ES2534675T3 - Polipéptido CRIg para la prevención y el tratamiento de trastornos asociados al complemento - Google Patents

Abstract

Un polipéptido CRIg, o una inmunoadhesina CRIg que comprende un polipéptido CRIg fusionado a una secuencia de inmunoglobulina, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección ocular asociada al complemento, en donde el polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg son un inhibidor selectivo de la ruta alternativa del complemento.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido CRIg para la prevención y el tratamiento de trastornos asociados al complemento.

Campo de la invención 5

La presente invención concierne a un receptor específico de macrófagos recientemente descubierto, CRIg (anteriormente denominado STIgMA), y a su uso en la prevención y/o el tratamiento de afecciones oculares asociadas al complemento, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) y la neovascularización coroidal (NVC). 10

Antecedentes de la invención

El sistema del complemento es una cascada compleja de enzimas constituido por una serie de glucoproteínas séricas que normalmente existen en forma de proenzima inactiva. Tres rutas principales, la ruta clásica y la ruta 15 alternativa, que convergen al nivel de C3, pueden activar el complemento, donde dos convertasas de C3 similares escinden C3 en C3a y C3b. También se ha descrito una ruta adicional, la ruta de la lectina de unión a manosa (LUM).

Los componentes de la ruta clásica se identifican con una C y un número (por ejemplo, C1, C3). Debido a la 20 secuencia en la que estos se identificaron, los cuatro primeros componentes están numerados C1, C4, C2 y C3. Los componentes de la ruta alternativa se indican con letras (por ejemplo B, P, D). Los fragmentos de escisión se designan con una letra minúscula después de la designación del componente (por ejemplo, C3a y C3b son fragmentos de C3). El fragmento C3b inactivo se designa como iC3b. Las cadenas polipeptídicas de las proteínas del complemento se designan con una letra griega después del componente (por ejemplo, C3 y C3, las cadenas  25 y  de C3). Las abreviaturas de los receptores de la membrana celular de C3 son CR1, CR2, CR3 y CR4.

La ruta clásica del sistema del complemento es un efector principal de la rama humoral de la respuesta inmunitaria humana. El desencadenante activador de la ruta clásica y de la ruta LUM (lectina de unión a manosa) es el anticuerpo de IgG o de IgM unido a antígenos o a lectinas en las células diana. La unión del anticuerpo al antígeno 30 expone un sitio del anticuerpo que es un sitio de unión para el primer componente del complemento, C1. C1 se une a las regiones expuestas de al menos dos anticuerpos unidos a antígeno, y como resultado, se activan sus subunidades C1r y C1s. La subunidad C1s activada es responsable de la escisión de los dos siguientes componentes del complemento implicados, C4 y C2. C4 se escinde en dos fragmentos, de los cuales la molécula más grande de C4b, se une a la membrana diana cercana, mientras que la molécula pequeña de C4a se retira. Un 35 sitio expuesto en C4b depositado está disponible para interaccionar con el siguiente componente del complemento, C2. Inmediatamente como en la etapa anterior, C1s activado escinde la molécula de C2 en dos partes, de las cuales permanece el fragmento C2a, mientras el fragmento más pequeño C2b, se retira. C4b2a, también conocida como convertasa C3, permanece unida a la membrana. Esta convertasa C3 convierte el siguiente componente del complemento, C3 en su forma activa. 40

La activación de la ruta alternativa del complemento comienza cuando C3b se une a la pared celular y a otros componentes celulares de los patógenos y/o a anticuerpos de IgG. Después, el factor B se combina con C3b unido a la célula y forma C3bB. C3bB se separa después en Bb y Ba mediante el factor B, para la formación de la convertasa de C3 de la ruta alternativa, C3bBb. La properdina, una proteína sérica, se une después a C3bBb y 45 forma C3bBbP que actúa como una convertasa de C3, que separa enzimáticamente moléculas de C3 en C3a y C3b. En este punto, se activa la ruta alternativa del complemento. Parte de C3b se une a C3bBb para formar C3bBb3b, que es capaz de separar moléculas de C5 en C5a y C5b.

La ruta alternativa es una ruta de autoamplificación y es importante en la eliminación y el reconocimiento de 50 bacterias y otros patógenos en ausencia de anticuerpos. La ruta alternativa también puede amplificar la activación del complemento después de la activación inicial del complemento mediante cualquiera de la ruta de la lectina y/o clásica. La etapa limitante de la velocidad de activación de la ruta alternativa en seres humanos es la acción enzimática del factor D en la escisión del factor B para formar la convertasa de C3 de la ruta alternativa, C3bBb. (Stahl et al., American Journal of Pathology 162: 449-455 (2003)). Existen pruebas contundentes sobre el papel de la 55 activación y deposición del complemento en la artritis inducida por adyuvante (AIA), y en la artritis inducida por colágeno (AIC) y en diversas otras enfermedades y afecciones.

Recientemente, el control defectuoso de la ruta alternativa se ha implicado en el desarrollo de enfermedades renales y oculares, incluyendo el síndrome urémico hemolítico (SUH) y la DMRE (Zipfel et al., Mol. Immunol. 43: 97-106 60 (2006), disponible en línea en
www.sciencedirect.com). Se ha descubierto que C3 es esencial para el desarrollo de NVC en ratones (Bora et al., J. Immunol. 174(1): 491-7 (2005)).

También es muy conocido el papel del sistema del complemento en afecciones inflamatorias y daño asociado a tejidos, enfermedades inmunitarias y enfermedades asociadas al complemento. 65

Se ha sugerido que la ruta alternativa juega un papel importante en la inflamación (Mollnes et al., Trends in Immunology 23: 61-64 (2002)), en el daño tisular local y remoto después de isquemia y reperfusión (Stahl et al., anteriormente mencionado); síndrome de diestrés respiratorio del adulto (SDRA, Schein et al.; Chest 91: 850-854 (1987)); activación del complemento durante la cirugía de derivación cardiopulmonar (Fung et al, J Thorac Cardiovasc Surg 122: 113-122 (2001)); dermatomiositis (Kissel, JT et al, NEJM 314: 329-334 (1986)); y pénfigo 5 (Honguchi et al. J Invest Dermatol 92: 588-592 (1989)). La ruta alternativa del complemento también se ha implicado en enfermedades autoinmunitarias, tales como, por ejemplo, nefritis lúpica y glomerulonefritis y vasculitis resultante (véase, por ejemplo, Watanabe et al., J. Immunol. 164: 786-794 (2000)); y artritis reumatoide, tal como artritis reumatoide juvenil (Aggarwal et al., Rheumatology 29: 189-192 (2000); y Neumann E. et al, Arthritis Rheum. 4: 934-45 (2002)). 10

El aumento local de la deposición y activación del complemento se correlaciona con la gravedad de la enfermedad (Atkinson, J Clin Invest 112: 1639-1641 (2003)). Se han sometido a ensayo antagonistas del receptor de C5a, tales como péptidos y moléculas orgánicas pequeñas, para el tratamiento de la artritis (Woodruf et al., Arthritis & Rheumatism 46(9): 2476-2485 (2002)), y diversas otras enfermedades inmunoinflamatorias (Short et al., Br J 15 Pharmacol 126: 551-554 (1999); Finch et al., J Med Chem 42: 1965-1074 (1999)); y compañías, tales como Promics (Australia), han llevado a cabo ensayos clínicos en seres humanos para ensayar la eficacia de antagonistas de C5a en indicaciones similares. C5a también está implicado en dermatomiositis y pénfigo (Kissel, JT et al, NEJM 314:329-334 (1986)). Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales anti-C5a que reducen la disfunción endotelial coronaria inducida por derivación cardiopulmonar y cardioplegia (Tofukuji et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116: 20 1060-1069 (1998)), previenen la artritis inducida por colágeno y mejoran la enfermedad establecida (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. A 92(19): 8955-8959 (1995)).

