CN103357022A

CN103357022A - 一种双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物及其制备方法

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Publication number: CN103357022A
Application number: CN2013102293322A
Authority: CN
Inventors: 钱军民; 徐明辉; 胥伟军; 柳雪峰
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2013-06-08
Filing date: 2013-06-08
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-06-08
Also published as: CN103357022B

Abstract

一种双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物及其制备方法，该偶联物以甲氧基聚乙二醇为原料，经醛基化改性后与含二硫键的二酰肼发生还原胺化反应，得到端酰肼基聚乙二醇；再经其端酰肼基与阿霉素的酮羰基反应形成腙键，即得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物。本发明的偶联物不仅可响应癌细胞内还原性酸性环境快速释放药物，提高抗癌治疗效果，降低癌细胞耐药可能性，而且能在水相中自组装形成纳米颗粒，从而可实现血液中长循环，改善阿霉素代谢动力学。该偶联物制备方法具有原料易得、工艺简单、反应条件温和、载药率高、成本低等优点。本发明的聚乙二醇-阿霉素偶联物在药物靶向递送、控制释放和提高临床抗癌治疗效果方面具有潜在用途。

Description

一种双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物及其制备方法。

背景技术

利用细胞毒药物治疗肿瘤即化疗，是一种基本的肿瘤治疗策略。但是，化疗药物临床疗效往往受限于化疗药物对正常组织/细胞严重的毒副作用。疗效和毒副作用均与给药剂量正相关。因此，提高化疗疗效的同时降低毒副作用一直是肿瘤化疗基础研究和临床应用所追求的目标。为实现这一目标，基于生物材料尤其是生物高分子材料的药物递送体系得到快速发展。生物高分子材料具有分子设计灵活、合成方法多样、理化性质可控、生物相容性好、可生物降解等优点，在药物递送方面被寄予厚望，已被用于开发各种各样的药物递送载体，如聚合物-药物偶联物、纳米颗粒、纳米凝胶、纳米胶束、树形分子等。其中，聚合物-药物偶联物具有血液循环过程中稳定性好、载药量高、循环寿命长等优点，一直是药物递送领域的研究热点。

聚乙二醇是一种生物相容性优异的合成高分子，已被美国FDA批准应用于临床。聚乙二醇在水和绝大多数有机溶剂中溶解性好，广泛应用于各种药物载体的表面修饰，以避免体内巨噬细胞和免疫系统对药物载体的调理作用，提高体内循环时间，延长药物半衰期，通过EPR效应增大药物在肿瘤处的积聚，发挥被动靶向作用，提高治疗效果。然而，由于聚乙二醇端基为羟基，反应活性不高，用其改性药物载体时通常需要对聚乙二醇端羟基进行活化处理，方能与待修饰材料键合。而将活化处理的聚乙二醇直接与药物键合形成聚乙二醇-药物偶联物，是一种工艺相对简单的药物递送体系，受到广泛关注。如申请号为201210104327.4的中国专利通过端马来酰亚胺基聚乙二醇与巯基化比伐卢定之间的迈克尔加成反应制得聚乙二醇-比伐卢定偶联物。申请号为201210128392.0和201110094275.2的中国专利分别利用丁二酸酐改性得到的端羧基聚乙二醇通过碳二亚胺法键接紫杉醇和喜树碱类药物，得到聚乙二醇-紫杉醇/喜树碱偶联物。另外申请号为201110067552.0的中国专利利用一端醛基化的端甲氧基聚乙二醇衍生物键接含氨基的重组人精氨酸酶I。这些聚乙二醇-偶联物能显著增强药物水溶性和稳定性、实现长循环。然而，这些偶联物中聚乙二醇和药物之间基本是通过稳定的化学键连接的，存在药物释放速度慢和潜在的内涵体逃逸困难等问题，影响药物疗效。

