CN103349777A - 用于预防和治疗补体相关紊乱的CRIg多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗补体相关紊乱的CRIg多肽。本发明关注最近发现的巨噬细胞特异受体CRIg，及其在预防和治疗补体相关紊乱中的用途，包括补体相关眼状况，诸如年龄相关黄斑变性(AMD)和脉络膜新血管形成(CNV)。

Description

用于预防和治疗补体相关紊乱的CRIg多肽
本申请是申请日为2005年10月12日、中国申请号为200580042653.5、发明名称为“用于预防和治疗补体相关紊乱的CRIg多肽”的发明申请的分案申请。
材料保藏
以下材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC,American TypeCulture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852 USA)：
名称      ATCC保藏号     保藏日期
基于pRK5的质粒DNA45416-1251     209620     1998年2月5日
此保藏是依据布达佩斯条约关于用于专利程序的微生物保藏的国际认可的规定及其（布达佩斯条约）细则进行的。这保证了从保藏之日起保持保藏的存活培养物30年。此保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司和ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权时或者在任何美国或外国专利申请向公众公开时，两者中居先者，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代，而且保证了依据35USC§122及依照它的管理章程（包括37CFR§1.14，特别要提及886 OG 638）由美国专利和商标局长决定的个人将有资格可获得后代。
本申请的受让人已同意，若保藏的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物更换。所保藏材料的可获得性并不解释为对违反任何政府的机构依据其专利法所授予的权利实践本发明的许可。
发明领域
本发明关注最近发现的巨噬细胞特异受体CRIg（早先称为STIgMA），及其在预防和/或治疗补体相关紊乱中的用途，包括补体相关眼状况，诸如年龄相关黄斑变性(AMD)和脉络膜新血管形成(CNV)。
发明背景
补体系统是由一系列血清糖蛋白构成的复杂酶级联，所述血清糖蛋白通常以无活性的原酶(pro-enzyme)形式存在。三种主要途径，经典途径和旁路途径，可活化补体，它们在C3水平归并，其中两种相似的C3转变酶将C3切割成C3a和C3b。另一种途径，甘露糖结合凝集素(MBL)途径也已有记载。
经典途径成分以C和数值标注（例如C1、C3）。鉴于它们鉴定的顺序，前四种成分的编号为C1、C4、C2和C3。旁路途径成分以字母表明（例如B、P、D）。切割片段以该成分名称后续的小写字母命名（例如C3a和C3b是C3的片段）。无活性C3b命名为iC3b。补体蛋白的多肽链以该成分后的希腊字母命名（例如C3α和C3β是C3的α和β链）。C3的细胞膜受体缩写为CR1、CR2、CR3和CR4。
补体系统的经典途径是人免疫应答体液分支的主要效应物。激活经典途径和MBL途径的扳机或是与抗原结合的IgG或IgM抗体或是靶细胞上的凝集素。抗体对抗原的结合暴露了抗体上作为第一补体成分C1的结合位点的位点。C1结合至少两个与抗原结合的抗体的暴露区域，结果是其C1r和C1s亚基受到活化。活化后的C1s负责下面两种所涉及补体成分C4和C2的切割。C4切割成两个片段，其中较大的C4b分子附着于附近的靶膜，而较小的C4a分子离去。沉积的C4b上的一个暴露位点可供与下面一种补体成分C2相互作用。正如在前一个步骤中，活化后的C1s将C2分子切割成两段，其中片段C2a保留，而较小的C2b片段离去。C4b2a，也称为C3转变酶，保持与膜结合。此C3转变酶将下一种补体成分C3转变成其活性形式。
补体旁路途径的激活在C3b与细胞壁和病原体的其它细胞成分和/或与IgG抗体结合时开始。然后因子B与结合细胞的C3b联合，形成C3bB。C3bB然后由因子B分裂成Bb和Ba，以形成旁路途径C3转变酶C3bBb。然后备解素，一种血清蛋白质，结合C3bBb，形成作为C3转变酶发挥功能的C3bBbP，它将C3分子酶促分裂成C3a和C3b。此时，补体旁路途径受到激活。有些C3b结合C3bBb以形成C3bBb3b，它能够将C5分子分裂成C5a和C5b。
旁路途径是一种自我放大途径，而且在不存在抗体时在细菌和其它病原体的清除和识别中是重要的。旁路途径还可在由凝集素和/或经典途径初始激活补体后放大补体激活。人中旁路途径激活的限速步骤是因子D对因子B切割成旁路途径C3转变酶C3bBb的酶促作用(Stahl et al.,American Journal ofPathology 162:449-455(2003))。补体激活和沉积在佐剂诱发的关节炎(AIA)和胶原诱发的关节炎(CIA)中及多种其它疾病和状况中的角色有强大的证据。
最近，有缺陷的旁路途径控制牵涉进肾病和眼病的形成，包括溶血性尿毒症综合征(HUS)和AMD(Zipfel et al.,Mol.Immunol.43:97-106(2006),可在线获得www.sciencedirect.com)。已经发现C3对于小鼠中CNV的形成是关键的(Bora et al.,J.Immunol.174(1):491-7(2005))。
补体系统在炎性状况和相关组织损伤、自身免疫病和补体相关疾病中的角色也是众所周知的。
已经提出旁路途径在炎症(Mollnes et al.,Trends in Immunology23:61-64(2002))、局部的及缺血和再灌注后的远端组织损伤(Stahl et al.,见上文)；成人呼吸窘迫综合征(ARDS;Schein et al.,Chest91:850-854(1987))；心肺旁路手术过程中的补体激活(Fung et al,J Thorac Cardiovasc Surg122:113-122(2001))；皮肌炎(Kissel,JT et al.,NEJM314:329-334(1986))；和天疱疮(Honguchi et al.,J Invest Dermatol92:588-592(1989))中扮演重要角色。补体旁路途径还已牵涉进自身免疫病，诸如例如狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎(参见例如Watanabe et al.,J.Immunol.164:786-794(2000))和类风湿性关节炎，诸如幼发型类风湿性关节炎(Aggarwal et al.,Rheumatology29:189-192(2000);Neumann E.et al.,Arthritis Rheum.4:934-45(2002))。
补体沉积和活化的局部增加与疾病的严重程度有关(Atkinson,J ClinInvest 112:1639-1641(2003))。C5a受体拮抗剂，诸如肽和有机小分子，已经测试用于治疗关节炎(Woodruf et al.,Arthritis&Rheumatism46(9):2476-2485(2002))和多种其它免疫炎性疾病(Short et al.,Br J Pharmacol126:551-554(1999);Finch et al.,J Med Chem42:1965-1074(1999))；而诸如Promics(Australia)等公司已经在进行人体临床试验以测试C5a拮抗剂在类似适应症中的功效。C5a还已牵涉进皮肌炎和天疱疮(Kissel,JT et al.,NEJM 314:329-334(1986))。抗C5a单克隆抗体还已显示出降低心肺转流术和心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍(Tofukuji et al.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.116:1060-1069(1998))，预防胶原诱发的关节炎，和改善已确立的疾病(Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(19):8955-8959(1995))。
调理吞噬作用(Opsonophagocytosis)，即补体片段在颗粒表面上沉积和吞噬细胞随后摄取的过程，对于循环颗粒，包括免疫复合物、凋亡细胞或细胞碎片、和病原体的清除是至关紧要的(Gasque,P.,Mol Immunol.41:1089-1098(2004))。驻留组织的巨噬细胞已知在补体介导的从循环中清除颗粒中扮演重要角色。Kupffer细胞，占驻留组织的巨噬细胞的90%以上，连续暴露于来自肝门静脉的血液，且在战略上位于肝血窦中以从胃肠道中有效清除调理后的病毒、肿瘤细胞、细菌、真菌、寄生虫和有害物质。此清除过程在很大程度上依赖补体C3作为调理素的存在(Fujita et al.,Immunol.Rev.198:185-202(2004))。在经由硫酯与细菌表面结合时，C3受到切割，并放大补体旁路途径。此反应导致C3片段的进一步沉积，它可充当巨噬细胞上补体受体的配体。此途径的重要性体现在缺乏C3的人对细菌和病毒感染的高易感性。
迄今已表征的补体受体CR1、3和4只在PKC激活或Fc受体刺激后内在化C3b和吞噬C3调理的颗粒(Carpentier et al.,Cell Regul2:41-55(1991);Sengelov,Crit.Rev.Immunol.15:107-131(1995);Sengelov et al.,J.Immunol.153:804-810(1994))。此外，CR1不在鼠Kupffer细胞的表面上表达(Fang et al.,J.Immunol.160:5273-5279(1998))。帮助KC组成性清除循环颗粒的补体受体迄今尚无记载。
抗C3b(i)抗体已有报道增强补体激活、C3b(i)沉积、和rituximab对CD20+细胞的杀伤(Kennedy et al.,Blood101(3):1071-1079(2003))。
鉴于已知补体级联牵涉多种疾病，需要鉴定和开发新的药品用于预防和/或治疗补体相关疾病。
发明概述
本发明基于补体受体家族的一个新成员和与补体系统相互作用的第一免疫球蛋白(Ig)超家族成员的鉴定。
一方面，本发明关注用于预防或治疗补体相关眼状况的方法，包括对有需要的受试者施用预防或治疗有效量的补体抑制物，诸如补体旁路途径的抑制物，例如CRIg多肽或其激动剂。
补体相关眼状况可以是例如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯希-林二氏(von Hippel-Lindau)病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成和视网膜新血管形成。优选的是，所述补体相关眼状况是AMD或CNV，包括这些状况的所有阶段。
另一方面，本发明关注用于预防AMD形成或发展的方法，包括对在至少一只眼中有风险形成AMD或诊断有AMD的受试者施用有效量的补体抑制物，诸如补体旁路途径的抑制物，例如CRIg多肽或其激动剂。
又一方面，本发明关注用于治疗干性AMD的方法，包括对有需要的受试者施用治疗有效量的补体抑制物，诸如旁路途径的抑制物，例如CRIg多肽或其激动剂。
在所有实施方案中，CRIg多肽可以例如选自SEQ ID NO:2,4,6和8的CRIg多肽和所述多肽的胞外结构域(ECD)。CRIg多肽，包括全长多肽及其ECD，可与免疫球蛋白序列，诸如免疫球蛋白重链恒定区序列，例如Fc区融合，而所得免疫粘附素可作为CRIg激动剂用于本发明的预防和治疗方法。免疫球蛋白优选是IgG，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3、或IgG-4，更优选IgG-1或IgG-3。IgG1重链恒定区序列可至少包含铰链、CH2和CH3区，或者例如CH1、铰链、CH2和CH3区。
又一方面，本发明关注用于预防或治疗补体相关疾病或状况的方法，包括用预防或治疗有效量的补体抑制物，诸如旁路途径的抑制物，例如CRIg多肽或其激动剂处理有需要的受试者。
另一方面，本发明关注用于在哺乳动物中抑制C3b补体片段生成的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的补体抑制物，诸如旁路途径的抑制物，例如CRIg多肽或其激动剂。
又一方面，本发明关注用于在哺乳动物中选择性抑制补体旁路途径的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的CRIg多肽或其激动剂。
在所有方面，CRIg多肽可以例如选自SEQ ID NO:2,4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外区。所述激动剂优选是上文所述CRIg-Ig融合蛋白（免疫粘附素）。所述免疫球蛋白序列可以是例如免疫球蛋白恒定区序列，诸如免疫球蛋白重链的恒定区序列。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白重链恒定区序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外区融合。在又一个实施方案中，所述免疫球蛋白重链恒定区序列是IgG，诸如IgG-1或IgG-3的，其中IgG-1重链恒定区序列可例如至少包含铰链、CH2和CH3区，或者铰链、CH1、CH2和CH3区。
补体相关疾病可以是例如炎性疾病或自身免疫病。
在一个具体的实施方案中，所述补体相关疾病选自：类风湿性关节炎(RA)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远端组织损伤(remotetissue injury)、心肺旁路手术过程中的补体激活、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍(coronary endothelial dysfunction)、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、年龄相关黄斑变性、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、同种移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺应激综合征(chronic occlusive pulmonary distress syndrome)、哮喘、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、动脉粥样硬化、遗传性血管性水肿、阵发性夜间血红蛋白尿和吸入性肺炎。
在另一个具体的实施方案，所述补体相关疾病选自：炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼发型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化（硬皮病）、特发性炎性肌病（皮肌炎、多肌炎）、斯耶格伦氏
Figure BDA00003310730700061
综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血（免疫性全血细胞减少、阵发性夜间血红蛋白尿）、自身免疫性血小板减少（特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少）、甲状腺炎（格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼发型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介导的肾病（肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎）、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎（甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎）、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病（例如囊性纤维化病）、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。
在又一个具体的实施方案中，所述补体相关疾病是类风湿性关节炎(RA)、银屑病或哮喘。
在所有实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物，诸如人类患者。
又一方面，本发明关注用于在受试者中预防或治疗年龄相关黄斑变性(AMD)或脉络膜新血管形成(CNV)的方法，包括对受试者施用有效量的补体抑制物，诸如旁路途径的抑制物，例如CRIg多肽或其激动剂。
本发明涉及下述各项。
1．用于预防或治疗补体相关眼状况的方法，包括对有需要的受试者施用预防或治疗有效量的补体抑制物。
2．项1的方法，其中所述补体抑制物是补体旁路途径的选择性抑制物。
3．项2的方法，其中所述补体抑制物是CRIg多肽或其激动剂。
4．项3的方法，其中所述CRIg多肽选自：SEQ ID NO:2,4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外结构域(ECD)。
5．项4的方法，其中所述CRIg多肽是SEQ ID NO:2,4,6或8的CRIg多肽的ECD。
6．项5的方法，其中所述CRIg多肽是SEQ ID NO:4或6的CRIg多肽的ECD。
7．项3的方法，其中所述CRIg多肽与免疫球蛋白序列融合。
8．项7的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定区序列。
9.项8的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是免疫球蛋白重链的。
10.项9的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外区融合以生成CRIg-Ig融合蛋白。
11.项10的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是IgG的。
12.项11的方法，其中所述IgG是IgG-1或IgG-3。
13.项12的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列至少包含铰链、CH2和CH3区。
14.项12的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列包含CH1、铰链、CH2和CH3区。
15.项10的方法，其中所述CRIg-Ig融合蛋白在CRIg和Ig序列之间包含接头。
16.项10的方法，其中所述CRIg-Ig融合蛋白由选自SEQ ID NO:20,21,25,26,27和28的核酸编码。
17.项1的方法，其中所述补体相关眼状况选自：年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。
18.项17的方法，其中所述补体相关眼病是年龄相关黄斑变性(AMD)或脉络膜新血管形成(CNV)。
19.项18的方法，其中所述方法包括预防CNV。
20.项18的方法，其中所述方法包括预防AMD发展。
21.项20的方法，其中所述方法包括预防AMD发展成CNV。
22.用于预防年龄相关黄斑变性(AMD)形成或发展的方法，包括对在至少一只眼中有风险形成AMD或诊断有AMD的受试者施用有效量的CRIg多肽或其激动剂。
23.项22的方法，其中所述CRIg多肽是SEQ ID NO:2,4,6或8的多肽的胞外结构域。
24.项23的方法，其中所述CRIg多肽是SEQ ID NO:4或6的多肽的胞外结构域。
25.项22的方法，其中所述激动剂是包含融合有免疫球蛋白序列的CRIg多肽序列的融合多肽。
26.项25的方法，其中所述融合多肽包含融合有免疫球蛋白重链恒定区序列的SEQ ID NO:4或6的多肽的胞外结构域。
27.项26的方法，其中所述融合多肽选自由SEQ ID NO:20,21,25,26,27和28的核苷酸序列编码的融合多肽。
28.项22-27任一项的方法，其中所述受试者是人。
29.项28的方法，其中所述人受试者在至少一只眼中已经诊断有AMD。
30.项29的方法，其中所述AMD是3类或4类干性AMD。
31.项30的方法，其中所述受试者已经鉴定为有风险形成CNV。
32.项31的方法，其中所述受试者在遗传上有风险形成CNV。
33.项30的方法，其中所述人受试者在两只眼中都已经诊断有AMD。
34.项33的方法，其中所述人受试者在两只眼中都有3类或4类AMD。
35.项28的方法，其中所述施药减缓AMD的发展。
36.项28的方法，其中所述施药延迟AMD发展成CNV。
37.项28的方法，其中所述施药预防AMD发展成CNV。
38.项29的方法，其中所述人受试者只在一只眼中已经诊断有AMD。
39.项38的方法，其中所述施药延迟在另一只眼中形成AMD。
40.项38的方法，其中所述施药预防在另一只眼中形成AMD。
41.项28的方法，其中所述施药通过玻璃体内注射进行。
42.项28的方法，还包括施用另外的药剂来预防或治疗AMD或CNV。
43.项42的方法，其中所述另外的药剂是抗VEGF-A抗体。
44.用于治疗干性年龄相关黄斑变性(AMD)的方法，包括对需要的受试者施用预防或治疗有效量的CRIg多肽或其激动剂。
45.项44的方法，其中所述CRIg多肽选自SEQ ID NO:2,4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外结构域(ECD)。
46.项45的方法，其中所述CRIg多肽是SEQ ID NO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外区。
47.项46的方法，其中所述CRIg多肽是SEQ ID NO:4或6的CRIg多肽的胞外区。
48.项45的方法，其中所述CRIg多肽与免疫球蛋白序列融合。
49.项48的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定区序列。
50.项49的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是免疫球蛋白重链的。
51.项50的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外结构域(ECD)融合。
52.项51的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是IgG的。
53.项52的方法，其中所述IgG是IgG-1或IgG-3。
54.项53的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列至少包含铰链、CH2和CH3区。
55.项53的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列包含CH1、铰链、CH2和CH3区。
56.用于预防或治疗补体相关疾病或状况的方法，包括用预防或治疗有效量的CRIg多肽或其激动剂处理需要此类治疗的受试者。
57.项56的方法，其中所述CRIg多肽选自SEQ ID NO:2,4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外区。
58.项57的方法，其中所述CRIg多肽与免疫球蛋白序列融合。
59.项58的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定区序列。
60项59的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是免疫球蛋白重链的。
61.项60的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外结构域(ECD)融合。
62.项61的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列是IgG的。
63.项62的方法，其中所述IgG选自IgG-1和IgG-3。
64.项62的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列至少包含铰链、CH2和CH3区。
65.项62的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列包含CH1、铰链、CH2和CH3区。
66.项56的方法，其中所述补体相关疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。
67.项66的方法，其中所述补体相关疾病选自：类风湿性关节炎(RA)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远端组织损伤、心肺旁路手术过程中的补体激活、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、年龄相关黄斑变性、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、同种移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺应激综合征(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、荨麻疹、慢性特发性荨麻疹、溶血性尿毒症综合征、子宫内膜异位、心源性休克、缺血再灌注损伤、和多发性硬化(MS)。
68.项66的方法，其中所述补体相关疾病选自：炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼发型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化（硬皮病）、特发性炎性肌病（皮肌炎、多肌炎）、斯耶格伦氏
Figure BDA00003310730700101
综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血（免疫性全血细胞减少、阵发性夜间血红蛋白尿）、自身免疫性血小板减少（特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少）、甲状腺炎（格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼发型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介导的肾病（肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎）、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎（甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎）、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病（例如囊性纤维化病）、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥、移植物抗宿主病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、阵发性夜间血红蛋白尿、遗传性血管性水肿和动脉粥样硬化。
69.项66的方法，其中所述补体相关疾病是类风湿性关节炎(RA)、银屑病或哮喘。
70.项57的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
71.项70的方法，其中所述哺乳动物是人。
72.用于在哺乳动物中抑制C3b补体片段生成的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的CRIg多肽或其激动剂。
73.项72的方法，其中所述CRIg多肽选自SEQ ID NO:2,4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外区。
74.项73的方法，其中所述CRIg多肽与免疫球蛋白序列融合。
75.项74的方法，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定区序列。
76.项75的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是免疫球蛋白重链的。
77.项76的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外结构域(ECD)融合。
78.项76的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列是IgG的。
79.项78的方法，其中所述IgG选自IgG-1和IgG-3。
80.项79的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列至少包含铰链、CH2和CH3区。
81.项79的方法，其中所述IgG-1重链恒定区序列包含CH1、铰链、CH2和CH3区。
82.用于在哺乳动物中选择性抑制补体旁路途径的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的CRIg多肽或其激动剂。
附图简述
图1A-1B显示了321个氨基酸的人CRIg多肽的核苷酸和氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:1和2）。
图2A-2B显示了399个氨基酸的全长长型天然人CRIg(huCRIg或huCRIg-长)的核苷酸和氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:3和4）。
图3A-3B显示了305个氨基酸的短型天然人CRIg(huCRIg-短)的核苷酸和氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:5和6）。
图4A-4C显示了280个氨基酸的天然鼠CRIg(muCRIg)的核苷酸和氨基酸序列（分别是SEQ ID NO:7和8）。
图5显示了全长huCRIg(SEQ ID NO:4)和huCRIg-短(SEQ ID NO:6)与muCRIg(SEQ ID NO:8)对比的氨基酸序列。显示了疏水信号序列、IgV、IgC和跨膜区。muCRIg在第170位具有预测的单一N-连接糖基化位点(NGTG)。标示了根据人CRIg基因的外显子-内含子边界推导出的Ig结构域边界。
图6显示了小鼠肝冷冻切片中CRIg的原位杂交。
图7显示了人肝冷冻切片中CRIg的原位杂交。
图8显示了激活的结肠和肾上腺巨噬细胞、Kupffer细胞、和胎盘Hofbauer细胞中CRIg的原位杂交。
图9显示了RA滑膜细胞中CRIg mRNA的原位杂交。
图10显示了脑小胶质细胞中CRIg mRNA的原位杂交。
图11显示了来自人哮喘组织的细胞中CRIg mRNA的原位杂交。
图12显示了来自人慢性肝炎组织的细胞中CRIg mRNA的原位杂交。
图13显示了肾上腺巨噬细胞中CRIg的免疫组化分析。
图14显示了肝Kupffer细胞中CRIg的免疫组化分析。
图15显示了脑小胶质细胞中CRIg的免疫组化分析。
图16显示了胎盘Hofbauer细胞中CRIg的免疫组化分析。
图17。显示huCRIg在多种组织中表达的Northern印迹分析。表达CRIg的人组织中存在1.5和1.8kb的两种转录物。
图18。(A)显示huCRIg在骨髓单核细胞系HL60和THP-1中及在已分化巨噬细胞中的表达升高的TAQMANTMPCR分析。在Jurkat T细胞、MOLT3、MOLT4和RAMOS B细胞系中发现了低水平表达。(B)huCRIgmRNA在体外单核细胞分化过程中的表达升高。从人外周血分离的单核细胞通过粘附于塑料达7天而分化。在分化过程中的不同时间点提取总RNA。(C)huCRIg蛋白在单核细胞分化成巨噬细胞的过程中的表达升高。单核细胞如(B)中所述处理，全细胞裂解物运行凝胶电泳并转移至硝酸纤维素膜，与huCRIg的多克隆抗体(4F7)一起温育。该多克隆抗体识别可能代表长型和短型huCRIg的48和38kDa条带。
图19。huCRIg蛋白在细胞系中的分子表征。(A)huCRIg-gd在293E细胞中瞬时表达，用抗gd免疫沉淀，并将印迹与抗gd或CRIg胞外结构域(ECD)的多克隆抗体一起温育。(B)在293细胞中表达的huCRIg是单体N-糖基化蛋白质。CRIg在用过钒酸钠处理HEK293细胞时酪氨酸磷酸化，但不征募Syk激酶。磷酸化CRIg与非糖基化CRIg相比以略高的分子量迁移。
图20。huCRIg在人单核细胞衍生的巨噬细胞上的选择性表达。外周血单核细胞用对B、T、NK细胞、单核细胞特异的抗体和用ALEXATMA488偶联的CRIg的单克隆抗体(3C9)染色。在所有外周血白细胞中以及在单核细胞衍生的树突细胞中不存在表达，但在体外分化的巨噬细胞中表达。
图21A-21B。CRIg mRNA和蛋白质表达受IL-10和地塞米松提高。(21A)实时PCR显示了CRIg mRNA的表达在用IL-10、TGFβ处理后升高且受地塞米松高度诱导，但受LPS、IFNγ和TNFα处理的下调。(21B)Ficoll分离的外周血单核细胞用多种细胞因子和地塞米松处理5天，并用抗CD14和抗CRIg双重染色。流式分析显示了用地塞米松处理的单核细胞的表面上及用IL-10和LPS处理后CRIg表达显著升高。
图22。CRIg在单核细胞衍生的巨噬细胞中的亚细胞定位。单核细胞在巨噬细胞分化培养基中培养7天，在丙酮中固定，并用多克隆抗CRIg抗体6F1或CD63和二抗山羊抗兔FITC染色。在共聚焦显微镜中研究细胞。在细胞质中找到CRIg，在此它与溶酶体膜蛋白CD63共定位。CRIg还在巨噬细胞的前缘和后缘处以与F-肌动蛋白相似的模式表达。比例尺=10μm。
图23。CRIg mRNA在慢性炎性疾病中的定位。原位杂交显示了从肺炎患者(A,B)或慢性哮喘患者(C,D)的组织获得的肺泡巨噬细胞中存在CRIgmRNA。CRIg mRNA还在从慢性肝炎患者(E,F)的肝活组织检查获得的组织中的肝Kupffer细胞中表达。