La opsonofagocitosis, el proceso de deposición de fragmentos del complemento en la superficie de partículas y la captación posterior por células fagocíticas, es crucial para la eliminación de partículas circulantes que incluyen 25 complejos inmunitarios, células apoptóticas o desechos celulares y patógenos (Gasque, P., Mol Immunol. 41: 1089-1098 (2004)). Se sabe que los macrófagos residentes en los tejidos juegan un papel importante en la eliminación de partículas, mediada por complemento, de la circulación. Las células de Kupffer, que constituyen más del 90 % de los macrófagos residentes en los tejidos, están continuamente expuestas a la sangre de la vena porta hepática y están estratégicamente situadas en los sinusoides hepáticos para eliminar eficazmente del tracto gastrointestinal, virus, 30 células tumorales, bacterias, hongos, parásitos y sustancias nocivas opsonizadas. Este proceso de eliminación depende en gran parte de la presencia del complemento C3 como una opsonina (Fujita et al., Immunol. Rev. 198: 185-202 (2004)). Después de la unión a las superficies bacterianas por medio de un tioéster, C3 se escinde y amplifica la ruta alternativa del complemento. Esta reacción conduce a la deposición adicional de fragmentos C3 que pueden servir como ligandos para receptores del complemento en macrófagos. La importancia de esta ruta se 35 muestra por la alta susceptibilidad de los seres humanos que carecen de C3 a infecciones bacterianas y víricas.

Los receptores del complemento caracterizados hasta ahora, CR1, 3 y 4 internalizan C3b y fagocitan partículas opsonizadas de C3 solo después de la activación de PKC o de la estimulación del receptor de Fc (Carpentier et al., Cell Regul 2, 41-55 (1991); Sengelov, Crit. Rev. Immunol.15: 107-131 (1995); Sengelov et al., J. Immunol.153: 804-40 810 (1994). Además, CR1 no se expresa en la superficie de células de Kupffer murinas (Fang et al., J. Immunol. 160: 5273-5279 (1998). Hasta ahora, no se han descrito receptores del complemento que ayuden a las CK en la eliminación constitutiva de partículas circulantes.

Se ha notificado que el anticuerpo anti-C3b(i) potencia la activación del complemento, la deposición de C3b(i), y la 45 destrucción de células CD20+ por rituximab (Kennedy et al., Blood 101(3): 1071-1079 (2003)).

En vista de la implicación conocida de la cascada del complemento en una diversidad de enfermedades, existe una necesidad para la identificación y el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas al complemento. 50

El documento WO 94/16719 A divulga un método para tratar enfermedades asociadas con inflamación o con activación inapropiada del complemento, que comprende la administración de una proteína CR1 soluble (receptor del complemento de tipo 1) y un éster de amidinofenilo o amidinonaftilo.

55

El documento WO 2004/028635 divulga un método para suministrar a la retina una proteína, tal como el factor del complemento CD59, para el tratamiento de trastornos de la retina, que incluyen desprendimiento de retina, retinopatía diabética, neovascularización retiniana, neovascularización coroidal y edema retiniano incluyendo edema macular.

60

El documento WO 00/53758 A2 divulga un método para tratar un trastorno relacionado con el sistema inmunitario, tal como un trastorno mediado por linfocitos T, administrando un polipéptido, tal como un polipéptido PRO362, un anticuerpo agonista del mismo, un anticuerpo antagonista del mismo o un fragmento del mismo. Los polipéptidos pueden fusionarse con una inmunoglobulina, incluyendo las regiones bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. 65

El documento WO 2004/022594 desvela ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que modulan respuestas inmunitarias, incluyendo un péptido de SEC ID Nº 42, y su uso en métodos para tratar enfermedades autoinmunitarias o enfermedades que se benefician de una respuesta inmunitaria potenciada o reducida.

El documento WO 01/36432 divulga proteínas humanas secretadas, incluyendo una proteína de SEC ID Nº 63, y el 5 uso de los péptidos, o agonistas o antagonistas de la misma, para el tratamiento de enfermedades del sistema inmunitario.

Rollins y Sims, J. Immunol 144(9): 3478-3483 (1990) divulgan la actividad inhibidora del complemento de CD59.

10

Johnson et al. Experimental Eye Research 73(6): 887-896 (2001) divulgan la activación del complemento y los procesos inflamatorios en la formación de drusas y degeneración macular relacionada con la edad.

Zhang et al., Diabetes 51(12): 3499-3504 (2002) divulgan la activación precoz del complemento y la disminución de niveles de inhibidores del complemento anclados a glucosilfosfatidilinositol en retinopatía diabética experimental y en 15 seres humanos.

Walker, Biochimica et, Biophysica Acta 1574: 387-390(2002) desvelan que la Ig Z39 se expresa conjuntamente con genes de macrófagos activados.

20

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la identificación de un nuevo miembro de la familia de receptores del complemento y del primer miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina (Ig) que interacciona con el sistema del complemento.

25

En un aspecto, la invención concierne a un polipéptido CRIg, o a una inmunoadhesina CRIg, que comprende un polipéptido CRIg fusionado a una secuencia de inmunoglobulina, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección ocular asociada al complemento, en la que el polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg es un inhibidor selectivo de la ruta alternativa del complemento.

30

La afección ocular asociada al complemento puede ser, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), neovascularización coroidal (NVC), uveítis, retinopatía diabética y otra relacionada con isquemia, endoftalmitis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis ocular, Oclusión de la Vena Central de la Retina (OVCR), neovascularización corneal y neovascularización retiniana. Preferentemente, la afección ocular asociada al complemento es DMRE o NVC, incluyendo todas las fases de estas 35 afecciones.

En todas las realizaciones, el polipéptido CRIg puede seleccionarse, por ejemplo, entre los polipéptidos CRIg de las SEC ID Nos: 2, 4, 6 y 8, y los dominios extracelulares (DEC) de dichos polipéptidos. El polipéptido CRIg, incluyendo los polipéptidos de longitud completa y sus DEC, pueden fusionarse a una secuencia de inmunoglobulina, tal como 40 una secuencia de región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, por ejemplo, la región Fc, y las inmunoadhesinas resultantes, pueden usarse como un agonista de CRIg, en métodos preventivos y de tratamiento. Preferentemente, la inmunoglobulina es una IgG, tal como IgG-1 o IgG-2, o IgG-3, o IgG-4, más preferentemente, IgG-1 o IgG-3. La secuencia de región constante de la cadena pesada de la IgG1 puede comprender, por ejemplo, al menos la región bisagra CH1, CH2 y CH3, o la región bisagra CH2 y CH3. 45

En un aspecto adicional, la invención concierne a un polipéptido CRIg, o a una inmunoadhesina CRIg que comprende un polipéptido CRIg fusionado a una secuencia de inmunoglobulina, para su uso en la prevención del desarrollo o progresión de la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) en un sujeto con riesgo de desarrollar una DMRE o que presenta un diagnóstico de DMRE en al menos un ojo. 50

En otro aspecto, la invención concierte a un polipéptido CRIg, o a una inmunoadhesina CRIg que comprende un polipéptido CRIg fusionado a una secuencia de inmunoglobulina, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) seca.