阿霉素是一种广谱抗肿瘤药物，具有很强的细胞毒性，其作用机制是嵌入DNA而抑制核酸的合成，从而达到控制肿瘤细胞的扩散和杀死肿瘤细胞的目的，临床上主要用于治疗肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等。与大多数化疗药物一样，存在水溶性差、选择性差、生物利用度低、毒副作用严重、易产生耐药性等问题，极大地限制了阿霉素作为抗肿瘤药物的使用。阿霉素临床应用是采用其盐酸盐形式，仅解决了水溶性问题，且体内半衰期较短，为40～50小时。因此，开发高效、稳定、长效的水溶性阿霉素制剂就成为研究热点之一，主要集中于前体药物和载体两类药物递送体系。其中，载体类递送体系如脂质体、纳米胶束、纳米凝胶、纳米粒等主要是通过物理包埋和吸附等方式装载药物，大幅度提高了生物利用度，但存在载药量低和早期药物突释等问题，仍可导致毒副作用，并且引入的大分子聚合物通常难以代谢。而前体药物，即聚合物-药物偶联物，可使药物牢牢固定于高分子上，避免了循环过程中的泄露问题，受到广泛重视，反应主要涉及13位羰基和3'位氨基。如申请号为201110343633.9的中国专利公开了一种通过酰胺键连接的聚(L-赖氨酸)或壳聚糖与阿霉素的偶联物，其优点是载体生物相容性好、制备过程简单，但存在酶降解不确定性大、释药速度难以调控等问题。申请号为201110113954.X和201010560808.7的中国专利分别公开了通过腙键和苯亚胺键连接的聚乙二醇-阿霉素偶联物及制备方法，这些偶联物具有pH敏感的药物控制释放功能，并能自组装形成纳米粒，具有通过EPR效应靶向肿瘤组织的能力。然而，这些偶联物均是引入一种敏感机制实现药物快速释放的。

因此，开发能在肿瘤细胞内快速释放药物的新型聚乙二醇-药物偶联物是非常必要的，对于提高抗肿瘤效果和降低毒副作用具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速释放药物且在水介质中能自组装成纳米颗粒的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物及其制备方法，该方法能够原料易得、工艺相对简单、反应条件温和、产品均一且粒径小，易于批量生产。

为了达到上述目的，本发明的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的结构式如下所示：

其中，n为8～50；x=y，且x为1～3。

一种该双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，包括以下步骤：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为400～2000道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成甲氧基聚乙二醇溶液，然后向甲氧基聚乙二醇溶液中滴加甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数2～10倍量的乙酸酐，室温搅拌8～24小时，得到的反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为（75:25）～（95:5）；

2）含二硫键的二酰肼的合成：

将含二硫键的二元酸和一元醇、甲苯和对甲苯磺酸加入反应器中，回流反应6～12小时，然后去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入水合肼水溶液，回流反应2～6小时，然后重结晶，得到含二硫键的二酰肼；其中，所加入的含二硫键的二元酸和一元醇的摩尔比为（1:10）～（1:30），所加入的含二硫键的二元酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:（20～40），所加入的一元醇为甲醇或乙醇；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数5～25倍量的含二硫键的二酰肼，室温反应4～12小时，再加入氰基硼氢化钠水溶液，反应12～36小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中进行透析，透析后留在透析袋内的溶液冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:（2～5）；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.2～6.8的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；将混合溶液在pH值为7.4～7.8的磷酸盐缓冲液中进行透析，透析后留在透析袋中的溶液冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为（1:5）～（1:20）。

所述的步骤1）甲氧基聚乙二醇溶液的质量浓度为1%～10%。

所述的步骤1）中的乙酸酐滴加到聚乙二醇溶液所需的时间为0.5～2小时，冷乙醚的温度为零下10℃～零下20℃。

所述的步骤2）中水合肼水溶液的质量浓度为50%-85%。

所述的步骤2）中的含二硫键的二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸。

所述的步骤2）中的含二硫键的二元酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01。

所述的步骤2）中的重结晶溶剂是由体积比为（3:7）～（1:9）的水和乙醇混合而成的。

所述的步骤3）中端醛基聚乙二醇水溶液的浓度为2～30mmol/L，反应液在蒸馏水中透析是在室温条件下进行的，透析时间为2天，冻干温度为零下40℃。

所述的步骤4）中的透析是在室温条件下进行的，透析时间2天，冻干温度为零下40℃。

进一步的，所述的步骤2）中每毫摩尔2,2'-二硫代二乙酸加入0.8-1.2mL的甲苯。

进一步的，所述的步骤3）中氰基硼氢化钠的浓度为30-120mmol/L。

进一步的，所述的步骤4）中每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于5-20mL的pH值为6.2的磷酸盐缓冲液。