图24。CRIg mRNA表达在发炎的滑膜中升高。CRIg mRNA在从无关节炎症的患者(A,C)的膝置换术获得的关节的滑膜中较低或不存在，但在有骨关节炎的患者(B,D)的血管翳中的细胞，可能是滑膜细胞或滑膜巨噬细胞中高度表达。
图25。用多克隆抗体6F1检测有变性关节病的患者(A,B,C)的滑膜内衬细胞中的CRIg蛋白。在对照滑膜(D)中没有找到CRIg的免疫组化检测。
图26。CRIg蛋白在驻留组织的巨噬细胞亚型中表达，且其表达在慢性炎性疾病中升高。(A)CRIg在稳定表达CRIg的CHO细胞的膜上表达。在从慢性哮喘患者获得的组织中的在肺泡巨噬细胞(B)中找到CRIg蛋白的高表达。(C)CRIg在人小肠的组织细胞中的表达。切片得自手术切除的组织且可能包含瘤。(D)CRIg蛋白在人产前胎盘中的Hofbauer细胞中的表达。CRIg蛋白在巨噬细胞中的高表达存在于肾上腺(E)中和人肝的Kupffer细胞(F)中。染色在5μm厚的丙酮固定切片上进行，使用DAB作为色原。图像在20X和40X放大倍数拍照。
图27。从动脉粥样硬化患者获得的血管斑上CD68和CRIg的免疫组化染色。将连续切片固定，并用人CD68的单克隆抗体(A,B)和针对人CRIg制备的多克隆抗体6F1(C,D)染色。根据连续切片的染色的判断，CRIg出现于动脉粥样硬化斑中存在的一群巨噬细胞和泡沫细胞中，且与CD68阳性巨噬细胞交叠。放大倍数：10X(A,C)和20X(B,D)。
图28。心间质巨噬细胞上CRIg和CD68的共染色。5μm切片得自人心（尸体解剖），用CRIg的单克隆抗体(3C9)和二抗抗小鼠FITC标记抗体染色。CD68通过使用CD68的PE标记单克隆抗体的染色来检测。放大倍数：20X。
图29。CRIg mRNA水平在从溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘患者获得的结肠组织中显著升高。对从多种组织提取的总RNA进行实时PCR。CRIg的mRNA在从溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病和COPD患者获得的组织中显著升高。统计学分析使用Mann-Whitney U检验进行。
图30。表达人CRIg的细胞显示出对人内皮细胞的粘附增加。(A)CRIg在人Jurkat T细胞系中稳定表达。(B)细胞预先加载荧光染料BCECF(Molecular Probes,Oregon)并加至包被有用或未用10ng/ml TNFα处理的单层人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的96孔板。清洗3次后，荧光在分光荧光计中计数，它指示保持对HUVEC细胞粘附的细胞数。该图代表4次独立实验。
图31。muCRIg IgG-Fc融合蛋白对胶原诱发的关节炎(CIA)小鼠模型发展的抑制。一组(CIA)小鼠(n=7)给予100μg muCRIg IgG-Fc融合蛋白(方)，而CIA小鼠对照组(n=8)接受100μg鼠IgG1(圆)，每周3次，达6周。小鼠每天检验炎症的征候并按0-16的标准评分（详情见实施例25），结果作图（平均值±SD，Student氏T检验p值=0.0004对照IgG1对测试muCRIg蛋白）。
图32是DNA42257（共有序列）的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。
图33显示了用CRIg-Fc处理的小鼠中关节肿胀的降低。
图34显示了muCRIg抑制关节发炎。
图35显示了用muCRIg-Fc处理的小鼠的关节中皮层骨体积的保持。
图36显示了CRIg-Fc处理不改变驻留组织的巨噬细胞的数目或形态。
图37显示了muCRIg处理不影响血清抗胶原抗体滴度。
图38显示了muCRIg在体内不改变不依赖T细胞的B细胞应答。
图39显示了抗体诱发的关节炎(AIA)后关节中的巨噬细胞浸润，在未脱钙冷冻关节中用F4/80染色产生。
图40显示了muCRIg-Fc在balb/c小鼠中预防抗体诱发的关节炎后的关节肿胀。
图41显示了muCRIg抑制抗体诱发的关节炎中的关节浸润。
图42显示了muCRIg敲除小鼠的生成。
图43显示了鼠CRIg-Fc融合蛋白结合C3调理的绵羊红血球(E-IgM)。
图44显示了人CRIg-Fc对E-IgM的结合依赖C3。
图45显示了血清调理的颗粒对表达CRIg的CHO细胞的结合。
图46显示了鼠CRIg-Fc结合补体C3b和iC3b，但不结合C2、C4、和C3d。
图47显示了鼠和人CRIg-Fc结合补体C3b、C3bi和C3c，但不结合C1、C2、C4、C3a和C3d。
图48A显示了鼠和人CRIg-Fc抑制酵母聚糖的C3沉积。
图48B显示了鼠CRIg-Fc在血清中抑制C3活化。
图49显示了鼠CRIg抑制旁路途径诱发的溶血，但不影响经典溶血途径。
图50。CRIg在驻留组织的巨噬细胞亚群上选择性表达。
(A)CRIg是单次跨膜免疫球蛋白超家族成员，由一个（人CRIg短型(huCRIg(S))和鼠CRIg(muCRIg)）或两个(huCRIgL)免疫球蛋白结构域组成。左边小图顶部的刻度标示以氨基酸计的大小。右边小图显示了hu和muCRIg与关节粘附分子-A(JAM-A)和A33抗原有较远关系。右边小图顶部的刻度标示氨基酸相似性百分比。
(B)CRIg在巨噬细胞中表达，但在单核细胞中不表达。使用抗人CRIg MAb(3C9)通过流式细胞术对在10%自体血清和20%胎牛血清中培养7天的人CD14+单核细胞和CD14+单核细胞分析huCRIg染色。使用抗muCRIg MAb(14G6)对小鼠CD11b+和F4/80+肝Kupffer细胞分析muCRIg染色。
(C)人和小鼠巨噬细胞的Western印迹分析。来自培养所示时间的人CD14+单核细胞或小鼠腹膜巨噬细胞的裂解物在还原性SDS缓冲液中煮沸，加载到4-10%Tris-苷氨酸凝胶上，并与多克隆抗CRIg抗体(6F1,左边小图)或抗muCRIg单克隆抗体(14C6,右边小图)一起温育。使用免疫前IgG(左边小图)和大鼠IgG2b(右边小图)作为同种型对照。左边小图中的箭头标示可能代表huCRIg(L)和(S)的57和50kDa条带的位置。
(D)肝Kupffer细胞上CRIg与CD68的共定位。使用单克隆抗CRIg(3C9人和14G6小鼠)和单克隆抗CD68抗体对从人和小鼠肝获得的切片进行免疫染色。
图51。外周血白细胞上CRIg表达的流式细胞术分析和C3片段和C3调理的颗粒对表达CRIg的CHO细胞的结合的分析。
(A)人和小鼠外周血白细胞上CRIg表达的流式细胞术分析。
(B)可溶性C3片段或补体调理的病原体结合表达鼠CRIg的CHO细胞，但不结合表达JAM-2的CHO细胞。悬浮细胞与A488标记的补体调理的颗粒一起在连续旋转下于室温温育30分钟。细胞清洗3次，并通过流式细胞术分析监测颗粒的结合。结果代表3次独立实验。
图52。可溶性和细胞表面表达的CRIg结合溶液中的或沉积在细胞表面上的C3片段。
(A)CRIg(L)转染的Jurkat细胞(Jurkat-CRIg)，但非空载体转染的Jurkat细胞(Jurkat-对照)与C3和IgM调理的绵羊红细胞(E-IgM)形成玫瑰花结。直方图(左边小图)显示了用人CRIg(L)稳定转染的Jurkat细胞上的CRIg表达。用C3缺陷(C3-)或C3充足(C3+)血清调理的E-IgM与CRIg或用对照载体转染的Jurkat混合1小时。该实验代表3次独立实验。
(B)CIg(L)-Fc对IgM调理的绵羊红血球(E-IgM)的结合依赖血清中存在C3。E-IgM用C3消减的人血清调理，其中加入浓度渐增的纯化的人C3。E-IgM随后与huCRIg(L)-Fc融合蛋白一起温育，继而使用抗人Fc多克隆抗体通过流式细胞术检测。此实验代表3次独立实验。
(C)显示CRIg(L)-和CRIg(S)-Fc结合C3b和iC3b的ELISA。浓度渐增的huCRIg(L)-和huCRIg(S)-Fc融合蛋白加至用纯化的C3b和iC3b包被的maxisorb板。结合使用偶联有HRPO的抗huFc抗体检测。所示结果代表使用不同批次融合蛋白和纯化的补体成分的4次独立实验。
(D)显示可溶性C3b二聚体结合huCRIg(L)-Fc的动力学结合数据。C3b对CRIg融合蛋白的亲和力使用表面等离振子共振测定。CRIg蛋白经由针对Fc融合标签的抗体的胺偶联捕捉到CM5传感器芯片上。然后注入二聚体C3b足够时间至饱和。Kd根据针对浓度绘制的、显示平衡时响应的结合曲线计算。C3b二聚体结合huCRIg(S)的计算亲和力为44nM，而对huCRIg(L)的亲和力为131nM。
(E)在细胞表面上表达的CRIg结合A488标记的C3b二聚体((C3b)2)，但不结合天然C3。左边小图显示了通过流式细胞术分析得到的经转染THP-1细胞上huCRIg(L)的表达水平。(C3b)2显示出对CRIg转染的THP-1细胞的可饱和结合。(C3b)2对THP-1CRIg的结合可用(C3b)2、C3b和CRIg的胞外结构域(CRIg-ECD)竞争掉，但C3不行。所示结果代表3次独立实验。
图53。CRIg敲除型小鼠的生成和表征。
(A)用于在ES细胞中同源重组的寻靶载体的生成。
(B)嵌合小鼠与野生型小鼠繁殖产生的杂合雌性后代中SRIg等位基因同源重组的Southern印迹验证。
(C)野生型和敲除型雄性和雌性小鼠外周血中白细胞数的比较。
(D)显示KC中不存在CR1、CR2和CD11c表达的FACS分析。
(E)C3-A488和C3c-A488结合野生型和敲除型KC的FACS分析。
图54。Kupffer细胞上的CRIg表达是C3b和iC3b的结合所必需的。(A)从CRIg敲除型小鼠获得的巨噬细胞上不存在CRIg蛋白。从CRIg野生型、杂合或敲除型小鼠获得的腹膜巨噬细胞与抗muCRIg mAb(14G6,左边小图)一起温育。从CRIg野生型和敲除型小鼠获得的Kupffer细胞(KC)与抗体14G6一起温育，并通过流式细胞术分析。
(B)CD11b和CD18、补体受体3的α和β链、和Crry的表达水平在从CRIg野生型小鼠和CRIg敲除型小鼠获得的Kupffer细胞上相似。从CRIg野生型或敲除型小鼠分离的Kupffer细胞与CD11b、CD18和Crry的抗体一起温育并通过流式细胞术分析。
(C)从CRIg野生型或敲除型小鼠分离的Kupffer细胞与活化的小鼠血清（通过于37°C温育30分钟而活化）、C3b、(C3b)2和iC3b一起温育。纯化的补体成分对细胞表面的结合用识别多种C3衍生片段的多克隆抗体检测。所示结果代表4次实验。
(D)从CRIg敲除小鼠分离的KC显示出与C3充足小鼠血清中调理的IgM包被的绵羊红血球(E-IgM)形成玫瑰花结降低。从CRIg野生型和敲除型小鼠的肝分离的KC与补体C3调理的E-IgM一起在存在对照IgG或抗CR3阻断性抗体(M1/70)时温育30分钟。将细胞固定，对与E-IgM形成玫瑰花结的KC数目计数并表述成KC总数的百分比。*=p<0.05。所示结果代表2次独立实验。
图55。Kupffer细胞循环上的CRIg。
(A)来自C3野生型(小图1,3,4和6)或C3敲除型小鼠(小图2,5)的Kupffer细胞(KC)与A488标记的抗CRIg抗体(14G6)和(C3b)2于4°C一起温育1小时(小图1-3)或于37°C一起温育10分钟(小图4-6)。细胞随后转移至4°C，并与(红色直方图)或不与(黑色直方图)抗A488抗体一起温育以区分细胞质和细胞表面表达的抗CRIg或C3b。
(B)CRIg和C3b在CRIg野生型KC但非CRIg敲除型KC中的内在化和共定位。从CRIg野生型和敲除型小鼠的肝分离的KC在槽载玻片上培养2天，并与A455偶联的抗CRIg抗体和A488偶联的C3b一起于37°C温育30分钟，制作标本(mount)并照相。
(C)CRIg但非Lamp1的抗体循环至细胞表面。Kupffer细胞用A488偶联的抗muCRIg或抗muLamp1抗体于37°C加载10分钟，清洗，随后在存在抗A488淬灭性抗体时于37°C温育所示时间。所示结果代表3次独立实验。
图56。CRIg在征募至颗粒摄取部位的循环内体上表达。
(A)细胞表面表达的CRIg定位至F-肌动蛋白阳性皱膜(membrane ruffles)。培养7天的单核细胞衍生的巨噬细胞与A488偶联的抗CRIg A488mAb 3C9(A1和A3中的绿色通道)和Alexa 546-鬼笔环肽(A2和A3中的红色通道)一起于4°C温育。箭头标示其中CRIg和肌动蛋白两种染色都比其余细胞表面(A3中归并图像中的黄色)更强的皱膜。比例尺是20μm。
(B)CRIg和C3b与运铁蛋白在循环内体中共定位。巨噬细胞与CRIg-A488(B1,B4中的绿色通道)或C30A488(B2,B4中的红色通道)一起在冰上温育1小时，然后在存在A647-运铁蛋白(B3,B4中的蓝色通道)时于37°C捕捉10分钟。比例尺是20μm。
(C)CRIg征募至吞噬杯(phagocytic cup)和吞噬体膜。巨噬细胞用C3充足血清调理的IgM包被的红细胞一起在存在A647标记的运铁蛋白时(C2,6和C4,8中的蓝色通道)于37°C温育10分钟(C1-4)或2小时(C5-8)。细胞随后固定，透化，并用抗CRIg多克隆抗体(C1,2和C4,5中的绿色通道)和A555偶联的LAMP-1的抗体(C3,7和C4,8中的红色通道)染色。
图57。人单核细胞衍生的巨噬细胞中CRIg的运输。
(A)显示C3b-A488对第7天MDM上的CRIg的可饱和结合的FACS图。
(B)MDM用抗CRIg抗体和C3b-A488在存在10倍摩尔过量的huCRIg(L)-ECD时于37°C脉冲(pulse)10分钟。抗CRIg抗体的结合和摄取对CRIg特异，因为它可通过抗体与10倍摩尔过量的CRIg-ECD(小图1)的共温育得到消除，而剩下运铁蛋白的摄取不受影响(小图2)。
(C)MDM在存在溶酶体蛋白酶抑制剂时于37°C温育20小时，然后将细胞清洗，用1%PFA固定，并用Cy3标记的抗小鼠IgG检测所摄取的抗体(C小图1和小图3中的红色通道)。细胞在10μg/ml兔抗CRIg6F1随后是FITC-抗兔中共染色以检测总CRIg分布(C小图2和C小图3中的绿色通道)。所摄取的抗体与内源CRIg信号(C小图3中归并图像中的黄色)几乎完全交叠，表明抗体摄取不影响CRIg运输。比例尺是20μm，而各通道下方右边所示有框区域的4x放大插图是5μm。C小图4人巨噬细胞在C3消减血清中温育13小时，然后固定，并用兔抗CRIg F1和FITC-抗兔标记。CRIg分布与C3充足血清中的基本上相同，二者都与循环内体标志物运铁蛋白(资料未显示)几乎完全交叠。比例尺是20μm。
(D)将MDM与1μg/ml抗CRIg-A488(小图1)、运铁蛋白-A647(小图2)一起于37°C温育10分钟，在4%PFA中固定，用皂苷缓冲液透化，并与小鼠-抗人Lamp-1-A555一起温育(小图3)。箭头标示CRIg和运铁蛋白在再循环区室中的共定位。
(E)MDM与1μg/ml抗CRIg-A488(小图1,小图4中的绿色通道)、运铁蛋白-A647(小图2,小图4中的蓝色通道)一起于37°C温育30分钟，清洗，并与PKH染色的、补体C3调理的绵羊红血球(SRBC,小图3,小图4中的红色通道)一起以1:10巨噬细胞:SRBC比率温育。
图58。缺乏CRIg的小鼠易患单核细胞增生利斯特氏菌(ListeriaMonocytogenes)(LM)感染。
(A)通过注射到侧面尾静脉中而感染了所示剂量LM的雌性CRIg野生型和CRIg敲除型小鼠的存活曲线，n=每组5-7只。统计学分析(Wilcoxon)：野生型对敲除型，2x104菌落形成单位(CFU)为p<0.005，5x104和2x105CFU为p<0.0001。
(B)LM感染后10分钟心、肝、血液和脾中的细菌计数分析(2x107CFU,n=每组5只)。统计学分析(成对t检验)：**p<0.01,*p<0.05。
(C)LM感染后1天CRIg敲除型小鼠血清中细胞因子和趋化因子的浓度升高。统计学分析(未配对t检验)：***p<0.001。
(D)CRIg敲除型小鼠KC中LM-A488的摄取降低。小鼠用2x107LM-A488感染。1小时后，将肝灌注，与F4/80的抗体一起温育，并通过流式细胞术分析。F4/80阳性KC随后通过FACS分选，并收集到聚L-赖氨酸包被的载玻片上供荧光显微镜检术的观察。内在化LM-A488数目在共聚焦显微镜中计数，并计算吞噬细胞指数。结果代表至少两次实验。
(E)CRIg小鼠具有降低的LM从循环中清除。CRIg和C3双重或单一敲除型小鼠静脉内注射2x107CFU LM。感染后10分钟对血液中的CFU计数。在存在C3时，CRIg敲除型小鼠具有显著降低的LM从循环中清除(p<0.001)。在不存在C3时，CRIg野生型或敲除型小鼠中LM的清除没有显著差异。
图59显示了人CRIg(短)-IgG融合物的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)。
图60显示了人CRIg(长)-IgG融合物的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)。
图61图示了两种不同构建物中的CRIg(STIgMA)-Fc连接，二者都插入pRK5载体的ClaI-XbaI位点。
图62显示了muCRIg-Fc融合蛋白（但非对照Fc融合蛋白）在野生型但非CRIg敲除型细胞中抑制LM从循环中清除。CRIg野生型和敲除型小鼠在静脉内注射2x107CFU LM前24小时和16小时用2次注射12mg/kgmuCRIg-Fc或对照-Fc融合蛋白处理。感染后10分钟对血液中的CFU计数。用muCRIg-Fc处理的CRIg野生型小鼠与用对照-Fc处理的野生型小鼠相比LM从循环中的清除有显著降低（p<0.001，非配对Student氏t检验）。在CRIg敲除型小鼠中，muCRIg-Fc处理对LM清除没有影响。
图63A-63B。用huCRIg分子抑制补体介导的免疫性溶血。63A.使用hCRIg-短和-长融合蛋白抑制猕猴血清RRBC溶血。63B.使用hCRIg-长ECD抑制猕猴血清RRBC溶血。
图64。用hCRIg-长在两种不同实验中抑制人血清溶血。
图65。用hCRIg-短-Fc和CRIg-长-Fc融合蛋白抑制人血清溶血。
图66。分别用hCRIg-长-ECD和hCRIg-短-ECD抑制人血清溶血。
图67显示了编码huCRIg-长-Fc（“无茎(stalk)”构建物）的核酸序列(SEQID NO:25)。
图68显示了编码在CRIg的跨膜结构域和Fc部分之间插入了“茎”的huCRIg-长-Fc的核酸序列(SEQ ID NO:26)。
图69显示了编码huCRIg-短-Fc（“无茎”构建物）的核酸序列(SEQ ID NO:27)。
图70显示了编码在CRIg的跨膜结构域和Fc部分之间插入了“茎”的huCRIg-短-Fc的核酸序列(SEQ ID NO:28)。
图71A和71B显示了实施例23中所述小鼠CNV研究的结果。
发明详述
I.定义
术语“PRO362”、“JAM4”、“STIgMA”、和“CRIg”可互换使用，指天然序列和变异CRIg多肽。
“天然序列”CRIg指与衍生自自然界的CRIg多肽具有相同氨基酸序列的多肽，无论其制备模式。因此，天然序列CRIg可以从自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段生成。术语“天然序列CRIg”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的CRIg（例如胞外结构域序列）、CRIg的天然存在变异形式（例如可变剪接形式）和天然存在等位变体。天然序列CRIg多肽明确包括321个氨基酸长的SEQ ID NO:2的人CRIg多肽（见图1A-1B），含或不含N-末端信号序列，含或不含位于第1位的起始甲硫氨酸，且含或不含位于SEQ ID NO:2的大约第277-307位氨基酸的任何或所有跨膜结构域。天然序列CRIg多肽还包括全长399个氨基酸长的SEQ ID NO:4的人CRIg多肽（huCRIg或huCRIg-长，见图2A-2B和5），含或不含N-末端信号序列，含或不含位于第1位的起始甲硫氨酸，且含或不含位于SEQ ID NO:4的大约第277-307位氨基酸的任何或所有跨膜结构域。在还有一个实施方案中，天然序列CRIg多肽是305个氨基酸的短型人CRIg（huCRIg-短，SEQ ID NO:6，见图3A-3B），含或不含N-末端信号序列，含或不含位于第1位的起始甲硫氨酸，且含或不含位于SEQ ID NO:6的大约第183-213位的任何或所有跨膜结构域。在一个不同的实施方案中，天然序列CRIg多肽是280氨基酸长的SEQ ID NO:8的全长鼠CRIg多肽（muCRIg，见图4A-4C和5），含或不含N-末端信号序列，含或不含位于第1位的起始甲硫氨酸，且含或不含位于SEQ ID NO:8的大约第181-211位氨基酸的任何或所有跨膜结构域。其它非人动物，包括高等灵长类动物和哺乳动物的CRIg多肽明确包括在此定义内。
“CRIg变体”指如下定义的、与天然序列CRIg多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的活性CRIg多肽，包括但不限于C-末端截短的321个氨基酸的huCRIg(SEQ ID NO:2)、全长huCRIg(SEQ ID NO:4)、huCRIg-短(SEQ IDNO:6)、和muCRIg(SEQ ID NO:8)，各自含或不含N-末端起始甲硫氨酸，含或不含N-末端信号序列，含或不含整个或部分跨膜结构域，且含或不含胞内结构域。在一个具体的实施方案中，CRIg变体与来自序列SEQ ID NO:2的序列内的成熟、全长多肽具有至少约80%氨基酸序列同源性。在另一个实施方案中，CRIg变体与来自SEQ ID NO:4的序列内的成熟、全长多肽具有至少约80%氨基酸序列同源性。在又一个实施方案中，CRIg变体与来自SEQ ID NO:6的序列内的成熟、全长多肽具有至少约80%氨基酸序列同源性。在还有一个实施方案中，CRIg变体与来自SEQ ID NO:8的序列内的成熟、全长多肽至少约80%氨基酸序列同源性。此类CRIg多肽变体包括例如其中在SEQ ID NO:2,4,6或8的序列的N-或C-末端有一个或多个氨基酸残基插入、替代和/或删除的CRIg多肽。其它变体在所示多肽序列的跨膜区内有一个或多个氨基酸插入、替代和/或删除。
通常，CRIg变体将与来自SEQ ID NO:2,4,6或8内的成熟氨基酸序列具有至少约80%氨基酸序列同一性，或至少约85%氨基酸序列同一性，或至少约90%氨基酸序列同一性，或至少约95%氨基酸序列同一性，或至少约98%氨基酸序列同一性，或至少约99%氨基酸序列同一性。优选的是，在胞外结构域(ECD)（SEQ ID NO:2或4的氨基酸1或约21至X，其中X是第271-281位的任何氨基酸残基；或SEQ ID NO:6的氨基酸1或约21至X，其中X是第178-186位的任何氨基酸残基；或SEQ ID NO:8的氨基酸1或约21至X，其中X是第176-184位的任何氨基酸残基）内存在最高程度的序列同一性。
CRIg(PRO362)“胞外结构域”或“ECD”指基本上不含各自全长分子的跨膜和胞质结构域的CRIg多肽形式。通常，CRIg ECD将具有少于1%的此类跨膜和/或胞质结构域，且优选的是，将具有少于0.5%的此类结构域。如上所述，任选的是，CRIg ECD将包含SEQ ID NO:2,4,6或8的氨基酸残基1或约21至X，其中X是SEQ ID NO:2或4中约271至281的任何氨基酸，SEQ ID NO:6中约178至186的任何氨基酸，和SEQ ID NO:8中约176至184的任何氨基酸。
关于本文中鉴定的CRIg(PRO362)序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为分别在对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与CRIg序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。测定百分比氨基酸序列同一性目的的序列对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后相对于较长序列计算序列同一性，即即使较短序列与较长序列的一部分显示出100%序列同一性，总体序列同一性仍将小于100%。
关于本文中鉴定的CRIg(PRO362)编码序列（例如DNA45416）的“百分比(%)核酸序列同一性”定义为分别在对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与CRIg编码序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。测定百分比核酸序列同一性目的的序列对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后相对于较长序列计算序列同一性，即即使较短序列与较长序列的一部分显示出100%序列同一性，总体序列同一性仍将小于100%。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与该核酸的天然来源中通常与之相关的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达所编码多肽的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
“分离的”CRIg多肽编码核酸分子指已经鉴定且与CRIg编码核酸的天然来源中通常与之相关的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的CRIg多肽编码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的CRIg多肽编码核酸分子因此与存在于天然细胞中的编码核酸分子有区别。然而，分离的CRIg编码核酸分子包括通常表达CRIg的细胞中所包含的CRIg编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
术语“补体相关疾病”在本文中以最广义使用，包括其发病机制牵涉补体系统激活异常的所有疾病和病理性状况，诸如例如补体缺陷。该术语明确包括受益于C3转变酶抑制的疾病和病理性状况。该术语另外包括受益于补体旁路途径抑制，包括选择性抑制的疾病和病理性状况。补体相关疾病包括但不限于炎性疾病和自身免疫病，诸如例如类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远端组织损伤、心肺旁路手术过程中的补体激活、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性病和其它补体相关眼状况，诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺应激综合征(COPD)、哮喘、和吸入性肺炎。
术语“补体相关眼状况”在本文中以最广义使用，包括其病理学牵涉补体，包括补体的经典和旁路路径，特别是旁路途径的所有眼状况和疾病。此组明确包括其发生、形成、或发展可通过抑制旁路途径来控制的与旁路途径有关的所有眼状况和疾病。补体相关眼状况包括但不限于黄斑变性病，诸如所有阶段的年龄相关黄斑变性(AMD)，包括干性和湿性（非渗出性和渗出性）形式、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎、和其它眼内新血管疾病，诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯希-林二氏(von Hippel-Lindau)病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。优选的一组补体相关眼状况包括年龄相关黄斑变性(AMD)，包括非渗出性（湿性）和渗出性（干性或萎缩性）AMD、脉络膜新血管形成(CNV)、糖尿病性视网膜病变(DR)、和眼内炎。
术语“炎性疾病”和“炎性紊乱”可互换使用，指其中哺乳动物免疫系统的成分引起、介导或以其它方式促成炎性应答，促成哺乳动物发病的疾病或紊乱。还包括其中降低免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。此术语包括免疫介导的炎性疾病，包括自身免疫病。
术语“T细胞介导的”疾病指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚至与B细胞有关的效应，如果B细胞得到刺激的话，例如受到由T细胞分泌的淋巴因子的刺激。
免疫相关和炎性疾病的例子，有些是T细胞介导的，包括但不限于炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼发型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化（硬皮病）、特发性炎性肌病（皮肌炎、多肌炎）、斯耶格伦氏
Figure BDA00003310730700251
综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血（免疫性全血细胞减少、阵发性夜间血红蛋白尿）、自身免疫性血小板减少（特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少）、甲状腺炎（格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼发型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介导的肾病（肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎）、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎（甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎）、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病（例如囊性纤维化病）、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥、移植物抗宿主病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、和动脉粥样硬化。
“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括乳癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、子宫内膜、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌。
“治疗”和“处理”指意图预防紊乱形成或改变紊乱病理学而进行的干预。因此，“治疗”和“处理”指治疗性处理和防范性或预防性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有紊乱的受试者以及要预防紊乱的受试者。在免疫相关疾病的治疗中，治疗剂可直接改变免疫应答成分应答的量级，或者使得疾病对其它治疗剂例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂、化疗剂等的治疗更加敏感。在补体相关疾病的治疗中，治疗可例如预防或减缓疾病的发展。因此，补体相关眼状况的治疗明确包括预防、抑制、或减缓状况的形成或者由状况的一个阶段发展成另一个更高阶段或发展成更严重的相关状况。
疾病诸如补体相关疾病的“病理学”包括所有现象，包括患者的舒适感(well-being)。这包括但不限于异常或不受控制的细胞生长（嗜中性细胞、嗜曙红细胞、单核细胞、淋巴细胞）、抗体生成、自身抗体生成、补体生成、干扰邻近细胞的正常机能、以异常水平释放细胞因子或其它分泌产物、任何炎性或免疫学应答的遏制或加重、炎性细胞（嗜中性细胞、嗜曙红细胞、单核细胞、淋巴细胞）浸润进入细胞空间(cellular space)、玻璃疣形成、视力丧失等。
术语“哺乳动物”在用于本文时指归入哺乳类的任何动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如马、猪、牛、犬、猫和雪貂等。在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物指人或非人灵长类动物，最优选人。
“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时（并发）施用和任意顺序的顺序施用。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
“治疗有效量”指在目标疾病或状况，诸如例如补体相关（眼）疾病或状况或者癌的状态，例如病理学中实现可测量改善所需活性CRIg、CRIg激动剂和拮抗剂的量。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接”的。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
杂交反应的“严格性”可以容易的由本领域普通技术人员确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的另外细节和解释，参见Ausubel等人，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，1995。
“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴别：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50%(v/v)甲酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，含750mM氯化钠,75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)采用50%甲酰胺,5x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH6.8),0.1%焦磷酸钠,5x Denhardt氏溶液,超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml),0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷，42℃，及42℃0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50%甲酰胺中洗涤，接着在含EDTA的0.1x SSC中于55℃进行高严格性洗涤。
