体的平均数，和
●t2对应于具有中性基团R3的谷氨酸盐单体的平均数，
s2、p2、q2和t2可选地是0，且
-聚合度DP2=（s2+p2+q2+r2+t2），DP2小于或等于2,000，尤其小于700，更尤其从40至450变化、尤其从40至250变化、尤其从40至150变化；
-所述通式（II）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
当然，对应于通式（II）的阳离子聚电解质使得聚电解质（r2-s2）的总电荷是正的。
根据本发明的特别优选的实施方式，通式（II）的阳离子聚电解质的具有疏水基的单体的摩尔分数xP2满足xP2=p2/（s2+p2+q2+r2+t2），xP2从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化，更尤其从4%至6%变化。
根据一个特别有利的实施方式，根据本发明的阳离子聚电解质是下式（II’）的聚电解质或者其药学上可接受的盐中的一种，
Figure BDA0000367925920000121
其中：
-X-表示抗衡阴离子，尤其氯离子、乙酸根离子或铵离子：
-PAG表示表示聚亚烷基二醇，优选地为摩尔质量在1,800g/mol至6,000g/mol范围内的聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇，尤其是摩尔质量在2,000g/mol至6,000g/mol范围内的聚乙二醇；
●q2对应于具有聚亚烷基二醇基团的赖氨酸单体的平均值，
●r2对应于在中性pH值下非接枝的赖氨酸单体阳离子的平均数，
q2可选地是0，且
-聚合度DP2=（p2+r2），DP2小于或等于2,000，尤其小于700，更尤其从40至450变化、尤其从40至250变化、尤其从40至150变化；
-所述通式（II’）的单体的链构型可以是无规、单嵌段或多嵌段类型。
聚电解质的平均分子量和聚合度以及对应于各个单元的摩尔分数的测定
在本发明的含义范围内，通过连接到尺寸排阻色谱装置的静态光散射检测仪测量聚合物的平均分子量。所保留的平均分子量是峰值分子量（Mp）。
在接枝聚（谷氨酸）的情况下，在以下条件下进行分析：
在水溶液中的接枝聚（谷氨酸）的样品通过添加0.1N的盐酸被沉淀、冻干、随后溶解在N-甲基吡咯烷酮（NMP）中且分析。
通过与包括三个连续的聚苯乙烯-共-二乙烯基苯色谱柱（
Figure BDA0000367925920000122
、
Figure BDA0000367925920000123
和
Figure BDA0000367925920000124
）的尺寸排阻色谱装置连接的18-角度（多角度）静态光散射检测仪，利用N-甲基吡咯烷来测量平均峰值分子量。
对应于构成聚电解质的各个单体单元（接枝或未接枝）AAi的摩尔分数xi在合适的溶剂中通过质子核磁共振（NMR）来测量。本领域的技术人员能够选择对于聚电解质的合适的溶剂以分析和确定分析条件。
在对应于式（I）的接枝聚（谷氨酸）的情况下，聚合物样品被冻干、溶解在含重氢的三氟乙酸中、随后通过配备有质子1H探针的300MHz的核磁共振波谱仪来分析。
具体地，通过这种方式确定对应于疏水基的平均摩尔接枝率的接枝有疏水基的单体单元的摩尔分数xp、接枝有聚亚烷基二醇的单体单元的摩尔分数xPAG、阴离子单体单元的摩尔分数xa和阳离子单体单元的摩尔分数xc。
通过如上文所述的尺寸排阻色谱法确定的聚合物链的平均分子量除以聚电解质的单体单元的平均分子量MAAm来计算平均聚合度DP：DP=Mp/MAAm。
该单元的平均分子量是构成聚电解质的单元的分子量的平均值，每一分子量分别通过该单元的摩尔分数来衡量。因此，对于具有n个不同单体单元AAi的聚电解质来说（各个单元具有分子量MAAi和摩尔分数xi），平均分子量MAAm由下式给出：
MAAm=x1.MAA1+x2.MAA2+…+xn.MAAn
当然，对应于上述各式（I）、（I’）、（II）和（II’）的根据本发明的纳米颗粒的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
-两种聚电解质的至少一种具有疏水侧基G或G’；
-两种聚电解质的至少一种具有聚亚烷基二醇侧基PAG，尤其是聚乙二醇PEG，
阴离子聚电解质和/或阳离子聚电解质具有的所述聚亚烷基二醇基团的数量满足：相对于聚合物总量，聚亚烷基二醇的质量比wPAG大于或等于0.05，尤其在0.05和0.75之间，尤其在0.05和0.6之间，尤其在0.05和0.5之间且优选在0.05和0.3之间。优选地，wPAG在0.1和0.75之间，优选在0.15和0.6之间，优选在0.15和0.5之间，优选在0.15和0.3之间。
在混合阴离子聚电解质和阳离子聚电解质之后的质量比wPAG可以从下式计算：
w PAG = ( x PAG 1 . m 1 . c 1 . ( DP 1 / M 1 ) . M PAG 1 ) + ( x PAG 2 . m 2 . c 2 . ( DP 2 / M 2 ) . M PAG 2 ) ( m 1 . c 1 ) + ( m 2 . c 2 )
其中：
-xPAG1和xPAG2表示具有通过阴离子聚电解质和阳离子聚电解质分别具有的聚亚烷基二醇基团的单体的摩尔分数；
-MPAG1和MPAG2表示具有通过阴离子聚电解质和阳离子聚电解质分别具有的聚亚烷基二醇接枝的摩尔质量；
-m1和m2分别表示在混合各自的聚合物质量浓度C1和C2（混合前）的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质之前的溶液的质量数；
-DP1和DP2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度；
-M1和M2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的摩尔质量；
根据第一实施方式，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度在40和250之间，优选在40和110之间；
■两种聚电解质中仅一种具有无规分布的疏水侧基，
■两种聚电解质中仅一种具有无规分布的聚亚烷基二醇类型的侧基，尤其摩尔质量在2,000g/mol和6,000g/mol之间的聚乙二醇基团，
■t2是0，即，阳离子聚电解质没有中性基团；