本发明就是通过在聚乙二醇和阿霉素之间嵌入对癌细胞微环境中还原性和酸性双重敏感的二硫键和腙键，实现聚乙二醇-阿霉素偶联物在肿瘤细胞内更快释放药物的目的，这种结构设计尚未见报道。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物是通过二硫键和腙键连接的，具有对癌细胞内酸性/还原性微环境双重敏感的功能，因此，该偶联物可以响应肿瘤细胞内的酸性/还原性微环境而使二硫键和腙键快速断裂，迅速释放阿霉素，达到提高肿瘤化疗疗效、避免癌细胞耐药性和降低毒副作用的目的，还可提高阿霉素的水溶性，降低肾脏清除率，实现体内长循环，从而起到被动靶向肿瘤的作用；同时，阿霉素释放速度有望比单一敏感型聚合物-药物偶联物更快，不仅最大化地增强疗效、克服耐药性和降低毒副，而且阿霉素以原始分子形式被释放出来，避免了二硫键作为连接键时阿霉素分子上的残基存在而导致的潜在药效下降；因此，相对于目前临床上广泛采用的游离态的阿霉素制剂，本发明的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物可望具有更高的疗效和更低的毒副作用。

本发明的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物具有两亲性质，在水介质中能自组装成粒径为20～80nm的纳米颗粒，具有血浆稳定性好和长循环性质，能通过EPR效应靶向肿瘤组织；该偶联物形成胶束的特性还可用于其他化疗药的包埋装载，实现不同化疗药的共同递送，发挥协同抗癌作用；该聚乙二醇-阿霉素偶联物的载药量高达20%～50%。此外，该聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法具有原料易得、工艺相对简单、反应条件温和、粒径小且均一等优点，易于批量生产。

附图说明

图1是实施例1制备的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的氢核磁共振谱图，a为聚乙二醇中亚甲基的化学位移；DOX为阿霉素的化学位移；

图2是动态光散射法测得的实施例1制备的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物自组装形成的纳米胶束的粒径分布图；

图3是实施例1制备的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物自组装形成的纳米胶束的透射电镜照片。

具体实施方式

本发明是以甲氧基聚乙二醇为原料，经醛基化改性后与含二硫键的二酰肼发生还原胺化反应，得到酰肼化聚乙二醇；再经其端酰肼基与阿霉素的酮羰基反应形成腙键，即得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物。含二硫键的二酰肼是由含二硫键的二元酸和一元醇对甲苯磺酸在甲苯中回流反应，然后去除溶剂，加入水合肼水溶液，回流反应，并重结晶得到的；含二硫键的二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸。

当以2,2'-二硫代二乙酸为原料时，得到的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的结构式为：

当以3,3'-二硫代二丙酸为原料时，得到的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的结构式为：

当以4,4'-二硫代二丁酸为原料时，得到的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的结构式为：

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为2000道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成质量浓度为10%的甲氧基聚乙二醇溶液，然后在1小时内向甲氧基聚乙二醇溶液中滴加完甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数5倍量的乙酸酐，室温搅拌12小时，得到的反应液经真空浓缩后用零下20℃的冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为75:25；

2）3,3'-二硫代二丙酰肼的合成：

将3,3'-二硫代二丙酸和乙醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中，回流反应8小时，然后真空去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为50%的水合肼水溶液，回流反应2小时，然后用体积比为1:9的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶，得到3,3'-二硫代二丙酰肼；其中，所加入的3,3'-二硫代二丙酸和乙醇的摩尔比1:15，所加入的3,3'-二硫代二丙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:20，所加入的3,3'-二硫代二丙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01，每毫摩尔3,3'-二硫代二丙酸加入1mL的甲苯中；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，配制成浓度为5mmol/L的端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数20倍量的3,3'-二硫代二丙酰肼，室温反应4小时，再加入浓度为100mmol/L的氰基硼氢化钠水溶液，继续反应12小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中透析2天，透析后留在透析袋内的溶液在零下40℃下冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:5；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在完全避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；在完全避光、室温条件下，将混合溶液在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中透析2天，透析后留在透析袋中的溶液冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1:5，每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于20mL的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液。

