CN102912015A - 鉴别刺参优良品种的分子标记及快速鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴别刺参优良品种的分子标记及快速鉴定方法，其中分子标记的引物为扩增ADP糖基化因子、扩增精氨酸激酶、扩增细胞色素氧化酶c亚单位、扩增热休克蛋白70和扩增肌动蛋白的引物，分子标记的表达基因为ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70和肌动蛋白的基因片段；鉴定刺参品种的方法为总RNA的提取、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，鉴定快速、简便、特异和有效，若至少其中三个基因片段的表达量为2.0，则该刺参为快速生长的刺参优良品种；这样就可以筛选出快速生长的刺参，作为优良品种的种质培育和养殖，可以缩短刺参的养殖时间，提高刺参的养殖效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子标记，具体涉及鉴别刺参优良品种的分子标记及快速鉴定方法。
背景技术
刺参（Stichopus japonicus Selenka）隶属于棘皮动物门，刺参纲，楯手目，俗称海老鼠和海黄瓜。主要分布在我国大连、北戴河、山东半岛、江苏连云港及平山岛等沿海。2006年开始，我们将北方刺参引入在我市象山地区的虾池进行养殖，养殖6个月的左右的刺参可由3g/个参苗平均增重到50-60g，而且成活率较高。在南移刺参养殖过程中，我们发现刺参品种的生长速度差异明显，有快速生长品种和缓慢生长品种，生长速度不同的刺参品种直接影响到最终的产量和效益，因此筛选快速生长刺参品种是提高产量和效益的前题。分子标记辅助选育极大的提升和加速了育种的进程，目前分子育种技术已广泛应用于农作物育种之中，选育出一些新的优良种质，为农业的大发展奠定了基础；如授权公告号为CN101831498B的发明专利，就公开了筛选香型水稻的分子标记及筛选方法，其分子标记有与水稻badh2的第4内含子反义链同源配对的香味等位基因正义引物，第7外显子正义链同源配对的非香味等位基因反义引物等4种引物，其筛选方法有水稻总RNA提取、与4种引物进行PCR扩增，然后对扩增产物凝胶电泳检测：若扩增产物只有约780bp条带，就为纯合香型水稻。但对筛选刺参优良品种还未有鉴别的分子标记报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴别刺参优良品种的分子标记，该分子标记可以快速鉴定刺参的品种是否为快速生长的优良品种。本发明还提供了利用分子标记快速鉴定刺参优良品种的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：鉴别刺参优良品种的分子标记，所述分子标记的引物如下：扩增ADP糖基化因子正向引物：AACGAATCTAAAATCATTAGTCAGTG，反向引物：CTACTATTGC TTGGAAAACG AGA；扩增精氨酸激酶正向引物：CAGATGGGAG GAGACATGAA GGA，反向引物：TGGATGGGCA AGTCAGAACAAATC；扩增细胞色素氧化酶c亚单位正向引物：TCATGGTAGC TGCTGTGAAG TAGG，反向引物：ACTTGTTCTG ATTCTTCGGA CACC；扩增热休克蛋白70正向引物：CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC，反向引物：ATTCGAGTCG AACCTCCG；扩增肌动蛋白正向引物：CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC，反向引物：ATTCGAGTCG AACCTCCG；所述分子标记的基因片段如下：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ADP糖基化因子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的精氨酸激酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的细胞色素氧化酶c亚单位，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的热休克蛋白70，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的肌动蛋白。
利用所述的鉴别刺参优良品种的分子标记快速鉴定刺参品种的方法，其特征在于步骤如下：
a、总RNA的提取：取刺参体腔液1.0mL，2000g离心5min，收集血细胞，加入Trizol试剂（购于Clontech公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm,离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm,离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度75%的乙醇1mL，4℃，12000rpm,离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成：上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（购于Clontech公司）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；