■相对于两种聚电解质的混合物中的阴离子基团的数量，阳离子基团的数量的摩尔比Z在0.1和2.2之间，优选在0.1和2之间，优选在0.4和1.5之间。
根据第二实施方式，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度在40至250之间，优选在40至110之间；
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质两者具有无规分布的疏水侧基；
■两种聚电解质中仅一种具有无规分布的聚亚烷基二醇类型的侧基，尤其摩尔质量在2,000g/mol和6,000g/mol之间的聚乙二醇基团；
■t2是0，即，阳离子聚电解质没有中性基团；
■相对于两种聚电解质的混合物中的阴离子基团的数量，阳离子基团的数量的摩尔比Z在0.1和2.2之间，优选在0.1和2之间，优选在0.4和1.5之间。
根据第三实施方式，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度在40至250之间，优选在40至110之间；
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质两者具有无规分布的疏水侧基；
■阴离子聚电解质和阳离子聚电解质两者具有无规分布的聚亚烷基二醇侧基，尤其摩尔质量在2,000g/mol和6,000g/mol之间的聚乙二醇基团；
■t2是0，即，阳离子聚电解质没有中性基团；
■相对于两种聚电解质的混合物中的阴离子基团的数量，阳离子基团的数量的摩尔比Z在0.1和2.2之间，优选在0.1和2之间，优选在0.4和1.5之间。
在下列变型中描述了根据本发明的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的特别优选的组合的示例。
根据第一优选实施方式变型，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■在阴离子聚电解质中的疏水基的摩尔分数xP1从2至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■在阴离子聚电解质中的聚亚烷基二醇基团的摩尔分数xPAG1是0；
■在阳离子聚电解质中的疏水基的摩尔分数xP2是0；
■在阳离子聚电解质中的聚亚烷基二醇基团的摩尔分数xPAG2从2至10%变化，尤其从2%至6%变化。
根据第二优选实施方式变型，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化；
■摩尔分数xP2是0；和
■摩尔分数xPAG2是0。
根据第三优选实施方式变型，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化；
■摩尔分数xP2从5%至20%变化，尤其从5%至10%变化；和
■摩尔分数xPAG2是0。
根据第四优选实施方式变型，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1是0；
■摩尔分数xP2从5%至20%变化，尤其从5%至10%变化；和
■摩尔分数xPAG2从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化。
根据第五优选实施方式变型，阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化；
■摩尔分数xP2从5%至20%变化，尤其从5%至10%变化；和
■摩尔分数xPAG2从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化。
纳米颗粒
如上文所述，根据本发明形成的纳米颗粒的平均直径在10nm至100nm的范围内。
优选地，纳米颗粒的尺寸可以从10nm至70nm变化、尤其从10nm至50nm变化。
纳米颗粒的尺寸通过准弹性光散射来测量。
用于通过准弹性光散射测量颗粒尺寸的测试
通过根据本领域的技术人员熟知的测量方法（例如使用ALV CGS-3类型的装置）获得的体积-平均流体力学直径表征颗粒尺寸。
通常，采用在0.15M NaCl介质中以1mg/g的浓度所制备且搅拌24小时的聚合物溶液进行测量。在0.8μm至0.2μm尺度上过滤这些溶液，然后通过动态光散射分析。
当使用ALV CGS-3类型的装置时，以波长为632.8nm的垂直偏振的He-Ne激光束操作，散射角是140°且信号采集时间是10分钟。对两个溶液样品重复测量三次。结果是6次测量的平均值。
纳米颗粒的制备
通过混合第一聚电解质的溶液与相反极性的第二聚电解质的溶液可以获得根据本发明的纳米颗粒，所述第一聚电解质和第二聚电解质满足：相对于聚合物总量，聚亚烷基二醇的质量比wPAG大于或等于0.05。
根据本发明的纳米颗粒尤其可以根据至少包括下列步骤的方法来制备：
（1）制备包括第一聚电解质的纳米颗粒的水溶液，所述第一聚电解质为带电状态且具有疏水侧基，所述纳米颗粒非共价地结合活性成分；
（2）将所述溶液（1）和极性与所述第一聚电解质的极性相反的至少一种第二聚电解质混合到一起；和
所述第一聚电解质和第二聚电解质中的至少一种具有聚亚烷基二醇侧基，所述聚亚烷基二醇基团的数量满足：相对于聚合物总量，聚亚烷基二醇的质量比wPAG大于或等于0.05，尤其在0.05和0.75之间，尤其在0.05和0.6之间，尤其在0.05和0.5之间，且优选在0.05和0.3之间；
所述第一聚电解质和第二聚电解质具有聚氨基酸直链骨架，且聚合度小于或等于2,000、优选小于700、尤其在40至450的范围内、尤其在40至250的范围内，且尤其在40至150的范围内。
根据一个具体实施方式，wPAG在0.1和0.75之间，优选在0.15和0.6之间，优选在0.15和0.5之间，优选在0.15和0.3之间。
具体地，第一聚电解质和第二聚电解质如上文限定。
根据一个具体实施方式，通过将活性成分添加到第一聚电解质的水性胶体溶液得到水溶液（1），所述活性成分非共价地结合所述第一聚电解质的纳米颗粒。
具体地，水溶液（1）的pH值在5到8的范围内、尤其是约为7。
根据具体实施方式，步骤（2）至少包括：
-制备第二聚电解质的水溶液，所述第二电解质的水溶液尤其具有从5至8范围内的pH值，且有利地具有与水溶液（1）的pH值相同的pH值；和