图1是实施例1制得的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的1H-NMR谱图，图1中数据清楚地显示出双功能聚乙二醇中亚甲基的化学位移（标记为a）和阿霉素的化学位移（标记为DOX）。图2和图3分别是实施例1制备的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物在水介质中自组装形成的纳米颗粒的粒径分布和透射电镜照片。图2数据表明，双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物形成的纳米胶束粒径分布范围为20～70nm，与图3照片中的结果一致，但粒径稍大一些，这是因为图2和图3分别给出的是流体动力学体积和干态颗粒的尺寸。

实施例2：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为1500道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成质量浓度为1%的甲氧基聚乙二醇溶液，然后在2小时内向甲氧基聚乙二醇溶液中滴加完甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数2倍量的乙酸酐，室温搅拌24小时，得到的反应液经真空浓缩后用零下20℃的冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为95:5；

2）2,2'-二硫代二乙酰肼的合成：

将2,2'-二硫代二乙酸和甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中，回流反应12小时，然后真空去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为85%的水合肼水溶液，回流反应6小时，然后用体积比为3:7的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶，得到2,2'-二硫代二乙酰肼；其中，所加入的2,2'-二硫代二乙酸和甲醇的摩尔比1:20，所加入的2,2'-二硫代二乙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:20，所加入的2,2'-二硫代二乙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01，每毫摩尔2,2'-二硫代二乙酸加入0.8mL的甲苯中；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，配制成浓度为10mmol/L的端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数15倍量的2,2'-二硫代二乙酰肼，室温反应12小时，再加入浓度为90mmol/L的氰基硼氢化钠水溶液，继续反应12小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中透析2天，透析后留在透析袋内的溶液在零下40℃下冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:3；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在完全避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.2的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；在完全避光、室温条件下，将混合溶液在pH值为7.8的磷酸盐缓冲液中透析2天，透析后留在透析袋中的溶液在零下40℃冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1:20，每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于15mL的pH值为6.2的磷酸盐缓冲液。

该双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物可在水介质中形成20～80nm的纳米粒。

实施例3：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为1200道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成质量浓度为3%的甲氧基聚乙二醇溶液，然后在0.5小时内向甲氧基聚乙二醇溶液中滴加完甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数2倍量的乙酸酐，室温搅拌8小时，得到的反应液经真空浓缩后用零下20℃的冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为8:1；

2）4,4'-二硫代二丁酰肼的合成：

将4,4'-二硫代二丁酸和甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中，回流反应12小时，然后真空去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为60%的水合肼水溶液，回流反应6小时，然后用体积比为3:7的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶，得到4,4'-二硫代二丁酰肼；其中，所加入的4,4'-二硫代二丁酸和甲醇的摩尔比为1:30，所加入的4,4'-二硫代二丁酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:40，所加入的4,4'-二硫代二丁酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01，每毫摩尔4,4'-二硫代二丁酸加入1.2mL的甲苯中；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，配制成10mmol/L的端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数10倍量的4,4'-二硫代二丁酰肼，室温反应12小时，再加入浓度为100mmol/L的氰基硼氢化钠水溶液，继续反应36小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中透析2天，透析后留在透析袋内的溶液在零下40℃下冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:4；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在完全避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.8的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；在完全避光、室温条件下，将混合溶液在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中透析2天，透析后留在透析袋中的溶液在零下40℃冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1:20，每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于12mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲液。

实施例4：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为800道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成质量浓度为6%的甲氧基聚乙二醇溶液，然后在2小时内向甲氧基聚乙二醇溶液中滴加完甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数8倍量的乙酸酐，室温搅拌16小时，得到的反应液经真空浓缩后用零下20℃的冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为9:1；

2）3,3'-二硫代二丙酰肼的合成：

将3,3'-二硫代二丙酸和甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中，回流反应8小时，然后真空去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为72%的水合肼水溶液，回流反应6小时，然后用体积比为2:8的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶，得到3,3'-二硫代二丙酰肼；其中，所加入的3,3'-二硫代二丙酸和甲醇的摩尔比为1:10，所加入的3,3'-二硫代二丙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:25，所加入的3,3'-二硫代二丙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01，每毫摩尔3,3'-二硫代二丙酸加入0.9mL的甲苯中；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，配制成浓度为25mmol/L的端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数15倍量的3,3'-二硫代二丙酰肼，室温反应10小时，再加入浓度为150mmol/L的氰基硼氢化钠水溶液，继续反应24小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中透析2天，透析后留在透析袋内的溶液在零下40℃下冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:2.5；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在完全避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.2的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；在完全避光、室温条件下，将混合溶液在pH值为7.8的磷酸盐缓冲液中透析2天，透析后留在透析袋中的溶液在零下40℃冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1:12，每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于8mL的pH值为6.2的磷酸盐缓冲液。