“中等严格条件”可以如Sambrook等人，《Molecular Cloning:A LaboratoryManual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989所述鉴别，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件（例如温度、离子强度和%SDS）。中等严格条件的一个例子是于37℃在含：20%甲酰胺,5x SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5x Denhardt氏溶液,10%硫酸右旋糖苷,和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1x SSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
术语“表位标记的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的本发明多肽的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得所述抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间（优选在约10个到约20个氨基酸残基之间）。
“有活性的”或“活性”在本发明CRIg多肽变体的语境中指保留天然的或天然存在的本发明多肽的生物学和/或免疫学活性的此类多肽的形式。一种优选的生物学活性是结合C3b和/或影响补体或补体活化，特别是抑制补体旁路途径和/或C3转变酶的能力。对C3转变酶的抑制可例如通过测量胶原或抗体诱发的关节炎期间正常血清中对C3周转(turnover)的抑制或关节炎关节中对C3沉积的抑制来测量。
“生物学活性”在抗体、多肽或模拟CRIg生物学活性且可通过本文所公开的筛选测定法鉴定的其它分子（例如有机或无机小分子、肽等）的语境中部分指此类分子结合C3b和/或影响补体或补体活化，特别是抑制补体旁路途径和/或C3转变酶的能力。
术语CRIg“激动剂”以最广义使用，包括定性模拟天然序列CRIg多肽的生物学活性（如上文所定义的）任何分子。此CRIg激动剂明确包括CRIg-Ig，例如CRIg-Fc融合多肽（免疫粘附素），还包括模拟至少一种CRIg生物学活性的小分子。优选的是，生物学活性指阻断补体途径，尤其是补体旁路途径。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全定性阻断、抑制、或中和天然多肽，诸如天然序列CRIg多肽的生物学活性的任何分子。
合适的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动性或拮抗性抗体或抗体片段，本发明天然多肽的片段、融合物或氨基酸序列变体，肽，小分子，包括有机小分子等。
“小分子”在本文中定义为分子量低于约600，优选低于约1000道尔顿。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖但不限于单一抗CRIg单克隆抗体（包括激动性、拮抗性、和中和性抗体）和具有多表位特异性的抗CRIg抗体组合物。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)指具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展示出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其它抗体样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成和由骨髓瘤以升高的水平生成。术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖但不限于完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展示出期望的生物学活性。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变区(VH)，接着是多个恒定区(CH)。每条轻链在一端具有一个可变区(VL)，而另一端是一个恒定区(CL)。轻链的恒定区与重链的第一恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区二者中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成（参见Kabat et al.,NIH Publ.No.91-3242,Vol.I,pages647-669(1991)）。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。具体而言，此定义所涵盖的抗体片段的例子包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab'片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域及CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有单臂抗体的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward et al.,Nature341:544-546(1989))，其由VH结构域构成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键相连的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子（例如单链Fv；scFv）(Bird et al.,Science 242:423-426(1988);Huston et al.,PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)“双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)(参见例如EP404,097;WO 93/11161;Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata etal.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995);美国专利5,641,870)。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段。“Fc”的名称反映了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区（或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为成对Fab'片段生成的，在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
根据其恒定区氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）轻链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定区氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别。免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同免疫球蛋白类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原性位点。另外，与通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的常规（多克隆）抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的优越性体现在它们是通过杂交瘤培养合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，并不解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.,Nature256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备（参见例如美国专利4,816,567）。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。还可参见美国专利5,750,373,5,571,698,5,403,484和5,223,409，它们描述了使用噬菌粒和噬菌体载体制备抗体。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体（免疫球蛋白），其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现所需生物学活性(美国专利4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列）。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的互补决定区(CDR)的数个或所有残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或输入CDR或框架序列中都没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能和使其最大化。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体最好还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。人源化抗体包括“灵长类化”(primatized)抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自由通过用目的抗原免疫短尾猴(macaque monkey)而生成的抗体。包含来自旧大陆猴类(OldWorld monkeys)的残基的抗体也有可能在本发明内。参见例如美国专利5,658,570;5,693,780;5,681,722;5,750,105;和5,756,096。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链（VH-VL）中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097;WO 93/11161;Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。
人IgG Fc区的“CH2结构域”（也称为“Cg2”结构域）通常自约第231位氨基酸残基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，两个N-连接分支的碳水化合物链介入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结构域或变异的CH2结构域。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C-末端的一段残基（即自IgG的约第341位氨基酸残基至约第447位氨基酸残基）。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异的CH3结构域（例如在其一条链中具有引入的“隆起”(protroberance)而在其另一条链中具有相应引入的“空腔”(cavity)的CH3结构域。参见美国专利5,821,333，明确收入本文作为参考）。此类变异的CH3结构域可用于生成本文所述多特异性（例如双特异性）抗体。
“铰链区”通常定义为自人IgG1的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列对比。铰链区在本文中可以是天然序列铰链区或变异的铰链区。变异铰链区的两条多肽链通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgG1铰链区。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种“效应物功能”。例示性的“效应物功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体；BCR）的下调；等。此类效应物功能通常要求Fc区与结合结构域（例如抗体可变区）组合，而且可使用本领域知道的用于评估此类抗体效应物功能的多种测定法来评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
“变异的Fc区”由于至少一处氨基酸修饰包含与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选的是，变异的Fc区与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有至少一处氨基酸替代，例如约一个至约十个氨基酸替代，优选约一个至约五个氨基酸替代。变异的Fc区在本文中将通常与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有例如至少约80%序列同一性，或至少约90%序列同一性，或至少约95%或更高序列同一性。
“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个CDR中具有导致抗体对抗原的亲和力与没有那些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知流程生成。Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献描述了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
“柔性接头”在本文中指包含两个或更多通过肽键相连的氨基酸残基且为由其连接的两段多肽（诸如两个Fd区）提供更多旋转自由的肽。所述旋转自由容许由柔性接头连接的两个或更多抗原结合位点各自更高效的接近靶抗原。合适的柔性接头肽序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、和gly-gly-gly-ser。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。通常，该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994。
“分离的”多肽诸如抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽，包括抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然化合物天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的化合物，例如抗体或其它多肽包括重组细胞内的原位化合物。然而，分离的化合物通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
词语“标记物”在用于本文时指与化合物，例如抗体或多肽直接或间接偶联从而产生“经标记”化合物的可检测化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的（例如放射性同位素标记物或荧光标记物），或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
“固相”指本发明的化合物可粘着的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃（例如可控孔径玻璃）、多糖（例如琼脂糖）、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱（例如亲和层析柱）。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利4,275,149中所述。
“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物（诸如本文中所公开的抗ErbB2抗体和任选的化疗剂）的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质（“粘附素”）的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应物功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点（即是“异源”的）、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定区序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA（包括IgA-1和IgA-2）、IgE、IgD或IgM。
“血管发生因子或血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生、内皮细胞生长、血管稳定性、和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体（血管生成素）、ephrins、ANGPTL3、ANGPTL4等。它还将包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun和D’Amore,Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);Streit and Detmar,Oncogene22:3172-3179(2003);Ferrara & Alitalo,Nature Medicine5(12):1359-1364(1999);Tonini etal.,Oncogene 22:6549-6556(2003)(例如列举血管发生因子的表1);Sato Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(2003)。
“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体发信号的小分子（例如PTK787/ZK2284,SU6668）。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrunand D’Amore,Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);Streit and Detmar,Oncogene22:3172-3179(2003)。
术语“有效量”指有效治疗（包括预防）哺乳动物中的疾病或紊乱的药物的量。因此，在年龄相关黄斑变性(AMD)或脉络膜新血管形成(CNV)的情况中，有效量的药物可减轻或预防视力丧失。对于AMD疗法，体内功效可例如通过如下一项或多项来测量：评估自基线至预期时间最佳矫正视力(BCVA)的平均变化；评估在预期时间与基线相比视力丧失少于15个字母的受试者的比例；评估在预期时间与基线相比视力获得超过或等于15个字母的受试者的比例；评估在预期时间Snellen视力相当于20/2000或更差的受试者的比例；评估NEI视觉功能问卷(Visual Functioning Questionnaire)；评估预期时间CNV的大小和CNV渗漏的量，通过荧光素血管造影术评估；等。如果适应症是预防干性AMD发展成湿性AMD或预防AMD发展成CMV，那么有效量的药物可抑制、减缓、或者部分或完全阻断所述发展。在这种情况中，有效量的测定牵涉疾病的分级，监测疾病发展的时间进程，和在必要时调整剂量以实现期望结果。
II.详述
本发明关注从胎肺文库克隆得到的、鉴定为巨噬细胞相关的单次跨膜Ig超家族成员(STigMA)或免疫球蛋白家族的补体受体(CRIg)多肽、与A33抗原和JAM1具有同源性的新巨噬细胞相关受体的用途。天然人CRIg表达成两种剪接变体，一种包含N-末端IgV样结构域和C-末端IgC2样结构域，而一种剪接形式缺乏C-末端结构域(分别是SEQ ID NO:4和6)。两种受体都具有单一跨膜结构域和胞质结构域，包含在体外在巨噬细胞中组成性磷酸化的酪氨酸残基。发现小鼠同系物与人CRIg具有67%序列同源性(SEQ ID NO:8)。全长人CRIg多肽还具有较短型式，缺失N-末端区段(SEQ ID NO:2)。
如下文实施例所示，CRIg结合补体C3b并抑制C3转变酶。CRIg在驻留组织的巨噬细胞上选择性表达，其表达受地塞米松和IL-10上调，受LPS和IFN-γ下调，且抑制不依赖B或T细胞应答的、胶原和抗体诱发的关节炎。
另外，发现CRIg在Kupffer细胞上高度表达，结合C3b和iC3b调理素，且是快速清除循环中的病原体所要求的。在结构上，CRIg与已知补体受体的不同之处在于它缺乏CR1和CR2中组合的C3b和C4b结合短共有重复序列，以及C3和CR4中存在的整联蛋白样结构域。尽管补体受体CR1-4在极其多种细胞类型上表达，然而CRIg表达限于驻留组织的巨噬细胞，包括肝Kupffer细胞。
消减研究确立了Kupffer细胞在感染早期在C3依赖性快速清除利斯特氏菌中的角色(Kaufmann,Annu Rev.Immunol.11:129-163(1993);Gregory etal.,J.Immunol.168:308-315(2002))，但是此过程中牵涉的受体迄今尚未鉴定。下文实施例中呈现的研究证明了巨噬细胞表达的CRIg结合沉积在病原体表面上的C3b和iC3b。由于对C3b和iC3b的此双重结合活性，CRIg是高效清除经这两种C3降解成分调理的单核细胞增生利斯特氏菌(LM)所要求的。
CRIg在肝脏快速清除C3调理的颗粒中的重要性得到进一步支持，即CRIg敲除(ko)小鼠未能从循环中有效清除C3调理的LM，导致多种器官中病原体的负荷升高和死亡率升高。在缺乏C3时，CRIg敲除野生型(wt)小鼠同样好的清除利斯特氏菌，表明CRIg功能依赖C3的存在。
补体受体CR1-4在肝Kupffer细胞清除LM中的角色尚未清楚确立。CR1和CR2在驻留组织的巨噬细胞上不存在，而且在滤泡树突细胞和B细胞上以优势表达，在此它们担任调节T和B细胞应答的角色(Krych-Goldber andAtkinson,Immunol.Rev.180:112-122(2001);Molina et al.,J.Exp.Med.175:121-129(1992);和实施例)。CR3在KC上以低水平表达，但是缺乏CR3和CR4二者的CD18共同β链、导致非功能性受体的敲除型小鼠显示出降低的、而非升高的对感染的易感性(Wu et al.,Infect.Immun.71:5986-5993(2003))。因此，CRIg代表了快速清除C3调理的颗粒中网状-内皮吞噬细胞系统的主要成分。
除了它在肝Kupffer细胞上的表达，CRIg存在于多种组织中的巨噬细胞亚群上，包括腹膜、心、肺、肾上腺和肠。已知这些巨噬细胞在死细胞和细胞残骸的吞噬作用中担任重要角色(Almeida et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1019:135-140(2004);Castellucci and Zaccheo,Prog.Clin.Biol.Res.296:443-451(1989);Taylor et al.,Annu.Rev.Immunol.23:901-944(2005))。这些驻留巨噬细胞上的CRIg表达可介导多种颗粒的补体依赖性调理吞噬作用。这得到了如下发现的支持，即CRIg敲除型小鼠展示出其心和肝组织中的LM降低，尽管循环LM负荷升高。因此，CRIg代表了在组织巨噬细胞中表达且充当快速清除补体调理的病原体的入口的新受体。
下文实施例呈现的结果进一步证明了CRIg在循环囊泡的胞内池上表达，由此确保细胞表面上CRIg的持续供应，供结合C3调理的颗粒。另外，表达CRIg的内体迅速募集至颗粒接触部位，在此它们可能有助于将膜交付给形成吞噬体。CRIg在C3调理的颗粒的吞噬作用中的重要性得到显示，即缺乏CRIg的KC没有能力结合C3b和iC3b，导致对C3调理的单核细胞增生利斯特氏菌的吞噬作用降低(见实施例)。
CRIg的亚细胞定位和胞内运输与已知补体C3受体不同。尽管CRIg定位于组成性循环的内体上，CR1、CR3和CR4位于分泌囊泡上，所述分泌囊泡在细胞因子刺激细胞时与质膜融合(Sengelov et al.,J.Immunol.153:804-810(1994);和Sengelov et al.,Crit.Rev.Immunol.15:107-131(1995))，且只在受体交联后通过大胞饮过程内在化配体(Carpentier et al.,Cell Regul.2:41-55(1991);Brown et al.,Curr.Opin.Immunol.3:76-82(1991))。结果是，细胞表面上的CRIg表达在刺激细胞后下调，而CR1和CR3细胞表面表达在刺激后升高。此升高充当结合和吞噬作用中的重要步骤，且像CRIg一样，CR3在C3调理的颗粒周围的吞噬细胞杯和吞噬体中集中(Aderem andUnderhill,Annu.Rev.Immunol.17:593-623(1999))。静息巨噬细胞中CRIg对配体的组成性循环和内吞作用与在炎性应答前在细菌感染的初始阶段期间，以及在非炎性状况下从循环中清除颗粒期间担任结合补体调理的颗粒的作用（例如募集激活的吞噬细胞）一致。
补体在机体防御中扮演关键角色，而且与免疫系统的其它成分一起保护个体免于病原体侵入机体。然而，如果没有恰当活化或控制，补体还可引起对宿主组织的损伤。补体的不当活化牵涉多种疾病的发病机理，称为补体相关疾病或紊乱，诸如免疫复合物和自身免疫病，及多种炎性状况，包括补体介导的炎性组织损伤。补体相关疾病的病理学有所不同，可能牵涉一段较长或较短时间的补体活化，完整级联、只有级联之一（例如经典或旁路途径）、只有级联的有些成分的活化，等。在有些疾病中，补体片段的补体生物学活性导致组织损伤和疾病。因此，补体的抑制剂具有高治疗潜力。旁路途径的选择性抑制剂将是特别有用的，因为通过经典途径从血液中清除病原体和其它有机体将保持完整。
已知C3b共价调理侵入机体的微生物的表面，且充当吞噬细胞上存在的补体受体的配体，最终导致对病原体的吞噬作用。在许多病理状态中，诸如上文所列，补体将在细胞表面上活化，包括血管壁、关节中的软骨、肝中的小球(glomeruli)或缺乏内在补体抑制物的细胞。补体活化导致由过敏毒素C3a和C5a的化学引诱物特性引起的炎症，而且可引起通过生成膜攻击复合物对自身细胞的损伤。不限于任何具体理论，通过结合C3b，认为CRIg抑制C3转变酶，由此预防或减轻补体介导的疾病，其例子已列于上文。
本发明的化合物
1.天然序列和变异CRIg多肽
上文已经讨论了天然CRIg分子及其核酸和多肽序列的制备。实施例1显示了SEQ ID NO:4的全长huCRIg的克隆。CRIg多肽可通过培养经包含CRIg核酸的载体转化或转染的细胞来生成。当然，设想了本领域众所周知的、可用于制备CRIg的替代方法。例如，CRIg序列或其部分可使用固相技术通过直接肽合成来生成(参见例如Stewart et al.,Solid-Phase PeptideSynthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可例如使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City,CA)使用制造商的说明书来实现。CRIg的各个部分可分别化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成全长CRIg。
CRIg变体可通过将适宜的核苷酸变化导入编码天然序列CRIg多肽的DNA，或者通过合成期望的CRIg多肽来制备。本领域技术人员将领会氨基酸变化可能改变CRIg的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。
可进行本文所述天然序列CRIg多肽中的变异，例如使用用于保守和非保守突变的任何技术和方针，例如美国专利5,364,934中所列。变异可以是替代、删除或插入一个或多个编码天然序列或变异CRIg的密码子，导致其氨基酸序列与相应的天然序列或变异CRIg相比有变化。任选的是，变异是通过将天然序列CRIg多肽的一个或多个结构域中的至少一个氨基酸用任何其它氨基酸替代。确定哪个氨基酸残基可插入、替代或删除而对期望活性没有不利影响的方针可通过比较CRIg与同源已知蛋白质分子的序列并将高同源区中进行的氨基酸序列变化的数目最小化而找到。
氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换的结果，诸如用丝氨酸替换亮氨酸，即保守氨基酸替换。插入或删除可以任选在1-5个氨基酸的范围内。允许的变异可通过在序列中系统进行氨基酸插入、删除或替代并在下文实施例中描述的体外测定法中测试所得变体的活性来确定。
变异可使用本领域已知的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的（定点）诱变、丙氨酸扫描、和PCR诱变。可在克隆的DNA上进行定点诱变(Carter etal.,Nucl.Acids Res.13:4331(1986);Zoller et al.,Nucl.Acids Res.10:6487(1987))、盒式诱变(Wells et al.,Gene34:315(1985))、限制性选择诱变(Wells etal.,Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317:415(1986))或其它已知技术以生成CRIg变体DNA。
还可采用扫描氨基酸分析以鉴定沿着毗邻序列可变化的一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这一类中的优选扫描氨基酸，因为它消除了β-碳的侧链且不大可能改变变体的主链构象。丙氨酸通常还因为它是最常见的氨基酸而成为优选的。此外，在隐藏的和暴露的位置都经常可以找到它(Creighton,The Proteins,W.H.Freeman&Co.,N.Y.;Chothia,J.Mol.Biol.150:1(1976))。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等构(isoteric)氨基酸。
发现消除或灭活整个或部分跨膜区和/或胞质区不损害CRIg生物学活性。因此，跨膜区和/或胞质区删除/灭活的CRIg变体明确的在本发明范围内。类似的，有生物学活性的天然短型huCRIg和鼠同系物的存在证明，可消除IgC2区而不损害生物学活性。
天然序列和变异CRIg多肽的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使CRIg的靶定氨基酸残基与有机衍生剂反应，该试剂能够与CRIg多肽的选定侧链或N-或C-末端残基反应。使用双功能剂的衍生化可用于例如使CRIg与不溶于水的支持物基质或表面交联，例如用于纯化抗CRIg抗体的方法。常用的交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水杨酸的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚氨基酯诸如3,3'-二硫代二(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如二-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷、及诸如3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙酰亚氨酸甲酯等试剂。
其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基、脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983))、N-末端胺的乙酰化、及任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明范围内所包括的对CRIg多肽的另一种类型的共价修饰包括改变多肽的天然糖基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指删除一个或多个在天然序列CRIg中发现的碳水化合物模块(moiety)，和/或添加一个或多个在天然序列CRIg中不存在的糖基化位点，和/或改变附着于糖基化位点的糖残基的比例和/或组成。在鼠CRIg的第170位发现预测的天然糖基化位点，序列为NGTG。
多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接糖基化指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸（其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。O-连接糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但在O-连接糖基化中也可能牵涉5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。天然序列CRIg具有不显著的N-糖基化。向CRIg多肽中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列来实现。改变可通过例如向天然序列CRIg中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（用于O-连接的糖基化位点），或者添加N-连接糖基化的识别序列。可任选通过DNA水平的变化来改变CRIg氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码CRIg多肽的DNA，从而产生将翻译成期望氨基酸的密码子。
增加CRIg多肽上碳水化合物模块的数目的另一种手段是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公开的WO 87/05330;和Aplin and Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)。