-将所述第二聚电解质的水溶液与所述水溶液（1）混合。
根据特别优选的实施方式，第一聚电解质具有疏水侧基，且当第一聚电解质分散在pH在5至8的范围内的水性介质时能够自发地形成纳米颗粒，该水性介质尤其是水。
不希望束缚于该理论，可以建议，疏水基的超分子结合形成疏水结构域导致纳米颗粒的形成。通过或多或少缩合在这些疏水结构域周围的一个或多个聚电解质链而构成各个纳米颗粒。
优选地，通过具有疏水侧基的第一聚电解质形成的纳米颗粒具有的平均直径在10nm到100nm的范围内，尤其在10nm到70nm的范围内，尤其在10nm到50nm的范围内。
用来描述在一种或多种活性成分和聚电解质之间的关系的术语“结合”或“被结合”是指，活性成分通过非共价键物理相互作用、尤其是疏水相互作用、和/或静电相互作用和/或氢键和/或通过聚电解质的空间封装与聚电解质结合。
根据另一具体实施方式，第二聚电解质也具有疏水侧基，且当第二聚电解质分散在pH在5至8的范围内的水性介质时能够自发地形成纳米颗粒，该水性介质尤其是水。
相对于根据本发明的两种聚电解质的混合物中的阴离子基团的数量，阳离子基团的摩尔比（用Z表示）优选地在0.1和2.2之间，优选在0.1和2之间，且尤其在0.4和1.5之间。
摩尔比Z反应了纳米颗粒的总电荷且尤其可以接近0，在一些应用中这证实是特别有趣的。
根据本发明的一个特别有利的实施方式，摩尔比Z在0.9和1.1之间，这说明纳米颗粒接近中性。
根据在制备根据本发明的纳米颗粒期间引入的聚电解质的数量和性质，可以通过下式来定义摩尔比Z：
Z = ( x c 2 . m 2 . C 2 . DP 2 / M 2 ) ( x a 1 . m 1 . C 1 . DP 1 / M 1 ) + ( x a 2 . m 2 . C 2 . DP 2 / M 2 )
其中：
-m1和m2分别表示在混合各自聚合物质量浓度为C1和C2（混合前）的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质之前的溶液的质量数；
-DP1和DP2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的聚合度；
-M1和M2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的摩尔质量；
-xc2表示阳离子聚电解质中具有阳离子基团的单体的摩尔分数；
-xa1和xa2分别表示阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的具有阴离子基团的单体的摩尔分数。
纳米颗粒可以是阴离子型、阳离子型或中性。在本发明的含义内，“阴离子纳米颗粒”是指在中性pH下总电荷为负的纳米颗粒；“阳离子纳米颗粒”是指在中性pH下总电荷为正的纳米颗粒。
此外，根据本发明的另一方面，根据本发明的纳米颗粒有利地具有低的总电荷，这通常可以改善在静脉给药之后的循环时间。
可以通过本领域的技术人员已知的任一方法（例如在中性pH下测量ζ电势）来测量总电荷，
优选地，根据本发明的纳米颗粒在中性pH下的ζ电势在-20mV到+20mV的范围内，优选在-15mV到+15mV的范围内，优选在-10mV到+10mV的范围内。
优选地，在步骤（1）和步骤（2）中制备的溶液的聚电解质的总浓度在1mg/g和50mg/g之间，优选在5mg/g和50mg/g之间，尤其在7mg/g至25mg/g之间。
有利地，在上文描述的制备方法的步骤（2）的最后获得的纳米颗粒的悬浮液具有足够浓度的纳米颗粒，且可以使用而无需另外的浓缩步骤。
有利地，根据本发明的方法获得的纳米颗粒的悬浮液适用于通过肠胃外途径给药，尤其通过皮下注射给药。
优选地，在20℃和10s-1的剪切速率下，纳米颗粒的悬浮液的粘度在1mPa·s至500mPa·s的范围中、优选从2mPa·s至200mPa·s的范围中。
使用标准设备，例如，具有锥板型的几何形状的加压流变仪（Gemini，Bohlin）（4cm和角度为2°），按照制造商的说明书在20℃下测量粘度。
根据另一实施方式变型，上文所述的制备方法的步骤（2）的最后获得的纳米颗粒的悬浮液经受尤其是通过切向超滤或前置超滤、离心分离、蒸发或冻干的一个或多个浓缩步骤。
根据另一实施方式变型，根据本发明的方法可以包括对获得的颗粒的悬浮液脱水的步骤（例如，通过冻干或雾化），以便获得干粉末形式的颗粒。
有利地，以冻干形式的根据本发明的纳米颗粒是稳定的。此外，它们在冻干之后易于再分散。因此，根据本发明的纳米颗粒的悬浮液可以被冻干随后在水溶液中重构，而不影响获得的纳米颗粒的性能。
本发明还涉及从根据本发明的组合物制备新的药学上的、植物检疫、食品、美容或营养制剂。
因此，根据本发明的组合物可以为粉末、溶液、悬浮液、药片或明胶胶囊的形式。
本发明的组合物尤其可以用来制备药剂。
本发明的组合物可以用于通过口服途径或肠胃外途径、尤其通过肠胃外途径和更具体地通过皮下途径来给药。
具体实施方式
通过以下实施例将更好地解释本发明，这些实施例仅通过例证方式给出。
实施例
实施例1
阴离子聚电解质PA 1 的合成：接枝有5%的维生素E和4%的聚乙二醇的聚 谷氨酸盐，且具有约100的聚合度
10g的DP100的聚（谷氨酸）和0.19g的二甲氨基吡啶在80℃下溶解在160mL的二甲基甲酰胺（DMF）中。该混合物在80℃下搅拌一整夜，冷却到15℃，随后依次加入在6.5mL的DMF溶液中的1.67g的α-生育酚、0.285g二甲氨基吡啶、在32mL的DMF溶液中的16.2g分子量为5000Da的聚乙二醇（PEG：MethoxyPEG（CH2）3NH2）、以及1.8mL二异丙基碳化二亚胺。反应混合物在15℃下搅拌24小时，随后用1N的苏打水中和。得到的溶液通过渗滤来净化以及浓缩。
利用TFA-d通过质子NMR测量的α-生育酚和聚乙二醇的接枝率分别是5.3%和3.8%。
下表1描述了阴离子聚电解质PA1的特征（符号p1、q1和s1参考说明书的式（I）；符号xp1、xa1、xPAG1、DP1是说明书中限定的符号）。
表1
Figure BDA0000367925920000211
实施例2
阳离子聚电解质PC 1 的合成：接枝有5%的维生素E和80%的精氨酸的聚谷 氨酸盐，且具有约100的聚合度
在申请人的国际申请WO2008/135563中特别描述了该聚合物的合成。