c、PCR扩增：25ul扩增体系：10×PCR缓冲液2.5ul，浓度10uM的dNTPs液1.5ul，浓度10uM的Mgcl2液1.5ul，浓度2U/ul的Taq酶液0.5ul，正向引物和反向引物浓度都为10uM的引物溶液1ul，RNA提取液1ul，ddH2O补充至25ul；扩增反应条件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析：95℃15s，60℃20s，然后缓慢升温至95℃；所述引物溶液含有扩增ADP糖基化因子正向引物和反向引物，或含有扩增精氨酸激酶正向引物和反向引物，或含有扩增细胞色素氧化酶c亚单位正向引物和反向引物，或含有扩增热休克蛋白70正向引物和反向引物，或含有扩增肌动蛋白正向引物和反向引物；
d、鉴定：扩增完成后，利用2-Δ△CT方法分析基因表达量，若ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70、肌动蛋白的基因片段中至少其中三个基因片段的表达量不低于2.0，则该刺参为快速生长的刺参优良品种。
与现有技术相比，本发明的优点在于鉴别刺参优良品种的分子标记及快速鉴定方法，其中分子标记的引物为扩增ADP糖基化因子、扩增精氨酸激酶、扩增细胞色素氧化酶c亚单位、扩增热休克蛋白70和扩增肌动蛋白的引物，分子标记的表达基因为ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70和肌动蛋白的基因片段；鉴定刺参品种的方法为总RNA的提取、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，鉴定快速、简便、特异和有效，若至少其中三个基因片段的表达量为2.0，则该刺参为快速生长的刺参优良品种；这样就可以筛选出快速生长的刺参，作为优良品种的种质培育和养殖，可以缩短刺参的养殖时间，提高刺参的养殖效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
2009年3月，从浙江省、宁波市象山港中采购3g/个左右的活体刺参20只，在实验室暂养2周，每天换2/3体积海水，每只刺参分别依以下方法进行刺参品种是否优良进行快速鉴定：
1、取刺参体腔液1.0mL，2000g离心5min，收集血细胞，加入Trizol试剂（购于Clontech公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm,离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm,离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度75%的乙醇1mL，4℃，12000rpm,离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
2、RNA提取液用cDNA合成试剂盒（购于Clontech公司）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；
3、对上述cDNA分别用5个基因片段的引物进行扩增，25ul扩增体系：10×PCR缓冲液2.5ul，浓度10uM的dNTPs液1.5ul，浓度10uM的Mgcl2液1.5ul，浓度2U/ul的Taq酶液0.5ul，正向引物和反向引物浓度都为10uM的引物溶液1ul，RNA提取液1ul，ddH2O补充至25ul；扩增反应条件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 20s，然后缓慢升温至95℃；5个基因片段的引物分别为扩增ADP糖基化因子正向引物：AACGAATCTAAAATCATTAG TCAGTG和反向引物：CTACTATTGC TTGGAAAACG AGA，扩增精氨酸激酶正向引物：CAGATGGGAG GAGACATGAA GGA和反向引物：TGGATGGGCAAGTCAGAACA AATC，扩增细胞色素氧化酶c亚单位正向引物：TCATGGTAGCTGCTGTGAAG TAGG和反向引物：ACTTGTTCTG ATTCTTCGGA CACC，扩增热休克蛋白70正向引物：CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC和反向引物：ATTCGAGTCGAACCTCCG，扩增肌动蛋白正向引物：CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC和反向引物：ATTCGAGTCG AACCTCCG，扩增是在自带的SDS2.0软件的ABI7300定量PCR仪进行；引物筛选参照Clontech公司PCR-Select cDNA Subtraction Kit构建的消减文库得出，引物由上海生工合成；
4、扩增完成后，分别计算△CT值，然后依2-ΔΔCT方法分析各扩增产物的基因表达量，若ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70、肌动蛋白的基因片段中至少其中三个基因片段的表达量不低于2.0，则该刺参为快速生长的刺参优良品种，上述20只刺参中，2只刺参的ADP糖基化因子、精氨酸激酶和热休克蛋白70的基因片段的表达量不低于2.0，1只刺参的精氨酸激酶、热休克蛋白70和肌动蛋白的基因片段的表达量不低于2.0，1只刺参的ADP糖基化因子、细胞色素氧化酶c亚单位和肌动蛋白的基因片段的表达量不低于2.0，2只刺参的细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70和肌动蛋白的基因片段的表达量不低于2.0，1只刺参的ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70的基因片段的表达量不低于2.0，1只刺参的ADP糖基化因子、精氨酸激酶、热休克蛋白70、肌动蛋白的基因片段的表达量不低于2.0，1只刺参的ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70、肌动蛋白的基因片段的表达量不低于2.0，这9只刺参就属于快速生长的优良品种。