消除CRIg多肽上存在的碳水化合物模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代。化学脱糖基化技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddin et al.,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edge et al.,Anal.Biochem.118:131(1981)。酶促切割多肽上的碳水化合物模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura et al.,Meth.Enzvmol.138:350(1987)所述。
对CRIg的另一种类型的共价修饰包括将CRIg多肽与多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene)，例如以美国专利4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337所述方式。
还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的天然序列和变异CRIg，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的CRIg，包括CRIg的片段。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的CRIg的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于CRIg多肽的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的CRIg多肽的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使CRIg多肽易于使用抗标签抗体或其它类型的结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其相应抗体是本领域众所周知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field et al.,Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988))；c-myc标签及其抗体8F9,3C7,6E10,G4,B7和9E10(Evan et al.,Molecular and CellularBiology 5:3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.,Protein Engineering3(6):547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp et al.,BioTechnology6:1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin etal.,Science 255:192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner et al.,J.Biol.Chem.266:15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6393-6397(1990))。
在另一个实施方案中，嵌合分子可包括CRIg多肽或其片段与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区的融合物。对于二价形式的嵌合分子，这样的融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。这些融合多肽是将异源蛋白质（“粘附素”）的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应物功能联合起来的抗体样分子，常常称为免疫粘附素。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点（即是“异源”的）、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定区序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA（包括IgA-1和IgA-2）、IgE、IgD或IgM。
由受体序列与适宜的免疫球蛋白恒定区序列连接而构建的嵌合物（免疫粘附素）是本领域已知的。文献中报道的免疫粘附素包括T细胞受体(Gascoigne et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2936-2940(1987))；CD4(Capon et al.,Nature337:525-531(1989);Traunecker et al.,Nature339:68-70(1989);Zettmeissl et al.,DNA Cell Biol.USA9:347-353(1990);Byrn et al.,Nature344:667-670(1990))；L-选择蛋白（归巢受体）(Watson et al.,J.Cell.Biol.110:2221-2229(1990);Watson et al.,Nature 349:164-167(1991))；CD44(Aruffo et al.,Cell61:1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley et al.,J.Exp.Med.173:721-730(1991))；CTLA-4(Lisley et al.,J.Exp.Med.174:561-569(1991))；CD22(Stamenkovic et al.,Cell66:1133-11144(1991))；TNF受体(Ashkenazi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535-10539(1991);Lesslaueret al.,Eur.J.Immunol.27:2883-2886(1991);Peppel et al.,J.Exp.Med.174:1483-1489(1991))；NP受体(Bennett et al.,J.Biol.Chem.266:23060-23067(1991))；和IgE受体α(Ridgway et al.,J.Cell.Biol.115:abstr.1448(1991))的融合物。
最简单和最直截了当的免疫粘附素设计将“粘附素”蛋白质的结合区与免疫球蛋白重链的铰链和Fc区联合起来。通常，在制备本发明的CRIg-免疫球蛋白嵌合物时，编码CRIg多肽或CRIg多肽胞外结构域(ECD)的核酸在C-末端将与编码免疫球蛋白恒定区序列N-末端的核酸融合，但N-末端融合物也是可能的。
通常，在此类融合物中，所编码嵌合多肽将至少保留在功能上有活性的免疫球蛋白重链恒定区铰链和CH2和CH3结构域。还对恒定区Fc部分的C-末端进行融合，或者直接对重链CH1或轻链相应区的N-末端进行融合。
进行融合的精确位点不是至关重要的；具体位点是众所周知的，可以为了优化CRIg-免疫球蛋白嵌合物的生物学活性、分泌或结合特征而选择。
在有些实施方案中，CRIg-免疫球蛋白嵌合物装配成单体或者异或同多聚体，特别是二聚体或四聚体，基本上如WO 91/08298中所述。
在一个优选的实施方案中，天然序列人CRIg多肽的序列，诸如例如huCRIg(长)(SEQ ID NO:4)或huCRIg(短)(SEQ ID NO:6)，或CRIg胞外结构域序列（包括huCRIg(长)和huCRIg(短)的ECD）与抗体包含免疫球蛋白例如免疫球蛋白G1(IgG1)效应物功能的C-末端部分（特别是Fc结构域）的N-末端融合。有可能将整个重链恒定区与CRIg或CRIg胞外结构域序列融合。然而，更优选的是，在融合中使用自铰链区中紧挨着木瓜蛋白酶切割位点（它在化学上定义IgG Fc；残基216，以重链恒定区的第一个残基或其它免疫球蛋白的类似位点为114）上游开始的序列。在一个特别优选的实施方案中，CRIg氨基酸序列与IgG1、IgG2或IgG3重链的铰链区和CH2和CH3，或者与CH1、铰链、CH2和CH3结构域融合。进行融合的精确位点不是至关重要的，最佳位点可通过常规实验确定。特定的CRIg-Ig免疫粘附素结构例示于图59-61。
在有些实施方案中，CRIg-免疫球蛋白嵌合物装配成多聚体，特别是同二聚体或四聚体。通常，这些装配好的免疫球蛋白将具有已知的亚基结构。基本的四链结构单元是IgG、IgD和IgE存在的形式。四链单元在较高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM通常作为通过二硫键保持在一起的基本四链单元五聚体存在；IgA球蛋白和偶尔的IgG球蛋白也在血清中以多聚体形式存在。在多聚体的情况中，每个四链单元可以是相同的或不同的。
或者，CRIg或CRIg胞外结构域序列可插入免疫球蛋白重链和轻链序列之间，从而得到包含嵌合重链的免疫球蛋白。在这个实施方案中，CRIg序列与免疫球蛋白每个臂中免疫球蛋白重链的3'末端融合，或是铰链和CH2结构域之间或是CH2和CH3结构域之间。Hoogenboom et al.,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)报道了相似构建物。
尽管在本发明的免疫粘附素中不要求存在免疫球蛋白轻链，免疫球蛋白轻链可以存在，或是与CRIg-免疫球蛋白重链融合多肽共价相连，或是直接与CRIg胞外结构域融合。在前一种情况中，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码CRIg-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。在分泌时，杂合重链和轻链将共价相连以提供包含两对以二硫键相连的免疫球蛋白重链-轻链的免疫球蛋白样结构。适于制备此类结构的方法有例如1989年3月28日授权的美国专利4,816,567中所公开的。
编码本发明的某些CRIg-Ig融合蛋白的核苷酸序列显示于图59、60和67-70。例如，如图67-70所示，融合蛋白可在CRIg和免疫球蛋白序列之间包含接头，诸如例如短肽序列，例如DKTHT。另外，在有些构建物中，CRIg跨膜(TM)区和免疫球蛋白(Fc)区之间的序列（在本文中称为“茎”序列）可删除。图67-70所示各种CRIg构建物中接头开始的氨基酸位置如下：huCRIg-长-Fc+茎:第267位；huCRIg-长-Fc-茎:第233位；huCRIg-短-Fc+茎:第173位；huCRIg-短-Fc-茎:第140位。
2.天然序列和变异CRIg多肽的制备
编码CRIg多肽的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有CRIg mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人CRIg DNA可以方便的从以人组织制备的cDNA文库获得，诸如实施例1中所述。CRIg编码基因也可从基因组文库或通过寡核苷酸合成而获得。
可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针（诸如CRIg的抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸）筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989所述。分离编码CRIg的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrook et al.,见上文;Dieffenbach et al.,PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1995)。
实施例1描述了用于筛选cDNA文库的技术。选作探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域众所周知的，包括使用放射标记物，像32P标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrook et al,见上文。
在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性（或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上）可使用采用各种算法来测量同源性的计算机软件程序，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、DNAstar、和INHERIT通过序列对比来测定。
具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断氨基酸序列筛选选定cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook et al.,见上文所述常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间产物。
将宿主细胞用本文所述用于CRIg生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由本领域技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian Cell Biotechnology:aPractical Approach,M.Butler,ed.,IRL Press,1991和Sambrook et al.,见上文。
转染方法是普通技术人员所知道的，例如CaPO4和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook et al.,见上文所述，或电穿孔通常用于原核生物或具有坚固细胞壁屏障的其它细胞。用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw et al.,Gene23:315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham and van der Eb,Virology52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利4,399,216。进入酵母的转化通常依照Van Solingen et al.,J.Bact.130:946(1977)和Hsiao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76:3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keown et al.,Methods in Enzvmology185:527-537(1990)和Mansour et al.,Nature336:348-352(1988)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446);大肠杆菌X1776(ATCC31,537);大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。
除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是CRIg编码载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）是常用的低等真核宿主微生物。
适用于表达糖基化CRIg的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9，以及植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的例子包括用SV40转化的猴肾CV1细胞（COS-7，ATCC CRL1651）；人胚肾细胞（293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)）；小鼠塞托利(sertoli)细胞（TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)）；人肺细胞（W138，ATCC CCL75）；人肝细胞（Hep G2，HB 8065）；及小鼠乳瘤细胞（MMT 060562，ATCC CCL51）。认为适宜宿主细胞的选择在本领域技术范围内。
可以将编码CRIg的核酸（例如cDNA或基因组DNA）插入复制型载体用于克隆（DNA扩增）或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种流程将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。
CRIg多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的CRIg DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列（包括糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导序列，后者见美国专利5,010,182）、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列（1990年4月4日公开的EP 362,179）、或1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV）可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体通常将包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取CRIg核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和繁殖如Urlaubet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.,Nature 282:39(1979);Kingsman et al.,Gene 7:141(1979);Tschemper et al.,Gene10:157(1980))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志(Jones,Genetics85:12(1977))。
表达和克隆载体通常包含与CRIg核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang et al.,Nature 275:615(1978);Goeddel et al.,Nature 281:544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,Nucleic acids Res.8:4057(1980);EP 36,776)、和杂合启动子诸如tac启动子(deBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还将包含与编码CRIg的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman etal.,J.Biol.Chem.255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968);Holland,Biochemistry17:4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。
作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 73,657。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录CRIg受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、腺病毒（诸如腺病毒2）、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)基因组、由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核生物对编码CRIg多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，作用于启动子以增加其转录。已知来自哺乳动物基因（球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子（bp100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于CRIg编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。
用于真核宿主细胞（酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞）的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码CRIg的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成CRIg的其它方法、载体和宿主细胞见Gething et al.,Nature 293:620-625(1981);Mantei et al.,Nature281:40-46(1979);EP 117,060;和EP 117,058。
基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使用适宜的标记探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201-5205(1980))、点印迹（DNA分析）或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。
或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色和/或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列CRIg多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与CRIg DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列来制备抗体。
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的CRIg。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液（例如Triton-X 100）或通过酶促裂解使其从膜上释放。CRIg表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。
可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化CRIg。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A Sepharose柱以除去污染物诸如IgG；及结合CRIg多肽的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher,Methods inEnzymology 182(1990);Scopes,Protein Purification:Principes and Practice,Springer-Verlag,New York(1982)。选择的纯化步骤将取决于例如所用生成过程的性质和所产生的具体CRIg。
3.CRIg多肽的激动剂
CRIg多肽的激动剂将模拟天然序列CRIg多肽的定性生物学活性。优选的是，生物学活性是结合C3b和/或影响补体或补体活化，特别是抑制补体旁路途径和/或C3转变酶的能力。激动剂包括例如免疫粘附素、肽模拟物和模拟天然CRIg定性生物学活性的非肽有机小分子。
上文已经讨论了CRIg-Ig免疫粘附素。
另一组CRIg激动剂是天然序列CRIg多肽的肽模拟物。肽模拟物包括例如包含非天然存在氨基酸的肽，倘若该化合物保留本文所述CRIg生物学活性。类似的，肽模拟物和类似物可包括模拟本发明CRIg多肽重要结构元件的结构和保留CRIg生物学活性的非氨基酸化学结构。术语“肽”在用于本文时指少于约50个氨基酸残基，优选少于约40个氨基酸残基，受约束（即具有有些结构元件，像例如存在启动β-转角或β-折叠片的氨基酸，或者例如因存在二硫键Cys残基而环化）或不受约束（例如线性）的氨基酸序列，包括其或其之间的多聚体诸如二聚体。对于少于约40个氨基酸残基的肽，优选约10个和约30个氨基酸残基之间的肽，尤其是约20个氨基酸残基的肽。然而，在阅读本公开书后，技术人员将认识到，不是根据特定肽的长度，而是根据它结合C3b和抑制C3转变酶，特别是补体旁路途径C3转变酶的能力来辨别肽。
肽可方便的使用固相肽合成来制备(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964);Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5132(1985))。固相合成从推定肽的羧基末端开始，将受保护的氨基酸偶联至惰性固相支持物。惰性固相支持物可以是能够充当初始氨基酸C-末端锚的任何大分子。通常，大分子支持物是交联聚合物树脂（例如聚酰胺或聚苯乙烯树脂），如Stewart andYoung,见上文的第2和4页图1-1和1-2所示。在一个实施方案中，C-末端氨基酸偶联至聚苯乙烯树脂以形成苯甲酯。大分子支持物的选择使得肽锚连接在用于肽合成中封闭的氨基酸α-氨基脱保护的条件下是稳定的。若使用碱不稳定的α-保护基，则希望在肽和固相支持物之间使用酸不稳定的连接。例如，酸不稳定的醚树脂对是碱不稳定的Fmoc氨基酸肽合成是有效的，如Stewart and Young,见上文的第16页所述。或者，可使用对酸解作用差异不稳定的肽锚连接和α-保护基。例如，氨甲基树脂诸如苯乙酰胺甲基(Pam)树脂在与Boc-氨基酸肽合成联合时运作很好，如Stewart and Young,见上文的第11-12页所述。
在起始氨基酸偶联至惰性固相支持物后，起始氨基酸的α-氨基保护基例如用三氟乙酸(TFA)在二氯甲烷中除去并例如在三乙胺(TEA)中中和。起始氨基酸的α-氨基脱保护后，加入合成中下一个α-氨基和侧链受保护的氨基酸。然后通过缩合以预期次序顺序偶联剩余的α-氨基和必要时侧链受保护的氨基酸以获得与固相支持物相连的中间化合物。或者，有些氨基酸可彼此偶联以形成期望肽的片段，随后将肽片段加至成长中的固相肽链。
两个氨基酸或者氨基酸和肽或者肽和肽之间的缩合反应可依照常用缩合方法进行，诸如酸法、混合酸酐法、DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)或DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)法、活泼酯法、对硝基苯酯法、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三[二甲氨基]膦六氟磷酸盐/酯)法、N-羟基琥珀酸亚氨酸酯法等，及Woodward试剂K法。
肽的化学合成中共同的是用合适的保护基保护氨基酸的任何反应性侧链基团。最终，这些保护基在顺序装配好期望多肽链后去除。同样共同的是在氨基酸或肽片段的C-末端羧基与成长中的固相多肽链的游离N-末端氨基反应时保护氨基酸或肽片段上的α-氨基，随后将α-氨基选择性去保护以容许添加下一个氨基酸或肽片段至固相多肽链。因此，多肽合成中共同的是生成这样的中间化合物，它包含在肽链中以期望序列定位的每个氨基酸残基，其中个别残基仍携带侧链保护基。这些保护基可基本上在从固相切下后同时去除以生成期望多肽产物。
α-和ε-氨基侧链可用下列基团保护：苄氧羰基(缩写为Z)、异烟氧羰基(iNOC)、邻氯苄氧羰基[Z(2Cl)]、对硝基苄氧羰基[Z(NO2)]、对甲氧基苄氧羰基[Z(OMe))]、叔丁氧羰基(Boc)、叔戊氧羰基(Aoc)、异冰片氧羰基、金刚氧羰基、2-(4-联苯基)-2-丙氧羰基(Bpoc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、甲磺酰乙氧羰基(Msc)、三氟乙酰基、邻苯二酰基、甲酰基、2-硝基苯磺酰基(NPS)、二苯基硫膦基(Ppt)和二甲基硫膦基(Mpt)，等等。
羧基官能团的保护基有例如苯甲酯(OBzl)、环己酯(Chx)、4-硝基苯甲酯(ONb)、叔丁酯(Obut)、4-吡啶基甲酯(OPic)，等等。常常期望具有氨基和羧基以外官能团的特定氨基酸诸如精氨酸、半胱氨酸和丝氨酸受到合适保护基的保护。例如，精氨酸的胍基可用硝基、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、金刚氧羰基、对甲氧基苯磺酰基、4-甲氧基-2,6-二甲基苯磺酰基(Nds)、1,3,5-三甲基苯磺酰基(Mts)，等等保护。半胱氨酸的巯基可用对甲氧基苄基、三苯甲基，等等保护。
上文所述许多受封闭的氨基酸可通过商业途径获得，诸如Novabiochem(San Diego,Calif.)、Bachem CA(Torrence,Calif.)或Peninsula Labs(Belmont,Calif.)。
Stewart and Young,见上文提供了关于肽制备流程的详细信息。α-氨基保护记载于第14-18页，侧链封闭记载于第18-28页。胺、羟基和巯基功能保护基的列表见第149-151页。
在期望氨基酸序列完成后，肽可从固相支持物切下，回收和纯化。通过能够破坏肽-固相连接的试剂从固相支持物切下肽，并任选的是，将肽上受封闭的官能团脱保护。在一个实施方案中，用液态氢氟酸(HF)通过酸解作用从固相切下肽，它还去除任何剩余的侧链保护基。优选的是，为了避免肽中残基的烷化（例如甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基的烷化），酸解反应混合液含有硫甲酚和甲酚清除剂。HF切割后，用醚清洗树脂，并以乙酸溶液的连续清洗从固相提取游离肽。将合并的清洗液冻干，并纯化肽。
4.CRIg多肽的拮抗剂
天然序列CRIg多肽的拮抗剂可用于治疗受益于过度补体活化的状况，包括肿瘤。
一组优选的拮抗剂包括特异性结合天然CRIg的抗体。例示性抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性和异源偶联的抗体。
制备多克隆抗体的方法是技术人员已知的。多克隆抗体可在动物中生成，例如通过一次或多次注射免疫剂和根据需要的佐剂。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射而注射到动物中。免疫剂可包括本发明的CRIg多肽或其片段或融合蛋白。将免疫剂与已知在所免疫哺乳动物中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔虫戚血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂（单磷酰基脂质A、合成的海藻糖dicorynomycolate）。免疫方案可以由本领域技术人员无需过多实验做出选择。
或者，识别和结合本发明多肽或者作为其拮抗剂发挥作用的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤法制备，诸如Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)所述。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适宜的宿主动物通常用免疫剂免疫以引发生成或能够生成将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。
免疫剂将通常包括本发明的CRIg多肽、其抗原性片段或融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，若希望人起源的细胞，或是使用脾细胞或淋巴节细胞，若希望非人哺乳动物来源。然后，使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),pp.59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷（“HAT培养基”），这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定的高水平的表达抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠源骨髓瘤系，可从例如索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diege,California,USA)和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA)获得。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,NewYork(1987)pp.51-63)。
然后可对杂交瘤细胞在其中培养的培养基测定针对本发明多肽或与本发明多肽具有相似活性的单克隆抗体的存在。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson andPollard,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到期望的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding,见上文)。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基或RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基或腹水分开或纯化。