55

En todas las realizaciones, el sujeto puede ser un mamífero, tal como un paciente humano.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1B muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de un polipéptido CRIg humano de 60 321 aminoácidos (SEC ID Nos: 1 y 2, respectivamente).

Las Figuras 2A-2B muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la forma larga de longitud completa de 399 aminoácidos del CRIg humano nativo (huCRIg o huCRIg-largo; SEC ID Nos: 3 y 4, respectivamente).

Las Figuras 3A-3B muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la forma corta de 305 65 aminoácidos del CRIg humano nativo (huCRIg-corto, SEC ID Nos: 5 y 6, respectivamente).

Las Figuras 4A-4C muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del CRIg murino nativo (muCRIg, SEC ID Nos: 7 y 8, respectivamente) de 280 aminoácidos.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos del huCRIg de longitud completa (SEC ID Nº: 4) y del huCRIg-corto (SEC ID Nº: 6) en alineamiento con muCRIg (SEC ID Nº: 8). Se muestran la secuencia señal hidrófoba, IgV, la IgC y las regiones transmembrana. muCRIg tiene un único sitio de glucosilación ligada a N predicho en la 5 posición 170 (NGTG). Se indican los límites del domino de Ig, deducidos de los límites exón-intrón del gen de CRIg humano.

La Figura 6 muestra la hibridación in situ de CRIg en secciones congeladas de hígado de ratón.

La Figura 7 muestra la hibridación in situ de CRIg en secciones congeladas de hígado humano.

La Figura 8 muestra la hibridación in situ de CRIg en macrófagos activados de colon y adrenales, en células de 10 Kupffer y en células de Hofbauer placentarias.

La Figura 9 muestra la hibridación in situ del ARNm de CRIg en células sinoviales de AR.

La Figura 10 muestra la hibridación in situ del ARNm de CRIg en células de la microglia cerebral.

La Figura 11 muestra la hibridación in situ del ARNm de CRIg en células de tejido asmático de seres humanos.

La Figura 12 muestra la hibridación in situ del ARNm de CRIg en células de tejido de hepatitis crónica en seres 15 humanos.

La Figura 13 muestra el análisis inmunohistoquímico de CRIg en macrófagos de la glándula adrenal.

La Figura 14 muestra el análisis inmunohistoquímico de CRIg en células de Kupffer hepáticas.

La Figura 15 muestra el análisis inmunohistoquímico de CRIg en células de la microglia cerebral.

La Figura 16 muestra el análisis inmunohistoquímico de CRIg en células de Hofbauer placentarias. 20

La Figura 17 muestra un análisis de transferencia de Northern que muestra la expresión de huCRIg en una variedad de tejidos. Dos transcritos de 1,5 y 1,8 kb estaban presentes en los tejidos humanos que expresaban CRIg.

Figura 18. (A) Análisis de PCR TAQMAN™ que muestra el aumento de la expresión de huCRIg en líneas celulares mielomonocíticas HL60 y THP-1 y en macrófagos diferenciados. Se encontraron bajos niveles de 25 expresión en las líneas de linfocitos T Jurkat, MOLT3, MOLT4 y en linfocitos B RAMOS. (B) Aumento de la expresión del ARNm de huCRIg durante la diferenciación in vitro de monocitos. Monocitos aislados de sangre periférica humana se diferenciaron adhiriéndolos a plástico durante un periodo de 7 días. El ARN total se extrajo en diferentes momentos durante la diferenciación. (C) Aumento de la expresión de la proteína huCRIg durante la diferenciación de monocitos en macrófagos. Los monocitos se trataron tal como se indica en (B), los lisados 30 celulares completos se procesaron en un gel y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa que se incubó con un anticuerpo policlonal (4F7) contra huCRIg. El anticuerpo policlonal reconoció una banda de 48 kDa y otra de 38 kDa que posiblemente representaban la forma larga y corta de huCRIg.

Figura 19. Caracterización molecular de la proteína huCRIg en líneas celulares. (A) La proteína huCRIg-gd se expresó transitoriamente en células HEK293, se inmunoprecipitó con anti-gd y las transferencias se incubaron 35 con anti-gd o con un anticuerpo policlonal contra el dominio extracelular de CRIg. (B) La proteína huCRIg expresada en células HEK293 es una proteína monomérica N-glucosilada. La tirosina de CRIg está fosforilada después del tratamiento de las células HEK293 con pervanadato sódico pero no atrae a la Syk quinasa. La proteína CRIg fosforilada migra a un peso molecular ligeramente mayor en comparación con la CRIg no fosforilada. 40

Figura 20. Expresión selectiva de huCRIg en macrófagos derivados de monocitos humanos. Las células mononucleares de sangre periférica se tiñeron con anticuerpos específicos para linfocitos citolíticos naturales, B, T, monocitos y con un anticuerpo monoclonal (3C9) conjugado con ALEXA™ A488 contra CRIg. La expresión estuvo ausente en todos los leucocitos de sangre periférica así como en células dendríticas derivadas de monocitos, pero se expresó en macrófagos diferenciados in vitro. 45

Figura 21. La expresión de la proteína y del ARNm de CRIg se aumentó con IL-10 y dexametasona. (A) La PCR en tiempo real muestra el aumento de la expresión del ARNm de CRIg después del tratamiento con IL-10, TGFβ y se indujo altamente con dexametasona pero se reguló negativamente por tratamiento con LPS, IFN, y TNF (B) Las células mononucleares de sangre periférica separadas por Ficoll se trataron con diversas citocinas y dexametasona durante 5 días y se tiñeron doblemente con anti-CD14 y anti-CRIg. El análisis de flujo mostró un 50 aumento drástico en la expresión de CRIg en la superficie de monocitos tratados con dexametasona y después del tratamiento con IL-10 y LPS.

Figura 22. Localización subcelular de CRIg en macrófagos derivados de monocitos. Los monocitos se cultivaron durante 7 días en medio de diferenciación de macrófagos, se fijaron en acetona y se tiñeron con anticuerpo policlonal anti-CRIg 6F1 o CD63 y anti-conejo de cabra secundario conjugado con FITC. Las células se 55 estudiaron en un microscopio confocal. Se encontró CRIg en el citoplasma donde se localiza conjuntamente con la proteína de membrana lisosomal CD63. CRIg también se expresó en los bordes posterior y delantero de los macrófagos con un patrón similar al de la F-actina. Barra de escala =10 m.

Figura 23. Localización de ARNm de CRIg en enfermedades inflamatorias crónicas. La hibridación in situ mostró la presencia de ARNm de CRIg en macrófagos alveolares obtenidos de tejido de un paciente con neumonía (A, 60 B) o de un paciente con asma crónica (C, D). El ARNm de CRIg también se expresó en células de Kupffer hepáticas en tejido obtenido de una biopsia de hígado de un paciente con hepatitis crónica (E, F).

Figura 24. La expresión de ARNm de CRIg estaba aumentada en sinovio inflamado. El ARNm de CRIg fue bajo o estaba ausente en las membranas sinoviales de una articulación obtenida de una sustitución de rodilla de un paciente que no tenía inflamación articular (A, C) pero que se expresaba altamente en células, posiblemente 65 sinoviocitos o macrófagos sinoviales, en el pannus de un paciente con osteoartritis (B, D).

Figura 25. Detección de la proteína CRIg con el anticuerpo policlonal 6F1 en células que revisten el sinovio de un paciente con enfermedad articular degenerativa (A, B, C). No se encontró detección inmunohistoquímica de CRIg en un sinovio control (D).