下表2描述了阳离子聚电解质PC1的特征（符号p2、q2、r2、s2和t2参考说明书的式（II）；符号DP2、M2、xp2、xa2、xc2、xPAG2和MPAG2是说明书中上文限定的符号）。
表2
Figure BDA0000367925920000212
Figure BDA0000367925920000221
实施例3
基于Z值不同的两种聚电解质PA 1 和PC 1 制备颗粒
用于制备聚电解质络合物的方案如下：
在保持温和搅拌的同时，将阴离子聚电解质PA1以10mM的NaCl溶液进行稀释以便获得质量m1的质量浓度C1的溶液。然后，仍保持搅拌，同时将利用10mM的NaCl溶液预先稀释至质量浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC1的溶液加入该溶液中。
在获得的混合物中的聚电解质的总质量浓度C通过下式给出：C=（m1·C1+m2·C2）/m1+m2）。
如上文所述，得到的纳米颗粒的直径通过准弹性光散射来测量。
通过在中性pH下测量ζ电势来测量总的ζ电荷。
下表3示出了比率Z（阳离子基团/阴离子基团摩尔比）和wPAG（聚亚烷基二醇/总聚合物质量比）、在混合物中的聚电解质的总质量浓度C、直径、和两种聚电解质PA1和PC1的溶液的不同混合物形成的纳米颗粒的ζ电势的值。
表3
Figure BDA0000367925920000231
结果显示，从根据本发明的阴离子聚电解质PA1和阳离子聚电解质PC1的混合物可以获得根据本发明的尺寸小于或等于50nm的纳米颗粒。
实施例4（比较）
基于没有接枝聚亚烷基二醇的阴离子聚电解质PA 2 （接枝有5%的维生素E 且聚合度约100的聚谷氨酸盐，而没有接枝聚乙二醇）和来自实施例2的阳离 子聚电解质PC 1 的混合物的制剂
尤其在申请人的国际申请WO03/104303中描述了该聚合物的合成。
下表4描述了非PEG化的阴离子聚电解质PA2的特征（符号p1、q1和s1参考说明书中的式（I）；符号DP1、M1、xp1、xa1、xPAG1和MPAG1是上文说明书的定义的符号）。
表4
Figure BDA0000367925920000232
Figure BDA0000367925920000241
以与实施例3中相同的方式，制备了在10mM的NaCl溶液中的浓度C1的质量m1的阴离子聚电解质PA2的溶液和在实施例2中所述的质量m2的阳离子聚电解质PC1的溶液，该阳离子聚电解质PC1的溶液利用10mM的NaCl溶液中预先稀释到浓度C2。以与实施例3中相同的方式，阳离子聚合物PC1被添加到阴离子聚合物PA2。
表5
Figure BDA0000367925920000242
结果清楚地显示，在混合不具有聚亚烷基二醇（w PAG =0）的聚电解质之后获得的纳米颗粒大于100nm（不是根据本发明）。
实施例5
合成对应于根据本发明的式（I）、式（I’）、式（II）和式（II’）的其他阴离 子聚电解质和其他阳离子聚电解质
-阴离子聚电解质PA 3 至PA 6 的合成
●PA3和PA6是具有维生素E接枝和聚乙二醇基团的聚谷氨酸盐。它们的合成类似于实施例1中提出的PA1的合成。
●PA4、PA5、和PA8是具有维生素E接枝且不含聚乙二醇基团的聚谷氨酸盐。在申请人的国际申请WO03/104303中尤其描述了这样的聚合物的合成。
PA7是具有硬脂胺接枝的聚天冬氨酸盐。该聚合物的合成如下：
步骤1：通过使用L-天冬氨酸，根据类似于Polymer1997，38（18），4733-4736中描述的方案来制备聚琥珀酰亚胺。
步骤2：根据类似于Langmuir2001，17，7501中描述的方案，硬脂胺氨基分解随后剩余的聚琥珀酰亚胺基团水解。
下表6汇总了所制备的阴离子聚电解质的特征。
表6
-阳离子聚电解质PC 2 至PC 8 的合成：
●PC2是具有维生素E接枝但不含聚乙二醇基团且不含中性基团的聚谷氨酸盐。类似于实施例2中提出的PC1的合成，尤其在申请人的国际申请WO2008/135563中描述了PC2的合成。
●PC6是具有维生素E接枝但不含聚乙二醇基团且具有羟乙基氨基-中性基团的聚谷氨酸盐。PC6的合成类似于PC2的合成，除了包括乙醇胺的接枝步骤。尤其在申请人的国际申请WO2006/079614中描述了该接枝步骤。
●PC7是具有维生素E接枝和聚乙二醇基团但不含中性基团的聚谷氨酸盐，。该聚合物的合成如下：
步骤1：按照实施例1的方案合成接枝有5%维生素E和4%聚乙二醇的聚谷氨酸盐。
步骤2：步骤1的产物被酸化到pH=3随后冻干。10g的冻干物在80℃下溶解在125mL的NMP中。获得的溶液被冷却到0℃，随后依次加入3.15mL的氯甲酸异丁酯和2.7mL的N-甲基吗啉。该混合物在0℃下被搅拌15分钟，观测到形成乳白色的悬浮液。同时，8.36g的精氨酰胺二盐酸盐被悬浮在150mL的NMP中，随后加入4.73mL的三乙胺。得到的悬浮液在20℃下被搅拌数分钟随后被冷却到0℃。活化的聚合物的乳白色悬浮液随后被加入到该精氨酰胺悬浮液中，在0℃下搅拌该反应混合物2小时，随后在20℃下搅拌该反应混合物一整夜。在相继加入2.4mL的1N的HCl溶液和2.5mL的水后，反应混合物被逐滴加入到1.2L的水中。得到的溶液通过渗滤被净化随后浓缩。
利用重水（D2O）通过质子NMR测量的所接枝的精氨酰胺的百分比为84%。
●PC3和PC4是不含维生素E接枝但具有聚乙二醇基团和羟乙基氨基-中性基团的聚谷氨酸盐。PC4的合成如下：
10g的DP100的聚（谷氨酸）在80℃下被溶解在200mL的NMP中。得到的溶液被冷却到0℃，随后连续加入10.5mL的氯甲酸异丁酯和9mL的N-甲基吗啉。该混合物在0℃下被搅拌15分钟。同时，4.75g的精氨酰胺二盐酸盐被悬浮在94mL的NMP中，且加入2.3mL三乙胺。得到的悬浮液在20℃下被搅拌数分钟随后被冷却到0℃。将在109mL的NMP中的5.46g的通过端氨基功能化的聚乙二醇（PEG）（摩尔质量为2,000g/mol（MEPA-20H，通过NOF销售））溶液、精氨酰胺/三乙胺悬浮液和3.27g的乙醇胺（EA）相继加入到活化的聚合物的乳白色悬浮液中。反应混合物在0℃下被搅拌一整夜。在加入0.93g的EA以后，反应混合物在20℃下被搅拌5小时。在相继加入0.77mL的35%的盐酸溶液和50mL的水以后，反应混合物被逐滴加入到500mL的水中，pH值用1N的苏打水调节到7至7.5。得到的溶液通过渗滤被净化随后浓缩。利用D2O通过质子NMR确定的PEG2,000和接枝的EA和精氨酰胺的百分比分别是3.70%和25%。