实施例2
对上述ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70、肌动蛋白的基因片段分别测序，利用Blast软件鉴定序列，得到ADP糖基化因子的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，精氨酸激酶的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，细胞色素氧化酶c亚单位的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，热休克蛋白70的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，肌动蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，证明本发明设计的各引物的特异性。
实施例3
2009年3月，对上述20只刺参进行养殖：在同一养殖塘位置接近的地方养殖4个月，上述9只优良品种的刺参增重45-55克，另外11只其中有三个基因片段表达量为2.0没有达到2.0的刺参增重25-35克，以上述9只优良品种的刺参为亲本进行育苗，第二年进行子代养殖及再育苗，第三年养殖，第二年和第三年的子代养殖4个月后增重也达到45克以上，说明鉴定的优良品种刺参生长快速，养殖效益好，可以作为优良品种选育和育种。
Claims (2)
1.鉴别刺参优良品种的分子标记，其特征在于所述分子标记的引物如下：扩增ADP糖基化因子正向引物：AACGAATCTA AAATCATTAG TCAGTG，反向引物：CTACTATTGC TTGGAAAACG AGA；扩增精氨酸激酶正向引物：CAGATGGGAGGAGACATGAA GGA，反向引物：TGGATGGGCA AGTCAGAACA AATC；扩增细胞色素氧化酶c亚单位正向引物：TCATGGTAGC TGCTGTGAAG TAGG，反向引物：ACTTGTTCTG ATTCTTCGGA CACC；扩增热休克蛋白70正向引物：CCAAGAGAACATTGTCAAGC，反向引物：ATTCGAGTCG AACCTCCG；扩增肌动蛋白正向引物：CCAAGAGAAC ATTGTCAAGC，反向引物：ATTCGAGTCG AACCTCCG；所述分子标记的基因片段如下：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ADP糖基化因子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的精氨酸激酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的细胞色素氧化酶c亚单位，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的热休克蛋白70，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的肌动蛋白。
2.利用权利要求1所述的鉴别刺参优良品种的分子标记快速鉴定刺参品种的方法，其特征在于步骤如下：
a、总RNA的提取：取刺参体腔液1.0mL，2000g离心5min，收集血细胞，加入Trizol试剂1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm,离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm,离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度75%的乙醇1mL，4℃，12000rpm,离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成：上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；
c、PCR扩增：对上述cDNA分别用5个基因片段的引物进行扩增，25ul扩增体系：10×PCR缓冲液2.5ul，浓度10uM的dNTPs液1.5ul，浓度10uM的Mgcl2液1.5ul，浓度2U/ul的Taq酶液0.5ul，正向引物和反向引物浓度都为10uM的引物溶液1ul，RNA提取液1ul，ddH2O补充至25ul；扩增反应条件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 20s，然后缓慢升温至95℃；所述引物溶液含有扩增ADP糖基化因子正向引物和反向引物，或含有扩增精氨酸激酶正向引物和反向引物，或含有扩增细胞色素氧化酶c亚单位正向引物和反向引物，或含有扩增热休克蛋白70正向引物和反向引物，或含有扩增肌动蛋白正向引物和反向引物；
d、鉴定：扩增完成后，利用2-Δ△CT方法分析基因表达量，若ADP糖基化因子、精氨酸激酶、细胞色素氧化酶c亚单位、热休克蛋白70、肌动蛋白的基因片段中至少其中三个基因片段的表达量不低于2.0，则该刺参为快速生长的刺参优良品种。
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