单克隆抗体还可通过重组DNA技术来生成，诸如美国专利4,816,567中所述。编码本发明单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序（例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针）。本发明的杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4,816,567;Morrison et al.,见上文)，或者通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可用此类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定区，或者可用它替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体。
抗体优选是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域众所周知的。例如，一种方法牵涉免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任何点截短，从而防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或者删除，从而防止交联。
体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以生成其片段，特别是Fab片段，可使用本领域已知的常规技术来完成。
本发明的抗体还可包括人源化抗体或人抗体。非人（例如鼠源）抗体的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列）。人源化抗体包括人免疫球蛋白（受体抗体）中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的抗体。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体和输入CDR或框架序列中都没有发现的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al.,Nature321:522-525(1986);Riechmannet al.,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
用于人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al.,Nature321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science239:1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
还可使用本领域已知的多种技术生成人抗体，包括噬菌体展示库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991);U.S.5,750,373)。类似的，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物，例如小鼠来生成。在攻击时，观察到人抗体生成，在所有方面与在人体中看到的非常相像，包括基因重排、装配和抗体全集。此方法记载于例如美国专利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016，及下列科学出版物：Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnology14:845-51(1996);Neuberger,Nature Biotechnology14:826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆，优选人或人源化抗体。在这种情况中，一种结合特异性可以是对本发明的多肽，另一种是对任何其它抗原，优选对细胞表面蛋白或者受体或受体亚基。
用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein and Cuello,Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）生成十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来完成。1993年5月13日公开的WO93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991)中披露了类似的流程。
可将具有期望结合特异性（抗体-抗原结合位点）的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的更多详情参见例如Suresh et al.,Methods in Enzymology 121:210(1986)。
异源偶联抗体由两种共价接合的抗体构成。此类抗体建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 91/00360;WO 92/200373;EP 03089)。设想了可使用合成蛋白质化学中已知的方法在体外制备抗体，包括牵涉交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇盐/酯和4-巯基丁亚氨酸甲酯及例如美国专利4,676,980中所公开的。
可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体在治疗免疫相关疾病中的效力。例如，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design3:219-230(1989)。
本发明还涉及包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素（例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段）或放射性同位素（即放射偶联物）。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。有多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y、和186Re。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚胺二甲酯）、活泼酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。
在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”（诸如链霉亲合素）偶联，用于组织预定位，其中对患者施用抗体-受体偶联物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（例如放射性核苷酸）偶联的“配体”（例如亲合素）。
5.目标疾病
5.1补体相关疾病和状况
本发明的CRIg多肽及其激动剂，尤其是CRIg-Ig免疫粘附素，可用于预防和/或治疗补体相关疾病和病理状况。所述疾病和状况包括但不限于炎性和自身免疫性疾病。
补体相关疾病的具体例子包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、缺血和再灌注后的远端组织损伤、心肺旁路手术过程中的补体激活、皮肌炎、天疱疮、狼疮肾炎及由此发生的肾小球肾炎和血管炎、心肺转流术、心脏停搏诱发的冠状动脉内皮功能障碍、II型膜性增生性肾小球肾炎、IgA肾病、急性肾衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂综合征、黄斑变性病和其它补体相关眼状况诸如年龄相关黄斑变性(AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯希-林二氏(vonHippel-Lindau)病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、以及同种移植、超急性排斥反应、血液透析、慢性阻塞性肺应激综合征(COPD)、哮喘和吸入性肺炎。
5.2补体相关眼状况
CRIg多肽及其激动剂，尤其是CRIg-Ig免疫粘附素，特别可用于预防和治疗补体相关眼状况（所有其病理学牵涉补体，包括经典和旁路途径，特别是旁路途径的补体眼状况和疾病），诸如例如黄斑变性病诸如所有阶段的年龄相关黄斑变性(AMD)包括干性和湿性（非渗出性和渗出性）形式、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变、眼内炎和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、冯希-林二氏(von Hippel-Lindau)病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成和视网膜新血管形成。一组优选的补体相关眼状况包括年龄相关黄斑变性(AMD)，包括非渗出性（湿性）和渗出性（干性或萎缩性）AMD、脉络膜新血管形成(CNV)、糖尿病性视网膜病变(DR)和眼内炎。
AMD指年龄相关黄斑变性，是超过60岁的个体中不可逆的视觉功能障碍的主导原因。AMD存在两种类型，即非渗出性（干性）和渗出性（湿性）AMD。干性或非渗出性形式牵涉中央视网膜（黄斑）下面视网膜色素上皮(RPE)的萎缩和肥厚变化，以及RPE上的沉积物（玻璃疣）。具有非渗出性AMD的患者可发展成湿性或渗出性形式的AMD，其中称作脉络膜新血管膜(CNVM)的异常血管在视网膜下发育，渗出液体和血液，最终在视网膜中和在视网膜下引起使人失明的盘状瘢痕。非渗出性AMD，它通常是渗出性AMD的前身，是更常见的。非渗出性AMD的表现有所不同；可存在硬质玻璃疣、软质玻璃疣、RPE地理性萎缩(geographic atrophy)和色素凝集。补体成分在AMD早期在RPE上沉积，是玻璃疣的主要组分。
本发明明确关注高风险AMD的治疗，包括3类和4类AMD。3类AMD的特征是在两只眼中都不存在晚期AMD，至少一只眼的视力有20/32或更好且有至少一个大个疣（例如125μm），广泛的（通过玻璃疣面积测量）中间玻璃疣，或不牵涉黄斑中央的地理性萎缩(GA)，或其任意组合。3类AMD（仍认为是“干性”AMD）具有转变为脉络膜新血管形成(CNV)的高风险。
4类高风险AMD（归入“湿性”AMD）的特征是指标眼(index eye)中视力20/32或更好，且没有晚期AMD（牵涉黄斑中央的GA或脉络膜新血管形成的特征）。对侧眼(fellow eye)的特征是晚期AMD，或视力低于20/32，可归于AMD黄斑病变。通常，如果不治疗，高风险AMD以比1或2类（风险不高）AMD的发展速率高约10-30倍的速率快速发展成脉络膜新血管形成(CNV)。
CRIg及其激动剂，诸如CRIg-Ig免疫粘附素，特别可用于预防AMD（特别是3类或4类AMD）发展成CNV，和/或预防在不受影响或影响较小的对侧眼中形成/发展AMD或CNV。在此语境中，术语“预防”以最广义使用，包括完全或部分阻断和减缓疾病的发展，以及延迟疾病更严重形式的发作。有高风险形成或发展成高风险（4类）AMD或CMV的患者尤其受益于本发明的这个方面。
已知补体因子H(CFH)多态性与个体形成AMD和/或CNV的风险有关。CFH中的突变可激活补体，继而可导致AMD/CNV。最近已有报道，补体因子H(CFH)多态性占到可导致AMD的风险的50%(Klein et al.,Science308:385-9(2005))。已经发现CFH的一种常见单元型(HF1/CFH)使个体易患年龄相关黄斑变性(Hageman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2):7227-7232(2005))。AMD已经隔离成一种常染色显性性状，疾病基因座定位至染色体1q25-q31，在标志物D1S466和D1S413之间，最大优势对数计分(lod score)约3.20(Klein et al.,Arch Opthalmol.116(8):1082-9(1998);Majewski et al.,Am.J.Hum.Genet.73(3):540-50(2003);Seddon et al.,Am.J.Hum.Genet.73(4):780-90(2003);Weeks et al.,Am.J.Ophthalmol.132(5):682-92(2001);Iyengar et al.,Am.J.Hum.Genet.74(1):20-39(2004))；染色体2q3/2q32，在标志物D12S1391和D2S1384之间，最大优势对数计分2.32/2.03(Seddon et al.,见上文)；3p13，在标志物D12S1300和D12S1763之间，最大优势对数计分2.19(Majewski et al.,见上文;Schick et al.,Am.J.Hum.Genet.72(6):1412-24(2003))；6q14，在标志物D6S1056和DS249之间，最大优势对数计分3.59/3.17(Kniazeva et al.,Am.J.Ophthlmol.130(2):197-202(2000))；9q33，在标志物D9S934处，最大优势对数计分2.06(Mejwski et al.,见上文)；10q26，在标志物D10S1230处，最大优势对数计分3.06(Majewski et al.,见上文;Iyengaret al.,见上文;Kenealy et al.,Mol.Vis.10:57-61(2004))；17q25，在标志物D17S928处，最大优势对数计分3.16(Weeks et al.,见上文)；和22q12，在标志物D22S1045处，最大优势对数计分2.0(Seddon et al.,见上文)。因此，遗传筛选是鉴定患者中谁是预防性处理，包括预防疾病发展成更严重形式，诸如从AMD发展成CNV的特别好的候选者的一个重要部分。
另外，鉴于补体激活和年龄相关黄斑变性(AMD)间联系的坚固证据，本发明提供了通过补体抑制，特别是抑制旁路途径来预防和治疗CNV和AMD的新方法。除了CRIg以外，旁路途径的抑制剂包括融合蛋白（例如免疫粘附素）、激动性抗CRIg抗体、及肽和非肽小分子。
5.3炎性状况和自身免疫病
作为补体相关疾病例子的炎性状况的更广泛列表包括例如炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼发型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化（硬皮病）、特发性炎性肌病（皮肌炎、多肌炎）、斯耶格伦氏
Figure BDA00003310730700621
综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血（免疫性全血细胞减少、阵发性夜间血红蛋白尿）、自身免疫性血小板减少（特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少）、甲状腺炎（格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼发型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介导的肾病（肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎）、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎（甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎）、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病（例如囊性纤维化病）、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。
在系统性红斑狼疮中，疾病的主要介质是生成对自身蛋白质/组织的自身反应性抗体及随后生成免疫介导的炎症。抗体或是直接或是间接介导组织损伤。尽管T淋巴细胞未显示出直接牵涉组织损伤，然而T淋巴细胞是形成自身反应性抗体所要求的。疾病的发生因此依赖T淋巴细胞。多个器官和系统在临床上受到影响，包括肾、肺、肌肉骨骼系统、粘膜皮肤、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性系统性自身免疫性炎性疾病，主要牵涉多个关节的滑膜，由此导致对关节软骨的损伤。发病机制依赖T淋巴细胞，而且与类风湿因子，针对自身IgG的自身抗体的生成有关，由此导致免疫复合物的形成，它在关节液和血液中达到高水平。关节中的这些复合物可诱发显著的淋巴细胞和单核细胞浸润到滑膜中及随后显著的滑膜变化；关节腔/液受到类似细胞的浸润及添加许多嗜中性粒细胞。受影响的组织主要是关节，常常是对称样式。然而，关节外疾病也存在两种主要形式。一种形式是形成关节外损伤，伴有正在进行的渐进性关节病和肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡的典型损伤。关节外疾病的第二种形式是所谓的费尔提氏(Felty)综合征，它发生在RA病程晚期，有时在关节病已经沉寂后，且牵涉出现嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和脾肿大。这可伴随着多个器官中的血管炎及梗塞、皮肤溃疡和坏疽的形成。患者还常常在受影响关节上面的皮下组织中形成类风湿性节结；晚期的节结具有由混合的炎性细胞浸润物包围的坏死中心。可在RA中出现的其它表现包括：心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的间质性肺炎、干燥性角膜结膜炎和类风湿性节结。
幼发型慢性关节炎是一种慢性特发性炎性疾病，常常开始于16岁之前。其表型与RA有些相似；类风湿因子阳性的某些患者归入幼发型类风湿性关节炎。疾病细分为三种主要类别：少数关节的、多关节的和系统性的。关节炎可以是严重的，通常是破坏性的，并导致关节僵硬和生长迟缓。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变。
脊椎关节病是具有一些普遍临床特征且普遍与HLA-B27基因产物表达有关的一组紊乱。这些紊乱包括：强直性脊柱炎、莱特尔氏(Reiter)综合征（反应性关节炎）、与炎性肠病有关的关节炎、与银屑病相关的脊椎炎、幼发型脊椎关节病及无差别(undifferentiated)脊椎关节病。区别性特征包括具有或没有脊椎炎的骶髂关节炎；炎性不对称关节炎；与HLA-B27有关（血清学上定义的MHC I型HLA-B基因座的等位基因）；眼炎症；及与其它类风湿性疾病有关的自身抗体的缺乏。对于诱发疾病来说关键的最相关细胞是CD8+T淋巴细胞，靶向由MHC I型分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可与MHC I型等位基因HLA-B27反应，就像它是由MHC I型分子表达的外源肽。已有假设，HLA-B27的表位可能模拟细菌或其它微生物的抗原性表位，因此诱导CD8+T细胞应答。
系统性硬化（硬皮病）的病因学未知。疾病的特点是皮肤硬化；这可能是由活性炎性过程诱导的。硬皮病可以是局部的或系统性的；血管损坏是普遍的，而且微血管系统中的内皮细胞损伤是系统性硬化发展中的早期且重要的事件；血管损伤可能由免疫介导。皮肤损伤中存在单核细胞浸润物及在许多患者中存在抗核抗体暗示免疫学基础。ICAM-1常常在皮肤损伤中成纤维细胞的细胞表面上调，说明T细胞与这些细胞相互作用可能在疾病的发病机理中起作用。牵涉的其它器官包括：胃肠道：平滑肌萎缩和纤维化，导致异常蠕动/运动；肾：同中心内皮下内膜增生，影响小弓形和叶间动脉，从而降低肾皮质血流，导致蛋白尿、氮血症和高血压；骨骼肌：萎缩、间质性纤维化、炎症；肺：间质性肺炎和间质性纤维化；及心：收缩带坏死、疤痕化/纤维化。
特发性炎性肌病，包括皮肌炎、多肌炎和其它，是导致肌肉软弱的未知病因的慢性肌肉炎性紊乱。肌肉损伤/发炎常常是对称的和渐进的。自身抗体与大多数形式有关。这些肌炎特异性自身抗体针对并抑制牵涉蛋白质合成的成分、蛋白质和RNA的功能。
斯耶格伦氏
Figure BDA00003310730700641
综合征是由免疫介导的炎症及随后泪腺和唾液腺功能破坏引起的。该病可能与炎性结缔组织疾病有关或伴随着炎性结缔组织疾病。该病与针对Ro和La抗原的自身抗体生成有关，这两种抗原都是小RNA-蛋白质复合物。损害导致干燥性角膜结膜炎、口干燥、及其它表现或关联，包括胆汁性肝硬化、外周或感觉神经病和可触知的紫癜。
系统性血管炎包括这样的疾病，其中原发性损伤是炎症，后续对血管的损伤导致由受影响血管供应的组织缺血/坏死/变性，且在某些情况中最终导致终端器官功能障碍。血管炎病还可作为其它免疫-发炎介导疾病诸如类风湿性关节炎、系统性硬化等的继发损伤或后遗症发生，特别是在还与免疫复合物形成有关的疾病中。原发性系统性血管炎组中的疾病包括：系统性坏死性血管炎：节结性多动脉炎、过敏性血管炎和肉芽肿病、多脉管炎；韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞性动脉炎。各种各样的血管炎病包括：粘膜与皮肤淋巴结综合征（MLNS或川畸氏(Kawasaki)病）、分离的CNS血管炎、贝切特氏(Behet)病、血栓闭塞性血管炎（伯格氏(Buerger)病）和皮肤坏死性小静脉炎。所列大多数类型的血管炎的发病机理认为主要是由于免疫球蛋白复合物在血管壁中沉积及随后经ADCC、补体活化或者两者诱导的炎性应答。
节结病是病因学未知，特征在于几乎机体任何组织中都存在上皮样肉芽肿的状况；最常见的是牵涉肺。发病机理牵涉患病部位持续存在活化的巨噬细胞和淋巴样细胞及随后由这些细胞类型释放局部和系统性活性产物而导致的慢性后遗症。
自身免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血、免疫性全血细胞减少症和阵发性夜间血红蛋白尿，是由于生成与红细胞（和在有些情况中其它血细胞，包括血小板）表面表达的抗原反应的抗体的结果，是经补体介导的溶解和/或ADCC/Fc受体介导的机制去除那些抗体包被细胞的反映。
在自身免疫性血小板减少症，包括血小板减少性紫癜，和其它临床背景中免疫介导的血小板减少症中，由于抗体或补体附着于血小板及随后经补体溶解、ADCC或Fc受体介导的机制去除而发生血小板破坏/去除。
甲状腺炎，包括格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼发型淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，是由于针对甲状腺抗原的自身免疫应答及产生与存在于甲状腺中且通常对甲状腺特异的蛋白质反应的抗体。现有的实验模型包括自发性模型：大鼠（BUF和BB大鼠）和鸡（肥胖鸡品系）；可诱导模型：用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原（甲状腺过氧化物酶）免疫动物。
I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛β细胞的自身免疫性破坏；该破坏由自身抗体和自身反应性T细胞介导。胰岛素或胰岛素受体的抗体也可产生胰岛素不响应的表型。
免疫介导的肾病，包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎，是由于抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织的损伤，或是直接由于生成针对肾抗原的自身反应性抗体或T细胞，或是间接由于针对其它非肾抗原有反应性的抗体和/或免疫复合物在肾中沉积。因此，导致免疫复合物形成的其它免疫介导的疾病也可作为间接后遗症诱导免疫介导的肾病。直接和间接的免疫机制都导致炎性应答，它在肾组织中产生/诱导损伤形成，导致器官功能受损，在有些情况中发展成肾衰竭。体液和细胞两种免疫机制都可牵涉损伤的发病机理。
中枢和周围神经系统的脱髓鞘病，包括多发性硬化；特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征；和慢性炎性脱髓鞘多神经病，认为具有自身免疫基础，而且由于对少突胶质细胞或对髓鳞脂直接造成损害而导致神经脱髓鞘。在MS中，有证据表明该病的诱导和发展依赖T淋巴细胞。多发性硬化是依赖T淋巴细胞的炎性脱髓鞘病，而且具有复发－缓和过程或漫长的渐进过程。病因未知；然而，病毒感染、遗传恶病质、环境和自身免疫性都会起作用。损伤含有主要由T淋巴细胞介导的浸润物、小胶质细胞和浸润的巨噬细胞；CD4+T淋巴细胞是损伤处的主要细胞类型。少突胶质细胞死亡和随后脱髓鞘的机理未知，但是可能是由T淋巴细胞驱动的。
炎性和纤维化肺病，包括嗜曙红细胞性肺炎；特发性肺纤维化和超敏性肺炎，可能牵涉不受调控的免疫-发炎应答。抑制该应答将具有治疗益处。
自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎，由自身抗体介导，其发生依赖T淋巴细胞。
银屑病是T淋巴细胞介导的炎性疾病。损伤含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加工细胞，及一些嗜中性粒细胞的浸润物。
变应性疾病，包括哮喘；变应性鼻炎；特应性皮炎；食物超敏性；和荨麻疹，依赖T淋巴细胞。这些疾病主要由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或二者组合介导。
移植相关疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，依赖T淋巴细胞；抑制T淋巴细胞功能具有改善作用。
6.治疗方法
为了预防、治疗或降低补体相关（免疫相关）疾病的严重程度，本发明化合物的适宜剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、药剂是为了预防还是治疗目的施用的、先前的疗法、患者的临床史和对化合物的响应、及主治医师的判断。一次性或通过一系列治疗将化合物合适的施用于患者。优选的是，希望在人体测试前首先在体外，然后在有用的动物模型中测定本发明药用组合物的剂量-响应曲线。
例如，根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至15mg/kg（如0.1-20mg/kg）多肽，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
本发明的化合物在用于预防或治疗眼疾病或状况时通常通过眼、眼内、和/或玻璃体内注射来施用。也可使用的其它施用方法包括但不限于局部、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和损伤内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
用于眼、眼内或玻璃体内施用的配制剂可使用本领域已知的方法和成分来制备。有效治疗的一项主要要求是正确渗透穿过眼。与眼前部的疾病（在那里药物可局部投递）不同，视网膜疾病要求更加部位特异的方法。滴眼剂和软膏剂很少渗透眼后部，而且血-眼屏障阻碍系统施用的药物渗透到眼组织中。因此，选择用于药物投递以治疗视网膜疾病，诸如AMD和CNV的方法通常是直接玻璃体内注射。根据患者的状况及所投递药物的特性和半衰期，玻璃体内注射通常以一定间隔重复。为了眼内（例如玻璃体内）渗透，通常优选较小的分子。在CRIg的情况中，所有形式，包括huCRIg短型和长型的ECD及其Ig(Fc)融合物、全长huCRIg长型和短型及其Ig(Fc)融合物，都适于眼内（包括玻璃体内）投递。
补体相关眼状况，诸如AMD或CNV，的治疗功效可通过评估眼内疾病中常用的多个终点来测量。例如，可评估视力损失。视力损失可通过但不限于例如下列各项来评估：测量自基线至预期时间点最佳矫正视力(BCVA)的平均变化（例如在BCVA基于早期处理糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)视力检查表和以4米测试距离评估）；测量在预期时间点与基线相比视力丧失少于15个字母的受试者的比例；测量在预期时间点与基线相比视力获得超过或等于15个字母的受试者的比例；测量在预期时间点Snellen视力相当于20/2000或更差的受试者的比例；测量NEI视觉功能问卷(VisualFunctioning Questionnaire)；测量预期时间点CNV的大小和CNV渗漏的量，例如通过荧光素血管造影术；等。可进行眼评估，例如包括但不限于例如进行眼检查，测量眼内压，评估视力，测量裂隙灯压(slitlamp pressure)，评估眼内炎症，等。
CRIg拮抗剂，诸如CRIg的抗体，可用于治疗肿瘤（癌）的免疫辅助疗法。现在完全确立了T细胞识别人肿瘤特异抗原。由MAGE、BAGE和GAGE基因家族编码的一组肿瘤抗原在所有成人正常组织中是沉默的，但在肿瘤，诸如黑素瘤、肺肿瘤、头和颈肿瘤、和膀胱癌中以显著量表达。DeSmet,C.etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7149(1996)。已经显示出T细胞的共刺激在体外和在体内都诱导肿瘤消退和抗肿瘤应答。Melero,I.et al,Nature Medicine3:682(1997);Kwon,E.D.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:8099(1997);Lynch,D.H.et al,Nature Medicine 3:625(1997);Finn,O.J.and Lotze,M.T.,J.Immunol.21:114(1998)。本发明的CRIg拮抗剂可作为佐剂单独施用或联合生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂以刺激T细胞增殖/激活和对肿瘤抗原的抗肿瘤应答。生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂可以使用已知施用方案以常规量施用。本发明CRIg拮抗剂的免疫刺激活性容许降低生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂的量，由此潜在降低对患者的毒性。
尽管有些巨噬细胞牵涉肿瘤根除，然而许多实体瘤已知包含支持肿瘤生长的巨噬细胞(Bingle et al.,J Pathol 196:254-265(2002);Mantovani et al.,Trends Immunol 23:549-555(2002))。这些巨噬细胞可在其表面上包含CRIg。阻断CRIg抑制补体激活能力的抗体可用于活化肿瘤细胞上的补体并经由补体介导的溶解来帮助根除肿瘤。此方法将在包含CRIg阳性巨噬细胞的肿瘤中特别有用。
在本发明的治疗方法中，本文中的组合物可联合一种或多种用于预防或治疗目标疾病或状况的其它治疗形式。因此，例如，如果目标是预防或治疗补体相关眼状况，那么CRIg（包括所有形式及其EC区和/或Ig融合物）的施用可联合或补充抗VEGF-A抗体ranibizumab(LucenitisTM,Genentech,Inc.)的施用，它正在AMD治疗的临床开发中。在最近结束的一项III期临床试验中，除了在患有湿性AMD的患者中达到了研究的主要功效终点，维持视力，根据糖尿病性视网膜病变早期处理(ETDRS)视力检查表的测量，25%(59/238)用0.3mg LucentisTM处理的患者和34%(81/240)用0.5mg LucentisTM处理的患者视力得到改善，增加了15个字母或更多，比较而言对照组的患者只有约5%(11/238)。差不多40%(188/478)用LucentisTM处理的患者在12个月时达到视力得分20/40或更好，比较而言对照组只有11%(26/238)。在12个月时，与加入研究时的视力相比，用LucentisTM处理的患者平均得到7个字母，而对照组患者平均丢失10.5个字母。
如果目标是治疗补体相关炎性或自身免疫性疾病，CRIg（包括所有形式）的施用可联合用于此类适应症的其它疗法。因此，例如，如果目标是类风湿性关节炎(RA)，可联合其它关节炎药物，诸如水杨酸盐/酯(salicialates)（例如阿司匹林）、传统非类固醇抗炎分子(NSAIDs)（诸如例如Asaid、奥斯克(Arthrotec)、凯扶兰(Cataflam)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)等）、COX-2抑制剂（例如Celebrex、Vioxx）。在此语境中，“联合”指同时施用或任意次序的顺序施用，而且可以是任何剂量形式，相同或不同的投递路径。
7.筛选测定法和动物模型
CRIg和CRIg激动剂，包括CRIg和CRIg ECD的Ig融合物，可在补体相关疾病或紊乱的多种基于细胞的测定法和动物模型中评估。
因此，例如，在预防和/或治疗关节炎中的功效可在胶原诱发的关节炎模型（Terato et al.Brit.J.Rheum.35:828-838(1966))中如下文实施例7所示评估。潜在的关节炎预防剂/治疗剂还可在通过静脉内注射四种单克隆抗体的混合物诱发的抗体介导的关节炎模型中筛选，如Terato et al.,J.Immunol.148:2103-8(1992);Terato et al.,Autoimmunity22:137-47(1995);和下文实施例8所述。用于预防和/或治疗关节炎的候选物还可在转基因动物模型中研究，诸如例如TNF-α转基因小鼠(Taconic)。这些动物表达人肿瘤坏死因子(TNF-α)，一种已经牵连人的类风湿性关节炎发病机制的细胞因子。TNF-α在这些小鼠中的表达导致前爪和后爪的严重慢性关节炎，提供了简单的炎性关节炎小鼠模型。
最近几年，还已开发出银屑病动物模型。因此，无皮脂(Asebia)(ab)、皮肤薄而易剥落(fsn)、和慢性增殖性皮炎(cpd)是具有银屑病样皮肤改变的自发性小鼠突变。皮肤过表达细胞因子，诸如干扰素-γ、白介素-1α、角质形成细胞生长因子、转化生长因子-α、干扰素-6、血管内皮生长因子或骨形态发生蛋白-6的转基因小鼠也可用于在体内研究银屑病和鉴定治疗银屑病的治疗剂。银屑病样损伤还描述于与PL/J品系回交的β2-整联蛋白亚效等位基因小鼠和β1-整联蛋白转基因小鼠、用CD4+/CD45RBhi T淋巴细胞重建的scid/scid小鼠、以及HLA-B27/hβ2m转基因大鼠。还知道使用人皮肤移植到免疫缺陷小鼠上的异种移植模型。因此，本发明的化合物可在Schon,M.P.etal,Nat.Med.3:183(1997)所述scid/scid小鼠模型中测试，其中小鼠展示与银屑病类似的组织病理学皮肤损伤。另一种合适的模型是如Nickoloff,B.J.etal.,Am.J.Path.146:580(1995)所述制备的人皮肤/scid小鼠嵌合物。更多详情参见例如Schon,M.P.,J Invest Dermatology112:405-410(1999)。