实施例5：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为600道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成质量浓度为8%的甲氧基聚乙二醇溶液，然后在1小时内滴加完甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数4倍量的乙酸酐，室温搅拌10小时，得到的反应液经真空浓缩后用零下20℃的冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为85:15；

2）2,2'-二硫代二乙酰肼的合成：

将2,2'-二硫代二乙酸和乙醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中，回流反应10小时，然后真空去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为60%的水合肼水溶液，回流反应5小时，然后用体积比为1:9的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶，得到2,2'-二硫代二乙酰肼；其中，所加入的2,2'-二硫代二乙酸和乙醇的摩尔比为1:18，所加入的2,2'-二硫代二乙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:35，所加入的2,2'-二硫代二乙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01，每毫摩尔2,2'-二硫代二乙酸加入0.7mL的甲苯中；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，配制成浓度为6mmol/L的端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数10倍量的2,2'-二硫代二乙酰肼，室温反应7小时，再加入浓度为60mmol/L的氰基硼氢化钠水溶液，继续反应22小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中透析2天，透析后留在透析袋内的溶液在零下40℃下冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:3.5；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在完全避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.6的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；在完全避光、室温条件下，将混合溶液在pH值为7.8的磷酸盐缓冲液中透析2天，透析后留在透析袋中的溶液在零下40℃冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1:8，每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于6mL的pH值为6.6的磷酸盐缓冲液。

实施例6：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为1000道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成质量浓度为7%的甲氧基聚乙二醇溶液，然后在1.5小时内向甲氧基聚乙二醇溶液中滴加完甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数10倍量的乙酸酐，室温搅拌18小时，得到的反应液经真空浓缩后用零下10℃的冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为12:1；

2）3,3'-二硫代二丙酰肼的合成：

将3,3'-二硫代二丙酸和乙醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中，回流反应6小时，然后真空去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为50%的水合肼水溶液，回流反应4小时，然后用体积比为1:6的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶，得到3,3'-二硫代二丙酰肼；其中，所加入的3,3'-二硫代二丙酸和乙醇的摩尔比1:20，所加入的3,3'-二硫代二丙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:30，所加入的3,3'-二硫代二丙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01，每毫摩尔3,3'-二硫代二丙酸加入0.8mL的甲苯；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，配制成浓度为2mmol/L的端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数5倍量的3,3'-二硫代二丙酰肼，室温反应8小时，再加入浓度为30mmol/L的氰基硼氢化钠水溶液，继续反应18小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中透析2天，透析后留在透析袋内的溶液在零下40℃下冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:2；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在完全避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.5的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；在完全避光、室温条件下，将混合溶液在pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中透析2天，透析后留在透析袋中的溶液在零下40℃冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1:10，每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于10mL的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液。

实施例7：

1）端醛基聚乙二醇合成：

将分子量为400道尔顿的甲氧基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜和无水氯仿的混合溶剂中，配制成质量浓度为1%的甲氧基聚乙二醇溶液，然后在2小时内向甲氧基聚乙二醇溶液中滴加完甲氧基聚乙二醇中羟基摩尔数2倍量的乙酸酐，室温搅拌24小时，得到的反应液经真空浓缩后用零下16℃的冷乙醚沉淀，即得端醛基聚乙二醇；其中，混合溶剂中无水二甲基亚砜和无水氯仿的体积比为95:5；

