JP2014515002A - 反対の電荷をもつ2つのポリアミノ酸のうちの一方が電荷過剰であるナノ粒子を製造する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、500nm以下の平均直径を有するナノ粒子の製造方法において、(1)疎水性側鎖基を有する電荷を帯びた状態の第一のポリ電解質のナノ粒子を含む水性溶液を用意すること;(2)該溶液(1)を該第一のポリ電解質の極性と反対の極性の少なくとも1の第二のポリ電解質と一緒にすること、ただし、該カチオン性ポリ電解質がアニオン性ポリ電解質の溶液に添加されて、過剰のアニオン性電荷を有する混合物を形成する;又は該アニオン性ポリ電解質がカチオン性ポリ電解質の溶液に添加されて過剰のカチオン性電荷を有する混合物を形成する、及び(3)このようにしてナノ粒子を形成すること;からなる段階を少なくとも含み、ただし、− 該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質はポリアルキレングリコール側鎖基のないポリアミノ酸直鎖骨格を有し、2,000以下の重合度を有し;− 該2つのポリ電解質の混合物における、カチオン性基の数:アニオン性基の数のモル比Zは0.1〜0.75又は1.3〜2の間に含まれ;かつ− ポリ電解質の総質量濃度Cは該混合物の1g当たり厳密に2mg未満である、前記製造方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、適切な場合には活性成分と結合されていてもよい、反対の極性を有する2つのポリ電解質の特定の混合物からナノ粒子を製造する新規方法に関する。
活性成分の配合物は、ある数の許容基準に適合し、かつ小さな直径を有する針、例えば27−から31−ゲージの針、を通しての容易な注入を許すために低い粘度を有するが、活性成分の十分な濃度を有していなければならない。
この分野において、出願人の会社は、国際公開第2008/135561号パンフレットに示されているように、活性成分を含むミクロ粒子により構成された、低い粘度を有する安定な懸濁物を開発することに成功した。これらのミクロ粒子は、延長された期間に亘って該活性成分を放出することができ、より特に反対の極性の2つのポリ電解質ポリマー(PE1)及び(PE2)であってそれらのうち少なくとも1は疎水性基を有している該2つのポリ電解質ポリマーの特定の条件下での混合物から形成される。この混合物は1〜100μmに含まれるサイズのミクロ粒子をもたらす。
しかし、ミクロ粒子の配合物は、静脈投与には適切ではなく、皮下ルートによる投与の枠組み内で過敏症(intolerance)の問題を有し得る。
結果的に、非経口的、特に静脈又は皮下の、ルートによる活性成分の投与の観点から、ずっと小さいサイズ、特にナノメートルスケールのサイズの粒子の懸濁物を有することが好ましい。
従って、非経口、特に静脈の、ルートによる投与に特に適切である、活性成分のナノ粒子の安定な懸濁物を製造する方法に対する需要がまだある。
本発明は、特に、そのようなナノ粒子の懸濁物が得られることを許す新規な方法を提案することを目的としている。
すべての期待と反対に、本発明者らは、特定のポリ電解質の特定の混合物から、適切な場合には活性成分を含むナノ粒子の流動性配合物を得ることが可能であることを見出した。
より正確には、その第一の特徴に従うと、本発明は、500nm以下の平均直径を有するナノ粒子の製造方法において、
(1)疎水性側鎖基を有する、電荷を帯びた状態の第一のポリ電解質のナノ粒子を含む水性溶液を用意すること;
(2)該溶液(1)を、該第一のポリ電解質の極性と反対の極性の少なくとも1の第二のポリ電解質と一緒にすること、ただし、過剰のアニオン性電荷を有する混合物を形成するためには該カチオン性ポリ電解質がアニオン性ポリ電解質の溶液に添加され;又は、過剰のカチオン性電荷を有する混合物を形成するためには該アニオン性ポリ電解質がカチオン性ポリ電解質の溶液に添加される、及び
(3)このようにしてナノ粒子を形成すること;
からなる段階を少なくとも含み、ただし、
− 該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質はポリアミノ酸の直鎖の骨格を有し、ポリアルキレングリコール側鎖基はなく、2,000以下の重合度を有し;
− 該2つのポリ電解質の混合物における、カチオン性基の数:アニオン性基の数のモル比Zは0.1〜0.75又は1.3〜2の間に含まれ;かつ
− ポリ電解質の総質量濃度Cは該混合物の1g当たり厳密に2mg未満である、
前記製造方法に関する。
(1)疎水性側鎖基を有する、電荷を帯びた状態の第一のポリ電解質のナノ粒子を含む水性溶液を用意すること;
(2)該溶液(1)を、該第一のポリ電解質の極性と反対の極性の少なくとも1の第二のポリ電解質と一緒にすること、ただし、過剰のアニオン性電荷を有する混合物を形成するためには該カチオン性ポリ電解質がアニオン性ポリ電解質の溶液に添加され;又は、過剰のカチオン性電荷を有する混合物を形成するためには該アニオン性ポリ電解質がカチオン性ポリ電解質の溶液に添加される、及び
(3)このようにしてナノ粒子を形成すること;
からなる段階を少なくとも含み、ただし、
− 該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質はポリアミノ酸の直鎖の骨格を有し、ポリアルキレングリコール側鎖基はなく、2,000以下の重合度を有し;
− 該2つのポリ電解質の混合物における、カチオン性基の数:アニオン性基の数のモル比Zは0.1〜0.75又は1.3〜2の間に含まれ;かつ
− ポリ電解質の総質量濃度Cは該混合物の1g当たり厳密に2mg未満である、
前記製造方法に関する。
特定の実施態様に従うと、本発明の方法は、特に接線方向の又は正面の超ろ過(frontal ultrafiltration)、遠心分離、蒸発又は凍結乾燥による1以上の濃縮の段階(4)を段階(3)の後に含む。
本発明の方法の変形の実施態様に従うと、Zは0.1〜0.75の間に含まれる。言い換えると、ポリ電解質の最終混合物が過剰のアニオン電荷を有するとき、段階(1)は、アニオン性ポリ電解質のナノ粒子の水性溶液を用意することからなる。次に段階(2)は、カチオン性ポリ電解質、特に水性溶液の形のカチオン性電解質を、好ましくは中くらいの撹拌下に置かれた第一のポリ電解質の溶液に添加することからなる。
逆に、Zが1.3〜2の間に含まれる場合、言い換えると、ポリ電解質の最終混合物が過剰のカチオン性電荷を有するとき、段階(1)は、カチオン性ポリ電解質のナノ粒子の水性溶液を用意することからなる。次に、段階(2)は、アニオン性ポリ電解質、特に水性溶液の形のポリ電解質を、好ましくは中くらいの撹拌下に置かれた第一の電解質の溶液に添加することからなる。
本発明の方法は、その段階(2)の特徴に関して、本発明に従わない粒子、すなわち、厳密に500nmより大きい平均直径を有する粒子の形成を妨げるために特に有利である。
特に有利な実施態様に従うと、段階(1)の水性溶液のナノ粒子は活性成分と非共有結合的に結合されている。
活性成分のナノ粒子のそのような水性溶液は第一のポリ電解質の水性コロイド状溶液に該活性成分を添加することにより得られ、該活性成分は該第一のポリ電解質のナノ粒子と非共有的に結合する。
本発明の方法の終わりに得られたナノ粒子の配合物はいくつかの点において有利であることが分かった。
第一に、本発明の方法により得られた粒子のナノメートルのサイズは特に静脈又は皮下ルートによる活性剤の配合物の投与に適切である。即ち、本発明は癌の治療のために使用される活性剤の非経口投与に関して特に有利であることが分かる。
さらに、本発明の方法において使用される該ポリ電解質は生体適合性である。それらは完ぺきに耐性(tolerated)があり、素早く即ち数日〜数週間のタイムスケールで分解する。
活性成分と結合された、本発明の方法により得られたナノ粒子は、活性成分、特にタンパク質のペプチド活性成分を運搬する及び/又は低分子量の活性成分を溶解させるのに特に有利であることが分かった。
特に、これらのナノ粒子は、延長された期間に亘って活性成分を放出することができる。
本発明の方法に従って得られた活性成分を含むナノ粒子は、有利には高い密度を有する。そのような密度は、立体障害効果(マトリックス効果)、活性成分とポリ電解質のナノ粒子との非共有結合的結合に加えての効果、により放出が遅くされることを許す。