重组（转基因）动物模型可使用用于生成转基因动物的标准技术通过将目的基因的编码部分导入目的动物的基因组来改造。可充当转基因操作对象的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类动物，例如狒狒、黑猩猩和其它猴类。本领域已知的用于将转基因导入此类动物的技术包括原核显微注射(pronucleic microinjection)(Hoppe and Wanger,美国专利4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转移进入种系(例如Van derPutten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6148-615(1985))；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson et al.,Cell56:313-321(1989))；胚胎电穿孔(Lo,Mol.Cell.Biol.3:1803-1814(1983))；精子介导的基因转移(Lavitrano et al.,Cell57:717-73(1989))。综述参见例如美国专利4,736,866。
为了本发明的目的，转基因动物包括那些只在其部分细胞中携带转基因的动物(“镶嵌动物”)。转基因可作为单一转基因或者串联物例如头-头或头-尾串联物整合。还可能如下将转基因选择性导入特定细胞类型，例如Lasko etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:623-636(1992)的技术。
转基因在转基因动物中的表达可通过标准技术来监测。例如，Southern印迹分析或PCR扩增可用于验证转基因的整合。然后可使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学等技术分析mRNA表达水平。
动物可进一步检验免疫病病理学的征候，例如通过组织学检验以测定免疫细胞是否浸润到特定组织中。还可进行阻断实验，其中用CRIg或候选激动剂处理转基因动物以测定对补体和补体激活，包括经典和旁路途径，或者T细胞增殖的影响程度。在这些实验中，将结合本发明多肽的阻断性抗体施用于动物并监测感兴趣的生物学效果。
或者，作为编码CRIg多肽的内源基因和导入动物胚胎细胞的编码相同多肽的改变的基因组DNA之间同源重组的结果，可构建具有缺陷的或改变的编码CRIg的基因的“敲除”动物。例如，编码CRIg的cDNA可用于依照已建立的技术克隆编码CRIg的基因组DNA。编码CRIg的基因组DNA的一部分可删除或用另一基因，诸如编码可用于监测整合的选择标志的基因的替换。通常，在载体中包含几千碱基未改变的侧翼DNA（5'和3'末端都有）(同源重组载体的描述参见例如Thomas and Capecchi,Cell51:503(1987))。将载体导入胚胎干细胞系（例如通过电穿孔），并选择其中导入的DNA与内源DNA发生同源重组的细胞(参见例如Li et al.,Cell69:915(1992))。然后将选择的细胞注射到动物（例如小鼠或大鼠）的胚泡中以形成聚集嵌合物(参见例如Bradley,in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell:A PracticalApproach,E.J.Robertson,ed.(IRL,Oxford,1987),pp.113-152)。然后可将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎足月生产以产生“敲除”动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以通过例如由于缺乏CRIg多肽而防御某些病理状况的能力和形成病理状况来表征。
因此，CRIg或其潜在激动剂的生物学活性可在鼠CRIg敲除小鼠中进一步研究，如下文实施例7所述。
已经描述了一种哮喘模型，其中通过用卵清蛋白使动物敏化，然后用通过气雾剂投递的相同蛋白质对动物挑战而诱导抗原诱发的气道高反应性、肺嗜曙红细胞增多和炎症。几种动物模型（豚鼠、大鼠、非人灵长类动物）在用气雾剂抗原挑战后显示与人的特应性哮喘相似的症状。鼠模型具有人哮喘的许多特征。测试CRIg和CRIg激动剂在治疗哮喘中的活性和效力的合适流程记载于Wolyniec,W.W.et al.,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.18:777(1998)及其引用的参考文献。
接触超敏感性是细胞介导的免疫功能的一种简单的体内测定法。在此流程中，使表皮细胞暴露于外源半抗原，它引起迟发型超敏感性反应，对此测量和定量。接触超敏感性牵涉初始敏化阶段，随后是引发阶段。引发阶段在表皮细胞遭遇它们先前已经接触过的抗原时发生。发生肿胀和发炎，使之成为人过敏性接触性皮炎的卓越模型。一种合适的流程详细记载于CurrentProtocols in Immunology,Eds.J.E.Cologan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,John Wiley & Sons,Inc.,1994,unit4.2。还可参见Grabbe,S.and Schwarz,T.,Immun.Today19(1):37-44(1998).
移植物抗宿主病在将免疫活性细胞移植到免疫遏制或耐受的患者中时发生。供体细胞识别和响应宿主抗原。应答可从危及生命的严重炎症至腹泻和体重减轻的轻微病例变化。移植物抗宿主病模型提供了评估T细胞针对MHC抗原和次要移植抗原的反应性的一种手段。一种合适的流程详细记载于Current Protocols in Immunology,见上文,unit4.3。
皮肤同种移植物排斥的一种动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏能力的一种手段，这是它们在抗病毒和肿瘤免疫中的角色的指示和度量。最常用和承认的模型使用鼠尾皮肤移植物。重复实验显示出皮肤同种移植物排斥是由T细胞、辅助T细胞和杀伤-效应T细胞而非抗体介导的。Auchincloss,H.Jr.and Sachs,D.H.,Fundamental Immunology,2nd ed.,W.E.Paul ed.,Raven Press,NY,1989,889-992。一种合适的流程详细记载于Current Protocolsin Immunology,见上文,unit4.4。可用于测试CRIg和CRIg激动剂的其它移植排斥模型有Tanabe,M.et al.,Transplantation58:23(1994)和Tinubu,S.A.etal.,J.Immunol.4330-4338(1994)描述的同种心移植模型。
迟发型超敏感性的动物模型同样提供了细胞介导的免疫功能的测定法。迟发型超敏感性反应是T细胞介导的体内免疫应答，特征为在抗原挑战后一段时间流逝后才达到峰值的炎症。这些反应也在组织特异性自身免疫病中发生，诸如多发性硬化(MS)和实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE,MS的一种模型)。一种合适的流程详细记载于Current Protocols in Immunology,见上文,unit4.5。
EAE是T细胞介导的自身免疫病，特征为T细胞和单核细胞炎症和随后中枢神经系统中轴突的脱髓鞘。EAE通常认为是人MS的相关动物模型。Bolton,C.,Multiple Sclerosis1:143(1995)。急性和复发-缓和两种模型都已开发。CRIg及其激动剂和拮抗剂可针对免疫介导的脱髓鞘病测试T细胞刺激性或抑制性活性，使用Current Protocols in Immunology,见上文,units15.1和15.2中所述方案。还可参见髓磷脂疾病的模型，其中将少突胶质细胞或施旺(Schwann)细胞移植到中枢神经系统中，如Duncan,I.D.et al.,Molec.Med.Today 554-561(1997)所述。
年龄相关黄斑变性(AMD)的一种动物模型由具有Ccl-2或Ccr-2基因无效突变的小鼠组成。这些小鼠形成AMD的主要特征，包括视网膜色素上皮(RPE)中积聚脂褐质和下面积聚玻璃疣、光受体萎缩和脉络膜新血管形成(CNV)。这些特征晚于6月龄形成。可对CRIg和CRIg激动剂测试玻璃疣形成、光受体萎缩和脉络膜新血管形成。
CNV可在多种激光诱发的脉络膜新血管形成模型中测试。因此，例如，可在大鼠和猕猴中通过导致脉络膜新血管形成的强烈激光光凝固而诱导CNV。此状况的发展和治疗可例如通过荧光素血管造影术，组织学和免疫组化评估，及治疗前和治疗后以不同时间间隔从动物采集的血清的药动学、溶血、抗体筛选和补体活化测定法来评估。预防性施用的功效可通过类似方法来监测，包括通过荧光素血管造影术监测血管渗漏、激光烧伤部位对补体沉积的抑制、眼检查、眼摄影术、收集玻璃体和视网膜组织、等等。下文实施例提供了更多详情。
心肌缺血-再灌注的模型可在小鼠或大鼠中进行。将动物切开气管并用小型动物通风机换气。将聚乙烯导管置于颈内动脉和颈外静脉中供测量平均动脉血压。通过用6-O缝合线结扎左前降支动脉(LAD)来启动心肌缺血再灌注。缺血是通过扎紧围绕LAD的可逆结扎以完全闭塞血管而产生的。30分钟后除去结扎，并对心灌注4小时。CRIg和CRIg激动剂的功效可通过测量心梗塞大小、心肌氨酸激酶活性、髓过氧化物酶活性和使用抗C3抗体的免疫组化来测试。
糖尿病性视网膜病变的一种模型牵涉用链唑霉素(streptozotocin)处理小鼠或大鼠。可对CRIg和CRIg激动剂测试它们对视网膜和玻璃体腔微静脉膨胀(venule dilatation)、视网膜内微血管异常和新血管形成的影响。
膜性增生性肾小球肾炎的一种模型可如下确立：将雌性小鼠i.p.免疫CFA中的0.5mg对照兔IgG（第-7天）。七天后（第0天），经尾静脉i.v.注射1mg兔抗小鼠肾小球基底膜(GBM)抗体。通过ELISA测量抗兔IgG抗体在血清中的升高。从代谢笼中的小鼠收集24小时尿样，并通过在血液尿素氮之外测量尿蛋白来评估小鼠肾功能。
药用组合物
本发明的活性分子，包括多肽及其激动剂，以及通过上文公开的筛选测定法鉴定的其它分子，可以药用组合物的形式施用以治疗炎性疾病。
本发明的活性分子，优选CRIg多肽或CRIg激动剂的治疗用配制剂如下制备供贮存，即以冻干剂型或水溶液的形式，将具有期望纯度的活性分子与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington'sPharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.,1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
通过本发明的筛选测定法鉴定的化合物可使用本领域众所周知的标准技术以类似方式配制。
脂转染或脂质体也可用于将多肽、抗体或抗体片段投递到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小片段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶蛋白质序列的能力的肽分子。此类肽可化学合成，和/或通过重组DNA技术生成(参见例如Marasco et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7893(1993))。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选彼此活性互补且没有不利影响的。或者/另外，组合物可含有细胞毒剂、细胞因子或生长抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性分子还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物投递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences,16th edition,Osol,A.Ed.,(1980)。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。
对于眼内施用，通常使用注射配制剂，通常相隔约六周给药。眼在每次注射前麻醉。
然而，也有可能使用具有CRIg或激动剂，诸如CRIg-Ig或CRIg ECD-Ig融合物的持续释放配制剂的植入物，用于玻璃体内释放。
提供下面的实施例只是为了例示目的，并非意图以任何方式限制本发明的范围。
在此明确收入本说明书中引用的所有专利和参考文献的全文作为参考。
实施例
除另有说明外，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实施例和整篇说明书中以ATCC编号鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection,10801 UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209）。
实施例1：编码人CRIg(PRO362)的cDNA克隆的分离
使用Swiss-Prot公用蛋白质数据库中的约950种已知的分泌型蛋白质的胞外结构域(ECD)序列（包括分泌信号，如果有的话）检索表达序列标签(EST)数据库。EST数据库包括公用的EST数据库（例如GenBank）和私有的ESTDNA数据库（
Figure BDA00003310730700751
Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto,CA）。检索使用计算机程序BLAST或BLAST-2（例如Altshul et al.,Methods in Enzymology266:460-480(1996)），将ECD蛋白质序列与EST序列的6种阅读框翻译结果进行比较。将BLAST得分为70（或在有些情况中为90）或更高但不编码已知蛋白质的比较用程序“phrap”（Phil Green,University of Washington,Seattle,Washington）簇集并装配成共有DNA序列。
共有DNA序列是相对于其它EST序列使用phrap装配出的。该共有序列在本文中称为DNA42257(SEQ ID NO:9)(见图32)。根据图32所示DNA42257(SEQ ID NO:9)共有序列，合成寡核苷酸：1)以通过PCR鉴定包含目的序列的cDNA文库，和2)作为探针用于分离CRIg的全长编码序列的克隆。正向和反向PCR引物的范围通常是20-30个核苷酸，常常设计成产生长约100-1000bp的PCR产物。探针序列通常长40-55bp。在有些情况中，当共有序列大于约1-1.5kbp时，合成另外的寡核苷酸。为了对几个文库筛选全长克隆，依照Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology，通过PCR扩增用PCR引物对筛选来自文库的DNA。然后使用探针寡核苷酸和引物对之一，将阳性文库用于分离编码目的基因的克隆。
合成PCR引物（正向和反向）：
正向PCR引物1(42257.f1)
5’-TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG-3’(SEQ ID NO:10)；
正向PCR引物2(42257.f2)
5’-GTCGGAAGACATCCCAACAAG-3’(SEQ ID NO:11)；
反向PCR引物1(42257.r1)
5’-CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC-3’(SEQ ID NO:12)；
反向PCR引物2(42257.r2)
5’-AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC-3’(SEQ ID NO:13)。
另外，根据DNA42257共有序列构建具有如下核苷酸序列的合成寡核苷酸杂交探针：
杂交探针(42257.p1)
5’-TGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGAT-3’(SEQ ID NO:14)。
为了对数个文库筛选全长克隆的来源，用上文所述PCR引物对通过PCR扩增筛选来自文库的DNA。然后使用探针寡核苷酸和PCR引物之一，将阳性文库用于分离编码CRIg基因的克隆。
从人胎脑组织(LIB153)分离RNA用于构建cDNA文库。用于分离cDNA克隆的cDNA文库是通过标准方法使用商品化试剂（诸如购自Invitrogen,SanDiego,CA）构建的。将cDNA用含NotI位点的寡dT引发，与SalI半磷酸化(hemikinased)衔接头以平端连接，用NotI切割，通过凝胶电泳恰当分离，并以限定取向克隆到合适的克隆载体（诸如pRKB或pRKD;pRK5B是不含SfiI位点的pRK5D前体;参见Holmes et al.,Science253:1278-1280(1991)）的唯一XhoI和NotI位点间。
对如上所述分离的克隆进行DNA测序，得到分离的CRIg多肽的DNA序列（本文中称为UNQ317(DNA45416-1251)(SEQ ID NO:1)）。
图1A-1B(SEQ ID NO:1)显示了UNQ317(DNA45416-1251)的完整核苷酸序列。克隆UNQ367(DNA45416-1251)(SEQ ID NO:1)含单一可读框，表观翻译起始位点位于核苷酸第1082-1084位(图1A-1B,SEQ ID NO:1)。预测多肽前体长321个氨基酸(图1A-1B,SEQ ID NO:2)。图1A-1B所示CRIg蛋白质具有估算分子量约35,544道尔顿，pI约8.51。对图1A-1B(SEQ ID NO:2)所示321个氨基酸的CRIg多肽的分析证明，在约第149位氨基酸至约第152位氨基酸处存在糖胺聚糖附着位点，约第276位氨基酸至约第306位氨基酸为跨膜结构域。克隆UNQ317(DNA45416-1251)已经保藏，ATCC保藏号为209620。
与JAM家族成员类似，CRIg(PRO362)，最近称为CRIg，是1型跨膜分子，免疫球蛋白超家族的成员。长型人CRIg(huCRIg(L))的胞外结构域编码V和C2型末端Ig结构域二者(Smith and Xue,J.Mol.Biol.274:530-545(1997))，而短型(huCRIg(S))只编码单一V型Ig，类似于鼠CRIg(muCRIg)(图50,A)。人和鼠CRIg的C末端胞质结构域都包含共有AP-2内在化基序（分别为YARL和DSQALI，Bonafacino&Traub,Ann Rev Biochem72:395(2003)）。HuCRIg和muCRIg共享67%的整体序列同源性，IgV结构域中存在83%的同源性。在JAM家族成员中，huCRIg与JAM-A最紧密相关。序列相似性限于形成Ig结构域折叠的一段保守残基(图50,A)。人和鼠CRIg都位于X染色体Xq12位置上，在该染色体上具有同线(syntenic)位置，侧翼为膜铁转运辅助蛋白(hephaestin)和膜突蛋白。
实施例2：蛋白质的制备和纯化
将hu和muCRIg的胞外结构域克隆到经过修改的pRK5表达载体中，在CRIg序列下游编码人或鼠IgG1Fc区。鼠IgG1的Fc部分包含双重突变(D265A,N297A)，防止Fc受体结合(Gong et al.,J.Immunol.174:817-826(2005))，用于控制Fc受体调节。使用人IREM-1和小鼠CLM-1Fc融合蛋白或者鼠抗gp120IgG抗体作为对照。通过将CRIg的ECD与酵母亮氨酸拉链、Flag及C-末端(6)组氨酸融合，制得LFH标记的CRIg。通过瞬时转染使蛋白质在CHO细胞中过表达。在全自动生物反应器中培养细胞，使用以F-12/Dulbecco氏改良Eagle氏培养基为基础添加了Ultra-Low IgG血清(Invitrogen)和Primatone HS(Sigma)的培养基。将培养维持7-12天直至收获。Fc融合蛋白通过蛋白A亲和层析然后Sephacryl S-300凝胶过滤来纯化。LFH融合蛋白在镍柱上纯化。人CRIg-ECD蛋白在吸附有单克隆抗体3C9的Millipore Glyceryl-CPG(173700404)柱上亲和纯化。蛋白质在pH3.0洗脱。hu和muCRIg-HIS如下制备：将CRIg ECD克隆到含C-末端(6)组氨酸的杆状病毒表达载体中。将质粒DNA转染到Sf9细胞中，用上清液感染H5细胞，蛋白质在镍柱上纯化。所有纯化后蛋白质的鉴定通过N-末端序列分析确认，所有人或鼠CRIg制备物的脂多糖浓度<5Eu/mg。
实施例3：抗体的制备
多克隆抗体如下制备：用完全氟氏佐剂中的200μg huCRIg(L)-His免疫新西兰兔，首次免疫后6周加强免疫。muCRIg和huCRIg的单克隆抗体如下制备：通过爪垫注射用50μg his标记的CRIg融合蛋白免疫Wistar大鼠和Balb/c小鼠。通过ELISA、FACS、Western印迹和免疫组织化学，根据与人和鼠CRIg-ECD的反应性选择克隆。除另有说明外，将获得的抗体用于后续测试。
实施例4：炎性细胞浸润到豚鼠皮肤中
下列实施例显示，huCRIg(PRO362)是促炎性的，即它刺激炎性细胞（即噬中性细胞、噬曙红细胞、单核细胞或淋巴细胞）浸润到豚鼠皮肤中。本文所述测定法监测此蛋白质诱导炎性细胞浸润到豚鼠皮肤中的能力。刺激炎性浸润的化合物在增强炎性反应有益的治疗中是有用的。抑制淋巴细胞增殖的化合物在抑制炎性反应有益的治疗中是有用的。治疗剂可采用例如针对CRIg的鼠-人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，模拟CRIg生物学活性的小分子、肽等，CRIg-Ig融合蛋白，CRIg胞外区，等等的形式。
将重350克或更重的无毛豚鼠(Charles River Labs)通过肌肉内注射氯胺酮(ketamine)(75-80mg/kg体重)和赛拉嗪(xylazine)(5mg/kg体重)麻醉。将huCRIg和对照蛋白质的蛋白质样品皮内注射到每只动物的背部中，每个注射点100μl体积。每只动物约16-24个注射点。心脏内注射1mL伊文思蓝(Evans blue)染料(以1%溶于生理缓冲盐水)。6小时后将动物安乐死，每一处皮肤注射点做活组织检查，在福尔马林中固定。皮肤经处理供组织病理学评估。对个点评估炎性细胞浸润到皮肤中的情况。有可见炎性细胞的点评为阳性。诱导炎性细胞浸润的样品评为促炎性物质。CRIg在此测定法中测试为阳性，表明抗炎活性。
实施例5：CRIg(PRO362)mRNA和多肽的表达
A.原位杂交和免疫组化
通过原位杂交、免疫组化和RT-PCR评估多种类型组织中CRIg mRNA的表达。
就原位杂交而言，将组织固定(4%福尔马林)，石蜡包埋，切片(3-5μm厚)，脱石蜡，用蛋白酶K(20μg/ml)脱蛋白(15分钟，37°C)，并处理供原位杂交。通过PCR制备本发明多肽的探针。引物包含T7或T3RNA聚合酶起始位点，从而容许在体外从扩增产物转录有义或反义探针。33P-UTP标记的有义和反义探针杂交过夜(55°C)，洗涤(0.1X SSC，55°C，2小时)，浸入NBT2核通道乳剂(Eastman Kodak,Rochester,NY)，曝光(4°C，4-6周)，显影，并用苏木精和曙红复染。通常出现代表性的成对的亮暗图像。
使用DAKO自动染色仪对5mm厚冰冻切片进行免疫组化染色。用Kirkegaard和Perry封闭液(1:10，4分钟，20°C)阻断内源性过氧化物酶活性。TBS/0.05%Tween-20(DAKO)中的10%NGS用于稀释和封闭。MAb 4F7.22.2抗CRIg(抗PRO362)或小鼠IgG以0.13mg/ml使用。生物素化山羊抗小鼠IgG(Vector Labs,Burlingame,CA)以1:200使用，用Vector Labs Standard ABC Elite试剂盒(Vector Labs,Burlingame,CA)检测。载玻片用Pierce金属增强的二氨基联苯胺(Pierce Chemicals,Rockford,IL)显色。在冰冻切片上进行CRIg(PRO362)和CD68表达的双重免疫组化，以显现CRIg表达对于巨噬细胞的定位。使用mAb4F7.22.2抗CRIg和购自DAKO的抗CD68mAb KP-1，分别通过藻红蛋白和FITC标志物检测。
在人和其它动物的很多种组织和细胞类型中检验了表达情况。
a.正常组织
检验的正常成人组织包括扁桃体、淋巴结、脾、肾、膀胱、肺、心、主动脉、冠状动脉、肝、胆囊、前列腺、胃、小肠、结肠、胰、甲状腺、皮肤、肾上腺、胎盘、子宫、卵巢、睾丸、视网膜和脑(小脑、脑干、大脑皮层)。还检验了正常人胎组织，包括E12-E16周龄脑、脾、肠和甲状腺。此外，还调查了鼠肝中的表达情况。
b.发炎组织
通过原位杂交检验的发炎组织包括患有慢性炎性疾病的组织，例如患有慢性哮喘、慢性支气管肺炎、慢性支气管炎／慢性慢性阻塞性肺病的肺，患有慢性淋巴细胞间质性肾炎的肾，和患有因慢性丙型肝炎感染、自身免疫性肝炎或酒精性肝硬化引发的慢性炎症和硬化的肝。
c.原发瘤(Primary Neoplasms)
通过原位杂交检验PRO362表达的原发人瘤包括乳癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、前列腺腺癌和结肠腺癌。
2.结果
发现CRIg(PRO362)在小鼠肝冰冻切片(图6)、人肝冰冻切片(图7)和多种组织巨噬细胞样细胞中表达，所述巨噬细胞样细胞包括结肠巨噬细胞(图8,A)、Kupffer细胞(图8,B)、肾上腺巨噬细胞(图8,C)、Hofbauer细胞(图8,D)、滑膜细胞(图9)、胚泡(alveolar)巨噬细胞、肠固有层中的驻留巨噬细胞及多种组织中的间质巨噬细胞。CRIg还在脑小胶质中显著表达(图10)。在存在瘤或炎性疾病而激活时，这些组织中的CRIg表达显著升高，所述炎性疾病包括类风湿性关节炎(图9)、炎性肠病、慢性肝炎(图12)、肺炎、慢性哮喘(图11)、神经胶质瘤和支气管炎。
为了进一步检验CRIg表达，对多种组织类型进行免疫组化染色。对组织巨噬细胞，包括肾上腺巨噬细胞、肝Kupffer细胞、脑小胶质细胞和胎盘Hofbauer细胞，进行CRIg和CD68的双重免疫组化染色，以测定CRIg和CD68是否在同一组织中表达。
发现CRIg与CD68在肾上腺巨噬细胞(图13)、肝Kupffer细胞(图14)、脑小胶质细胞(图15)和胎盘Hofbauer细胞(图16)中共表达。
实施例6：CRIg(PRO362)牵涉慢性炎症
如实施例1和下文所述，克隆与A33抗原和JAM1具有同源性的新型巨噬细胞相关受体，并鉴定为单一跨膜Ig超家族成员巨噬细胞相关多肽(CRIg或PRO362)。
CRIg表达为两种剪接变体。一种变体为399个氨基酸的多肽，包含N-末端IgV样结构域和C-末端IgC2样结构域，称为huCRIg或huCRIg-长(SEQID NO:4)。长355个氨基酸、缺少C-末端结构域的剪接形式称为huCRIg-短(SEQ ID NO:6)。两种受体都具有单一跨膜结构域和胞质结构域，后者包含在体外在巨噬细胞中组成性磷酸化的酪氨酸残基。
本研究证明了CRIg在驻留组织的巨噬细胞子集中选择性表达，而且与慢性炎症有关。
材料和方法
细胞
在知情同意后，从健康的成人志愿者静脉穿刺取血，使用Ficoll-PaquePLUS(Amersham Pharmacia Biotech)按照制造商的说明书分离。从界面获取PBMC，用冷PBS洗涤，用0.2%NaCl溶解30秒，用1.6%NaCl中和。细胞计数，保存在冰上直至使用。为了分离外周血子集，按照制造商的说明书使用未开封的MACS试剂盒(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)。通过将CD14+单核细胞在含10%(v/v)自体人血清、20%胎牛血清和10mM l-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的HG-DMEM培养基中培养可长达2周，诱导向巨噬细胞表型的分化。第5天更换培养基。为了流式细胞术分析，使用冰冷的细胞解离液(Sigma)使细胞从培养皿解离。通过向孔中直接添加0.5ml裂解缓冲液，制备用于Western印迹分析的裂解物。将裂解物与含有SDS和β-巯基乙醇的样品缓冲液混合，在Tris-甘氨酸凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素膜。通过锥虫蓝排除试验，评估细胞存活力。
流式细胞术
用于流式细胞术分析的细胞用含2%胎牛血清和5μg/ml人IgG(Calbiochem,San Diego,CA)的PBS于4℃封闭30分钟。接着，将细胞与抗CRIg(抗PRO362)单克隆抗体3C9一起温育。用PBS洗涤后，将细胞用偶联有藻红蛋白(PE)的CD11b、CD14、CD163、CD15、CD68抗体(Pharmingen)染色。
细胞-细胞粘附研究
使含全长CRIg的pRK表达载体在人Jurkat T细胞系中稳定表达，如其它地方所述使用新霉素选择和自动克隆(autoclone)分选。给细胞预加载荧光染料BCECF(Molecular Probes,Oregon)，加到包被有经过或未经10ng/mlTNFα处理的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层的96孔Maxisorb板(CORNINGTM)中。如下温和洗涤细胞：向孔中加入温育缓冲液（含10mMCaCl、10mM镁和1.5mM NaCl的HBSS），接着将平板倒扣在一张吸水纸上。洗涤3次后，在荧光分光仪中进行荧光计数。荧光读数代表仍然粘附于HUVEC细胞的细胞数。
Northern印迹分析
使用Ambion试剂盒按照制造商的建议用随机引发全长CRIg cDNA的32P标记探针探查多个组织Northern印迹。将印迹于22°C对磷成像屏曝光4小时。切出印迹，用人或小鼠β-肌动蛋白的商品化探针(Clontech)再次探查，以评估每一道中的RNA负荷和数量，并用磷成像仪(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)分析。
实时RtPCR分析
对于定量PCR分析(TAQMANTM)，推荐来自人组织或原代细胞的总mRNA(100ng)(PerkinElmer Life Sciences)及基于CRIg编码序列的引物。
Fc和His融合蛋白的制备
将人CRIg克隆到杆状病毒表达载体pHIF(Pharmingen)中。HIS标记的CRIg融合蛋白由CRIg胞外结构域和8个组氨酸融合而成。使用镍亲和树脂，从悬浮培养的杆状病毒感染昆虫细胞的上清液纯化His标记的融合蛋白。
单克隆和多克隆抗体的制备
就本试验而言，通过爪垫注射用10μg CRIg-His8对雌性BALBc进行免疫和加强免疫，如先前Ghilardi et al.,J.Biol.Chem.277:16831-16836(2002)所述。通过ELISA筛选针对CRIg-His的单个克隆。针对JAM家族成员和人IgG Fc测试选择的克隆。将克隆滴定至单细胞密度，再次筛选。发现克隆3C9(IgG1)对CRIg有选择反应性。将克隆用于生成腹水并在蛋白G(Amersham Pharmacia Biotech)上纯化；使用Pierce BCA试剂(Pierce,Rockford,IL)测定蛋白质浓度。
通过给新西兰兔注射150μg CRIg-His，制备多克隆抗体。通过ELISA测定血清滴度。在循环IgG水平峰值时收集血清，在蛋白A柱上纯化。
原位杂交
设计PCR引物(在上5’-TCTCTGTCTCCAAGCCCACAG(SEQ ID NO:18)和在下5’-CTTTGAGGAGTCTTTGACC(SEQ ID NO:19))以扩增700bp的huJAM4片段。引物包含T7或T3RNA聚合酶起始位点，从而分别容许有义或反义探针在体外从扩增产物转录。正常成人组织包括扁桃体、淋巴结、脾、肾、肺和心。患有慢性炎性疾病的组织包括患有慢性哮喘、慢性支气管炎的肺，患有因慢性丙型肝炎感染引发的慢性炎症和硬化的肝。将组织在4%福尔马林中固定，石蜡包埋，切片(3-5μm厚)，脱石蜡，用20μg/ml蛋白酶K脱蛋白(15分钟，37°C)，并如其它地方所述处理供原位杂交。
免疫组化
人肝获自Ardais Corporation,Lexington,MA。免疫组化染色使用DAKO自动染色仪对5-6μm厚的冰冻肝切片进行。用Kirkegaard和Perry封闭液(1:10，4分钟，20°C)阻断内源性过氧化物酶活性。TBS/0.05% Tween-20中的10%正常山羊血清(NGS)用于稀释和封闭。Mab 3C9以1μg/ml使用。载玻片用Pierce金属增强的二氨基联苯胺(Pierce Chemicals)显影。
对于切片的免疫荧光染色，将切片用PBS/10%NGS封闭，与mAb 3C9一起于20°C温育1小时。使用偶联至FITS的兔抗小鼠FITC标记二抗作为检测剂。对于双重染色流程，随后将切片用PE偶联的人CD68的单克隆抗体染色。
结果
如实施例1所述，使用识别人JAM1保守Ig结构域的简并引物，从人胎cDNA文库克隆得到huCRIg。对几个克隆的测序揭示了321个氨基酸的可读框（图1A-1B，SEQ ID NO:2）。Blast检索证实与1型跨膜蛋白Z39Ig具有相似性(Langnaese et al.,Biochim Biophys Acta1492:522-525(2000))。后来发现这种321个氨基酸的蛋白质丢失了一些C-末端氨基酸残基。经测定全长huSIgMA蛋白具有399个氨基酸残基，如图2A-2B所示（SEQ ID NO:4）。CRIg的胞外区由2个Ig样结构域组成，包括一个N-末端V组结构域和一个C-末端C2组结构域。使用3’和5’引物克隆得到CRIg缺少近膜IgC结构域的剪接变体，CRIg-短（305个氨基酸，图3A-3B，SEQ ID NO:6）。
鼠CRIg的克隆及与人CRIg的序列比较