Figura 26. La proteína CRIg se expresó en un subtipo de macrófagos residentes en tejido y su expresión aumentó en enfermedades inflamatorias crónicas. (A) CRIg se expresó en la membrana de células CHO que 5 expresaban de manera estable CRIg. Se encontró alta expresión de la proteína CRIg en macrófagos alveolares (B) en tejidos obtenidos de un paciente con asma crónica. (C) Expresión de CRIg en histiocitos del intestino delgado humano. La sección se obtuvo de tejido extirpado quirúrgicamente y podría contener un neoplasma. (D) Expresión de la proteína CRIg en células de Hofbauer en placenta humana de pretérmino. La alta expresión de la proteína CRIg en macrófagos estaba presente en la glándula adrenal (E) y en las células de Kupffer de hígado 10 humano (F). Se realizó tinción en secciones de 5 m de espesor fijadas en acetona usando DAB como cromógeno. Las imágenes se fotografiaron a 20X y 40X aumentos.

Figura 27. Tinción inmunohistoquímica de CD68 y CRIg en una placa vascular obtenida de un paciente con aterosclerosis. Secciones consecutivas se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal contra CD68 humano (A, B) y un anticuerpo policlonal 6F1 suscitado contra la proteína CRIg humana (C, D). CRIg apareció en 15 una población de macrófagos y en células espumosas presentes en la placa aterosclerótica, y se solapó con los macrófagos CD68 positivos, tal y como se evalúa en la tinción de secciones consecutivas. Aumentos: 10X (A, C) y 20X (B, D).

Figura 28. Cotinción de CRIg y CD68 en macrófagos intersticiales de corazón. Se obtuvieron secciones de 5 m de un corazón humano (autopsia) y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal contra CRIg (3C9) y con un 20 anticuerpo secundario anti-ratón marcado con FITC. CD68 se detectó por tinción con un anticuerpo monoclonal contra CD68 marcado con PE. Aumentos: 20X.

Figura 29. Los niveles de ARNm de CRIg están significativamente elevados en tejido de colon obtenido de pacientes con colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar oclusiva crónica (EPOC) y asma. La PCR en tiempo real se realizó en el ARN total extraído de los diversos tejidos. El ARNm para CRIg estaba 25 significativamente aumentado en tejidos obtenidos de pacientes con colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y EPOC. El análisis estadístico se realizó usando el ensayo de la U de Mann-Whitney.

Figura 30. Las células que expresan la proteína CRIg humana mostraron una adherencia aumentada para las células endoteliales humanas. (A) CRIg se expresó de modo estable en una línea celular de linfocitos T Jurkat. (B) Las células se precargaron con el colorante fluorescente BCECF (Molecular Probes, Oregón) y se añadieron 30 a una placa de 96 pocillos recubierta con una monocapa de células endoteliales humanas de la vena del cordón umbilical (HUVEC) tratadas con o sin TNFα 10 ng/ml. Después de 3 lavados, se contó la fluorescencia en un espectrofluorómetro que indicaba el número de células que permanecían adheridas a las células HUVEC. La gráfica fue representativa de 4 experimentos independientes.

Figura 31. Inhibición de la progresión del modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (AIC) mediante la 35 proteína de fusión muCRIg IgG-Fc. Un grupo de ratones (AIC) (n=7) recibió 100 g de proteína de fusión muCRIg IgG-Fc (cuadrados), mientras que un grupo de ratones control AIC (n=8) recibió 100 g de IgG1 murina (círculos), 3 veces por semana durante 6 semanas. Se examinó a los ratones diariamente con respecto a los signos de inflamación y se recibieron una puntuación en una escala de 0-16 (detalles en el Ejemplo 25) y los resultados se representaron gráficamente (media  DT, valor p del ensayo de la T de Student=0,0004 para la 40 IgG1 control frente a la proteína muCRIg de ensayo).

La Figura 32 es la secuencia de nucleótidos del ADN42257 (secuencia consenso) (SEC ID Nº: 9).

La Figura 33 muestra la reducción de la hinchazón articular en ratones tratados con CRIg-Fc.

La Figura 34 muestra que muCRIg inhibe la inflamación articular.

La Figura 35 muestra la preservación del volumen del hueso cortical en articulaciones de ratones tratados con 45 muCRIg-Fc.

La Figura 36 muestra que el tratamiento con CRIg-Fc no altera el número ni la morfología de los macrófagos residentes en los tejidos.

La Figura 37 muestra que el tratamiento con muCRIg no afecta a los títulos de los anticuerpos anti-colágeno en suero. 50

La Figura 38 muestra que la proteína muCRIg no altera las respuestas de células B independientes de células T in vivo.

La Figura 39 muestra la infiltración de macrófagos en las articulaciones después de artritis inducida por anticuerpos (AIA), generada con la tinción F4/80 en articulaciones no descalcificadas congeladas.

La Figura 40 muestra que muCRIg-Fc previene la hinchazón articular después de artritis inducida por anticuerpos 55 en ratones Balb/c.

La Figura 41 muestra que muCRIg inhibe la inflamación articular en artritis inducida por anticuerpos.

La Figura 42 muestra la generación de ratones muCRIg genosuprimidos (knock-out).

La Figura 43 muestra que la proteína de fusión CRIg-Fc se une a glóbulos rojos de oveja opsonizados con C3 (E-IgM). 60

La Figura 44 muestra que la unión de CRIg-Fe humano a E-IgM es dependiente de C3.

La Figura 45 muestra la unión de partículas opsonizadas con suero con células CHO que expresan CRIg.

La Figura 46 muestra que la CRIg-Fc murina que se une a C3b y a C3bi del complemento pero no se une a C2, C4, C3c y C3d.

La Figura 47 muestra que la CRIg-Fc murina y humana se une a C3b, C3bi y C3c del complemento pero no se une a C1, C2, C4, C3a y C3d.

La Figura 48A muestra que la CRIg-Fc murina y humana inhiben la deposición de C3 sobre zimosano.

La Figura 48B muestra que la CRIg-Fc murina inhibe la activación de C3 en suero.

La Figura 49 muestra que la CRIg murina inhibe la hemólisis inducida por la ruta alternativa pero no afecta a la 5 hemólisis de la ruta clásica.

Figura 50, CRIg se expresa selectivamente en una subpoblación de macrófagos residentes en tejidos.

(A) CRIg es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas con un solo dominio transmembrana que consiste en uno (CRIg humano corto (huCRIg(C)) y CRIg murino (muCRIg) o dos dominios de 10 inmunoglobulina (huCRIgL). La escala de la parte superior del panel izquierdo indica el tamaño en aminoácidos. El panel de la derecha muestra que el huCRIg y el muCRIg están distantemente relacionados con la molécula A de adhesión funcional (JAM-A) y el antígeno A33. La escala de la parte superior del panel derecho indica el % de aminoácidos similares.

(B) CRIg se expresa en macrófagos pero no en monocitos. Se analizaron monocitos CD14+ humanos y 15 monocitos CD14+ cultivados durante 7 días en suero autólogo al 10 % y en suero bovino fetal al 20 % para la tinción de huCRIg por citometría de flujo usando un AcM anti-CRIg humano (3C9). Las células de Kupffer hepáticas CD11b+ y F4/80+ de ratón se analizaron para la tinción de muCRIg usando un AcM anti-muCRIg (14G6).