さらに、本発明に従うナノ粒子の懸濁物は有利に優れた安定性を有する。次に、本発明の方法の最後に得られる混合物は、該懸濁物の物理化学的性質を、特に粘度、粒子サイズ、コロイド又は化学的安定性の点において損なうことなく、特に接線方向又は正面の超ろ過、遠心分離、蒸発又は凍結乾燥による1以上の濃縮段階に付される。即ち、本発明に従って、流動性があり、かつ十分に濃縮されたナノ粒子の安定な懸濁物を得ることが可能である。
さらに、本発明に従うナノ粒子の懸濁物は、上記のように製造された2つの液状懸濁物を単純に混合することにより投与の時にその場で形成されることができる。即ち、ナノ粒子のこれらの懸濁物は簡単に貯蔵されることができ、産業スケールでの制限された製造コストが想定されることを許す。
最後に、該活性成分は過剰な温度、かなりの剪断、界面活性剤又は有機溶媒を必要としない水性法において使用され、このことは活性成分の可能性のある分解を避けることを有利に可能にする。そのような特徴は、ある種の活性成分、例えば、上記の条件に付されたとき分解される潜在的な可能性があるペプチド及びタンパク質、に関して特に有利であるようである。
他の特徴、利点、及び本発明に従う方法の実施態様は、以下の記載を読むとより明らかになる。
本文の残りにおいて、表現「〜と〜との間に含まれる」、「〜から〜の範囲」及び「〜から〜まで変化する」は、等価であり、別に特定されない限り、限界値が含まれることを意味する。
ポリ電解質
上記のように、本発明の方法は、反対の極性の少なくとも2のポリ電解質、言い換えると少なくとも1のアニオン性ポリ電解質及び少なくとも1のカチオン性ポリ電解質、の混合物を使用する。
上記のように、本発明の方法は、反対の極性の少なくとも2のポリ電解質、言い換えると少なくとも1のアニオン性ポリ電解質及び少なくとも1のカチオン性ポリ電解質、の混合物を使用する。
「ポリ電解質」により、本発明の意味内において水、特に5〜8の範囲のpHにおける水、においてイオン化して、ポリマー上に電荷を作り出すことのできる基を有するポリマーを意味する。即ち、極性溶媒、例えば水における溶液において、ポリ電解質は解離して、その骨格上に電荷が、及び溶液中に対イオンが現れるようにする。
例えば、ポリ電解質のカルボン酸とアミン官能基は、溶液のpHに依存してそれぞれ−COOH又は−COO−及びNH2又はNH3 +の形の下でおり、溶液中に存在する対カチオン及び対アニオンにより中性が保証される。
ポリ電解質が酸基を含む場合、該化合物は塩の形であり得る。塩の選択は当業者の能力の範囲内である。例えば、対カチオンは、特に一価の金属カチオン、好ましくはナトリウム又はカリウムイオンであることができる。ポリ電解質がアミン基を含む場合、対アニオンは、特に塩化物イオン、アセテートイオン、又はアンモニウムイオンであることができる。
本発明に従うポリ電解質は、一組の同じ又は異なるポリ電解質基を含むことができる。
別に特定されない限り、ポリ電解質は、本説明の残りを通して、本発明の方法の段階(2)の間に該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の混合物のpH値において現れると記載される。「カチオン性」又は「アニオン性」のような基の記載は、例えば、該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の混合物のこのpH値においてこの基が持つ電荷に照らして、考慮される。同様に、ポリ電解質の極性はこのpH値においてこの電解質が持つ総電荷に照らして定義される。
より特に、「アニオン性ポリ電解質」により2つのポリ電解質の混合物のpH値において負の総電荷を有するポリ電解質が意味される。
同様に、「カチオン性ポリ電解質」により2つのポリ電解質の混合物のpH値において正の総電荷を有するポリ電解質が意味される。
ポリ電解質の「総電荷」により、この電解質が持つ正及び負の電荷のすべての代数的合計が意味される。
好ましくは、ナノ粒子の形成をもたらす、アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の混合物のpH値は、5〜8、好ましくは6〜7.5である。
特に好ましい実施態様に従うと、水性溶液(1)は、5〜8、特に6〜7.5の範囲のpH、より特に約7のpHを有する。
特定の実施態様に従うと、本発明の方法の段階(2)は、少なくとも:
− 特に5〜8の範囲のpH、有利には水性溶液(1)のpH値と同じであるpH、を有する、第二のポリ電解質の水性溶液を用意すること;そして
− 第二のポリ電解質の該水性溶液を該水性溶液(1)と混合すること
を含む。
− 特に5〜8の範囲のpH、有利には水性溶液(1)のpH値と同じであるpH、を有する、第二のポリ電解質の水性溶液を用意すること;そして
− 第二のポリ電解質の該水性溶液を該水性溶液(1)と混合すること
を含む。
本発明の特徴の一つに従うと、第一のポリ電解質は疎水性の側鎖基を有する。このポリ電解質は、特に、5〜8の範囲のpHを有する水性媒体、特に水に分散されたときに、ナノ粒子を自発的に形成することができる。
理論に拘束されることを望まないが、疎水性の領域を形成する疎水性基の超分子の組み合わせがナノ粒子の形成をもたらすことを示唆することができる。即ち、各ナノ粒子は、これらの疎水性領域の周囲で多かれ少なかれ濃縮された1以上のポリ電解質鎖により構成されている。
好ましくは、疎水性側鎖基を有する第一のポリ電解質により形成されるナノ粒子は、10〜100nm、特に10〜70nm、より特に10〜50nmの範囲の平均直径を有する。
別の特定の実施態様に従うと、本発明の方法の段階(2)の第二のポリ電解質もまた疎水性基を有する。それもまた、5〜8のpHを有する水性媒体、特に水、に分散されたときに、ナノ粒子を形成することができる。
ポリアミノ酸の直鎖の骨格
上記のように、本発明に従って考慮されるポリ電解質は、ポリアミノ酸の直鎖の骨格を有する、即ちアミノ酸残基を含む。
上記のように、本発明に従って考慮されるポリ電解質は、ポリアミノ酸の直鎖の骨格を有する、即ちアミノ酸残基を含む。
有利には、本発明に従うポリ電解質は生分解性である。
本発明の意味内において、用語「ポリアミノ酸」は、天然のポリアミノ酸及び合成のポリアミノ酸の両方を包含する。
ポリアミノ酸は直鎖のポリマー、有利にはペプチド結合により結合されたアルファアミノ酸からなる。
ブロック又はランダムコポリマー、マルチ鎖ポリマー、及びアミノ酸の特定の配列を含むポリマーを形成するたくさんの合成技術がある(ポリマーの科学と工学の百科事典、第12巻、第786頁;ジョンワイリー&サンズを参照のこと)。
当業者は、その知識のおかげで、これらの技術を実施して、本発明に適するポリマーを得ることができる。特に、国際公開第96/29991号パンフレット、国際公開第03/104303号パンフレット、国際公開第2006/079614号パンフレット、国際公開第2008/135563号パンフレット、及びKangら(Langmuir、2001年、第17巻、第7501〜7506頁)の教示も参照されたい。
好ましい実施態様の変形に従うと、該ポリアミノ酸鎖はアルファ−L−グルタメート又はアルファ−L−グルタミン酸のホモポリマーにより構成されている。
別の実施態様の変形に従うと、該ポリアミノ酸鎖はアルファ−L−アスパルテート又はアルファ−L−アスパラギン酸のホモポリマーにより構成されている。
別の実施態様の変形に従うと、該ポリアミノ酸鎖は、アルファ−L−アスパルテート/アルファ−Lグルタメート、アルファ−L−アスパラギン酸/アルファ−L−グルタミン酸、アルファ/ベータ−L−アスパルテート又はアルファ/ベータ−L−アスパラギン酸のコポリマーにより構成されている。
別の実施態様の変形に従うと、該ポリアミノ酸鎖はポリ−L−リシンのホモポリマーにより構成されている。
そのようなポリアミノ酸は、特に、国際公開第03/104303号パンフレット、国際公開第2006/079614号パンフレット、及び国際公開第2008/135563号パンフレットに記載されており、これらの内容は参照することにより取り込まれる。これらのポリアミノ酸は、国際公開第00/30618号パンフレットに記載されているタイプのものでもあることができる。
これらのポリマーは、当業者に公知の方法により得られることができる。
本発明に従って使用されることのできるある数のポリマー、可変の質量を有する例えば、ポリ(アルファ−L−グルタミン酸)、ポリ(アルファ−D−グルタミン酸)、ポリ(アルファ−D,L−グルタメート)、ポリ(ガンマ−L−グルタミン酸)及びポリ(L−リシン)タイプである。