使用huCRIg的完整可读框和tblastn算法，检索鼠表达序列标签(EST)数据库。对3个克隆的DNA测序产生相同的280个氨基酸的完整可读框。使用3个引发区的引物从小鼠脾文库克隆全长转录本。鼠的克隆类似于huCRIg的剪接形式，即缺少C-末端Ig样结构域。胞外IgV结构域在人和鼠受体之间非常保守，具有93%同一性。鼠的胞质结构域保守性较差，比其人对应物短20个氨基酸，同一性为40%。编码鼠CRIg(muCRIg)的核酸及推测氨基酸序列在图4A-4C中分别如SEQ ID NOS:7和8所示。
CRIg在多种组织中的驻留巨噬细胞子集上表达且其表达在炎症中升高
huCRIg的Northern印迹分析显示1.5和1.8kb的两种转录本（图17），在肾上腺、肺、心和胎盘中表达最高，在其它器官诸如脊髓、甲状腺、乳腺和淋巴结中表达较低。在所有组织中，1.8kb转录本是最丰富表达的转录本，可能编码长型CRIg。在小鼠肝和心中检测到约1.4kb的单一转录本。
TAQMANTM实时PCR分析
为了鉴定表达CRIg的特定细胞系，使用实时定量PCR和对N-末端Ig结构域特异的引物/探针。在经PMA处理的骨髓细胞系HL-60和单核细胞细胞系THP-1中发现了低但可检测的mRNA表达。B和T细胞系中未见表达（图18,A）。
分化后单核细胞上的CRIg表达。
为了确定CRIg在分化中单核细胞/巨噬细胞中表达时的详细情况，我们测定了在存在人自体血清时经诱导而分化的非吸附单核细胞和粘附单核细胞中的CRIg mRNA水平。CRIg mRNA水平随时间逐渐升高，在铺板后第7天达到最高水平（图18,B）。在此分化阶段，mRNA水平比未分化单核细胞中的mRNA水平高100倍。
单核细胞/巨噬细胞裂解物的Western印迹分析显示，CRIg蛋白质表达与CRIg mRNA表达的升高平行升高（图18,C），表明在单核细胞分化而形成巨噬细胞时CRIg表达。印迹上出现48kDa条带和40kDa条带，可能代表长型和短型人CRIg。
CRIg的分子表征
CRIg在还原和非还原条件下的迁移类似，表明其以单体形式表达（图19,A）。在用PNGase F对CRIg去糖基化时，迁移模式只有轻微改变，表明N-糖基化不显著。在用过钒酸盐处理过表达CRIg的细胞时，CRIg磷酸化（图19,B）。磷酸化CRIg的迁移表现为略高Mw的蛋白质（55kDa）。在人HEK293细胞中，酪氨酸磷酸化的CRIg胞质结构域不募集Syk激酶（结果未显示)。
外周血单核细胞上CRIg表达的流式细胞术分析
为了测定CRIg在循环白细胞中的表达模式，使用单克隆抗人CRIg抗体3C9，对从健康供体的血液分离的淋巴细胞进行流式细胞术分析。通过用八聚His标记的人CRIg胞外结构域免疫Balb/C小鼠，制备抗体。所述抗体是非阻断性抗体，直接与ALEXATMA488偶联，可用于检测丙酮固定的冰冻切片中的天然蛋白质。用几种免疫细胞表面抗原的PE偶联抗体进行复染。所有白细胞表面上均未发现CRIg，包括B-,T-,NK细胞、单核细胞和粒细胞（图20）。然而，在巨噬细胞分化培养基中培养了7天的单核细胞上发现CRIg表达。
单核细胞中CRIg表达的调控
为了研究CRIg表达的调控，将巨噬细胞在存在各种促炎和抗炎细胞因子时培养7天，通过实时PCR或流式分析测定CRIg表达水平。巨噬细胞用IL-10和TGF-β处理2天后，CRIg mRNA的表达升高，而IL-4、IL13和LPS使表达下调（图21A）。与对照未处理巨噬细胞相比，地塞米松处理将表达提高5倍。为了测定细胞表面表达的CRIg的调控，对经各种细胞因子和地塞米松处理5天的外周血单核细胞进行流式细胞术。使用偶联有ALEXATMA488的单克隆抗体克隆3C9检测CRIg。细胞用抗CD-14抗体共染色。在单核细胞用IL-10和LPS处理5天后，发现CRIg的表面表达升高（图21B）。用地塞米松处理后，发现表面CRIg表达显著升高。
CRIg的亚细胞分布
为了研究CRIg的亚细胞分布，将单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)培养15天，然后固定，用单克隆抗体（克隆3C9）或多克隆兔抗体4F7，接着用FITC偶联二抗和PE标记抗CD63抗体染色。共焦显微术显示CRIg在核周细胞质中高表达，与溶酶体膜蛋白CD63的表达交叠（图22）。CRIg还在巨噬细胞的前及后缘表达，在此它的染色模式与CD63的不交叠。
正常及疾病组织中的CRIg表达
研究驻留组织的巨噬细胞中的CRIg表达及其表达在患有慢性炎性疾病的组织中的变化。使用原位杂交，对一组低聚甲醛固定的人组织测定CRIgmRNA表达。在从肺炎或慢性哮喘患者的肺尸检获得的肺泡巨噬细胞中发现了高表达水平（图23，A,B,C和D）。在慢性肝炎患者的肝Kupffer细胞中发现了高mRNA表达（图23，E和F）。
在先前的研究(Walker,Biochimica et Biophysica Acta 1574:387-390(2002))和电子文库筛选中，在类风湿性关节炎患者的滑膜中发现了CRIgmRNA的高表达。因此，研究从类风湿性关节炎、骨关节炎和变性(degenerative)骨病患者获得的滑膜中CRIg的表达模式。在从骨关节炎患者获得的滑膜细胞中发现了CRIg mRNA的高表达（图24，B)。浅层中的滑膜细胞具有最高的CRIg表达（图24，D）。此外，使用多克隆抗体6F1研究从类风湿性关节炎患者获得的人滑膜的冰冻切片中的CRIg表达。CRIg在滑膜中的一部分（20-40%）滑膜细胞和组织巨吞噬细胞中表达（图25，A,B,C）。这些细胞最有可能是A型巨噬细胞样滑膜细胞。对照滑膜中未见染色（图25，D）。
还在许多不同组织中的巨噬细胞上发现CRIg蛋白质的表达。从稳定表达CRIg的CHO细胞制备的冰冻切片显示CRIg的膜定位(图26,A)。在肺泡巨噬细胞(图26，B)、小肠固有层中的组织细胞(图26，C)、胎盘中的Hofbauer细胞(图26，D)、肾上腺中的巨噬细胞(图26，E)和肝中的Kupffer细胞(图26，F)中发现CRIg蛋白质。
动脉粥样硬化斑含有大量紧紧粘附于主动脉腔壁上的巨噬细胞或巨噬细胞-泡沫细胞。考虑到CRIg在巨噬细胞-内皮粘附中的作用，研究动脉粥样硬化斑中的CRIg表达。将斑的交替切片用抗CD63（图27，A和B）或抗CRIg（图27，C和D）染色。在排列血管壁的泡沫细胞中发现了抗CD63和CRIg的交叠染色模式，表明CRIg在动脉粥样硬化中起作用。
为了测定CRIg是否在巨噬细胞上选择性表达，对心间质巨噬细胞进行双重染色免疫荧光（图28）。如覆盖图所示（图28，第三张小图），CRIg阳性的间质巨噬细胞大多数也是CD68阳性的。并非所有CD68阳性巨噬细胞都是CRIg阳性的，表明后者对于驻留组织的巨噬细胞的亚型是特异的。
为了定量测定炎性肠病(IBD)综合征中的mRNA表达水平，从获自溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病患者或者获自无IBD表现的患者的结肠组织提取mRNA。使用对CRIg特异的引物进行实时PCR，测量相对表达水平。与对照组织相比，溃疡性结肠炎患者中的表达水平高出16倍，克罗恩氏病患者中高5倍(图29,A)。类似地，测定肺组织中的相对RNA等价物，发现慢性阻塞性肺病患者的组织中最高(COPD：比正常高14倍)，哮喘患者中与正常没有显著差异(图29,B)。
众所周知，Ig超家族分子介导细胞表面识别和细胞-细胞粘附。由于CRIg表达在排列于血管的间质巨噬细胞中较高，所以研究CRIg在巨噬细胞-内皮细胞粘附中的参与情况。将用全长CRIg-长(图30,A)稳定转染的Jurkat细胞系加载荧光染料BCECF，把细胞加到已经培养有HUVEC细胞单层的96孔maxisorb板的孔中。通过3次温和洗涤后剩余荧光量测量粘附。与经对照质粒稳定转染的Jurkat细胞相比，表达CRIg的Jurkat细胞更多粘附对照及TNFα刺激的内皮二者(图30,B)。
讨论
本研究首次描述了新型Ig超家族成员CRIg/Z39Ig的组织分布、表达调控及分子表征，证实了其在驻留组织的巨噬细胞中的选择性表达。
在具有完全分化表型的驻留巨噬细胞上发现了CRIg表达。其表达在慢性炎症样、类风湿性关节炎及炎性肠病的组织中升高。CRIg表达在这些通常特征在于Th2型疾病的疾病中的升高可能符合在体外Th2细胞因子对其表达的调控。这种表达升高是否是由于CRIg阳性巨噬细胞存在增加或者炎性巨噬细胞上的表达升高，还有待确定。
CRIg可介导人巨噬细胞的效应物功能之一，包括细菌识别、吞噬作用、抗原呈递及细胞因子释放。这些结果表明了CRIg在巨噬细胞对血管内皮细胞壁粘附及可能的迁移中的作用。
CRIg表达在非微生物炎性疾病像溃疡性结肠炎和慢性阻塞性肺病(COPD)中升高，但在用LPS或其它细菌细胞壁成分像脂磷壁酸和细菌脂蛋白处理时在分离的巨噬细胞中下调。用LPS长时间处理，2天以上，引起CRIg的表达升高。这可能由于经LPS刺激的巨噬细胞分泌的IL-10自分泌作用。在用地塞米松处理单核细胞或巨噬细胞时，发现CRIg的mRNA及蛋白质两种水平均显著上调。发现在用地塞米松处理时，很少的单核细胞/巨噬细胞表面受体表达升高。一个例子是CD163，但其受地塞米松的诱导极不显著。对抗炎细胞因子IL10和TGFβ引起的CRIg上调相当感兴趣，表明CRIg可能介导糖皮质类固醇的抗炎作用。
如本文所述，CRIg在一部分CD68阳性巨噬细胞上表达，它们可能是活化的巨噬细胞。使用CRIg和CRIg-Fc融合蛋白的阻断性和激活性抗体，其在巨噬细胞效应物功能、粘附和迁移中的作用及其在慢性炎性疾病中的作用已经进行了调查，描述见实施例7。
只有很少的细胞表面标志物在分化的巨噬细胞，诸如CD68和CD163上特异性表达。尽管CD68在所有人巨噬细胞群上明显表达，然而在其它骨髓样细胞上还有某些非骨髓样细胞上也检测到该抗原。因此，CRIg是在一部分间质成熟巨噬细胞上选择性表达的第一种细胞表面抗原。
实施例7：DBA-1J小鼠中胶原诱发的关节炎(CIA)中的CRIg融合蛋白
本试验的目的是在疾病形成和CIA(胶原诱发的关节炎，类风湿性关节炎的一种实验动物模型系统)发展中比较CRIg融合蛋白与对照鼠IgG1。
如实施例4中所讨论的，CRIg在一部分巨噬细胞中特异性高表达，并且在慢性炎症组织中升高。鼠CRIg在胶原诱发的关节炎小鼠的发炎关节中的巨噬细胞和滑膜细胞中高表达。体外研究显示CRIg牵涉巨噬细胞对内皮的粘附。CRIg-Fc融合蛋白或是通过影响组织巨噬细胞的特性或是通过影响其它细胞(例如T细胞、B细胞、上皮细胞、内皮细胞)的免疫应答，影响自身免疫病的病程，在此案中是小鼠中胶原诱发的关节炎。这可导致关节中炎症、肿胀和长期骨质侵蚀的缓和。
muCRIg-Fc融合蛋白如下制得：将鼠IgG1的铰链、CH2和CH3结构域与鼠CRIg的胞外结构域(第1-200位氨基酸)融合。将含有防止Fc受体结合的双重突变的融合物用于控制Fc受体调控。muCRIg-Fc融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。（相似huCRIg-Ig和huCRIg-短-Ig的编码序列分别如SEQ ID NO:15和16所示。）通过用质粒DNA瞬时转染CHO细胞生成蛋白质。如下纯化融合蛋白：将细胞上清液运行蛋白A柱，接着是离子交换层析以消除聚集体。如下评估血清半衰期：给C57B6小鼠注射一剂4mg/kgCRIg-Fc，然后以指定时间间隔从小鼠采集血清。通过夹心式ELISA测定鼠CRIg-Fc的血清水平，其中使用识别CRIg胞外结构域上不同表位的抗CRIgmAb。
动物模型物种:小鼠
种系:DBA-1J
供应商:JACKSON
年龄范围:7-8周龄
选择小鼠作为物种来研究胶原诱发的关节炎(CIA)，因为CIA是与人类风湿性关节炎(RA)具有相似临床和病理学特征的炎性多关节炎。这种动物模型已经被多家实验室使用，CIA的组织病理学类似于具有滑膜增生且其发展成血管翳形成、软骨变性/破坏和边缘骨质侵蚀及随后关节变形的RA中所看到的。另外，小鼠在系统发生学上是最低等的哺乳动物。此外，还没有体外模型能够模拟RA复杂的多因素发病机理。
试验设计
试验组：
1)在200μl盐水中皮下(SC)注射6mg/kg mIgG1同种型，3次/周，共7周(n=8)。2)在100μl盐水中皮下(SC)注射4mg/kg muCRIg，3次/周，共7周(n=8)。
将小鼠用在CFS(Difco)中乳化的牛CII(100μg,Sigma,St Louis)皮内免疫。21天后，将小鼠用在IFA(Difco)中乳化的CII再次挑战。从第24天开始，一组小鼠(n=7)给予100μg muCRIg(PRO362)Fc，每周3次，共6周，第二组(n=8)接受100μg鼠IgG1作为对照。每天检查小鼠关节炎症的征候，并如下评分：0,正常；1,红斑和轻微肿胀，限于踝关节；2,红斑和轻微肿胀，从踝扩散至跖和掌关节；3,红斑和中度肿胀，从踝扩散至跖或掌关节；4,红斑和重度肿胀，从踝扩散至爪趾。每只爪的最大关节炎得分为4，每只小鼠的最大得分为16(图31)。
第0天，将所有小鼠用在100μl弗氏完全佐剂(CFA)中乳化的100μg牛II型胶原免疫。将CFA中的II型胶原皮内注射于尾根部右侧。第21天时，在尾部左侧皮内给予第二次免疫，即100μl弗氏不完全佐剂中的100μg牛II型胶原。调查人员每天检查动物(M-F)。使用Nestlet作为富集装置(enrichmentdevice)，为动物提供额外的填料。如有必要，在笼子底部放置弄湿的食物。咨询兽医人员后将虚弱的动物处死。在研究结束时采集末端faxitron X射线和microCT，评估关节损伤/侵蚀情况。此外，处理前和终止时对动物称重。
第35天和研究终止时，对第1-8组小鼠采血，供测定血清pK和抗II型胶原抗体滴度（100μl眼窝采血）。
第70天时，所有小鼠最终在3%异氟烷下心内采血，供终末血像(terminalhemogram)、白细胞分类计数和血清pK(G3)评估。
在诱发关节炎后第70天，将小鼠安乐死。收集所有四肢，供放射成像、5CT和组织病理学。
结果
将CRIg融合蛋白muCRIg-Fc系统注射到胶原诱发关节炎小鼠（类风湿关节炎动物模型）中显示，与接受IgG1的对照组小鼠(圆圈)相比，接受CRIg融合蛋白的实验组小鼠(方框)的CIA发展显著减缓（见图31：p值=0.0004）。通过注射在弗氏完全佐剂中乳化的牛II型胶原，诱发了胶原诱发的关节炎。首次免疫后21天给予加强免疫。将动物每周3次用鼠CRIg-Fc融合蛋白或用抗gp120IgG1处理。剂量为4mg/kg，在100μl PBS中，皮下注射。处理从第21天开始，持续至第70天。每天对小鼠观察后爪的肿胀情况，作为关节炎的征候。关节炎的严重程度分为如下1-16个等级：0=未出现红斑和肿胀，1=红斑和轻微肿胀限于中爪(mid-foot)(跗骨)或踝，2=红斑和轻微肿胀，从踝扩散至中爪，3=红斑和中度肿胀，从踝扩散至跖关节，4=红斑和重度肿胀，涵盖踝、爪和趾。
重复试验
调整上述方案，重复并验证胶原诱发的关节炎(CIA)模型中先前试验的结果。调整后的方案包括根据体内microCT成像的结果，调查放射性照射对疾病形成和发展的潜在作用。
将70只DBA-1J小鼠(7-8周龄，Jackson Laboratories)分为5个处理组，两组(G1和G3)每组各15只小鼠，两组(G4和G5)每组各10只小鼠，一组(G2)20只小鼠。
处理组：
G1:在100μl盐水中皮下注射4mg/kg MuIgG1同种型，3次/周，共7周(n=15)。
G2:在100μl盐水中皮下注射4mg/kg MuCRIg-IgG1，3次/周，共7周(n=20)。
G3:在100μl盐水中皮下注射4mg/kg MuTNFRII-IgG1同种型，3次/周，共7周(n=15)。
G4:在100μl盐水中皮下注射4mg/kg MuIgG1同种型，3次/周，共7周，用体内microCT麻醉(n=10)。
G5:在100μl盐水中皮下注射1.0mg/kg MuTNFRII-IgG1，3次/周，共7周，用体内microCT麻醉(n=10)。
TNF是由单核吞噬细胞、Ag刺激的T细胞、NK细胞和肥大细胞分泌的细胞因子。它牵涉正常的炎性和免疫应答。TNF-α在类风湿关节炎(RA)的发病机理中发挥重要作用。发现RA患者滑液中TNF水平升高。在此方案中，使用mTNFRII-Fc作为阳性对照，阻断TNF与其细胞表面受体之间的相互作用。
第0天，将从G1到G5的所有小鼠用在100μl弗氏完全佐剂(CFA)中乳化的100μg牛II型胶原免疫。将CFA中的II型胶原皮内注射于尾根部右侧。第21天时，在尾部左侧皮内给予第二次免疫，即100μl氟氏不完全佐剂中的100μg牛II型胶原。
每天检查动物。每周将G4-5组的小鼠用异氟烷麻醉，进行体内microCt。在研究结束时采集末端faxitron X射线和microCT，评估关节损伤/侵蚀情况。
第35天和研究终止时，对G1-5组小鼠采血，供血清pK和抗II型胶原抗体滴度（100μl眼窝采血）。第70天时，所有小鼠最终在3%异氟烷下心内采血，供终末血像(terminal hemogram)、白细胞分类计数和血清pK(G3)。
在诱发关节炎后第70天时，将小鼠安乐死。收集所有四肢，供放射成像、microCT和组织病理学。
图33显示CRIg-Fc处理小鼠中关节肿胀显著减轻。
第70天时对从muCRIg处理动物获得的福尔马林固定、石蜡包埋组织(H&E染色）进行的免疫组化显示，关节炎症因处理得到抑制。图34显示了用II型胶原免疫后70天的DBA1/J小鼠的跖关节H&E染色切片。A.在腱鞘周围区域和关节腔周围区域发现大量炎性细胞浸润物；B.A的详图；C.CRIg-Fc处理小鼠的关节中的低度炎性浸润物。在腱鞘和关节腔周围区域发现很少的炎性细胞；D.B的详图。
图35显示在muCRIg-Fc处理小鼠的关节中皮质骨体积得到保持。注射胶原后70天处死对照IgG处理组和CRIg-Fc处理组小鼠，通过μCT扫描关节。与muIgG1处理动物相比，代表CRIg-Fc组和对照IgG组的小鼠关节中的骨质侵蚀和骨密度损失情况显示于左图。muCRIg-Fc处理动物中皮质骨体积的保持显著更大。该图像是使用Analyze图像分析软件从μCT数据制作而成的三维表面透视图。
图36显示了CRIg-Fc既不改变驻留组织的巨噬细胞的数目也不改变其形态。将来自抗gp120IgG1(左图)或CRIg-Fc(右图)处理小鼠的肝和肺解剖，在福尔马林中固定，然后在石蜡中包埋。将7微米切片用F4/80的抗体染色。对切片的仔细检查显示，两个试验组中有相等数目的F4/80阳性巨噬细胞。此外，巨噬细胞的形态没有观察到任何差别。
图37显示了muCRIg-Fc处理不影响血清抗胶原抗体滴度。免疫后70天测定抗胶原抗体的血清滴度。在用CRIg-Fc处理的动物与用抗gp120处理的动物间在IgG1、IgG2a和IgM抗体亚型的血清滴度中没有发现任何差别。这意味着CRIg-Fc不影响用II型胶原免疫的小鼠中的抗体应答。图38显示了muCRIg-Fc降低循环炎性巨噬细胞的数目。免疫后70天从用CRIg-Fc和抗gp120处理的动物采集外周血，使用炎性和非炎性单核细胞的标志物通过流式细胞术进行分析。与抗gp120处理组相比，用CRIg-Fc处理的动物显示出炎性单核细胞数目显著增加，非炎性单核细胞数目减少。
总之，本实施例中所述实验的结果证明，muCRIg-Fc融合蛋白抑制胶原诱发的关节炎。具体而言，该结果显示CRIg-Fc抑制关节肿胀，抑制炎症，保持皮质关节骨体积，及减少循环炎性巨噬细胞数目。
其它实验已经显示出CRIg-Fc不影响体内B细胞或T细胞应答。
实施例8：小鼠中抗体介导的CIA中的CRIg融合蛋白
抗体介导的关节炎与胶原诱发的关节炎的不同之处在于不注射抗原（牛II型胶原），取而代之的是注射识别II型胶原的抗体。由此，绕过适应性B和T细胞应答而经由Fc受体和补体介导的活化直接诱导对巨噬细胞和嗜中性细胞上的效应物功能。
可以通过静脉内注射由
Figure BDA00003310730700922
小鼠B杂交瘤细胞系生成的四种不同单克隆抗体的组合来诱导抗体介导的CIA(Terato et al.,J.Immunol.148:2103-8(1992))。所述单克隆抗体中的3种识别在84个氨基酸残基的片段，CB11的LyC2（II型胶原的最小致关节炎片段）内簇集的自身抗原性表位，第四种单克隆抗体与LyC1起反应。所有四种抗体都识别各种II型胶原种类共有的保守表位，并与同源和异源II型胶原发生交叉反应(Terato et al.,supra;Terato et al.,Autoimmunity22:137-47(1995))。
Figure BDA00003310730700921
诱导关节炎的单克隆抗体混合物可通过商业途径获得(Chemicon International,Inc.,Temecula,CA,catalog No.90035)。
方案
将10只4-5周龄的BALB-c小鼠(CR/Hollister)分成两组，每组5只小鼠。
从注射抗体混合物的前一天（第-1天）开始，将动物每天用100μgmuCRIg-Fc或100μg对照-Fc(抗gp120IgG1)处理，持续至第14天。在第14天。每天至少两次检查动物，保存观察的书面记录。通过目测观察对疾病程度评分。
目测评分系统：
0=未出现红斑和肿胀
1=红斑和轻微肿胀，限于中爪
2=红斑和轻微肿胀，从踝扩散至中爪
3=红斑和中度肿胀，从踝扩散至跖关节
4=红斑和重度肿胀，涵盖踝、爪和爪趾
使用Nestlet作为富集装置(enrichment device)，为动物提供额外的填料。
在第14天时处死所有动物，采集关节供免疫组化染色或苏木精-曙红染色。采集血样供血液学分析。
结果
图39显示了抗体诱发关节炎(AIA)后关节中的巨噬细胞浸润，在未脱钙的冰冻关节中用F4/80染色制得。给雌性Balb/C小鼠静脉内注射2mg抗胶原抗体(arthrogen)，接着在3天后腹膜内注射25μg LPS。抗体注射后14天，将小鼠安乐死，收集爪，在聚乙烯醇中包埋。从冰冻关节切出7μm厚的切片，用鼠CRIg和巨噬细胞特异性标志物F4/80的抗体染色。
图40表明muCRIg在Balb/c小鼠中防止抗体诱发关节炎后的关节肿胀。关节炎是通过Terato及其同事的方法(Terato et al.,(1992),见上文;Terato etal.,(1995)见上文)使用识别II型胶原上保守表位的4种单克隆抗体的混合物(Chemicon)诱导的。给6周龄的雌性Balb/C小鼠静脉内注射2mg抗CII抗体，接着在3天后腹膜内注射25μg LPS。将动物每天用鼠CRIg-Fc融合蛋白或者用对照-Fc融合蛋白处理。剂量为4mg/kg，在100μl PBS中，皮下注射。处理从注射抗胶原抗体的前一天开始，持续至第14天将小鼠安乐死。注射LPS后每天对动物观察后爪肿胀情况，作为关节炎的征候。关节炎的严重程度分为如下1-16个等级：0=未出现红斑和肿胀，1=红斑和轻微肿胀，限于中爪(跗骨)或踝，2=红斑和轻微肿胀，从踝扩散至中爪，3=红斑和中度肿胀，从踝扩散至跖关节，4=红斑和重度肿胀，涵盖踝、爪和爪趾。
治疗性处理与预防性处理类似进行，只是处理从第4天开始，而不是第-1天。muCRIg-Fc处理降低AIA小鼠爪中的炎性细胞因子水平。关节炎后爪中细胞因子C3a和C5a浓度的测量依照Kagari et al,J.Immunol.169:1459-66(2002)的方法进行。简而言之，在抗体诱发关节炎后的指定时间点，收集爪，在液氮中冷冻。此后，在液氮冷却的金属盘上研磨爪，在含0.1%PMSF(Sigma)的冰冷PBS中分散。将样品用Vitatron(NL)匀浆器在冰上匀浆，通过以14000g离心10分钟除去不溶部分，收集上清液。使用购自BDPharmingen的细胞因子ELISA测量上清液中的细胞因子。
muCRIg-Fc处理抑制AIA中补体C3在软骨上的沉积，但不抑制IgG2a的沉积。给雌性Balb/C小鼠静脉内注射2mg抗胶原抗体(arthrogen)，接着在3天后腹膜内注射25μg LPS。注射抗体后14天，将小鼠安乐死，收集爪，在聚乙烯醇中包埋，然后在置于干冰上冷却的异戊烷中冰冻。从冰冻关节切出7μm厚的切片，用鼠C3的FITC偶联多克隆抗体(Calbiochem)和鼠IgG2a的A594偶联多克隆抗体(Jackson Immunoresearch)染色。将切片在Leitz荧光显微镜下照相。
用H&E染色进行的免疫组化的结果显示于图41。对照处理小鼠(muIgG1)具有中度至重度的关节炎(左侧小图)，而muCRIg处理小鼠具有很小程度关节炎至没有关节炎(右侧小图)。该结果显示出muCRIg抑制抗体诱发关节炎中的关节炎症。
总之，与用抗gp120IgG1处理的动物相比，用鼠CRIg-Fc处理的动物具有显著降低的临床得分。CRIg在此动物模型中表现出预防和治疗两种功效。关节炎严重程度的减轻还表现为关节中炎性细胞的减少，尤其是嗜中性细胞。循环中的嗜中性细胞数目增多，可能反映了迁移到关节中的嗜中性细胞减少。与RA的临床表现平行，muCRIg-Fc抑制局部IL-1β和IL-6生成。MuCRIg处理不影响免疫复合物沉积，但抑制补体C3在软骨上的沉积。发现效应物功能不依赖Fc受体结合。huCRIg-短-Fc还表现出显著的预防活性。
实施例9：鼠CRIg-Fc结合C3调理的绵羊红细胞(E-IgM)
将SRBC(MP Biomedicals,ICN/Cappel)用大鼠IgM(E-IgM)(ForssmanAg,Pharmingen)包被。将E-IgM用正常小鼠血清或来自C3敲除小鼠的血清调理。将调理后的E-IgM与不同浓度的鼠CRIg-Fc一起温育。使用融合蛋白Fc部分的FITC标记抗体，通过流式细胞术监测融合蛋白与E-IgM的结合。
如图43所示，鼠CRIg以剂量依赖方式结合用正常小鼠血清调理的E-IgM，但不结合用C3缺陷血清调理的E-IgM，表明CRIg选择性结合鼠C3或C3片段。
实施例10：人CRIg-Fc与E-IgM的结合依赖C3
将SRBC(MP Biomedicals,ICN/Cappel)用大鼠IgM(E-IgM)(ForssmanAg,Pharmingen)包被。将E-IgM用C3或C5缺陷的人血清调理。将调理后的E-IgM与不同浓度的人CRIg-Fc一起温育。使用融合蛋白Fc部分的FITC标记抗体，通过流式细胞术监测融合蛋白与E-IgM的结合。
如图44所示，人CRIg以剂量依赖方式结合用C5缺陷血清调理的E-IgM，但不结合用C3缺陷血清调理的E-IgM，表明CRIg选择性结合人C3或C3片段。使用人CRIg ECD得到了相似结果。
实施例11：血清调理颗粒与表达CRIg的CHO细胞的结合
将50μl新鲜C57B6雌性血清+20μg/ml mCRIg-mFc(PUR5270-B)或mPIGR-mFc(4699)混合在一起。在37°C，在PBS/0.2%明胶/0.18%葡萄糖/1mM MgCl2(PBSgg++)中加入来自Molecular Probes的A488颗粒、酵母聚糖、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌达60分钟。将调理后的颗粒用PBS洗涤两遍，然后在37°C、存在或缺少CRIg-Fc或对照-Fc蛋白质时加至表达鼠CRIg(克隆5C10)或人JAM2的CHO细胞达30分钟。将细胞用PBS洗涤两遍，在FACS Caliber中分析颗粒与细胞表面的结合。
如图45所示，用C3缺陷血清调理的颗粒结合表达CRIg的CHO细胞，但不结合表达JAM2的CHO细胞。在存在CRIg-Fc融合蛋白时结合消除，但存在对照-Fc融合蛋白时则不然，表明CRIg结合C3b的结合位点位于胞外结构域。
实施例12：MuCRIg Fc结合C3b
使用
Figure BDA00003310730700961
设备进行实时监测表面等离振子共振测定法，然后使用BiaEvaluation3.0软件(Biacore AB,Uppsala,Sweden)分析数据。所有测定法中使用羧化右旋糖苷芯片(传感器芯片CM5,研究级,购自Biacore AB)。将CM5芯片的流动槽用于标准胺偶联流程，或者制备用于C3b的直接酶促偶联，其中使用标准活化-去活化流程，步骤之间不添加任何蛋白质。用含N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺的新鲜溶液实施活化步骤(Biacore AB,以5μl/min的流速注射7-15分钟)，然后用乙醇胺-HCl(1.0M，pH8.5)去活化(Biacore AB,注射7-15分钟)。使用Hepes缓冲盐水(Biagrade,Biacore AB)或VBS作为全程流动缓冲液。这些初始步骤后，使用VBS或VBS作为连续流动缓冲液，流速5μl/分钟，只使用除气后的缓冲液。
将蛋白质胺偶联到
Figure BDA00003310730700962
芯片上—使用制造商推荐的标准胺偶联流程，将C3b、iC3b、C3c和C3d偶联到CM5芯片上。将待偶联蛋白质对10mM醋酸盐缓冲液(pH5.0-5.7)透析，获得负净电荷用于胺偶联。简而言之，将芯片表面用N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺活化(注射7-15分钟,5μl/min)，然后注射纯化的C3b(50μg/ml,20μl)、C3c(70μg/ml,30μl)或C3d(130μg/ml,20μl)，直至达到适于结合试验的偶联水平，即1,000-5,000共振单位(RU)。然后，如上所述，将流动槽去活化。试验前，用10mM醋酸盐缓冲液pH4.6中的VBS和3M NaCl彻底洗涤流动槽。
使用
Figure BDA00003310730700963
的结合测定法—我们测试了CRIg-Fc对胺偶联的C3b、C3c和C3d的结合。为了
Figure BDA00003310730700964
注射，将试剂对VBS透析，用VBS稀释，然后过滤(0.20μmSartorius Corp.,Edgewood,NY)或浓缩(10分钟，14,000xg)。使用BCA蛋白质测定法(Pierce)测量透析后试剂的蛋白质浓度。将融合蛋白分开注射通过对照流动槽（活化及去活化但没有任何偶联蛋白质的流动槽，“空白通道”）和通过偶联有蛋白质的流动槽，流速5μl/min和22°C。所有结合测定法至少进行一式两份，使用独立制备的传感器芯片。
如图46所示，鼠CRIg-Fc显示出C3b特异性结合传感器芯片，计算Kd为250nM。
实施例13：小鼠和人CRIg-Fc结合补体C3b
将Maxisorb板用PBS中的3μg/ml C1、C3a,b,c,d、C4、C6包被过夜。将板用PBS+4% BSA封闭2小时，与PBS+4% BSA+0.1% Tween中各种浓度的鼠或人CRIg-Fc融合蛋白一起于室温温育1小时。洗涤平板，与偶联有过氧化物酶的山羊抗小鼠或山羊抗人Fc抗体一起温育。洗涤后，将板与TNB底物一起温育，在读板仪上读取OD值。
图47所示结果表明，鼠和人CRIg与C3b、C3c和C3bi的结合以依赖浓度的方式增加，与C1、C2、C4、C3a和C3d没有结合。
实施例14：小鼠和人CRIg-Fc抑制C3在酵母聚糖上的沉积
使用利用酵母聚糖A颗粒(Sigma)上C3沉积的流式细胞术分析的方法研究对旁路途径的抑制(Quigg et al.,J.Immunol.160:4553-4560(1998))。简而言之，首先如下活化10ml 0.15M NaCl中的50mg酵母聚糖颗粒：煮沸60分钟，然后用PBS洗涤2遍。在每个旁路途径测定条件中，向含有终浓度10mMEGTA和5mM MgCl2的反应管中加入2x107个颗粒。然后加入文中所述含10mM EDTA(阴性对照)或递增数量鼠CRIg-Fc的样品。添加10μl BALB/c血清作为补体来源，所有样品用PBS补至100μl。将样品于37°C温育20分钟，加入10mM EDTA终止反应。离心颗粒，取上清液，冰冻用于后续分析。然后将颗粒用冷PBS,1% BSA洗两遍，然后在冰上与FITC偶联的山羊抗小鼠C3(Cappel,Durham,NC)一起温育1小时。然后将样品用冷PBS,1%BSA洗两遍，重悬于PBS，然后使用EPICS细胞计数仪(Coulter,Hialeah,FL)通过流式细胞术分析。用如下公式计算抑制百分率：[1-[样品平均通道荧光-背景(10mM EDTA条件)/阳性对照平均通道荧光(无Crry-Ig)-背景]]x100。
还通过Western印迹分析来自反应的上清液以测定C3切割程度。在本分析中，取5μl上清液与等量含10%2-ME的SDS-PAGE上样缓冲液混合。将样品在7.5%丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，在0.19M Tris,0.025M甘氨酸、20%甲醇缓冲液转移至Hybond增强型化学发光(ECL)纸(Amersham,Arlington Heights,IL)过夜。此后，将膜在含10%牛奶的PBS,0.1%Tween中封闭1小时。然后将已预滴定的抗C3mAb RmC11H9(Quigg et al.,见上文)加含1%BSA的相同缓冲液中的印迹。洗涤后，加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗大鼠IgG(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)(针对小鼠IgG预吸附)达1小时，然后洗涤印迹，用增强型化学发光(ECL)系统(Amersham)显影。
流式细胞术以检测表面结合的C3(图48A)，或者通过Western印迹分析酵母聚糖反应上清液的等分试样和使用抗C3 mAb的检测(图48B)后，分析酵母聚糖颗粒上CRIg-Fc对补体活化的抑制。完整C3和C3'链在B中的位置如右边箭头所示。10mM EDTA泳道代表阴性对照，第2-7泳道顶部显示了CRIg-Fc的递增剂量。
实施例15：CRIg抑制SRBC的旁路途径溶血
对于旁路途径，将兔红细胞(RRBC)用含0.1%明胶的佛罗拿(veronal,巴比妥)缓冲液(Bio Whittacker)洗涤，以1x109细胞/ml重悬于GVB。将10μl细胞悬浮液加至10μl含抑制剂的C1q消减血清。将混合液在温室中于37°C振摇温育35分钟。加入200μl含10mM EDTA的GVB，将细胞以2500rpm离心5分钟，取100μl等分试样于412nm波长处读数。
对于经典途径，将用IgM调理的绵羊红细胞(E-IgM)在fB缺陷血清中温育。方法学类似于旁路途径测量。
图49所示结果显示，鼠CRIg抑制旁路途径诱导的溶血，但不影响经典途径溶血。用人CRIg获得了相似的结果。
实施例16：CRIg选择性抑制补体旁路途径
使用全血清的溶血测定法
按照Kostavasili et al.,J.Immunol.158:1763-71(1997)所述，用兔红细胞(Er)评估补体旁路途径。简而言之，将Er(Colorado Serum,Denver,CO)用GVB洗涤3遍，重悬至1x109/ml。取10μl Er加至10μl GVB/EGTA(0.1M EGTA/0.1M MgCl2)、抑制剂、10μl C1q消减人血清，用GVB将体积调至100μl，于37°C温育30分钟。添加250μl GVB/10mM EDTA终止反应，以500xg离心5分钟。通过200μg上清液在412nm处的吸光度，测定溶血情况。通过将无抑制剂存在时发生的溶解设定为100%溶解，将溶解百分率标准化。