(C) Análisis de transferencia de Western de macrófagos humanos y de ratón. Los lisados de los monocitos 20 CD14+ humanos cultivados durante los periodos de tiempo indicados o los macrófagos peritoneales de ratón se hirvieron en tampón reductor SDS, se cargaron en un gel de Tris-glicina al 4-10 % y se incubaron con un anticuerpo anti-CRIg policlonal (6F1, panel izquierdo) o con un anticuerpo anti-muCRIg monoclonal (14C6, panel derecho). La IgG preinmune (panel izquierdo) y la IgG2b de rata (panel derecho) se usaron como controles de isotipo. Las flechas del panel izquierdo indican la posición de una banda de 57 y de 50 kDa que 25 posiblemente representaban huCRIg(L) y -(C).

(D) Colocalización de CRIg con CD68 en células de Kupffer hepáticas. Se realizó la inmunotinción en secciones obtenidas a partir de hígado humano y de ratón usando anti-CRIg monoclonal (3C9) humano y 14G6 ratón), y anticuerpos anti-CD68 monoclonales.

30

Figura 51. Análisis de citometría de flujo de la expresión de CRIg en leucocitos de sangre periférica y análisis de unión de fragmentos C3 o partículas opsonizadas con C3 a células CHO que expresan CRIg.

(A) Análisis de citometría de flujo de la expresión de CRIg en leucocitos periféricos humanos y de ratón.

(B) Unión de fragmentos C3 solubles o patógenos opsonizados con complemento a células CHO que 35 expresan CRIg murino, pero no a células CHO que expresan JAM-2. Las células en suspensión se incubaron con partículas opsonizadas con el complemento marcadas con A488 con rotación continua durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces y la unión de las partículas se controló por análisis de citometría de flujo. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes.

40

Figura 52. La proteína CRIg soluble y expresada en la superficie celular se une a fragmentos de C3 en solución o depositados sobre la superficie celular.

(A) Las células de Jurkat transfectadas con CRIg(L) (Jurkat-CRIg), pero no las células Jurkat transfectadas con vector vacío (Jurkat-control), forman rosetas con glóbulos rojos de oveja opsonizados con C3 e IgM (E-45 IgM). El histograma (panel izquierdo) muestra la expresión de CRIg en células Jurkat transfectadas de un modo estable con CRIg(L). Los E-IgM opsonizadas con suero C3 deficiente (C3-) o C3 suficiente (C3+) se mezclaron con CRIg o con células Jurkat transfectadas con control vector durante 1 hora. El experimento fue representativo de tres experimentos independientes.

(B) La unión de CRIg(L)-Fc a glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgM (E-IgM) es dependiente de la 50 presencia de C3 en suero. Los E-IgM se opsonizaron con suero humano empobrecido en C3 al cual se añadieron concentraciones en aumento de C3 humano purificado. Los E-IgM se incubaron posteriormente con una proteína de fusión huCRIg(L)-Fc que, a su vez, se detectó con un anticuerpo policlonal anti-Fc humano detectado por citometría de flujo. El experimento fue representativo de tres experimentos independientes. 55

(C) ELISA que muestra la unión de CRIg(L)- y CRIg(C)-Fc a C3b e iC3b. Se añadieron concentraciones en aumento de las proteínas de fusión huCRIg(L)- y huCRIg(C)-Fc a placas maxisorb cubiertas con C3b e iC3b purificados. La unión se detectó usando un anticuerpo anti-huFc conjugado con HRPO. Los resultados que se muestran son representativos de 4 experimentos independientes que usan distintos lotes de proteínas de fusión y componentes del complemento purificados. 60

(D) Datos de cinética de unión que muestran dímeros de C3b solubles que se unen a huCRIg(L)-Fc. La afinidad de C3b por las proteínas de fusión de CRIg se determinó usando resonancia de plasmón superficial. Las proteínas CRIg se capturaron en una microplaca detectora CM5 mediante acoplamiento con aminas de un anticuerpo dirigido contra la etiqueta de fusión Fc. El C3b dimérico se inyectó después durante un tiempo suficiente hasta alcanzar la saturación. Se calculó la Kd a partir de una curva de unión que muestra la 65

respuesta en el equilibrio representada gráficamente frente a la concentración. Los dímeros de C3b se unen a huCRIg(C) con una afinidad calculada de 44 nM y a huCRIg(L) con una afinidad de 131 nM.

(E) CRIg expresado en la superficie celular se une al dímero de C3b marcado con A488 (C3b)2) pero no al C3 nativo. El panel izquierdo muestra los niveles de expresión de huCRIg(L) en células THP-1 transfectadas mediante análisis de citometría de flujo. (C3b)2 muestra la unión saturable a células THP-1 transfectadas con 5 CRIg. La unión de (C3b)2 a células TPH-1 transfectadas CRIg compitió con C3b2, C3b y el domino extracelular de CRIg (DEC-CRIg), pero no por C3. Los resultados mostrados son representativos de 3 experimentos independientes.

3

Figura 53. Generación y caracterización de ratones CRIg genosuprimidos (ko, knock out) 10

(A) Generación de un vector de direccionamiento que se usa para la recombinación homóloga en células ME (madre embrionarias)

(B) Confirmación por transferencia de Southern de la recombinación homóloga del alelo CRIg en la descendencia de hembras heterocigotas de ratones quiméricos cruzados con ratones ts (de tipo silvestre) 15

(C) Comparación de números de leucocitos en la sangre periférica de ratones macho y hembra de ts y ko.

(D) Análisis FACS que muestra la ausencia de expresión de CR1, CR2 y CD11c en CK.

(E) Análisis FACS de unión de C3-A488 y C3c-A488 a las CK de ts y ko.

Figura 54. La expresión de CRIg en las células de Kupffer es necesaria para que se produzca la unión de C3b e 20 iC3b

(A) La proteína CRIg está ausente en macrófagos obtenidos de ratones CRIg KO. Macrófagos peritoneales obtenidos de ratones CRIg ts, het o ko se incubaron con un AcM anti-muCRIg (14G6; panel izquierdo). Las células de Kupffer (CK) obtenidas de ratones CRIg ts y ko se incubaron con el anticuerpo 14G6 y se 25 analizaron por citometría de flujo.

(B) Niveles de expresión de CD11b y CD18, las cadenas alfa y beta del receptor del complemento 3 y Crry son similares en las células de Kupffer obtenidas de ratones CRIg ts y CRIg ko. Las células de Kupffer aisladas de ratones CRIg ts o ko se incubaron con anticuerpos contra CD11b, CD18 y Crry y se analizaron por citometría de flujo. 30

(C) Las células de Kupffer aisladas de ratones CRIg ts o ko se incubaron con suero de ratón activado (activado a través de incubaciones durante 30 minutos a 37 ºC), C3b, (C3b)2 e iC3b. La unión de los componentes del complemento purificados a la superficie celular se detectó con un anticuerpo policlonal que reconoce los diversos fragmentos derivados de C3. Los resultados mostrados son representativos de 4 experimentos. 35

(D) Las CK aisladas de ratones CRIg ko muestran disminución de la formación de rosetas con glóbulos rojos de oveja recubiertos con IgM (E-IgM) opsonizados en suero de ratón con suficiente C3. Las CK aisladas de hígados de ratones CRIg ts y ko se incubaron con E-IgM opsonizados con el C3 del complemento durante 30 minutos en presencia de IgG control o del anticuerpo bloqueante anti-CR3 (M1/70). Se fijaron las células y se contó el número de CK que formaban rosetas con E-IgM y se expresó como un porcentaje del número total 40 de CK * = p<0,05. Los resultados mostrados son representativos de 2 experimentos independientes.