ポリ(L−グルタミン酸)は、フランス国特許出願公開第2801226号に記載のルートの従って合成されることもまたできる。
ここで、
− Raは、水素原子、直鎖のC2〜C10アシル基、分岐状のC3〜C10アシル基、ピログルタメート基又は以下で定義される疎水性基Gを表し;
− Rbは−NHR5基又は、窒素により結合されかつそのカルボキシルは任意的に−NHR5アルキルアミノ基又は−OR6アルコキシにより置換されていてもよいところの末端アミノ酸残基を表わし、ここで
・R5は水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、又はベンジル基を表し;
・R6は、水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、ベンジル基、又は基Gを表し;
− Gは、オクチルオキシ−、ドデシルオキシ−、テトラデシルオキシ−、ヘキサデシルオキシ−、オクタデシルオキシ−、9−オクタデセニルオキシ−、トコフェリル−、及びコレステリル−から選択された疎水性基、好ましくはアルファ−トコフェリル−を表し;
・s1は中性pHにおいてアニオン性である、非グラフト化グルタメートモノマーの平均数に該当し、
・p1は、疎水性の基Gを有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
p1は任意的にゼロであってもよく、
− 重合度DP1=(s1+p1)は2,000以下、特に700未満、より特に40〜450、特に40〜250、特に40〜150の範囲であり、
− 該一般式(I)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプである。
− Raは、水素原子、直鎖のC2〜C10アシル基、分岐状のC3〜C10アシル基、ピログルタメート基又は以下で定義される疎水性基Gを表し;
− Rbは−NHR5基又は、窒素により結合されかつそのカルボキシルは任意的に−NHR5アルキルアミノ基又は−OR6アルコキシにより置換されていてもよいところの末端アミノ酸残基を表わし、ここで
・R5は水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、又はベンジル基を表し;
・R6は、水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、ベンジル基、又は基Gを表し;
− Gは、オクチルオキシ−、ドデシルオキシ−、テトラデシルオキシ−、ヘキサデシルオキシ−、オクタデシルオキシ−、9−オクタデセニルオキシ−、トコフェリル−、及びコレステリル−から選択された疎水性基、好ましくはアルファ−トコフェリル−を表し;
・s1は中性pHにおいてアニオン性である、非グラフト化グルタメートモノマーの平均数に該当し、
・p1は、疎水性の基Gを有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
p1は任意的にゼロであってもよく、
− 重合度DP1=(s1+p1)は2,000以下、特に700未満、より特に40〜450、特に40〜250、特に40〜150の範囲であり、
− 該一般式(I)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプである。
本発明の特に好ましい実施態様に従うと、式(I)の該アニオン性ポリ電解質は、xp1=p1/(s1+p1)が2〜22%、特に4〜12%を変動するように疎水性基を有するモノマーのモルフラクションxp1を有する。
ここで、
− G´は、オクチル−、ドデシル−、テトラデシル−、ヘキサデシル−、オクタデシル−、9−オクタデセニル−から選択される疎水性基を表し;
・s1=(s1´+s1´´)は、中性pHにおいてアニオン性である非グラフト化アスパルテートモノマーの平均数に該当し、
・p1=(p1´+p1´´)は、疎水性基G´を有するアスパルテートモノマーの平均数に該当し、任意的にゼロであってもよく、
− 重合度DP1=(s1+p1)は2,000以下、特に700未満、より特に20〜450、特に20〜250、特に20〜150の範囲であり、
− 該一般式(I´)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプである。
− G´は、オクチル−、ドデシル−、テトラデシル−、ヘキサデシル−、オクタデシル−、9−オクタデセニル−から選択される疎水性基を表し;
・s1=(s1´+s1´´)は、中性pHにおいてアニオン性である非グラフト化アスパルテートモノマーの平均数に該当し、
・p1=(p1´+p1´´)は、疎水性基G´を有するアスパルテートモノマーの平均数に該当し、任意的にゼロであってもよく、
− 重合度DP1=(s1+p1)は2,000以下、特に700未満、より特に20〜450、特に20〜250、特に20〜150の範囲であり、
− 該一般式(I´)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプである。
本発明の第二の特に好ましい実施態様に従うと、式(I´)の該アニオン性ポリ電解質は、xp1=p1/(s1+p1)が2〜22%、特に4〜12%を変動するように疎水性基を有するモノマーのモルフラクションxp1を有する。
ここで、
− Raは、水素原子、直鎖のC2〜C10アシル基、分岐状のC3〜C10アシル基、ピログルタメート基又は以下で定義される疎水性基Gを表し;
− Rbは−NHR5基又は、窒素により結合されかつそのカルボキシルは−NHR5アルキルアミノ基又は−OR6アルコキシにより任意的に置換されていてもよいところの末端アミノ酸残基を表し、ここで
・R5は水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、又はベンジル基を表し;
・R6は、水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、ベンジル基、又は基Gを表し;
− Gは、オクチルオキシ−、ドデシルオキシ−、テトラデシルオキシ−、ヘキサデシルオキシ−、オクタデシルオキシ−、9−オクタデセニルオキシ−、トコフェリル−、及びコレステリル−から選択された疎水性基、好ましくはアルファ−トコフェリル−を表し;
− R2は、カチオン性基、特に、アミン官能基により結合されたアルギニンアミドを表し;
− R3は、アミン官能基により結合されたヒドロキシエチルアミノ−、ジヒドロキシプロピルアミノから選択された中性基を表し;
・s2は中性pHにおいてアニオン性である、非グラフト化グルタメートモノマーの平均数に該当し、
・p2は、疎水性基Gを有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
・r2は、カチオン性基R2を有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
・t2は、中性基R3を有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
s2、p2及びt2は任意的にゼロであってもよく、 かつ
− 重合度DP2=(s2+p2+r2+t2)は2,000以下、特に700未満、より特に、40〜450、特に40〜250、特に40〜150の範囲であり、
− 該一般式(II)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプであることができる。
− Raは、水素原子、直鎖のC2〜C10アシル基、分岐状のC3〜C10アシル基、ピログルタメート基又は以下で定義される疎水性基Gを表し;
− Rbは−NHR5基又は、窒素により結合されかつそのカルボキシルは−NHR5アルキルアミノ基又は−OR6アルコキシにより任意的に置換されていてもよいところの末端アミノ酸残基を表し、ここで
・R5は水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、又はベンジル基を表し;
・R6は、水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、ベンジル基、又は基Gを表し;
− Gは、オクチルオキシ−、ドデシルオキシ−、テトラデシルオキシ−、ヘキサデシルオキシ−、オクタデシルオキシ−、9−オクタデセニルオキシ−、トコフェリル−、及びコレステリル−から選択された疎水性基、好ましくはアルファ−トコフェリル−を表し;