使用适量的反应物和摩尔质量为3,000g/mol的聚乙二醇，类似于PC4合成PC3。
●PC5是不含维生素E接枝和中性基团但具有聚乙二醇基团的聚谷氨酸盐。除了接枝乙醇胺（PC5的合成中没有进行该步骤）以外，PC5的合成类似于上文提出的PC3和PC4的合成。
●PC8是不含维生素E接枝和聚乙二醇基团但具有二羟丙基胺基-中性基团的聚谷氨酸盐。该聚合物的合成如下：
62.8g的DP100的聚（谷氨酸）在80℃下被溶解在1,293g的NMP中。得到的溶液被冷却到0℃，随后连续加入69.68g的氯甲酸异丁酯和51.6g的N-甲基吗啉。该混合物在0℃下被搅拌15分钟。同时，26.37g的精氨酰胺二盐酸盐被悬浮在501.98g的NMP中，加入33.2g的丝氨醇（APD），随后加入10.79g的三乙胺。得到的悬浮液在20℃下被搅拌数分钟随后被冷却到0℃，随后被添加到活化的聚合物的乳白色悬浮液中。反应混合物在0℃下被搅拌6小时。加入7.9g的APD，然后反应混合物在0℃下被搅拌一整夜。在加入52g的35%的HCl溶液以后，反应混合物被逐滴加入到5.4L的水中，pH值用1N的苏打水调节到7至7.5。得到的溶液通过渗滤被净化随后浓缩。利用D2O通过质子NMR确定的所接枝的APD和精氨酰胺的百分比分别是72%和18%。
●PC9是不含维生素E接枝和中性基团但具有聚乙二醇基团的聚赖氨酸。该聚合物的合成如下：
1.5g的聚-L-赖氨酸被溶解在10mL的10mM的Hepes缓冲液（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸）中，pH值用0.1N的苏打水调节到8.1。
随后加入0.628g的α-琥珀酰亚氨氧基戊二酰基（succinimidyloxyglutaryl）-ω-甲氧基、聚氧化乙烯（Sunbright ME-050GS），再次调节pH值到8.1。反应混合物在室温下被搅拌一整夜。
反应混合物通过渗滤被净化随后浓缩。
下表7示出了所制备的阳离子聚合物的特征。
表7
（a）在该情况下t2是指羟乙基氨基-中性接枝
（b）在该情况下t2是指二羟丙基胺基-中性接枝
实施例6
从实施例5中所制备的阴离子聚电解质PA和阳离子聚电解质PC的混合物 获得的制剂
阴离子聚电解质PA稀释在10mM的NaCl溶液中以获得浓度为C1的溶液。
阳离子聚电解质PC稀释在10mM的NaCl溶液中以获得浓度为C2的溶液。
根据所寻求的最终的混合物是否具有过量的阴离子电荷或者过量的阳离子电荷，该方法在加入顺序方面不同：
-对于寻求具有过量阴离子电荷的混合物（表8中的试验e3.1至试验e3.9），浓度为C1的质量m1的阴离子聚电解质PA在温和搅拌下被置入烧杯中，随后加入浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC；
-对于寻求具有过量阳离子电荷的混合物（表8中的试验e3.10），浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC在温和搅拌下被置入烧杯中，随后加入浓度C1的质量m1的阴离子聚合物PA随后被添加到该混合物。
下表8汇总了在混合物中所用的质量和浓度以及混合物的特征。
表8
Figure BDA0000367925920000291
结果表明，从根据本发明的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的混合物可以获得小于50nm的纳米颗粒。
实施例7
根据本发明的包含作为活性成分的重组人生长激素（rhGH）的制剂
rhGH首先与阴离子聚电解质PA混合，由此获得的PA/rhGH络合物随后与阳离子聚电解质PC混合。更确切地：
利用磷酸盐缓冲液将阴离子聚电解质PA稀释到20mM且与含有4.3mg/g的rhGH（Biosidus P161）的溶液混合，以获得具有浓度为C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp1的rhGH蛋白质的PA/rhGH混合物。该混合物在室温下温和搅拌12小时。
质量m1的该PA/rhGH混合物被添加到质量m2的浓度C2的阳离子聚电解质中。最后的混合物的总聚合物浓度C（如实施例3中计算的）、且蛋白质浓度Cp=m1Cp1/（m1+m2）。
通过空间排阻色谱法（柱G4,000+G2,000SWXL–被稀释十分之一的PBS缓冲液–流速0.5mL/min）分析最终的混合物来测定没有结合聚电解质的活性成分的浓度。在所有的情况中，对应于没有结合rhGH的洗脱时间的峰值没有检测：没有结合rhGH的部分因此<1%。
下表9汇总了在混合物中所用的质量和浓度以及混合物的特征。
表9
Figure BDA0000367925920000301
Figure BDA0000367925920000311
结果表明，根据本发明的包含rhGH蛋白质和根据本发明的聚电解质的制剂由小于50nm的纳米颗粒构成。
实施例8
根据本发明的包含作为活性成分的重组人生长激素（rhGH）的制剂，该制 剂通过超滤和冻干/重构两种方法浓缩
使用台式冻干仪（CHRIST Alpha2-4LP plus），持续24小时冻干在实施例7的试验e4.2中（具有聚电解质PA6和PC2）描述的一部分制剂。所冻干的粉末随后分散在水中以获得比先前的试验e4.2浓缩大约20倍的溶液。在不到5分钟内得到均匀的胶体溶液。
在具有10kDa的截留分子量（cutoff）的膜上，通过前置超滤以大约10的系数来浓缩另一部分制剂。
在下表10中示出了浓缩前和浓缩后的溶液的特征。
表10
Figure BDA0000367925920000312
结果清楚地显示，根据本发明的制剂可以容易地浓缩而不改变颗粒的尺寸。
实施例9
根据本发明的包含作为活性成分的鲑降钙素（sCT）的制剂
sCT首先与阴离子聚电解质PA混合，由此获得的PA/sCT络合物随后与阳离子聚电解质PC混合。更确切地：
阴离子聚电解质PA以10mM的磷酸盐缓冲溶液进行稀释并且与含有10mg/g的sCT（Polypeptide Laboratories AB）的溶液混合，以便获得具有浓度C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp1的蛋白质sCT的PA/sCT混合物。该混合物在环境温度下利用磁棒搅拌1小时。