2）2,2'-二硫代二乙酰肼的合成：

将2,2'-二硫代二乙酸和甲醇加入盛有甲苯和对甲苯磺酸的反应器中，回流反应12小时，然后真空去除溶剂，再向反应器内的剩余物中加入质量浓度为85%的水合肼水溶液，回流反应6小时，然后用体积比为3:7的水和乙醇混合而成的溶剂重结晶，得到2,2'-二硫代二乙酰肼；其中，所加入的2,2'-二硫代二乙酸和甲醇的摩尔比1:20，所加入的2,2'-二硫代二乙酸与水合肼水溶液中的水合肼的摩尔比为1:20，所加入的2,2'-二硫代二乙酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01，每毫摩尔2,2'-二硫代二乙酸加入1mL的甲苯；

3）还原胺化反应：

将端醛基聚乙二醇溶于蒸馏水中，配制成浓度为30mmol/L的端醛基聚乙二醇水溶液，向端醛基聚乙二醇水溶液中加入端醛基聚乙二醇中醛基摩尔数25倍量的2,2'-二硫代二乙酰肼，室温反应12小时，再加入浓度为120mmol/L的氰基硼氢化钠水溶液，继续反应12小时，得到反应液；将反应液在蒸馏水中透析2天，透析后留在透析袋内的溶液在零下40℃下冻干，得到端酰肼基聚乙二醇；其中，所加入的端醛基聚乙二醇中的醛基与氰基硼氢化钠水溶液中的氰基硼氢化钠的摩尔比为1:3；

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

在完全避光的条件下，将端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐溶于pH值为6.2的磷酸盐缓冲液中，得到混合溶液；在完全避光、室温条件下，将混合溶液在pH值为7.6的磷酸盐缓冲液中透析2天，透析后留在透析袋中的溶液在零下40℃冻干，得到双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物；其中，所加入的端酰肼基聚乙二醇和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1:20，每毫摩尔端酰肼基聚乙二醇溶于5mL的pH值为6.2的磷酸盐缓冲液。

近期的一些研究表明，药物递送体系在肿瘤处聚集后若能快速释放药物，将可显著提高药物的抗肿瘤效果，降低癌细胞耐药可能性，同时不会对正常组织和细胞造成严重的影响（Nat Rev Drug Discov,2010,9:29-42）。

目前，实现药物递送体系在肿瘤处快速释放药物的主要理论基础是癌细胞拥有酸性和生物还原性的微环境，可使对酸敏感的腙键、希夫碱、缩醛/缩酮等和对生物还原性敏感的二硫键迅速断裂。含有这些化学键的载体或载体-药物偶联物在进入癌细胞后，就能感受到酸性和还原性信号而快速释放药物。如通过腙键键接于聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物中的阿霉素可在乳腺癌细胞内酸性环境中快速释放阿霉素（Biomaterials,2009,30:6065-6075）。而通过二硫键连接的聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物或聚乙二醇-聚酰胺嵌段共聚物胶束包埋阿霉素后，在癌细胞内会因二硫键断裂而快速释放阿霉素（Biomaterials,2009,30:6358-6366和Biomaterials,2010,31:7124）。

Claims

1.一种双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物，其特征在于，该偶联物结构式如下所示：

其中，n为8～50；x=y，且x为1～3。

2.一种根据权利要求1所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）端醛基聚乙二醇合成：

2）含二硫键的二酰肼的合成

3）还原胺化反应：

4）双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物生成：

3.根据权利要求2所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1）甲氧基聚乙二醇溶液的质量浓度为1%～10%。

4.根据权利要求2或3所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1）中的乙酸酐滴加到聚乙二醇溶液所需的时间为0.5～2小时，冷乙醚的温度为零下10℃～零下20℃。

5.根据权利要求2所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤2）中水合肼水溶液的质量浓度为50%-85%。

6.根据权利要求2所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤2）中的含二硫键的二元酸为2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸或4,4'-二硫代二丁酸。

7.根据权利要求2所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤2）中的含二硫键的二元酸与对甲苯磺酸的摩尔比为1:0.01。

8.根据权利要求2所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤2）中的重结晶溶剂是由体积比为（3:7）～（1:9）的水和乙醇混合而成的。

9.根据权利要求2所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤3）中端醛基聚乙二醇水溶液的浓度为2～30mmol/L，反应液在蒸馏水中透析是在室温条件下进行的，透析时间为2天，冻干温度为零下40℃。

10.根据权利要求2所述的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物的制备方法，其特征在于：所述的步骤4）中的透析是在室温条件下进行的，透析时间2天，冻干温度为零下40℃。