− R2は、カチオン性基、特に、アミン官能基により結合されたアルギニンアミドを表し;
− R3は、アミン官能基により結合されたヒドロキシエチルアミノ−、ジヒドロキシプロピルアミノから選択された中性基を表し;
・s2は中性pHにおいてアニオン性である、非グラフト化グルタメートモノマーの平均数に該当し、
・p2は、疎水性基Gを有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
・r2は、カチオン性基R2を有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
・t2は、中性基R3を有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
s2、p2及びt2は任意的にゼロであってもよく、 かつ
− 重合度DP2=(s2+p2+r2+t2)は2,000以下、特に700未満、より特に、40〜450、特に40〜250、特に40〜150の範囲であり、
− 該一般式(II)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプであることができる。
もちろん、式(II)に該当するカチオン性ポリ電解質はポリ電解質の総電荷(r2−s2)が正であるようなものである。
本発明の特に好ましい実施態様に従うと、式(II)のカチオン性ポリ電解質は、xp2=p2/(s2+p2+r2+t2)が2〜22%、特に4〜12%を変動するように疎水性基を有するモノマーのモルフラクションxp2を有する。
もちろん、本発明の方法において使用されるアニオン性及びカチオン性ポリ電解質の性質は、該2つのポリ電解質の少なくとも1つが疎水性の側鎖基Gを有するようなものである。
ポリ電解質の平均分子量及び重合度並びに各単位に相当するモルフラクションの測定
本発明の意味において、ポリマーの平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーデバイスに接続された静的光散乱検出器により測定される。保持された該平均分子量はピークの分子量(Mp)である。
本発明の意味において、ポリマーの平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーデバイスに接続された静的光散乱検出器により測定される。保持された該平均分子量はピークの分子量(Mp)である。
グラフト化されたポリ(グルタミン酸)の場合、該分析は以下の条件において行われる。
水性溶液中のグラフト化されたポリ(グルタミン酸)の試料は、0.1Nの塩酸を添加することにより沈殿され、凍結乾燥され、その後N−メチルピロリドン(NMP)に溶解され、分析される。
平均ピーク分子量は、3つの連続するポリスチレン−コ−ジビニルベンゼンクロマトグラフィーのカラム(5μm/100000Å、5μm/10000Å、及び5μm/1000Å)を含む、N−メチルピロリドン中のサイズ排除クロマトグラフィーに接続された18角(MALLS)静的光散乱検出器により測定される。
該ポリ電解質を構成する(グラフト化されている又はされていない)モノマー単位AAiのそれぞれに対応するモルフラクションxiは、適切な溶媒中でプロトンNMRにより測定される。当業者はポリ電解質のための適切な溶媒を選択して、分析しかつ分析条件を決めることができる。
式(I)に対応するグラフト化されたポリ(グルタミン酸)の場合、ポリマー試料は凍結乾燥され、重水素化トリフルオロ酢酸に溶解され、その後プロトン1Hプローブを備えられた300MHzNMR分光計により分析される。
特に、疎水性基中の平均モルグラフト化率に相当する、疎水性基でグラフト化されたモノマーにおけるモルフラクションxp、アニオン性モノマー単位におけるモルフラクションxa及びカチオン性モノマー単位におけるモルフラクションxcがこのようにして測定される。
平均重合度DPは、上記のようにサイズ排除クロマトグラフィーにより測定されたポリマー鎖の平均分子量をポリ電解質のモノマー単位の平均分子量MAAmにより除することにより計算される:DP=Mp/MAAm。
ある単位のこの平均分子量は、ポリ電解質を構成する単位の分子量の平均であり、それぞれはこの単位のモルフラクションにより加重されている。即ち、それぞれ、分子量MAAi及びモルフラクションxiの、n個の異なるモノマー単位AAiを有するポリ電解質の場合、平均重量MAAmは以下の式により与えられる。
本発明の特徴の一つに従うと、本発明の方法において使用される該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の量及び性質は、2つのポリ電解質の混合物におけるカチオン性基の数:アニオン性基の数のモル比(Zと表示される)は0.1〜0.75、又は1.3〜2の間に含まれるようなものである。
好ましくは、モル比Zは、0.3〜0.75、より好ましくは0.5〜0.75、又は1.3〜1.5の間に含まれる。
ここで
− m1及びm2は、アニオン性ポリ電解質及びカチオン性ポリ電解質を混合する前の溶液の質量をそれぞれ表し、(混合する前の)ポリマーのそれぞれの質量濃度はC1及びC2である;
− DP1及びDP2は、それぞれ該アニオン性ポリ電解質及び該カチオン性ポリ電解質の重合度を表し;
− M1及びM2は、それぞれ、該アニオン性ポリ電解質及びカチオン性ポリ電解質のモル質量を表し;
− xc2は、該カチオン性ポリ電解質においてカチオン性基を有するモノマーのモルフラクションを表し;
− xa1及びxa2は、それぞれ、該アニオン性ポリ電解質及び該カチオン性ポリ電解質のアニオン性基を有するモノマーのモルフラクションを表す。
− m1及びm2は、アニオン性ポリ電解質及びカチオン性ポリ電解質を混合する前の溶液の質量をそれぞれ表し、(混合する前の)ポリマーのそれぞれの質量濃度はC1及びC2である;
− DP1及びDP2は、それぞれ該アニオン性ポリ電解質及び該カチオン性ポリ電解質の重合度を表し;
− M1及びM2は、それぞれ、該アニオン性ポリ電解質及びカチオン性ポリ電解質のモル質量を表し;
− xc2は、該カチオン性ポリ電解質においてカチオン性基を有するモノマーのモルフラクションを表し;
− xa1及びxa2は、それぞれ、該アニオン性ポリ電解質及び該カチオン性ポリ電解質のアニオン性基を有するモノマーのモルフラクションを表す。
本発明の別の特徴に従うと、本発明において使用される該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の量及び性質は、ポリ電解質の総質量濃度が厳密に2mg/混合物1g未満であるようなものである。
特に、ポリ電解質の総質量濃度Cは0.5〜1.8mg/混合物1g、特に1〜1.5mg/混合物1gに含まれる。
水性溶液においてポリ電解質を使用する枠組みにおいて、本発明に従うポリ電解質の総質量濃度Cは、本発明の方法の段階(2)の終わりに得られる水性溶液の1g当たり、厳密に2mg未満である。
ポリ電解質の総質量濃度は、
C=(m1・C1+m2・C2)/(m1+m2)
により定義されることができる。m1、m2、C1及びC2は前に定義されたとおりである。
C=(m1・C1+m2・C2)/(m1+m2)
により定義されることができる。m1、m2、C1及びC2は前に定義されたとおりである。
第一の実施態様に従うと、該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質は
・該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・該アニオン性ポリ電解質は、ランダムに分布された4〜12モル%の疎水性側鎖を有するようなものである。
・該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・該アニオン性ポリ電解質は、ランダムに分布された4〜12モル%の疎水性側鎖を有するようなものである。
第二の実施態様に従うと、該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質は、
・ 該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・ t2はゼロであり、即ち、該カチオン性ポリ電解質は中性基を有さない;
・ 該カチオン性ポリ電解質及び該アニオン性ポリ電解質の両者は、ランダムに分布された4〜12モル%の疎水性側鎖を有する
