CN103352044A

CN103352044A - 一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法

Info

Publication number: CN103352044A
Application number: CN2013102822275A
Authority: CN
Inventors: 林毅; 刘鑫; 王艳玲; 姜家生; 蔡永萍
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2013-10-16

Abstract

本发明公开了一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法，步骤包括：提取棉花雄性不育系与可育系的花药总DNA，设计并合成如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以花药总DNA为模板进行PCR扩增，分离出编码棉花Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶的基因。本发明的突出优势是设计并合成了Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段特异性引物，同时提供了该基因PCR扩增的最佳反应条件，首次在棉花雄性不育系中克隆了该基因片段；通过比较该基因在不育系与可育系植株中表达的差异性，为进一步探讨该基因与棉花不育性状之间的关系奠定了基础。

Description

一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法。

背景技术

目前，植物雄性不育的分子生物学研究在逐步开展，对于花粉发育的研究已有相当多的理论支持。马小定等应用cDNA-AFLP分析棉花双隐性核不育系ms5ms6的不育株和可育株花粉进行对比，得到17个差异条带，这些基因的表达在时间和空间上也均存在着差异，经过BLAST比对找到有14个同源性较高的基因，分别是与细胞壁发育，基因表达和能量代谢相关的基因，将这些基因在NCBI中比对，找到同源性最高的Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因cDNA序列。

尿苷二磷酸葡糖脱氢酶（UDPGDH）主要参与4种代谢途径，包括：戊糖和葡萄糖醛酸之间的转化、抗坏血酸和醛糖二酸的代谢、淀粉和蔗糖之间的转化以及核苷酸糖的代谢过程，它参与的反应如下：

UDP-葡糖醛酸是合成细胞壁和多种糖的前体物质，是核糖代谢途径的重要的中间产物，许多糖类是由UDP-葡萄糖醛酸衍生出来的，在有机体中扮演着重要角色。UDPGDH在多糖合成中的作用为：UDPGDH催化UDPG生成UDP-葡萄糖醛酸，可能是生成纤维素果胶途径的关键酶。纤维素果胶是合成初生壁的重要前体，所以UDPGDH在细胞壁发育过程中起着一定的作用。而不育的发生与小孢子壁的发育有关，因此UDPGDH基因可能在败育过程中起作用。

本研究以一种UDPGDH基因Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因为研究对象，通过分析其在可育株与不育株DNA序列的差异性，研究其对基因表达的影响，进而分析该基因对植株育性的调控。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法，包括以下步骤：

提取棉花雄性不育系与可育系的花药总DNA，设计如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以花药总DNA为模板进行PCR扩增，分离出编码棉花Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因。

所述上游引物和下游引物与基因非扩增区域无同源性，无发夹结构，且其内部链无二级结构，长度均为24bp。

所述Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因具有SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列以及它的突变形式，所述突变形式包括：缺失、无义、插入、错义。

所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3～5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，30～35个循环，循环结束后，再进行72℃延伸7～10min。

所述棉花雄性不育系与可育系的花药选自6个时期，包括：幼花药发育期（现蕾1～5天，直径1～3mm），花粉母细胞发育期（现蕾6～7天，直径3～4mm），花粉母细胞减数分裂期（现蕾8～9天，直径4～5mm），花粉粒发育期（现蕾10～11天，直径5～6mm），纤维层发育期（现蕾12～15天，直径6～7mm）和成熟花粉期（现蕾16～20天，直径7～8mm）。

本发明的有益效果在于：设计了Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段特异性引物，同时提供了Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因PCR扩增的最佳反应条件，首次在棉花雄性不育系中克隆了Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段；通过对该基因在不育系与可育系植株中表达差异性的比较，为进一步探讨该基因与棉花不育性状之间的关系奠定了基础。

具体实施方式

下面根据实施例对本发明做进一步详细说明，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明技术构思以及内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

1、材料的选取：

取棉花雄性不育系ms5ms6与可育系的花蕾（取样时间为上午6:00），选取6个时期的花药，包括：幼花药发育期（现蕾1天，直径2mm），花粉母细胞发育期（现蕾6天，直径3mm），花粉母细胞减数分裂期（现蕾8天，直径4mm），花粉粒发育期（现蕾10天，直径5mm），纤维层发育期（现蕾12天，直径6mm）和成熟花粉期（现蕾16天，直径7mm），保存于-70℃冰箱备用。

2、花药总DNA的提取：

（1）取上述各时期的棉花核雄性不育系和可育系花药各0.5g，加入等量的PVP，加液氮充分研磨至粉末状，转移至离心管中，加入1mL的65℃预热的CTAB缓冲液，混匀，65℃温浴30min；

（2）4℃下12000rpm离心10min，取上清；

（3）上清中加入1/2体积的pH为8.0的酚，再加入与混合液等体积的氯仿与异戊醇混合液，氯仿与异戊醇混合液的体积比为24：1，混匀，4℃下12000rpm离心15min，取上清；

（4）再加入等体积的上述氯仿与异戊醇混合液，4℃下12000rpm离心15min，取上清；

（5）上清中加入1/10体积的醋酸钠，再加入混合液2倍体积的无水乙醇，混匀，静置30min，4℃下12000rpm离心10min，弃上清；

（6）加入1mL的体积分数为75％的乙醇，洗涤沉淀，4℃下12000rpm离心5min，弃上清；

（7）重复步骤（6），室温风干，加入20μL的TE缓冲液（购于上海生物工程有限公司）充分溶解，于-20℃保存备用。

3、Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因特异性引物的设计：

根据GenBank里棉花Spot-9-UDPGDH基因全长cDNA序列（序列如SEQ ID NO:3所示，GenBank登录号为FJ415166.1）设计引物，并委托上海生物工程有限公司合成，引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

4、Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的PCR扩增：

（1）PCR反应体系：

在PCR管中依次加入：10×PCR Buffer2.5μL，dNTP2μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O17μL，Taq酶0.5μL（购于大连宝生物工程有限公司）。

（2）PCR反应条件：

94℃预热3min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min，PCR产物于4℃保存。

Claims

1.一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法，其特征在于，包括以下步骤：提取棉花雄性不育系与可育系的花药总DNA，设计如SEQ IDNO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物，以花药总DNA为模板进行PCR扩增，分离出棉花Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因。

2.根据权利要求1所述的一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物与基因非扩增区域无同源性，无发夹结构，且其内部链无二级结构，长度均为24bp。

3.根据权利要求1所述的一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因具有SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列以及它的突变形式，所述突变形式包括：缺失、无义、插入、错义。

4.根据权利要求1所述的一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3～5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，30～35个循环，循环结束后，再进行72℃延伸7～10min。

5.根据权利要求1所述的一种Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法，其特征在于，所述棉花雄性不育系与可育系的花药选自6个时期，包括：幼花药发育期，花粉母细胞发育期，花粉母细胞减数分裂期，花粉粒发育期，纤维层发育期和成熟花粉期。