Figura 55. CRIg en células de Kupffer recicladas

(A) células de Kupffer (CK) de ratones C3 ts (paneles 1, 3, 4 y 6) o C3 ko (paneles 2, 5) se incubaron con 45 anticuerpo anti-CRIg marcado con A488 (14G6) y (C3b)2 durante una hora a 4 ºC (paneles de 1-3) o durante 10 minutos a 37 ºC (paneles 4-6). Las células se transfirieron posteriormente a 4 ºC y se incubaron con anticuerpo anti-A488 (histograma en rojo) o sin anticuerpo (histograma en negro) para distinguir el anti-CRIg o C3b expresado en el citoplasma del de la superficie celular.

(B) Internalización y co-localización de CRIg y C3b en las CK CRIg ts, pero no CRIg ko. CK aisladas de 50 hígados de ratones CRIg ts y ko se cultivaron durante 2 días en portaobjetos con cámaras y se incubaron con anticuerpos anti-CRIg conjugados con A455 y C3b conjugado con A488 durante 30 minutos a 37 ºC, se montaron y se realizaron fotografías.

(C) Los anticuerpos de CRIg, pero no los de Lamp1, se reciclan a la superficie celular. Las células de Kupffer se cargaron con anticuerpos anti-muCRIg o anti-muLamp1 conjugados con A488 durante 10 minutos a 37 ºC, 55 se lavaron y posteriormente se incubaron a 37 ºC durante los periodos de tiempo indicados en presencia de anticuerpo de desactivación anti-A488. Los resultados mostrados son representativos de 3 experimentos independientes.

Figura 56. CRIg se expresa en endosomas de reciclaje que se acumulan en sitios de ingestión de partículas. 60

(A) El CRIg expresado en la superficie celular se localiza en las ondulaciones de las membranas positivas para F-actina. Los cultivos de macrófagos derivados de monocitos se incubaron durante 7 días a 4 ºC con el AcM anti-CRIg A488 conjugado con A488 3C9 (A1 y canal verde en A3) y Alexa 546-faloidina (A2 y canal rojo en A3). Las cabezas de flecha indican ondulaciones de membrana donde la tinción tanto de CRIg como de la 65

actina fueron más intensas que en el resto de la superficie celular (amarillo en las imágenes combinadas en A3). La barra de escala es de 20 m.

(B) CRIg y C3b se colocalizan con transferrina en endosomas de reciclaje. Los macrófagos se incubaron durante 1 hora en hielo con CRIg-A488 (B1, canal verde en B4) o C30A488 (B2, canal rojo en B4) después se continuó durante 10 minutos a 37 ºC en presencia de A647-transferrina (B3, canal azul en B4). Escala de 5 barras = 20 m.

(C) CRIg se acumula en la copa fagocítica y en la membrana de fagosoma. Los macrófagos se incubaron con glóbulos rojos recubiertos con IgM opsonizados con suero con suficiente C3 durante 10 minutos (C1-4) o 2 horas (C5-8) a 37 ºC en presencia de transferrina marcada con A647 (C2, 6 y canal azul C4, 8). Las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron posteriormente con anticuerpos anti-CRIg policlonales (C1, 2 y 10 canal verde en C4, 5) y anticuerpo contra LAMP-1 conjugado con A555 (C3, 7 y canal rojo en C4, 8).

Figura 57. Tránsito de CRIg en macrófagos derivados de monocitos humanos.

(A) Representación gráfica de FACS que muestra la unión saturable de C3b-A488 a CRIg en MDM de 7 días. 15

(B) Los MDM se pulsaron durante 10 minutos a 37 ºC con anticuerpo anti-CRIg y C3b-A488 en presencia de un exceso molar de 10 veces de huCRIg(L)-DEC. La unión y captación del anticuerpo anti-CRIg fue específica para CRIg dado que podía suprimirse por co-incubación del anticuerpo con un exceso molar de 10 veces de CRIg-DEC (panel 1) dejando al mismo tiempo intacta la captación de transferrina (panel 2).

(C) Los MDM estuvieron durante 20 h a 37 ºC en presencia de inhibidores de proteasa lisosomal, después las 20 células se lavaron, se fijaron con PFA al 1 % y el anticuerpo captado se detectó con anti-IgG de ratón marcado con Cy3 (C panel 1, y canal rojo en panel 3). Las células se co-tiñeron en 10 g/ml de anti-CRIg de conejo 6F1 seguido de anti conejo - FITC para detectar la distribución de CRIg total (C panel 2 y canal verde en panel C 3). El anticuerpo captado se solapaba casi completamente con la señal endógena de CRIg (amarillo en la imagen combinada en panel C3), indicando que la captación del anticuerpo no influye en el 25 tránsito de CRIg. La barra de escala es de 20 m y 5 m en el inserto de 4x aumentos de las regiones en recuadro mostradas en la parte inferior derecha de cada canal. Los macrófagos humanos del panel C4 se incubaron en suero empobrecido en C3 durante 13 horas, después se fijaron y se marcaron con F1 anti-CRIg de conejo y FITC anti-conejo. La distribución de CRIg fue esencialmente idéntica a la en suero con suficiente C3, solapando ambas casi completamente con el marcador de reciclaje endosomal transferrina (datos no 30 mostrados). La barra de escala es de 20 m.

(D) Los MDM se incubaron con 1 g/ml de anti-CRIg-A488 (panel 1), transferrina-A647 (panel 2) durante 10 minutos a 37 ºC, se fijaron en PFA al 4 %, se permeabilizaron con tampón de saponina y se incubaron con anti-Lamp-1-A555 humano de ratón (panel 3). Las flechas indican la co-localización de CRIg y la transferencia en el compartimento de reciclaje. 35

(E) Los MDM se incubaron con 1 g/ml de anti-CRIg-A488 (panel 1, canal verde en panel 4), transferrina-A647 (panel 2, canal azul en panel 4) durante 30 minutos a 37 ºC, se lavaron y se incubaron con glóbulos rojos de oveja GRO, panel 3, canal rojo en panel 4) opsonizados con complemento C3, teñidos con PKH (GRSO, panel 3, canal rojo en el panel 4) a una relación de 1:10 de macrófagos : GRO.

40

Figura 58. Los ratones que carecen de CRIg son susceptibles a infección por Listeria monocytogenes (LM).

(A) Curvas de supervivencia de hembras de ratones CRIg de tipo silvestre y CRIg ko infectadas con las dosis de LM indicadas después de inyección en la vena lateral de la cola, n = 5-7 por grupo. Análisis estadístico (Wilcoxon): ts frente ko p<0,005 para 2 x 10e4 unidades formadoras de colonias (UFC), p<0,0001 para 5 x 45 10e4 y 2 x 10e5 UFC.

(B) Análisis de recuentos bacterianos en corazón, hígado, sangre y bazo 10 minutos después de infección por LM (2 x 10e7 UFC, n= 5 por grupo). Análisis estadístico (ensayo de la t de muestras relacionadas): **p<0,01, *p<0,05.

(C) Concentraciones aumentadas de citocinas y quimiocinas en el suero de ratones CRIg ko un día después 50 de las infecciones por LM. Análisis estadístico (ensayo de la t de muestras no relacionadas): ***p<0,001.

(D) Captación reducida de LM-A488 en CK en ratones CRIg ko. Los ratones se infectaron con 2 x 10e7 LM-A488. Una hora más tarde, los hígados se perfundieron, se incubaron con anticuerpos contra F4/80 y se analizaron por citometría de flujo. Las CK F4/80 positivas se clasificaron posteriormente mediante FACS y se recogieron en portaobjetos recubiertos con poli-1-lisina para su observación al microscopio de fluorescencia. 55 El número de LM-A488 internalizado se contó en un microscopio confocal y se calculó el índice fagocítico. Los resultados son representativos de al menos dos experimentos.