ようなものである。
・ 該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・ t2はゼロであり、即ち、該カチオン性ポリ電解質は中性基を有さない;
・ 該カチオン性ポリ電解質及び該アニオン性ポリ電解質の両者は、ランダムに分布された4〜12モル%の疎水性側鎖を有する
ようなものである。
第三の実施態様に従うと、該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質は
・ 該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・ 該アニオン性ポリ電解質は、ランダムに分布された4〜12モル%の疎水性側鎖を有し;かつ
・ 該カチオン性ポリ電解質は、30〜60モル%のカチオン性側鎖、特にアルギニンを有する
ようなものである。
・ 該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・ 該アニオン性ポリ電解質は、ランダムに分布された4〜12モル%の疎水性側鎖を有し;かつ
・ 該カチオン性ポリ電解質は、30〜60モル%のカチオン性側鎖、特にアルギニンを有する
ようなものである。
第四の実施態様に従うと、該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質は、
・ 該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・ 該アニオン性ポリ電解質は、ランダムに分布された18〜22モル%の疎水性側鎖を有する
ようなものである。
・ 該アニオン性及び該カチオン性ポリ電解質の重合度が50〜220に含まれ;
・ 該アニオン性ポリ電解質は、ランダムに分布された18〜22モル%の疎水性側鎖を有する
ようなものである。
ナノ粒子
前記のように、本発明に従って形成されるナノ粒子は、500nm以下の平均直径を有している。
前記のように、本発明に従って形成されるナノ粒子は、500nm以下の平均直径を有している。
好ましくは、該ナノ粒子のサイズは20〜300nm、特に50〜200nmを変動することができる。
該ナノ粒子のサイズは準弾性光散乱により測定されることができる。
準弾性光散乱による粒子サイズを測定するための試験
粒子サイズは、当業者に周知である測定方法に従って、例えば、ALV CGS−3タイプを使用して、得られた体積平均流体力学直径により特徴づけられる。
粒子サイズは、当業者に周知である測定方法に従って、例えば、ALV CGS−3タイプを使用して、得られた体積平均流体力学直径により特徴づけられる。
一般的に、測定は0.15MNaCl媒体中において1mg/gの濃度において調製され、24時間撹拌されたポリマーの溶液を用いて行われる。次に、これらの溶液は、0.8〜0.2μm上でろ過され、動的光散乱法により分析される。
波長632.8nmの、垂直方向に偏光されたHe−Neレーザービームで操作するALV CGS−3タイプのデバイスを使用するとき、散乱角は140°であり、信号収集時間は10分である。測定は溶液の2つの試料について3回繰り返される。結果は6回の平均である。
本発明の意味内において、「アニオン性ナノ粒子」により、中性のpHにおいてはその総電荷が負であるナノ粒子が、そして「カチオン性ナノ粒子」により、中性のpHにおいてその総電荷が正であるナノ粒子が意味される。
活性成分
前に述べたように、本発明の方法は少なくとも1の活性成分をもまた使用することができる。
前に述べたように、本発明の方法は少なくとも1の活性成分をもまた使用することができる。
即ち、本発明の方法により得られるナノ粒子の配合物は、活性成分を運搬する目的のために使用されることができる。
特に好ましい実施態様に従うと、該活性成分は段階(1)の水性溶液において使用される。有利には、該活性成分は段階(1)の水性溶液のナノ粒子と非共有結合的に結合する。
1以上の活性成分とポリ電解質の間の関係を記載するために使用される用語「結合」又は「結合された」は、該活性成分が該ポリ電解質と非共有結合的物理的相互作用、特に疎水性相互作用、及び/又は静電的相互作用及び/又は水素結合及び/又は該ポリ電解質による立体的カプセル化により結合されていることを意味する。
この活性成分は、治療的、化粧料的又は予防的な利益又はイメージングの利益のある分子であることができる。
それは、タンパク質、グリコタンパク質、1以上のポリアルキレングリコール鎖[好ましくはポリエチレングリコール(PEG)]に共有結合的に結合されたタンパク質、ペプチド、多糖類、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成の医薬品物質、及びそれらの混合物を含む群から好ましくは選択される。
より好ましくは、該活性成分は、エリスロポイエチン類、ヘモグロビンラフィマー、それらの類縁体又は誘導体;オキシトシン、バソプレッシン、副腎皮質刺激性ホルモン、成長因子、血液因子類、ヘモグロビン、チトクローム類、アルブミン類プロラクチン、ルリベリン(黄体組織を作るホルモン放出ホルモン即ちLHRH)、又はその類縁体、例えばロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン、ナファレリン;LHRH拮抗剤類、LHRHコンペティター類、ヒト、ブタ、又はウシの成長ホルモン類(GH)、成長ホルモン放出ホルモン、インシュリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン類、又はこれらの混合物、インターフェロン類、例えばインターフェロンアルファ、アルファ−2b、ベータ、ベータ−1a、又はガンマ;ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン類、エンドモルフィン類、アンジオテンシン類、チロトロピン放出因子(TRF),腫瘍壊死因子(TNF),神経成長因子(NGF),成長因子類、例えばベクラペルミン、トラフェルミン、アンセスチム、ケラチン生成細胞成長因子、顆粒白血球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒白血球−マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF),マクロファージ−コロニー刺激因子(M−CSF),ヘパリナーゼ、骨形成タンパク質(BMP),hANP,グルカゴン様ペプチド(GLP−I)その類縁体類及びアゴニスト類、特にエクセナチド、VEG−F,組換B型肝炎アンチゲン(rHBsAg),レニン、サイトカイニン類、ブラジキニン、バシトラシン類、ポリミキシン類、コリスチン類、チロシジン、グラミシジン類、エタネルセプト、イミグルセラーゼ、ドロトレコギンアルファ、シクロスポリン類及びその合成類縁体類、並びに酵素類、サイトカイニン類、抗体類、アンチゲン類、及びワクチン類、抗体類の薬学的に活性な変性物及び破片例えばリツキシマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリツマブ及びセツキシマブを含むサブグループから選択される。
他の活性成分は、多糖類(例えばヘパリン)及びオリゴ若しくはポリヌクレオチド、DNA、RNA、iRNA、抗生物質及び生細胞、リスペリドン、ズクロペンチキソール、フルフェナジン、ペルフェナジン、フルペンチクソール、ハロペリドール、フルスピリレン、クエチアピン、クロザピン、アミスルプリド、スルピリド、ジプラシドン等である。
より特に、該活性成分は成長ホルモン、インターフェロンアルファ、カルシトニン、及びフルベストラントから選択される。
有利に、本発明の方法に従って得られたナノ粒子の懸濁物は、非経口ルート、特に静脈ルートによる投与に適切である。
好ましくは、該懸濁物は、20℃、10秒−1の剪断において測定されて、1〜500好ましくは2〜200mPa.s.の粘度を有する。
該粘度は、標準的な装置、例えばコーン及びプレートタイプの形状(4cm及び角度2°)を有する、強制された応力レオメーター(Gemini,Bohlin)を使用して、製造業者の説明書に従って20℃において測定されることができる。
特定の実施態様に従うと、上記の本発明に従う方法の段階(2)の終わりに得られるナノ粒子の懸濁物は、特に接線方向又は正面の超ろ過、遠心分離、蒸発又は凍結乾燥による1以上の濃縮の段階に付される。