根据所寻求的最终的混合物是否具有过量的阴离子电荷或者过量的阳离子电荷，该方法在加入顺序方面不同：
-对于寻求具有过量阴离子电荷的混合物（下表中的试验e5.1和e5.2），质量m1的先前混合物PA/sCT在温和搅拌下被置入烧杯中，预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC随后被加入到该混合物中；
-对于寻求具有过量阳离子电荷的混合物（下表中的试验e5.3），预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC在温和搅拌下被置入烧杯中，质量m1的先前混合物PA/sCT随后被添加到该混合物中。
最后的混合物具有总聚合物浓度C和蛋白质浓度Cp。
在具有30kDa的截留分子量的超滤器上通过超速离心分离和通过HPLC分析滤液之后，来确定没有结合聚电解质的活性成分的浓度。在所有情况下，该浓度严格地小于5%。
在实施例5中描述了该实施例中所用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的特征。
表11
Figure BDA0000367925920000321
Figure BDA0000367925920000331
结果表明，根据本发明的包含鲑降钙素和根据本发明的聚电解质的制剂由小于50nm的纳米颗粒构成。
实施例10
根据本发明的包含作为活性成分的鲑降钙素（sCT）的制剂
sCT首先与阴离子聚电解质PA混合，由此获得的PA/sCT络合物随后与阳离子聚电解质PC混合。更确切地：
阴离子聚电解质PA以10mM的NaCl溶液进行稀释且与含有10mg/g的sCT（Polypeptide Laboratories AB）的溶液混合，以获得具有浓度为C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp1的蛋白质sCT的PA/sCT混合物。该混合物在室温下搅拌30分钟。
质量m1的先前混合物PA/sCT在温和搅拌下被置于烧杯中，预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC随后被加入到该混合物中。
最后的混合物具有总聚合物浓度C和蛋白质浓度Cp。
该实施例所用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质分别是实施例5中描述的聚电解质PA4和聚电解质PC7。
表12
Figure BDA0000367925920000332
实施例11
根据本发明的包含作为活性成分的重组人胰岛素（INS）的制剂
胰岛素首先与阴离子聚电解质PA混合，由此获得的PA/INS络合物随后与阳离子聚电解质PC混合。更确切地：
INS（Biocon）的原液制备如下：
0.36g的INS溶解在9g的蒸馏水中，该溶液用磁棒以250rpm搅拌10分钟。通过加入2.66g的0.1N的盐酸溶液随后以500rpm搅拌15分钟，该溶液被酸化。在以500rpm搅拌的同时加入3.98g的0.1N的氢氧化钠溶液，随后，在15分钟以后，加入3.90g的蒸馏水，以获得17.54mg/g（考虑水在胰岛素粉末中存在的水的百分比）的INS的最终浓度。
阴离子聚电解质PA以10mM的氯化钠溶液进行稀释且与含有17.54mg/g的INS（Biocon）的胰岛素原液混合，以获得具有浓度为C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp的蛋白质INS的PA/sCT混合物。该混合物在室温下温和搅拌20小时。
利用10mM的NaCl溶液预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质，在搅拌条件下加入到烧杯中的质量m1的该PA/INS混合物。最后的混合物具有总聚合物浓度C（如上文计算）和蛋白质浓度Cp（如上文计算）。
在具有50kDa的截留分子量的超滤器上通过超速离心分离和通过HPLC分析滤液之后，来确定没有结合聚电解质的活性成分的浓度。在这些条件下没有结合活性成分的浓度是大约8%。该实施例所用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质分别是实施例5中描述的聚电解质PA4和聚电解质PC7。
表13
Figure BDA0000367925920000341
Figure BDA0000367925920000351
结果表明，根据本发明的包含重组人胰岛素和根据本发明的聚电解质的制剂由小于50nm的纳米颗粒构成。
实施例12
根据本发明的包含作为活性成分的艾塞那肽的制剂
艾塞那肽首先与阴离子聚电解质PA混合，由此获得的PA/艾塞那肽络合物随后与阳离子聚电解质PC混合。更确切地：
阴离子聚电解质PA以10mM的NaCl溶液进行稀释且与含有10mg/g的艾塞那肽（Assia Chemical Industries LTD）的溶液混合，以获得具有浓度为C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp1的艾塞那肽的PA/艾塞那肽混合物。该混合物在室温下保持温和搅拌30分钟。
利用10mM的NaCl溶液预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC随后被加入到在烧杯中保持温和搅拌的质量m1先前的PA/艾塞那肽混合物。
最后的混合物具有如上文计算的总聚合物浓度C且蛋白质浓度Cp。
表14
Figure BDA0000367925920000352
Figure BDA0000367925920000361
实施例13
根据本发明的包含作为活性成分的氟维司群的制剂
氟维司群首先与阴离子聚电解质PA混合，由此获得的PA/氟维司群络合物随后与阳离子聚电解质PC混合。
更确切地，阴离子聚电解质PA以10mM的NaCl溶液进行稀释且与粉末形式的氟维司群（ScimoPharm台湾）混合，以获得具有浓度为C1的阴离子聚电解质PA和浓度Cp的氟维司群的PA/氟维司群混合物。该混合物在30℃下保持温和搅拌24小时。
利用10mM的NaCl溶液预先稀释到浓度C2的质量m2的阳离子聚电解质PC加入到保持温和搅拌的质量m1的先前的PA/氟维司群混合物。