(E) Los ratones CRIg tienen una eliminación reducida de LM de la circulación. Los ratones ko sencillos o dobles para CRIg y C3 a los ratones recibieron una inyección i.v. de 2 x 10e7 UFC de LM. Diez minutos después de la infección se contaron las UFC en sangre. En presencia de C3, los ratones CRIg ko tuvieron 60 una eliminación significativamente reducida de LM de la circulación (p<0,001). En ausencia de C3, no hubo diferencias significativas en la eliminación de LM en ratones CRIg ts o ko.

La Figura 59 muestra la secuencia de nucleótidos de una fusión CRIg(corto)humano-IgG. (SEC ID Nº: 20).

La Figura 60 muestra la secuencia de nucleótidos de una fusión CRIg(largo)humano-IgG (SEC ID Nº: 21). 65

La Figura 61 ilustra la confluencia de CRIg (STIgMA)-Fc en dos construcciones diferentes, ambas de las cuales están insertadas en un vector pK5 en un sitio ClaI-XbaI.

La Figura 62 muestra que la proteína de fusión muCRIg-Fc (pero no la proteína de fusión Fc control) inhibe la eliminación de LM de la circulación en células de CRIg ts pero no en las CRIg ko. Ratones CRIg ts y ko se trataron con 2 inyecciones de 12 mg/kg de proteínas de fusión muCRIg-Fc o control-Fc 24 h y 16 h antes de la 5 inyección i.v. con 2 x 107 UFC de LM. Las UFC en sangre se contaron 10 minutos después de la infección. Los ratones CRIg ts que se trataron con muCRIg-Fc tuvieron una eliminación significativamente reducida de LM de la circulación en comparación con los ratones de ts tratados con control-Fc (p<0,001, ensayo de la t de Student de muestras no relacionadas). En los ratones CRIg ko el tratamiento con muCRIg-Fc no tuvo efecto adverso sobre la eliminación de LM. 10

Figura 63. Inhibición de la hemólisis inmunitaria mediada por el complemento con moléculas de huCRIg. A. Inhibición de la hemólisis de GRC (glóbulos rojos de conejo) de suero de mono Cinomolgo usando proteínas de fusión hCRIg-corto y hCRIg-largo. B. Inhibición de la hemólisis de RRBC de suero de momo Cinomolgo usando hCRIg-largo DEC.

Figura 64. Inhibición de la hemólisis de suero humano con hCRIg-largo en dos experimentos distintos. 15

Figura 65. Inhibición de la hemólisis de suero humano con las proteínas de fusión hCRIg-corto-Fc y CRIg-largo-Fc.

Figura 66. Inhibición de la hemólisis de suero humano con hCRIg-largo-DEC y hCRIg-corto-DEC, respectivamente.

La Figura 67 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica huCRIg-Iargo-Fc (construcción “sin tallo”) (SEC 20 ID Nº: 25).

La Figura 68 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica huCRIg-largo-Fc que tiene un “tallo” insertado entre el dominio transmembrana de CRIg y la parte Fc (SEC ID Nº: 26).

La Figura 69 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica huCRIg-corto-Fc (construcción "sin tallo") (SEC ID Nº: 27). 25

La Figura 70 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica huCRIg-corto-Fc que tiene un "tallo" insertado entre el dominio transmembrana de CRIg y la parte Fc (SEC ID Nº: 28).

Las Figuras 71 A y B muestran los resultados de estudios de NVC en ratón descritos en el Ejemplo 23.

Descripción detallada de la realización preferida 30

I. Definiciones

Los términos “PRO362”, “JAM4”, “STIgMA” y “CRIg” se usan indistintamente, y se refieren a polipéptidos CRIg de secuencia nativa y variantes. 35

Un polipéptido CRIg de “secuencia nativa” es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido CRIg derivado de la naturaleza, sin importar su modo de preparación. Por lo tanto, un CRIg de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes y/o sintéticos. La expresión “CRIg de secuencia nativa”, incluye específicamente formas de CRIg de origen natural truncadas o secretadas (por ejemplo, 40 una secuencia del dominio extracelular), las formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativas) y las variantes alélicas de origen natural de CRIg. La secuencia nativa de los polipéptidos CRIg incluyen específicamente los 321 aminoácidos del polipéptido CRIg humano largo de SEC ID Nº: 2 (que se muestra en la Figura 1), con o sin la secuencia señal de N terminal, con o sin la metionina de iniciación en la posición 1, y con o sin ninguno o con todos los dominios transmembrana que están aproximadamente en las 45 posiciones 277 a 307 de la SEC ID Nº: 2. Los polipéptidos CRIg de secuencia nativa incluyen adicionalmente el polipéptido CRIg humano de longitud completa de 399 aminoácidos de longitud de SEC ID Nº: 4 (huCRIg, o huCRIg-largo, que se muestra en las Figuras 2 y 5), con o sin una secuencia señal del N terminal, con o sin la metionina de iniciación en la posición 1, con o sin uno o todos los dominios transmembrana que están aproximadamente en las posiciones de aminoácidos 277 a 307 de SEC ID Nº: 4. En una realización aún adicional, el polipéptido de secuencia 50 nativa de CRIg es la forma corta, de 305 aminoácidos, del CRIg humano (huCRIg-corto, SEC ID Nº: 6, que se muestra en la Figura 3), con o sin una secuencia señal del N terminal, con o sin la metionina de iniciación en la posición 1, y con o sin cualquiera o todos los dominios transmembrana que están aproximadamente en las posiciones de 183 a 213 de SEC ID Nº: 6. En una realización diferente, el polipéptido CRIg de secuencia nativa es un polipéptido CRIg murino de longitud completa de 280 aminoácidos de longitud de SEC ID Nº: 8 (muCRIg, que se 55 muestra en las Figuras 4 y 5), con o sin una secuencia señal del N terminal, con o sin la metionina de iniciación en la posición 1 y con o sin ninguno o con todos los dominios transmembrana que están aproximadamente en las posiciones de aminoácidos 181 a 211 de SEC ID Nº: 8. Los polipéptidos CRIg de otros animales no humanos, incluyendo primates superiores y mamíferos, se incluyen específicamente en esta definición.

60

“Variante de CRIg” significa un polipéptido CRIg activo, como se define a continuación, que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido CRIg de secuencia nativa, incluyendo, sin limitación, el huCRIg truncado en el C terminal de 321 aminoácidos (SEC ID Nº: 2), el huCRIg de longitud completa (SEC ID Nº: 4), el huCRIg-corto (SEC ID Nº: 6) y el muCRIg (SEC ID Nº: 8), cada uno de ellos con o sin la metionina de iniciación de N terminal, con o sin la secuencia señal de N terminal, con o sin todos o parte de los dominios transmembrana y 65 con o sin el dominio intracelular. En una realización particular, la variante de CRIg tiene al menos aproximadamente

el 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido maduro de longitud completa de dentro de la secuencia de la SEC ID Nº: 2. En otra realización, la variante de CRIg tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido maduro de longitud completa de dentro de la secuencia de SEC ID Nº: 4. En otra realización más, la variante de CRIg tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido maduro de longitud completa de dentro de la secuencia 5 de SEC ID Nº: 6. En una realización adicional más, la variante de CRIg tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido maduro de longitud completa de dentro de la secuencia de SEC ID Nº: 8. Dichas variantes del polipéptido CRIg incluyen, por ejemplo, polipéptidos CRIg en los que se insertan, sustituyen y/o delecionan, uno o más restos de aminoácidos, en el extremo N o C de la secuencia de las SEC ID Nos: 2, 4, 6 u 8. Otras variantes tienen uno o más aminoácidos insertados, sustituidos y/o delecionados 10 dentro de las regiones transmembrana de las secuencias polipeptídicas indicadas.