別の実施態様の変形に従うと、次に、本発明の方法は、乾燥粉末の形で粒子を得るために、得られた粒子の懸濁物を脱水する段階(例えば凍結乾燥又は霧状化)を含むことができる。
有利に、本発明に従うナノ粒子は凍結乾燥された形において安定である。その上、それらは凍結乾燥後に再分散させるのが容易である。即ち、本発明に従って得られたナノ粒子の懸濁物は、得られるナノ粒子の性質に影響を及ぼすことなく、凍結乾燥されて、次に、水性溶液において再構成されることができる。
本発明の方法は、本発明に従う組成物から製造された新規な医薬品、植物検疫、食品、化粧料又はダイエット食品の調合を許すことができる。
即ち、本発明の段階(2)の終わりにおいて得られたナノ粒子の懸濁物は、粉末、溶液、懸濁物、錠剤又はゼラチンカプセルの形の組成物を製造するために、1以上の次の転化の段階を経ることができる。
本発明の方法の最後に得られた組成物は、特に医薬品の製造に意図されることができる。
該組成物は、経口ルート又は非経口ルート、特に非経口ルート、より特に皮下ルートによる投与のために意図されることができる。
本発明は、説明のために与えられた以下の実施例により、よりよく説明される。
実施例1
アニオン性ポリ電解質PA:ビタミンEでグラフトされたポリグルタメート(PA 1 〜PA 5 )の合成
そのようなポリマーの合成は、特に本出願人の国際公開第03/104303号パンフレットに記載されている。
アニオン性ポリ電解質PA:ビタミンEでグラフトされたポリグルタメート(PA 1 〜PA 5 )の合成
そのようなポリマーの合成は、特に本出願人の国際公開第03/104303号パンフレットに記載されている。
ドデカノールでグラフトされたポリグルタメート(PA 6 )
そのようなポリマーの合成は、特に本出願人の国際公開第00/30618号パンフレットに記載されている。
そのようなポリマーの合成は、特に本出願人の国際公開第00/30618号パンフレットに記載されている。
オクタデシルアミンでグラフトされたポリアスパルテート(PA 7 )
ステップ1:ポリサクシンイミドがL−アスパラギン酸を使用して「ポリマー」1997年、第38巻、第18号、第4733〜4736頁に記載されたプロトコルに類似するプロトコルに従って製造される。
ステップ2:「ラングミュアー」2001年、第17巻、第7501頁に記載のプロトコルに類似するプロトコルに従って、ステアリルアミンでのアミノ分解次に残っているポリサクシンイミド基の加水分解。
ステップ1:ポリサクシンイミドがL−アスパラギン酸を使用して「ポリマー」1997年、第38巻、第18号、第4733〜4736頁に記載されたプロトコルに類似するプロトコルに従って製造される。
ステップ2:「ラングミュアー」2001年、第17巻、第7501頁に記載のプロトコルに類似するプロトコルに従って、ステアリルアミンでのアミノ分解次に残っているポリサクシンイミド基の加水分解。
下の表1は、アニオン性ポリ電解質PAの特徴を記載する(p1及びs1の表記は詳細な説明の式(I)及び(I´)をさし、xp1、xa1、DP1の表記は発明の詳細において定義されたものである。)
実施例2
カチオン性ポリ電解質PC:ビタミンE及びアルギニンでグラフトされたポリグルタメート(PC 1 、PC 2 及びPC 3 )の合成
これらのポリマーの合成は、特に本出願人の国際公開第2008/135563号パンフレットに記載されている。
カチオン性ポリ電解質PC:ビタミンE及びアルギニンでグラフトされたポリグルタメート(PC 1 、PC 2 及びPC 3 )の合成
これらのポリマーの合成は、特に本出願人の国際公開第2008/135563号パンフレットに記載されている。
ビタミンE、アルギニン及びエタノールアミンでグラフトされたポリグルタメート(PC 4 及びPC 5 )
このポリマーの合成は、ポリマーPC1、PC2及びPC3の合成と似ており、さらにエタノールアミンのグラフト化の段階を含む。このグラフト化段階は、本出願人の国際公開第2006/079614号パンフレットに記載されている。
このポリマーの合成は、ポリマーPC1、PC2及びPC3の合成と似ており、さらにエタノールアミンのグラフト化の段階を含む。このグラフト化段階は、本出願人の国際公開第2006/079614号パンフレットに記載されている。
ポリリシン(PC 6 )
この生成物は、市販されており、特にシグマアルドリッチの参照番号P2658で入手可能である。
下記の表2は、カチオン性ポリ電解質PCの特徴を記載する(表記p2、r2、s2及びt2は詳細な説明の式(II)を指し、表記DP2、M2、xp2、xa2、及びxc2は発明の詳細において上記で定義されたものである)。
この生成物は、市販されており、特にシグマアルドリッチの参照番号P2658で入手可能である。
下記の表2は、カチオン性ポリ電解質PCの特徴を記載する(表記p2、r2、s2及びt2は詳細な説明の式(II)を指し、表記DP2、M2、xp2、xa2、及びxc2は発明の詳細において上記で定義されたものである)。
実施例3
Zの異なる値のための、2つのポリ電解質PA及びPCに基づく粒子の製造
アニオン性ポリ電解質PAは、NaClの10mM溶液において希釈され、濃度C1を有する溶液を得る。
Zの異なる値のための、2つのポリ電解質PA及びPCに基づく粒子の製造
アニオン性ポリ電解質PAは、NaClの10mM溶液において希釈され、濃度C1を有する溶液を得る。
カチオン性ポリ電解質PCは、NaClの10mM溶液において希釈され、濃度C2を有する溶液を得る。
そうすると、本方法は、求められる最終混合物が過剰のアニオン電荷又は過剰のカチオン電荷を有するかに依存して、添加の順序において異なる。
− 過剰のアニオン電荷を有するところの、求められている混合物の場合(下記の表において試験e1.1〜e1.9)、濃度C1における質量m1のアニオン性ポリ電解質PAが、穏やかな撹拌下、ビーカーに入れられ、次に濃度C2における質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが添加される。
− 過剰のカチオン電荷を有するところの、求められている混合物の場合(下記の表において試験e1.10及びe1.11)、濃度C2における質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが穏やかな撹拌下、ビーカーに入れられ、次に濃度C1における質量m1のアニオン性ポリ電解質PAが添加される。
− 過剰のアニオン電荷を有するところの、求められている混合物の場合(下記の表において試験e1.1〜e1.9)、濃度C1における質量m1のアニオン性ポリ電解質PAが、穏やかな撹拌下、ビーカーに入れられ、次に濃度C2における質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが添加される。
− 過剰のカチオン電荷を有するところの、求められている混合物の場合(下記の表において試験e1.10及びe1.11)、濃度C2における質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが穏やかな撹拌下、ビーカーに入れられ、次に濃度C1における質量m1のアニオン性ポリ電解質PAが添加される。
得られたナノ粒子の直径は上記の準弾性光散乱法により測定される。
総ゼータ電荷は、中性のpHにおけるゼータポテンシャルの測定により測定される。
比Z(カチオン基/アニオン基のモル比)、混合物中のポリ電解質の総質量濃度C、直径、及び2つのポリ電解質PA及びPCの溶液の種々の混合物について形成されたナノ粒子のゼータポテンシャルの種々の値が下記の表3に示される。
該結果は、本発明に従って、アニオン性PA及びカチオン性PCポリ電解質の混合物から本発明に従う500nm以下のサイズのナノ粒子を得ることが可能であることを示す。
実施例4(比較)
混合後に2mg/g超の総ポリマー濃度を有する又は厳密に0.75超及び1.3未満の電荷モル比Zを有する配合物
使用されたアニオン性及びカチオン性ポリ電解質は上記のポリ電解質から選択される。
混合後に2mg/g超の総ポリマー濃度を有する又は厳密に0.75超及び1.3未満の電荷モル比Zを有する配合物
使用されたアニオン性及びカチオン性ポリ電解質は上記のポリ電解質から選択される。
NaClの10mM溶液における濃度C1における、実施例1に記載されたアニオン性ポリ電解質PAの、量m1の溶液が、NaClの10mM溶液における濃度C2における、実施例2に記載されたカチオン性ポリ電解質PCの、量m2の溶液に添加される。