为了测定CRIg对补体经典途径的影响，遵循类似流程，只是用E-IgM代替Er且在GVB++中在fB缺陷人血清中进行测定法。
C3转变酶介导的C3切割的测量
为了检验CRIg对C3转变酶(C3b.Bb)(来自Kostavasili et al.,见上文)的液相C3切割的影响，将0.4μM纯化的C3与GVB(20μl体积)中的huCRIg-长、huCRIg-短、muCRIg或因子H一起于37°C温育15分钟。此后，在存在50mM MgEGTA时在30μl总体积中加入0.4μM因子B和0.04μM因子D以激活该途径。于37°C温育30分钟后，反应混合液用30μl含2-ME的Laemmli氏样品缓冲液(BioRad)终止，煮沸3分钟，在8%SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上电泳。通过用SimplyBlue染料(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色显现蛋白质。扫描凝胶供密度测定分析，计算受到切割的C3的百分率。对照在GVBE(含10mM EDTA的GVB)中温育以抑制切割。
旁路途径DAA的微量滴定板测定法如先前所述进行(Krych-Goldberg etal.,J.Biol.Chem.274:31160-8(1999))。将微量滴定板用5μg/ml C3b(Advanced Research Technologies)磷酸盐缓冲盐水包被过夜。将板用含1%牛血清清蛋白和0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲盐水于37°C封闭2小时，与含71mM NaCl和0.05%Tween 20的2.5mM佛罗拿缓冲液pH7.4中的10ng因子B、1ng因子D和0.8mM NiCl2一起于37°C温育15分钟。使用相同缓冲液，与0.01-1μg CRIg-Fc、0.129μg山羊抗人因子B抗体和100μg1:15,000稀释的偶联有辣根过氧化物酶的抗山羊抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories,West Grove,PA)序贯温育1小时。用邻苯二胺显色。在此测定法中，DAF和因子H如预料的作为衰变促进活性的介质起作用，使用AmershamPharmacia Biotech des-Arg RIA试剂盒检测C3a释放。
C5转变酶测定法
使C3b沉积在酵母聚糖上，即将1x1010个酵母聚糖颗粒重悬于0.2ml10mg/ml C3，添加5μg胰蛋白酶，然后于22°C温育10分钟。重复胰蛋白酶导致的C3b沉积，细胞用5ml GVB洗涤6遍。将酵母聚糖颗粒重悬于100μlGVB，与50μl含因子B(35μg)和因子D(0.5μg)的GVB及50μl10mM NiCl2混合。于22°C温育5分钟后，加入5μl0.2M EDTA。通过加入50μl C3(500μg)放大结合的C3b，将细胞于22°C温育30分钟。洗涤携带C3b的酵母聚糖颗粒，重复放大流程直至获得期望数目的C3b/酵母聚糖。
因为C5转变酶形成所需时间不足1分钟，所以在进行测定法的同一反应混合液中形成酶。如先前所述，在饱和浓度的因子B、因子D和C6下，在0.5毫升硅化微量离心管中测定酶速度(velocity)。测定混合液含有不同浓度的C5（于37°C预温育20分钟以消除冻/融产生的背景C5b,6样活性）、因子B（1.2μg,516nM），因子D（0.1μg,167nM）、C6（2.5μg,833nM）和0.5mMNiCl2。反应由添加ZymC3b、ESC3b或ERC3b开始。根据每个细胞的C3b密度，调节细胞浓度使25μg GVB终体积中有9-35ng结合的c3b，导致2-8nM酶浓度。于37°C温育15分钟后，通过将测定管转移至冰浴和添加冰冷的GVBE，防止C5的进一步切割。立即通过使用EC的溶血测定法，对适当稀释的测定混合液滴定C5b,6形成情况。使用用纯化的C5b,6制作的标准曲线定量C5b,6。采用足以在后续步骤中将C5切割降至不可检测水平的冷的温度和稀释度，建立对照。使用EC溶解作为终点，兔红细胞(ER)或绵羊红细胞(ES)的溶解显示贡献出<2%的C5b,6滴度。
使用EC对人C5b-9导致的溶血溶解的敏感性，通过溶血测量C5b,6。向来自C5转变酶测定法的稀释样品的等分试样(25μl)中在终体积225μlGVBE中加入1.2x107个EC和5μl合并正常人血清(NHS)的混合物作为补体蛋白C7-C9的来源。将反应混合液于37°C温育10分钟，然后通过以10,000xg离心1分钟除去未溶解细胞。通过分光光度法在414nm定量血红蛋白释放量。测量2%Nonidet P-40中的EC溶解作为100%溶解。含C5和C6但不含C5转变酶的对照作为背景减去。含C5转变酶但不含纯化的C5或C6的对照证明，从EC溶解过程中用作C7-9来源的NHS没有形成显著量的C5b,6。
结果
结果显示于图49(A)-(E)（未提供）。
图49(A)（未提供）显示了CRIg抑制C1q缺陷血清中兔红细胞的溶血（旁路途径），但不抑制fB缺陷血清中IgM调理绵羊红细胞的溶血（经典途径），表明hatCRIg选择性抑制补体旁路途径。
如图49(B)（未提供）所示，CRIg抑制液相C3转变酶活性。凝胶显示了用渐增浓度的人CRIg-ECD（10-100nM）抑制对C3115kDaα链的切割。
图49(C)和(D)（未提供）显示了CRIg既不作为因子I介导的C3切割的辅因子，也不作为C3转变酶衰变的促进剂。
图49(E)（未提供）中所列数据显示了CRIg抑制酵母聚糖颗粒上形成的旁路途径C5转变酶。
实施例17：CRIg在一部分组织巨噬细胞上表达
制备对人和小鼠CRIg特异的单克隆抗体，用于确定CRIg的表达，如实施例3所述。尽管外周血C14+单核细胞上没有CRIg，但是在单核细胞衍生的巨噬细胞上通过流式细胞术很容易检测到CRIg（图50,B）。外周血CD4+和CD8+T细胞、CD19+B细胞、CD56+NK细胞、CD15+粒细胞上不存在huCRIg（图51,A）。与huCRIg类似，外周血和脾白细胞上没有muCRIg，包括CD11b+骨髓细胞，但是在肝Kupffer细胞上检测到muCRIg（KC，图50,B）。在单核细胞分化成巨噬细胞时，通过55和48K Mr蛋白质证实了huCRIg(L)和(S)蛋白的表达（图50,C）。类似的，通过48K Mr糖蛋白，在腹膜巨噬细胞(PM)中检测到小鼠CRIg。MuCRIg具有一个预测的N-连接糖基化位点，并糖基化，表现为凝胶上约5kDa的迁移率变化（结果未显示）。
由于在肝中检测到高水平CRIg mRNA，所以通过免疫组化进一步分析肝中的CRIg表达。CRIg在人和小鼠肝中在CD68+KC上表达，但是在肾上腺、胎盘、滑膜、肠和腹膜的巨噬细胞上也检测到CRIg（数据未显示）。人脾巨噬细胞、郎格汉斯(Langerhan)细胞、小胶质细胞和骨髓衍生巨噬细胞，以及多种人和小鼠巨噬细胞细胞系（THP-1、RAW275、PU1.1、j774；结果未显示）没有CRIg。总之，这些结果表明CRIg在多种组织中的驻留巨噬细胞群上高表达。
实施例18：CRIg结合C3b和iC3b
材料和方法
补体蛋白
依照Hammer et al.,J.Biol.Chem.256(8):3995-4006(1981)的方法分离人和小鼠C3，另外用蛋白A柱除去污染性IgG。为了获取hC3b，将hC3与摩尔比10:10:1的CVF、hfB和hfD一起在存在10mM MgCl2时于37°C温育1小时。随后用强阴离子交换monoQ5/50(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)和Superdex S-200 10/300 GL凝胶过滤柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)分离hC3b片段，根据考马斯蓝染色的凝胶，纯度>95%。为了制备C3b二聚体，将如上制备的C3b与甲醇中的双马来酰亚胺己烷(Pierce)以2.2:1摩尔比在PBS pH7.0中于4°C反应3天。通过打断硫酯键通过游离巯基产生交联。采用此流程，产率高于50%。二聚体用Superdex S-20010/300GL凝胶过滤柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)纯化。根据考马斯蓝染色的凝胶，二聚体纯度为95%。制备水解的C3，即向含10mM EDTA的PBS中的C3添加2M甲胺pH7.0，使得反应体积中的终浓度为50mM。将反应于37°C进行4小时，然后在Superdex S-20010/300GL凝胶过滤柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上纯化，将iC3b和C3c(Advanced ResearchTechnologies)在Superdex S-20010/300GL凝胶过滤柱上纯化，从二聚体中分离出单体。C3d、因子B、因子D和因子P、补体成分C1-9、抗体敏化的绵羊红细胞和眼镜蛇毒因子获自Advanced Research Techologes(San Diego,CA)。
结果
CRIg在高度吞噬性细胞群上的表达促使我们探究CRIg是否牵涉调理后颗粒的结合。已经证明补体和Fc受体介导吞噬作用。(综述见Aderem andUnderhill,Annu.Rev.Immunol.17:593-623(1999);Underhill and Ozinsky,Annu.Rev.Immunol.20:825-852(2002))。为了确定CRIg是否结合补体C3，对用兔IgG(E-IgG)或小鼠IgM(E-IgM)包被的绵羊红细胞分析其在存在C3或C5缺陷人血清时与表达CRIgL的Jurkat T细胞系形成玫瑰花结的能力。在存在C3时(C3+)表达CRIg(L)的Jurkat细胞而非对照Jurkat细胞与E-IgM形成玫瑰花结，但在不存在C3时(C3-)则不然（图52,A)。CRIg似乎不牵涉Fc受体介导的结合，因为用IgG调理的Es与Jurkat CRIg细胞不形成玫瑰花结（结果未显示）。
为了测试CRIg是否能直接结合细胞表面上的补体成分，制备了一种可溶形式的人CRIg，其中CRIg的ECD与人IgG1的Fc部分融合。在存在C3时融合蛋白huCRIg-长-Fc而非对照-Fc与调理后的E-IgM结合，但在不存在C3时则不然（图52,B）。当C3缺陷血清用纯化的人C3重建时，结合又恢复了。V型Ig结构域足以满足结合所需，因为huCRIg(S)-Fc和muCRIg-Fc都能够结合E-IgM（结果未显示）。
作为补体活化诱导酶促级联反应的结果，C3切割成其多种分解产物C3b、iC3b、C3c、C3dg和C3d，其中每一种都能充当CRIg的结合配偶。使用板结合型ELISA，huCRIg(L)和huCRIg(S)-Fc而非对照Fc表现出与C3b和iC3b的可饱和结合（图52,C），与C3、C3a、C3c或C3d则不然（结果未显示）。对于不含Fc部分的huCRIgL-ECD和muCRIg-Fc观察到相似的结果，与iC3b的结合大于与C3b的结合（结果未显示）。相反，可溶性C3b还与板包被的huCRIg(L)-Fc结合，并且受到huCRIg(L)-ECD的竞争（结果未显示）。因此，CRIg能结合溶液中的C3b和iC3b，或者当C3b和iC3b结合于基底上时。由于C3b在沉积于细胞表面上时以多聚体形式存在，所以进一步评估CRIg与人工组装的C3b二聚体(C3b2)的结合。根据表面等离振子共振的测量，C3b2与huCRIg(L)结合的Kd为131nM(图52,D)，与huCRIg(S)结合的Kd为44nM(图52,D)。
为了使这些生化研究完整，我们评估了细胞表面CRIg对C3衍生产物的结合特异性。A488标记的C3b2二聚体形成结合CRIg+而非CRIg-的THP-1细胞的表面（图52,E）。结合是特异性的，因为它受到添加可溶性未标记C3b2、C3b单体及huCRIg(L)-ECD而非天然C3的竞争。除结合可溶性补体片段外，在CHO细胞系表面上表达的muCRIg还结合在C3充足而非缺陷血清中调理的各种颗粒（图51,B）。总之，这些研究证明，在细胞表面上表达的CRIg以及可溶性CRIg(CRIg-Fc)是iC3b和C3b的受体。
实施例19：Kupffer细胞上的CRIg表达是可溶性的或颗粒结合的C3片段结合所必需的
材料和方法
1.CRIg敲除(ko)小鼠的生成
所有动物都在无菌无病原体条件下饲养，动物试验得到了Genentech研究用动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee)的批准。制备CRIg敲除胚胎干细胞，即通过电穿孔将外显子1用新霉素抗性基因置换的线性化寻靶载体导入C2B6胚胎干(ES)细胞。选择对新霉素有抗性的克隆，通过Southern印迹验证同源重组。所筛选的100个克隆中有7个为同源重组阳性。将两个靶向克隆注射到C57VL/6胚泡中，转移到假孕的代孕母兽(foster mother)中，将所得雄性嵌合小鼠与C57BL/6雌性小鼠交配以获得+/-小鼠。通过Southern印迹分析或来自F1子代的尾部DNA验证2ES克隆的种系传递（图42,B）。进行+/-小鼠杂交以生成-/-CRIg小鼠。这两种克隆的表型是相同的。为了通过PCR方法进行常规基因分型，使用公用有义引物5'-CCACTGGTCCCAGAGAAAGT-3'(SEQ ID NO:22)及野生型特异性反义引物(5'-CACTATTAGGTGGCCCAGGA-3')(SEQ ID NO:23)和敲除特异性反义引物(5'-GGGAGGATTGGGAAGACAAT-3')(SEQ ID NO:24)，对野生型等位基因扩增出306bp片段而对突变型等位基因扩增出406bp片段。C3敲除小鼠的生成先前已有描述(Naughton et al.,Immunol.156:3051-3056(1996))。为了生成CRIg/C3双重敲除小鼠，将混合s129/B6背景(F2)的C3敲除小鼠与CRIg敲除小鼠杂交。然后，将两种等位基因都是杂合的F1雌兽与CRIg等位基因为半合子的C3杂合雄兽杂交。将由此交配得到的后代用于研究。通过流式细胞术分析CRIg表达所使用的C57B6小鼠购自JacksonLaboratories(Bar Harbor)。
2.Western印迹和脱糖基化
将人和鼠巨噬细胞在含1%SDS,0.1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer)的PBS中溶解。以10,000g离心后，将可溶组分进行SDS凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜。显现CRIg蛋白，即使用抗CRIg抗体和HRPO偶联的二抗，然后通过ECL(Amersham)检测所结合抗体的化学发光。为了测定CRIg的糖基化状态，将表达CRIg-gD的细胞用抗gD抗体免疫沉淀，用PNGase、O-糖基化酶和神经氨酸酶依照制造商的说明书(Biolabs,NE)处理，然后使用生物素化的抗gD抗体进行Western印迹分析。
结果
为了研究CRIg的生物学功能，如上文所述和图42,A所示，通过同源重组生成CRIg基因有无效突变的小鼠。通过Southern印迹（图53,B）、腹膜渗出物细胞溶解物的Western印迹（图54,A）及流式细胞术（图54,B）验证删除。小鼠以预期孟德尔比率出生，没有出现总体表型或组织病理学异常。在来自野生型动物和敲除动物的血液、脾和淋巴结中，不同淋巴区室中的免疫细胞绝对数是相似的（图53,C）。此外，在分别通过流式细胞术和免疫组化分析时，对F4/80+KC和心巨噬细胞数没有观察到差异（结果未显示）。其它补体结合蛋白质，包括CR3的α链和β链及KC上的补体受体相关基因y(Crry)，的表达水平没有变化(图54,C)。类似的，野生型和敲除KC之间在CR1、CR2或CD11c、CR4β链的表达低或不可检测这一点上是类似的。
接着，测试了CRIg野生型和CRIg敲除KC对C3降解产物的结合能力。C3片段(C3b、C3b2和iC3b)很容易在CRIg野生型KC的表面上沉积（图54,B）。相反，在CRIg野生型KC中没有检测到C3b、C3b2、iC3b或iC3b2的结合。检测到C3和C3c对野生型或敲除KC的很少结合或没有检测到结合（图53,E）。
为了将分析从可溶性C3片段的结合扩展至结合于细胞表面的C3片段的结合，检验了KC上的CRIg结合C3调理的IgM包被的红细胞的作用。CRIg敲除KC在与CRIg野生型KC比较时，展现出E-IgM形成玫瑰花结减少约60%（图54,D）。在加入CR3封闭性抗体时观察到玫瑰花结形成进一步减少(<20%)，所以CR3对总的结合活性贡献甚微。因此，CRIg表达是C3降解产物和C3调理颗粒与Kupffer细胞结合所必需的。
实施例20：CRIg内在化并在再循环内体上表达
由于C3调理颗粒对其受体的结合可触发将随后的胞吞作用(Fearon et al.,J.Exp.Med.153:1615-1628(1981);Sengelov,Crit.Rev.Immunol.15:107-131(1995))，使用猝灭Alexa488荧光染料的多克隆抗体(Austin et al.,Mol.Biol.Cell15:5268-5282(2004))来分析CRIg和C3b是否在KC中内在化。将A488偶联的抗CRIg mAb与KC一起于4°C预温育。于4°C添加抗A488抗体抑制表面结合的抗CRIg抗体的荧光，如图47A小图1所示。在将A488偶联的抗CRIg mAb与KC一起于37°C温育30分钟，然后与抗A488抗体一起温育时，荧光不受抑制(图55,A小图4)，表明抗CRIg抗体在4°C-37°C在转移至细胞时内在化，因而不能猝灭抗A488抗体。对C3b发现了类似的结果（图55,A小图3和6）。抗CRIg抗体的内在化不依赖C3的存在，因为在从C3敲除小鼠分离的KC中(图55,A小图2和5)和不存在血清时（结果未显示）发生了抗体摄取。免疫组化进一步证实，在来自CRIg野生型而非敲除小鼠的KC的细胞质中存在抗CRIg抗体和C3b（图55,B）。随时间过去，用A488偶联的抗CRIg抗体包被的KC在存在胞外抗A488抗体时温育，观察到荧光随时间减少，表明抗CRIg抗体再循环回到细胞表面（图55,C）。再循环的时程再次不依赖C3，因为存在和不存在C3时猝灭的动力学相似（结果未显示）。相反，溶酶体蛋白Lamp1的抗体仍留在细胞内，不随时间减少。这些结果表明CRIg作为位于组成性再循环膜集合上的C3b受体发挥功能。
为了进一步确定CRIg在其中再循环的亚细胞区室，使用去褶合显微镜检术显现人单核细胞衍生巨噬细胞(MDM)，其中使用运铁蛋白作为再循环内体的标志物，使用Lamp1作为溶酶体的标志物。培养7天的MDM在60%显示可饱和C3b结合的细胞上表达CRIg(图55,A)，这种结合可用huCRIg(L)的胞外结构域竞争掉（结果未显示）。用抗CRIg抗体于4°C包被的巨噬细胞在富含F-肌动蛋白的丝足突出中展现局部(focal)CRIg表达（箭头，图56,A，小图1-3）。此外，CRIg抗体与C3b共定位至细胞表面（结果未显示）。将细胞从4°C转移至37°C，然后于37°C温育10分钟（图56,B），导致CRIg抗体和C3b快速内在化进入位于细胞外围的运铁蛋白+内体区室（图56,B，小图1-4，箭状物），接近Lamp1+区室（箭状物，图57,D，小图1-4）。延长追踪时间直至24小时，CRIg仍定位在内体区室内，而且没有在溶酶体中降解（结果未显示）。将巨噬细胞与抗CRIg抗体一起温育不影响CRIg分布，因为内在化的CRIg抗体与固定后用多克隆抗体检测到的CRIg全部集合完全交叠（图57,C，小图1-3），不依赖培养基中C3的存在（图57,C，小图4）。总之，这些结果表明，再循环和早期内体上存在CRIg，而且在不存在配体或交联抗体时发生CRIg的内在化。
由于C3b和iC3b大部分沉积在暴露于血清的颗粒上(Brown,Curr.Opin.Immunol.3:76-82(1991))，所以接下来我们探究了C3调理颗粒的吞噬过程中CRIg阳性内体在巨噬细胞中的定位。在遭遇iC3b调理的绵羊红细胞(E-IgM)时，CRIg从运铁蛋白阳性囊泡迅速（10分钟）重新分布到正在形成的吞噬体，表现为环绕所吞没红细胞的环（图56,C，小图1和4，箭状物）。将巨噬细胞与C3调理的颗粒一起温育后2小时，吞噬体就成熟了，表现为它们易位进入溶酶体区室（图56,C，小图5-8）。CRIg在围绕C3调理颗粒的吞噬体膜上高表达（图56,C，小图5和8，箭状物），大多数巨噬细胞不再存在于运铁蛋白+内体区室内。尽管CRIg仍存在于溶酶体区室中的一部分吞噬体上，但是其表达与LAMP-1的表达不交叠（图56,C，小图7和8，箭头）。LAMP-1+膜中不存在CRIg不大可能是由于溶酶体对CRIg的降解，因为蛋白酶抑制剂在温育期间持续存在。在一些已经摄取E-IgM但缺乏CRIg+吞噬体的巨噬细胞中，CRIg+与运铁蛋白+区室共定位（粗箭状物，图56,C，小图5和8，粗箭状物），表明在E-IgM转移至溶酶体区室后，CRIg+回到再循环区室。
总之，这些结果表明，CRIg从内体募集到颗粒摄取位点，参与吞噬体形成的初期，但是在吞噬体-溶酶体融合时，CRIg从吞噬体逃离回到内体区室。
实施例21：缺乏CRIg的小鼠易患单核细胞增生利斯特氏菌感染
材料和方法
1.微生物、小鼠感染及通过CFU计数测定的利斯特氏菌生长评估
所有试验使用有毒力的单核细胞增生利斯特氏菌(LM)(ATCC菌株43251)。通过在BALB/c小鼠中连续传代来维持细菌毒力。从受感染脾获得新鲜分离物，在脑心浸液（液态）或脑心浸液平板(Difco Laboratories,Detroit,MI)中培养。将细菌反复洗涤，重悬于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)，然后在含40%甘油的PBS中分成小份保存于-80°C。将小鼠以不同剂量在尾静脉中静脉内接种单核细胞增生利斯特氏菌。为了观察细菌在各种器官中的生长，我们给小鼠静脉内注射1x104个菌落形成单位(CFU)的利斯特氏菌，该剂量对CRIg敲除小鼠或CRIg野生型小鼠都不会致死。通过将10倍连续稀释液在脑-心浸液琼脂(Difco Laboratories)平板上铺涂，测定接种物、肝和脾匀浆物、及受感染细胞中的活细菌数。于37°C温育24小时后，对CFU数计数。
2.测定Kupffer细胞中的利斯特氏菌-A488摄取
用A-488标记试剂盒依照制造商的说明书(Molecular Probes,Oregon)标记活的单核细胞增生利斯特氏菌。通过菌落计数评估标记流程后活的利斯特氏菌数。给CRIg野生型小鼠或CRIg敲除小鼠静脉内注射1千万个CFU的LM。1小时后，依照上文所述方法灌注肝和分离Kupffer细胞。将细胞用PE标记的抗F4/80抗体染色，使用抗PE珠(Miletnyi)分离阳性细胞，接着用MoFlo流式细胞仪(DakoCytomation,Ft.Collins,CO)分选。将F4/80阳性细胞收集到盖玻片上，使用共聚焦和光学显微镜估算内在化的标记细菌数。对每张载玻片上4个不同视野的400个细胞中每个细胞的细菌数计数。吞噬细胞指数如下计算，每个细胞的细菌数的平均值乘以含至少1个细菌的kupffer细胞的百分率。结果显示了从四只不同动物获得的吞噬细胞指数的平均值和标准偏差。
结果
根据CRIg与C3b/iC3b调理颗粒的结合，为了探究CRIg在体内在补体调理颗粒的吞噬作用中的作用，将CRIg野生型小鼠和CRIg敲除小鼠感染不同剂量的单核细胞增生利斯特氏菌(LM)，它是一种革兰氏阳性兼性细菌，在暴露于血清时，激活补体旁路途径，该途径主要将C3b和iC3b沉积在细菌表面上(Croize et al.,Infec.Immunol.61:5134-5139(1993))。CRIg敲除小鼠对LM感染明显更易感，表现为致死率升高（图58,A）。相反，CRIg-Ig融合蛋白预处理提高CRIg野生型小鼠而非CRIg敲除小鼠的易感性（图62）。
符合CRIg在补体C3调理颗粒的结合和吞噬中的作用，CRIg敲除小鼠在从血液中清除LM方面降低，导致脾和肺中LM荷载增加（图58,B）。受感染小鼠肝和心中LM荷载也减少，这可能反映了这些组织中存在表达CRIg的巨噬细胞（图58,B）。CRIg敲除小鼠中炎性应答升高，表现为IFN-γ、TNF-α及IL-6的血清水平升高（图58,C）。与清除C3调理颗粒对CRIg的要求一致，与CRIg野生型KC相比，CRIg敲除KC表现出LM的结合和吞噬显著减少（图58,D）。最后，在CRIg敲除小鼠血液中检测到的利斯特氏菌荷载的升高依赖于C3，因为C3敲除小鼠的感染消除了CRIg敲除小鼠与CRIg野生型小鼠之间的细菌滴度差异（图58,E）。有趣的是，与C3充足小鼠相比，C3敲除小鼠的细菌循环水平显著较低，这有可能反映了对C3敲除小鼠中利斯特氏菌清除负责的不依赖C3的机制参与度升高。然而，缺乏C3时的快速清除不导致长期的有效清除病原体，因为C3缺陷小鼠在革兰氏阳性细菌感染后2天内死亡(Cunnion et al.,J.Lab.Clin.Med.143:358-365(2004))。这些结果有力的说明，在肝Kupffer细胞上表达的CRIg在从循环系统中快速清除补体C3调理的病原体中发挥至关重要的作用。
实施例22：用huCRIg分子抑制补体介导的免疫溶血
完全清楚了，兔红细胞特异性激活补体旁路途径，导致C5b-9复合物溶解细胞(Polhill,et al.,J.Immunol.121(1):363-370(1978))。具体而言，兔红细胞启动旁路补体级联反应，导致形成的MAC引起这些细胞的溶解。如果测试化合物能够抑制旁路途径，那么将试剂加到浸泡在血清（在这种情况中是猕猴或人C1q消减血清）中的兔红细胞应该能够防止细胞溶解。这可通过监测由溶解的红细胞释放的血红蛋白引起的412nm波长处的吸光度变化来评估。在猕猴血清试验中，从猕猴的股静脉采集血液。不使用抗凝剂。使样品于室温凝结。将样品离心，收集血清，保存在设定维持-60°C至-80°C的冰箱中。将兔红细胞(RRBC)用GVB(1x佛罗拿缓冲液(Biowhittaker),0.1%明胶)洗涤3遍，用GVB重悬至1x109/ml。加入GVB、huCRIg（短型或长型，或者长ECD），接着加入10μl GVB+/EGTA(GVB,0.1M EGTA,0.1M MgCl2)。加入10μl猕猴血清或C1q消减血清(Quidel)，然后加入10μl RRBC，将混合液弹指混合。在温室中于37°C振摇温育45分钟后，加入250μl GVB/10mMEDTA，将混合液以2500rpm离心5分钟。使用250μl等分试样，于412nm处读数。图63A和63B（猕猴血清）及图64-66（人血清）所示结果证明，所试CRIg化合物抑制补体。
hST-L:人CRIg-长
hST-S:人CRIg-短
hST-L ECD:人CRIg-长ECD
hPIGR:人多聚免疫球蛋白受体
fH:补体因子H
实施例23：在脉络膜新血管形成小鼠模型中测试鼠CRIg-Fc融合蛋白
脉络膜新血管形成(CNV)可通过激光灼伤视网膜而实验诱发。在本研究中，将40只C57BL-6小鼠(Charles River Laboratory)分为两个处理组。
第1组（对照）：在第-1、1、3和5天，腹膜内注射12mg/kg gp120mIgG1。
第2组：在第-1、1、3和5天，腹膜内注射12mg/kg鼠CRIg(mCRIg)。
每个组的动物通过皮下(s.c.)注射氯胺酮(25mg/g)和赛拉嗪(1.28mg/g)混合物麻醉。用一滴1%托吡卡胺放大瞳孔。然后将动物固定在塑料模具中。用二极管激光（100μm光点直径）在眼中视神经周围产生3个激光照射斑点，使用OcuLight GL二极管激光（532nm）、Zeiss30W裂隙灯和显微操作器。右眼用120mW、0.1秒及100μm裂隙大小照射激光。激光照射斑点除形成的泡表明Brach氏膜破裂。
激光照射处理后7天，使用共聚焦显微镜检术评估激光照射斑点。此时，将动物用异氟烷麻醉，穿过心灌注0.5ml含50mg/ml荧光素标记右旋糖苷(Sigma)的PBS。摘除眼，用10%磷酸盐缓冲福尔马林固定，弃除视网膜，将剩余的眼杯状物(eye cup)平置于载玻片上。组织病理学检查包括脉络膜平铺标本的补体片段和弹性蛋白的免疫组化染色，及通过共聚焦显微镜检术监测眼中FITC-右旋糖苷染色血管系统来分析CNV复合物的大小。
结果显示于图71A和71B，其中右眼中的烧伤孔分别按照0-3及0-5的评分标准评分。
实施例24：在遭受激光诱发的视网膜损伤的猕猴中测试CRIg ECD和CRIg-Fc融合蛋白
在本研究中使用24只猕猴，全部雄性或全部雌性，或者12只雄性和12只雌性。这些动物年龄为2-7岁，重量为2-5kg。
表2
组的命名和剂量水平
施药经由头静脉的静脉内注射。动物在激光处理前至少服药一次，在研究的剩余时间每周三次。剂量根据最近记录的体重确定，在10-15mg/kg范围内。
在第4天，所有动物每只眼的黄斑通过CORL接受激光处理，用532nm二极管绿色激光灼烧(OcuLight GL,IRIDEX Corp Inc,Mountain View,California)，使用裂隙灯投递系统及Kaufman-Wallow(Ocular Instruments Inc.,Bellevue,Wash)平底隐形眼镜。激光及支持设备由CORL供应。将动物用氯胺酮和赛拉嗪麻醉。9个区域对称分布于每只眼的黄斑中。激光参数包括75微米光点直径和0.1秒持续时间。通过生成水泡和少量出血的能力评估所用功率。除非在第一次激光处理时就观察到出血，否则第二个激光斑点遵循相同的激光处理流程（除调整瓦数外）置于第一个附近。对于不邻近凹的区域，初次功率设为500mW；如果设置第二个斑点，功率定为650mW。对于邻近凹的区域，功率设为400mW（初次）和550mW（第二次）。根据眼科医生的判断，可根据激光照射时观察到的情况调整功率设置。
临床眼科检查
每只动物在处理开始前及第8、15、22和29天各进行一次临床眼科检查。将动物用氯胺酮麻醉，用散瞳剂放大眼（瞳孔）。使用裂隙灯生物显微镜检查双眼的附件和前部。使用间接检眼镜检查双眼眼底。根据眼科医师的判断，可使用其它合适的仪器检查眼睛，可拍照。
眼睛拍照
在激光处理当天（激光处理后）、服药期1第10、17、24和31天、及服药期2第6天（尸检当天)各进行一次眼睛拍照(OP)。在服药期1期间同时进行荧光素血管造影术时，首先进行OP。
将动物用氯胺酮麻醉，在同时进行荧光素血管造影术时用异氟烷麻醉剂保持麻醉，单独进行时（即激光处理后）用氯胺酮和赛拉嗪麻醉。用散瞳药放大眼（瞳孔）。对每只眼进行彩色照相，包括视网膜和相关眼异常、后极的立体照相、及两个中度-周边视野(mid-peripheral field)（颞部和鼻部）的非立体照相。
荧光素血管造影术
所有动物在处理开始前及服药期1第10、17、24和31天（激光照射后第6、13、20和27天）各进行一次荧光素血管造影术。
使动物在荧光素血管造影术之前禁食。将动物用氯胺酮麻醉，用异氟烷维持麻醉，用散瞳药放大眼（瞳孔）。给动物插管，因为荧光素注射后可能呕吐。给动物静脉内注射荧光素。荧光素注射开始和结束时拍照。荧光素注射后，对右眼的后极进行系列快速立体照相，接着在1分钟前对左眼的后极作立体照相配对，然后对每只眼睛都进行，在约1-2和5分钟。在大约2-5分钟之间，对每只眼的中度-周边视野（颞部和鼻部）进行非立体照相。如果在5分钟时间点观察到荧光素渗漏，在大约10分钟做立体照相配对。
依照如下分级系统进行荧光素血管造影照片评估，用于证明过度通透性（荧光素渗漏）或任何其它异常。
Figure BDA00003310730701111
认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明的范围不受所保藏构建物的限制，因为所保藏实施方案意图作为本发明某些方面的单一例证，任何功能相当的构建物都在本发明的范围内。本文中的材料保藏不构成承认本文中所包含的书面说明不足以能够实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，也不应解释为将权利要求的范围限制于它所呈现的具体例证。
实际上，根据前述描述，除了本文所显示和描述的，本发明的各种更改对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。
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Claims (11)

1.CRIg多肽或包含与免疫球蛋白序列融合的CRIg多肽的CRIg免疫粘附素在制备用于在哺乳动物中抑制C3b补体片段生成的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述CRIg多肽选自SEQ ID NO:2,4,6,8的CRIg多肽和所述多肽的胞外区。
3.权利要求2的用途，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白恒定区序列。
4.权利要求3的用途，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是免疫球蛋白重链的。
5.权利要求4的用途，其中所述免疫球蛋白重链恒定区序列与SEQ IDNO:2,4,6或8的CRIg多肽的胞外区融合以生成CRIg-Ig融合蛋白。
6.权利要求5的用途，其中所述免疫球蛋白恒定区序列是IgG的。
7.权利要求6的用途，其中所述IgG是IgG-1或IgG-3。
8.权利要求7的用途，其中所述IgG-1重链恒定区序列至少包含铰链、CH2和CH3区。
9.权利要求7的用途，其中所述IgG-1重链恒定区序列包含CH1、铰链、CH2和CH3区。
10.CRIg多肽或包含与免疫球蛋白序列融合的CRIg多肽的CRIg免疫粘附素在制备用于在哺乳动物中选择性抑制补体旁路途径的药物中的用途。
11.一种制备CRIg敲除小鼠的方法，包括制备CRIg敲除胚胎干细胞，即通过电穿孔将外显子1用新霉素抗性基因置换的线性化寻靶载体导入C2B6胚胎干(ES)细胞；选择对新霉素有抗性的克隆，通过Southern印迹验证同源重组；将两个靶向克隆注射到C57VL/6胚泡中，转移到假孕的代孕母兽中，将所得雄性嵌合小鼠与C57BL/6雌性小鼠交配以获得+/-小鼠；通过Southern印迹分析或来自F1子代的尾部DNA验证2ES克隆的种系传递；进行+/-小鼠杂交以生成-/-CRIg小鼠；为了通过PCR方法进行常规基因分型，使用公用有义引物5'-CCACTGGTCCCAGAGAAAGT-3'及野生型特异性反义引物5'-CACTATTAGGTGGCCCAGGA-3'和敲除特异性反义引物5'-GGGAGGATTGGGAAGACAAT-3'，对野生型等位基因扩增出306bp片段而对突变型等位基因扩增出406bp片段。
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