最后的混合物具有如上文计算的总聚合物浓度C且活性成分浓度Cp。
在实施例5中描述了该实施例中所用的阴离子聚电解质和阳离子聚电解质的特征。
表15
Figure BDA0000367925920000362
实施例14
根据本发明的制剂的粘度的测量
使用台式冻干器（CHRIST Alpha2-4LP plus）冻干在实施例3的试验e1.7中描述的一部分制剂（具有聚电解质PA1和PC1）。随后，该冻干的粉末被分散在水中以获得比试验e1.7中的溶液浓缩约10倍的溶液。在不到5分钟内得到均匀的胶体溶液。
在20℃下、以10s-1的剪切速率，使用具有锥板型的几何形状的加压流变仪（Gemini，Bohlin）（4cm和2°的角度）来测量粘度。
表16
Figure BDA0000367925920000371
结果显示，根据本发明的制剂是足以用于通过非肠道途径且尤其通过皮下注射而注射的流体。

Claims (21)

1.一种纳米颗粒，所述纳米颗粒通过至少一种活性成分和至少两种相反极性的聚电解质形成，所述聚电解质具有聚氨基酸直链骨架且具有小于或等于2,000的聚合度，其特征在于：
-两种聚电解质中的至少一种聚电解质具有疏水侧基；
-两种聚电解质中的至少一种聚电解质具有聚亚烷基二醇侧基；
所述纳米颗粒具有在10nm至100nm的范围内的平均直径且包括大量的聚亚烷基二醇基团使得，相对于聚合物总量，所述聚亚烷基二醇的质量比wPAG大于或等于0.05。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，通过混合第一聚电解质的溶液与相反极性的第二聚电解质的溶液获得所述纳米颗粒，所述第一聚电解质和第二聚电解质满足：相对于聚合物总量，所述聚亚烷基二醇的质量比wPAG大于或等于0.05。
3.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，相对于阴离子聚电解质和阳离子聚电解质具有的阴离子基团的数量，所述阳离子基团的数量的摩尔比Z在0.1和2之间，尤其在0.4和1.5之间。
4.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，相对于聚合物总量，所述聚亚烷基二醇的质量比wPAG在0.05和0.75之间、尤其在0.05和0.6之间，尤其在0.05和0.5之间且优选在0.05和0.3之间。
5.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的尺寸在10nm到70nm之间变化，优选在10nm至50nm之间变化。
6.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，当具有疏水侧基的所述聚电解质被分散在pH在5到8的范围内的水性介质中时，所述聚电解质能够自发地形成纳米颗粒，所述水性介质尤其是水。
7.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚电解质是下式（I）的聚电解质或者其药学上可接受的盐，
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸酯基或如下文限定的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮结合的末端氨基酸残基，所述末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-；
-PAG表示聚亚烷基二醇，优选为摩尔质量在1,800g/mol至6,000g/mol范围内的聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇，尤其是摩尔质量在2,000g/mol至6,000g/mol范围内的聚乙二醇；
●s1对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，
●q1对应于具有聚亚烷基二醇基团的谷氨酸盐单体的平均值，
p1和q1可选地是0，
-聚合度DP1=（s1+p1+q1）小于或等于2,000，尤其小于700、尤其在40到450的范围中，尤其在40到250的范围中、尤其在40到150的范围中，
-所述通式（I）的单体的链构型能够为无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚电解质是下式（I’）的聚电解质或者其药学上可接受的盐，
Figure FDA0000367925910000031
其中：
-G’表示选自下列基团的疏水基：辛基-、十二烷基-、十四烷基-、十六烷基-、十八烷基-、和9-十八烯基-；
●s1=（s1′+s1″）对应于在中性pH值下非接枝的天冬氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p1=（p1′+p1″）对应于具有疏水基G’的天冬氨酸盐单体的平均数且能够可选地为0，
-聚合度DP1=（s1+p1）小于或等于2,000、尤其小于700、更尤其在20至450的范围内、尤其在20至250的范围内、尤其在20至150的范围内，
-所述通式（I’）的单体的链构型能够为无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
9.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子聚电解质是下式（II）的聚电解质或者其药学上可接受的盐,
Figure FDA0000367925910000032
其中：
-Ra表示氢原子、直链的C2至C10酰基、支链的C3至C10酰基、焦谷氨酸酯基或如下文定义的疏水基G；
-Rb表示-NHR5基团或通过氮结合的末端氨基酸残基，该末端氨基酸残基的羧基可选地由-NHR5烷氨基自由基或-OR6烷氧基取代，其中：
●R5表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、或苄基；
●R6表示氢原子、直链的C1至C10烷基、支链的C3至C10烷基、苄基或基团G；
-G表示选自下列基团的疏水基：辛氧基-、十二烷氧基-、十四烷氧基-、十六烷氧基-、十八烷氧基-、9-十八烯氧基-、生育酚基-和胆甾醇基-；