結果は、本発明に従わない比Z又は濃度においてポリ電解質を混合した後に得られたナノ粒子は、本発明に従わない500nmより大きいことを明確に示す。
実施例5
超ろ過により濃縮された本発明に従う配合物
1.65mg/gの総ポリマー濃度を有する実施例3の配合物e1.9は、10kDaのカットオフを有する膜上で正面の超ろ過により約8倍濃縮される。得られた最終的なポリマー濃度(乾燥抽出物により測定された)は13.4mg/gである。濃縮後の粒子のサイズ(平均体積直径)は332nmであり、ゼータポテンシャルは−37mVである。
超ろ過により濃縮された本発明に従う配合物
1.65mg/gの総ポリマー濃度を有する実施例3の配合物e1.9は、10kDaのカットオフを有する膜上で正面の超ろ過により約8倍濃縮される。得られた最終的なポリマー濃度(乾燥抽出物により測定された)は13.4mg/gである。濃縮後の粒子のサイズ(平均体積直径)は332nmであり、ゼータポテンシャルは−37mVである。
従って、この実施例は、この配合物を構成する粒子のサイズ及びゼータポテンシャルを有意に変えることなく、得られた配合物を超ろ過により濃縮することが可能であることを示す。
実施例6
サケのカルシトニン(sCT)を活性成分として取り込んだ本発明に従う配合物
sCTはまず、アニオン性ポリ電解質PAと混合され、次に、このようにして得られたPA/cST錯体はカチオン性ポリ電解質PCと混合される。
サケのカルシトニン(sCT)を活性成分として取り込んだ本発明に従う配合物
sCTはまず、アニオン性ポリ電解質PAと混合され、次に、このようにして得られたPA/cST錯体はカチオン性ポリ電解質PCと混合される。
より正確には、該アニオン性ポリ電解質PAは10mMのホスフェートバッファの溶液において希釈され、10mg/gのsCTを含む溶液と混合されて(ポリペプチドラボラトリーズ AB)、濃度C1のアニオン性ポリ電解質PA及び濃度Cp1のタンパク質sCTを有するPA/sCT混合物を得る。該混合物は環境温度において1時間穏やかに撹拌される。
前もって濃度C2に希釈された、質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが、穏やかな撹拌下で保持された、質量m1の、前記の混合物PA/sCTに添加される。
最終混合物は、総ポリマー濃度C及びタンパク質濃度Cpを有する。
ポリ電解質と結合されていない活性成分の濃度は、30kDaのカットオフを有する超フィルター上での超遠心分離による分離及びHPLCによるろ液の分析の後に測定される。全ての場合において、該濃度は、厳密に5%未満である。
この実施例にために使用される該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の特徴は、実施例1及び2に記載されている。
結果は、サケのカルシトニン及び本発明に従うポリ電解質を取り込んだ本発明に従う配合物は、500nmより小さいナノ粒子からなることを示す。
実施例7
活性成分としてサケのカルシトニン(sCT)を取り込んでいる本発明に従う配合物
まずsCTはアニオン性ポリ電解質PAと混合されて、次に、このようにして得られたPA/sCT錯体がカチオン性ポリ電解質PCと混合される。
活性成分としてサケのカルシトニン(sCT)を取り込んでいる本発明に従う配合物
まずsCTはアニオン性ポリ電解質PAと混合されて、次に、このようにして得られたPA/sCT錯体がカチオン性ポリ電解質PCと混合される。
より正確には、該アニオン性ポリ電解質PAは10mMのNaClの溶液において希釈され、10mg/gのsCTを含む溶液と混合されて(ポリペプチドラボラトリーズ AB)、濃度C1のアニオン性ポリ電解質PA及び濃度Cp1のsCTタンパク質を有するPA/sCT混合物を得る。該混合物は環境温度において1時間穏やかに撹拌される。
10mMのNaClの溶液において、前もって濃度C2に希釈された、質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが、穏やかな撹拌下で保持された、質量m1の、前記のPA/sCT混合物に添加される。
最終混合物は、総ポリマー濃度C及びタンパク質濃度Cpを有する。
ポリ電解質に結合されていない活性成分の濃度は、30kDaのカットオフを有する超フィルター上での超遠心分離による分離及びHPLCによるろ液の分析の後に測定される。全ての場合において、該濃度は、厳密に5%未満である。
この実施例にために使用される該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の特徴は、実施例1及び2に記載されている。
結果は、サケのカルシトニン及び本発明に従うポリ電解質を取り込んだ本発明に従う配合物は、500nmより小さいナノ粒子からなることを示す。
実施例8
インターフェロンα−2b(IFNα)を活性成分として取り込んだ本発明に従う配合物
まずIFNαはアニオン性ポリ電解質PAと混合されて、次に、このようにして得られたPA/IFNα錯体がカチオン性ポリ電解質PCと混合される。より正確には:
インターフェロンα−2b(IFNα)を活性成分として取り込んだ本発明に従う配合物
まずIFNαはアニオン性ポリ電解質PAと混合されて、次に、このようにして得られたPA/IFNα錯体がカチオン性ポリ電解質PCと混合される。より正確には:
該アニオン性ポリ電解質PAはNaClの10mM溶液において希釈される。次に、2.3mg/gのIFNα(バイオシダス)を含む溶液が添加されて、濃度C1のアニオン性ポリ電解質PA及び濃度Cp1のIFNαタンパク質を有するPA/IFNα混合物を得る。この混合物は環境温度において14時間穏やかな撹拌下に保たれる。
NaClの10mM溶液において、前もって濃度C2に希釈された、質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが、撹拌下で保持された、質量m1の、前記のPA/IFNα混合物に添加される。次に該混合物は1時間撹拌される。
最終混合物は、総ポリマー濃度C及びタンパク質濃度Cpを有する。
この実施例にために使用される該アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の特徴は、実施例1及び2に記載されている。
結果は、IFNα及び本発明に従うポリ電解質を取り込んだ本発明に従う配合物は、200nmより小さいナノ粒子からなることを示す。
実施例9
フルベストラントを取り込んだ本発明に従う配合物
まずフルべストランはアニオン性ポリ電解質PA5と混合されて、次に、このようにして得られたPA5/フルベストラント錯体がカチオン性ポリ電解質PC1と混合される。
フルベストラントを取り込んだ本発明に従う配合物
まずフルべストランはアニオン性ポリ電解質PA5と混合されて、次に、このようにして得られたPA5/フルベストラント錯体がカチオン性ポリ電解質PC1と混合される。
より正確には、該アニオン性ポリ電解質PA5はNaClの10mM溶液において希釈され、粉末の形のフルベストラント(ScimoPharm 台湾)と混合されて、濃度C1のアニオン性ポリ電解質PA5及び濃度Cpの活性成分を有するPA5/フルベストラント混合物を得る。該混合物は30℃において24時間穏やかな撹拌下に保たれる。
NaClの10mM溶液において、前もって濃度C2に希釈された、質量m2のカチオン性ポリ電解質PCが、穏やかな撹拌下で保持された、質量m1の、前記のPA5/フルベストラント混合物に添加される。
最終混合物は、総ポリマー濃度C及び活性成分濃度Cpを有する。
Claims (15)
- 500nm以下の平均直径を有するナノ粒子の製造方法において、
(1)疎水性側鎖基を有する、電荷を帯びた状態の第一のポリ電解質のナノ粒子を含む水性溶液を用意すること;
(2)上記溶液(1)を、該第一のポリ電解質の極性と反対の極性の少なくとも1の第二のポリ電解質と一緒にすること、ただし、過剰のアニオン性電荷を有する混合物を形成するためにはカチオン性ポリ電解質がアニオン性ポリ電解質の溶液に添加され;又は、過剰のカチオン性電荷を有する混合物を形成するためには、アニオン性ポリ電解質がカチオン性ポリ電解質の溶液に添加される、及び
(3)このようにしてナノ粒子を形成すること;
からなる段階を少なくとも含み、ただし、
− 上記アニオン性及びカチオン性ポリ電解質はポリアミノ酸の直鎖の骨格を有し、ポリアルキレングリコール側鎖基はなく、2,000以下の重合度を有し;
− 該2つのポリ電解質の混合物におけるカチオン性基の数:アニオン性基の数のモル比Zは0.1〜0.75又は1.3〜2の間に含まれ;かつ
− ポリ電解質の総質量濃度Cは該混合物の1g当たり厳密に2mg未満である、
前記製造方法。 - 上記アニオン性及びカチオン性ポリ電解質の混合物におけるカチオン性基の数:アニオン性基の数のモル比Zが0.3〜0.75、より特に0.5〜0.75、又は1.3〜1.5の間に含まれることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 該混合物におけるポリ電解質の総質量濃度Cが、0.5〜1.8mg/g、特に1〜1.5mg/gの間に含まれることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 該混合物が、5〜8、特に6〜7.5の範囲のpHにおいて製造されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 段階(2)が、少なくとも:
− 特に5〜8の範囲のpH、有利には段階(1)の水性溶液のpH値と同じであるpH、を有する、第二のポリ電解質の水性溶液を用意すること;そして
− 該第二のポリ電解質の上記水性溶液を段階(1)の該水性溶液と混合すること
を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 該ナノ粒子のサイズが20〜300nm、好ましくは50〜200nmの範囲であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 疎水性側鎖基を有する上記ポリ電解質が、5〜8の範囲のpHを有する水性媒体、特に水、に分散されたとき、自発的にナノ粒子を形成することができることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 上記アニオン性ポリ電解質が、以下の式(I)又はその薬学的に許容される塩のものであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法、
ここで、
− Raは、水素原子、直鎖のC2〜C10アシル基、分岐状のC3〜C10アシル基、ピログルタメート基又は以下で定義される疎水性基Gを表し;
− Rbは−NHR5基又は、窒素により結合されかつそのカルボキシルは任意的に−NHR5アルキルアミノ基又は−OR6アルコキシにより置換されていてもよいところの末端アミノ酸残基を表し、ここで
・R5は水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、又はベンジル基を表し;
・R6は、水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、ベンジル基、又は基Gを表し;
− R1は、水素原子又は1価の金属カチオン、好ましくはナトリウム又はカリウムイオンを表わし;
− Gは、オクチルオキシ−、ドデシルオキシ−、テトラデシルオキシ−、ヘキサデシルオキシ−、オクタデシルオキシ−、9−オクタデセニルオキシ−、トコフェリル−、及びコレステリル−から選択された疎水性基、好ましくはアルファ−トコフェリル−を表し;
・s1は中性pHにおいてアニオン性である、非グラフト化グルタメートモノマーの平均数に該当し、
・p1は、疎水性の基Gを有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
p1は任意的にゼロであってもよく、
− 重合度DP1=(s1+p1)は2,000以下、特に700未満、より特に40〜450、特に40〜250、特に40〜150の範囲であり、
− 上記一般式(I)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプである。 - 上記アニオン性ポリ電解質は、以下の式(I´)のもの又はその薬学的に許容される塩の一つである請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法、
ここで、
− G´は、オクチル−、ドデシル−、テトラデシル−、ヘキサデシル−、オクタデシル−、9−オクタデセニル−から選択される疎水性基を表し;
・s1=(s1´+s1´´)は、中性pHにおいてアニオン性である非グラフト化アスパルテートモノマーの平均数に該当し、
・p1=(p1´+p1´´)は、疎水性基G´を有するアスパルテートモノマーの平均数に該当し、任意的にゼロであってもよく、
p1は任意的にゼロであってもよく、
− 重合度DP1=(s1+p1)は2,000以下、特に700未満、より特に20〜450、特に20〜250、特に20〜150の範囲であり、
− 上記一般式(I´)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプである。 - 上記カチオン性ポリ電解質が、以下の式(II)のもの又はその薬学的に許容されるその塩の一つであることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法、
ここで、
− Raは、水素原子、直鎖のC2〜C10アシル基、分岐状のC3〜C10アシル基、ピログルタメート基又は以下で定義される疎水性基Gを表し;
− Rbは−NHR5基又は、窒素により結合されかつそのカルボキシルは−NHR5アルキルアミノ基又は−OR6アルコキシにより任意的に置換されていてもよいところの末端アミノ酸残基を表し、ここで
・R5は水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、又はベンジル基を表し;
・R6は、水素原子、直鎖のC1〜C10アルキル基、分岐状のC3〜C10アルキル基、ベンジル基、又は基Gを表し;
− Gは、オクチルオキシ−、ドデシルオキシ−、テトラデシルオキシ−、ヘキサデシルオキシ−、オクタデシルオキシ−、9−オクタデセニルオキシ−、トコフェリル−、及びコレステリル−から選択された疎水性基、好ましくはアルファ−トコフェリル−を表し;
− R2は、カチオン性基、特にアルギニンを表し、
− R3は、ヒドロキシエチルアミノ−、ジヒドロキシプロピルアミノから選択された中性基を表し;
・s2は中性pHにおいてアニオン性である、非グラフト化グルタメートモノマーの平均数に該当し、
・p2は、疎水性基Gを有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
・r2は、カチオン性基R2を有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
・t2は、中性基R3を有するグルタメートモノマーの平均数に該当し、
s2、p2及びt2は任意的にゼロであってもよく、かつ
− 重合度DP2=(s2+p2+r2+t2)は2,000以下、特に700未満、より特に40〜450、特に40〜250、特に40〜150の範囲であり、
− 上記一般式(II)のモノマーの鎖形成は、ランダム、モノブロック又はマルチブロックタイプであることができる。 - 該水性溶液(1)の該第一のポリ電解質の上記ナノ粒子が、活性成分と非共有結合的に結合されていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 上記活性成分が治療的、化粧料的、又は予防的な利益又はイメージングの利益のある分子であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 該水性溶液(1)は、特に5〜8の範囲のpH値を有する、該第一の電解質の水性コロイド状溶液に該活性成分を添加することにより得られ、上記活性成分は上記第一のポリ電解質のナノ粒子と非共有結合的に結合することを特徴とする、請求項11又は12に記載の方法。
- 特に接線方向の又は正面の超ろ過、遠心分離、蒸発又は凍結乾燥による、濃縮の1以上の段階を段階(3)の後に含むことを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 得られた粒子、特に凍結乾燥又は霧状化により得られた粒子、の懸濁物を脱水する段階を、段階(3)の後に含むことを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
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