-PAG表示聚亚烷基二醇，优选是摩尔质量在1,800g/mol至6,000g/mol范围内的聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇，尤其是摩尔质量在2,000g/mol至6,000g/mol范围内的聚乙二醇；
-R2表示阳离子基团，尤其通过胺官能团结合的精氨酰胺；
-R3表示选自羟乙基氨基-、通过胺官能团结合的二羟丙基氨基-的中性基团；
●s2对应于在中性pH值下非接枝的谷氨酸盐单体阴离子的平均数，
●p2对应于具有疏水基G的谷氨酸盐单体的平均数，
●q2对应于具有聚亚烷基二醇基团的谷氨酸盐单体的平均值，
●r2对应于具有阳离子基团R2的谷氨酸盐单体的平均数，和
●t2对应于具有中性基团R3的谷氨酸盐单体的平均数，
s2、p2、q2和t2可选地是0，且
-聚合度DP2=（s2+p2+q2+r2+t2）小于或等于2,000，尤其小于700，更尤其从40至450变化、尤其从40至250变化、尤其从40至150变化；
-所述通式（II）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阳离子聚电解质是下式（II’）的聚电解质或者其药学上可接受的盐,
Figure FDA0000367925910000051
其中：
-X-表示抗衡阴离子，尤其氯离子、乙酸根离子或铵离子：
-PAG表示表示聚亚烷基二醇，优选地为摩尔质量在1,800g/mol至6,000g/mol范围内的聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇，尤其是摩尔质量在2,000g/mol至6,000g/mol范围内的聚乙二醇；
●q2对应于具有聚亚烷基二醇基团的赖氨酸单体的平均值，
●r2对应于在中性pH值下非接枝的赖氨酸单体阳离子的平均数，
q2可选地是0，且
-聚合度DP2=（p2+r2）小于或等于2,000，尤其小于700，更尤其从40至450变化、尤其从40至250变化、尤其从40至150变化；
-所述通式（II’）的单体的链构型可以是无规类型、单嵌段类型或多嵌段类型。
11.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■所述阴离子聚电解质中的疏水基的摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■所述阴离子聚电解质中的聚亚烷基二醇基团的摩尔分数xPAG1是0；
■所述阳离子聚电解质中的疏水基的摩尔分数xP2是0；和
■所述阳离子聚电解质中的聚亚烷基二醇基团的摩尔分数xPAG2从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化。
12.根据权利要求1至7或9至10中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化；
■摩尔分数xP2是0；和
■摩尔分数xPAG2是0。
13.根据权利要求1至7或9中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化；
■摩尔分数xP2从5%至20%变化，尤其从5%至10%变化；和
■摩尔分数xPAG2是0。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1是0；
■摩尔分数xP2从5%至20%变化，尤其从5%至10%变化；和
■摩尔分数xPAG2从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化。
15.根据权利要求1至7或9中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述阴离子聚电解质和阳离子聚电解质满足：
■摩尔分数xP1从2%至22%变化，尤其从4%至12%变化；
■摩尔分数xPAG1从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化；
■摩尔分数xP2从5%至20%变化，尤其从5%至10%变化；和
■摩尔分数xPAG2从2%至10%变化，尤其从2%至6%变化。
16.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述活性成分是具有医疗、美容或预防用途的分子或用于成像的分子。
17.一种组合物，其特征在于，所述组合物至少包括根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒。
18.一种用于制备根据权利要求1至16中任一项所述的纳米颗粒的方法，其特征在于，所述方法至少包括下列步骤：
1）制备包括第一聚电解质的纳米颗粒的水溶液，所述第一聚电解质为带电状态且具有疏水侧基，所述纳米颗粒非共价地结合活性成分；
2）将所述溶液（1）和极性与所述第一聚电解质的极性相反的至少一种第二聚电解质混合到一起，以形成所述纳米颗粒；和
所述第一聚电解质和第二聚电解质中的至少一种聚电解质具有聚亚烷基二醇侧基，所述聚亚烷基二醇基团的数量满足：相对于聚合物总量，所述聚亚烷基二醇的质量比wPAG大于或等于0.05；
所述第一聚电解质和第二聚电解质具有聚氨基酸直链骨架，且具有小于或等于2,000的聚合度。
19.根据前一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一聚电解质和第二聚电解质是根据权利要求3、4、6至15中任一项所限定的聚电解质。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，通过将活性成分添加到所述第一聚电解质的水性胶体溶液来获得所述水溶液（1），所述水溶液尤其具有5到8范围内的pH值，所述活性成分非共价地结合所述第一聚电解质的纳米颗粒。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2）至少包括：
-制备所述第二聚电解质的水溶液，所述第二聚电解质的水溶液尤其具有5至8范围内的pH值，且有利地具有与步骤1）的所述水溶液的pH值相同的pH值；和
-将所述第二聚电解质的所述水溶液与步骤1）的所述水溶液混合。
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