Normalmente, una variante de CRIg tendrá una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80 %, o una identidad de secuencia aminoácidos de al menos aproximadamente 85 %, o una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 90 %, o una identidad de secuencia de 15 aminoácidos de al menos aproximadamente 95 %, o una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 98 %, o una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 99 % con la secuencia de aminoácidos madura de dentro de las SEC ID Nos: 2, 4, 6 u 8. Preferentemente, el grado más alto de identidad de secuencia se produce en los dominios extracelulares (DEC) ( los aminoácidos 1 a aproximadamente 21 a X de SEC ID Nº: 2 o 4, en los que X es cualquier resto de aminoácido de la posición 271 a la 281; o los aminoácidos 1 o aproximadamente 21 a X de 20 SEC ID Nº: 6, en los que X es cualquier resto de aminoácido de la posición 178 a la 186, o los aminoácidos 1 o aproximadamente 21 a X de SEC ID Nº: 8, en los que X es cualquier resto de aminoácido de la posición 176 a la 184).

El “dominio extracelular” o “DEC” de CRIg (PRO362) se refiere a una forma del polipéptido CRIg, que está 25 esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático de las moléculas de longitud completa respectivas. Normalmente, los DEC de CRIg tendrán menos del 1 % de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmáticos y preferentemente, tendrán menos de 0,5 % de dichos dominios. Tal como se explica anteriormente, opcionalmente, los DEC de CRIg comprenderán los restos de aminoácidos 1 o de aproximadamente 21 a X de las SEC ID Nos: 2, 4, 6 u 8, en los que X es cualquier aminoácido de aproximadamente la posición 271 a la 281 en las 30 SEC ID Nos: 2 o 4, cualquier aminoácido de aproximadamente la posición 178 a 186 en la SEC ID Nº: 6, y cualquier aminoácido de aproximadamente la posición 176 a la 184 en la SEC ID Nº: 8.

El “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a las secuencias de CRIg (PRO362) identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia 35 candidata que son idénticos con respecto a los restos de aminoácidos en la secuencia de CRIg, respectivamente, después de alinear las secuencias y de introducir los huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede realizarse de diversos modos que están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo, usando programas 40 informáticos disponibles al público, tales como los programas informáticos BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquiera de los algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se comparan. La identidad de secuencia se calcula después respecto a la secuencia más larga, es decir incluso si una secuencia más corta muestra una identidad de secuencia del 100 % 45 con respecto a una parte de una secuencia más larga, la identidad de secuencia total será menor del 100 %.

El “porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos” con respecto a las secuencias codificantes de CRIg (PRO362) identificadas en el presente documento (por ejemplo, ADN45416) se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con respecto a los nucleótidos en la secuencia codificante 50 de CRIg, respectivamente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede realizarse de diversos modos que están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles al público, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el 55 alineamiento, incluyendo cualquiera de los algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se comparan. La identidad de secuencia se calcula después con respecto a la secuencia más larga, es decir, incluso si una secuencia más corta muestra una identidad de secuencia del 100 % con respecto a una parte de una secuencia más larga, la identidad de secuencia total será menor del 100 %. 60

Una molécula de ácido nucleico “aislada” es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico es distinta en forma o configuración a la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal 65 como existe naturalmente en las células. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye moléculas de

ácido nucleico contenidas en células que normalmente expresan un polipéptido codificado en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.

Una molécula de ácido nucleico “aislada” que codifica un polipéptido CRIg, es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia 5 normalmente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica CRIg. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido CRIg es distinta en forma o configuración a la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido CRIg se distinguen de la molécula o moléculas de ácido nucleico codificantes en tanto estas existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica CRIg incluye moléculas de ácido nucleico que codifican CRIg contenidas en células 10 que normalmente expresan CRIg en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.

La expresión “enfermedad asociada al complemento” se usa en el presente documento en el más amplio sentido e incluye todas las enfermedades y afecciones patológicas cuya patogénesis implica anomalías en la activación del 15 sistema de complemento, tales como, por ejemplo, las deficiencias del complemento. La expresión incluye específicamente enfermedades y afecciones patológicas que se benefician de la inhibición de la convertasa de C3. La expresión adicionalmente incluye las enfermedades y afecciones patológicas que se benefician de la inhibición, incluyendo inhibición selectiva, de la ruta alternativa del complemento.

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La expresión “afección ocular asociada al complemento” se usa en el presente documento en el más amplio sentido e incluye todas las afecciones y enfermedades oculares cuya patología implica el complemento, incluyendo las rutas alternativa y clásica, y en particular la ruta alternativa del complemento. Dentro de este grupo se incluyen específicamente todas las enfermedades y afecciones oculares asociadas con la ruta alternativa, cuya aparición, desarrollo o progresión puede controlarse mediante la inhibición de la ruta alternativa. Las afecciones oculares 25 asociadas al complemento incluyen, sin limitación, enfermedades maculares degenerativas, tales como todas las fases de la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), incluyendo las formas seca y húmeda (no exudativa y exudativa), neovascularización coroidal (NVC), uveítis, retinopatía diabética y otras relacionadas con isquemia, endoftalmitis, y otras enfermedades neovasculares intraoculares, tales como el edema macular diabético, la miopía patológica, LA enfermedad de von Hippel-Lindau, la histoplasmosis ocular, Oclusión de la Vena Central de 30 la Retina (OVCR), neovascularización corneal y neovascularización retiniana. Un grupo preferido de afecciones oculares asociadas al complemento incluye la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), incluyendo la DMRE no exudativa (húmeda) y exudativa (seca o atrófica), la neovascularización coroidal (NVC), la retinopatía diabética (RD) y la endoftalmitis.

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El “tratamiento” es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, “tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Las personas que necesitan el tratamiento incluyen a las que ya tienen el trastorno así como a las que se tendrá que prevenir el trastorno. En el tratamiento de una enfermedad relacionada con el sistema inmunitario, un agente terapéutico puede alterar directamente la magnitud de la respuesta de un componente de la respuesta 40 inmunitaria, o hacer que la enfermedad sea más susceptible al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos, etc. En el tratamiento de una enfermedad asociada al complemento, el tratamiento podría, por ejemplo, prevenir o ralentizar la progresión de una enfermedad. Por lo tanto, el tratamiento de una afección ocular asociada al complemento incluye específicamente la prevención, inhibición, o ralentización del desarrollo de la afección, o de la progresión de una 45 fase de la afección a otra fase más avanzada, o en una afección relacionada más grave.

La “patología” de una enfermedad, tal como una enfermedad asociada al complemento, incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Estos incluyen, sin limitación, el crecimiento celular anómalo o incontrolable (de células neutrófilas, eosinófilas, monocíticas, linfocíticas), la producción de anticuerpos, la 50 producción de autoanticuerpos, la producción de complemento, la interferencia con el funcionamiento normal de células adyacentes, la liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anómalos, la supresión o agravamiento de cualquier respuesta inflamatoria o inmunológica, infiltración de células inflamatorias (neutrófilas, eosinófilas, monocíticas, linfocíticas) en los espacios celulares, la formación de drusas, la pérdida de visión, etc.

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El término “mamífero”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo, sin limitación, seres humanos, primates no humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como caballos, cerdos, ganado, perros, gatos y hurones, etc. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un ser humano, o un primate no humano, más preferentemente un ser humano. 60

La administración “en combinación con” de uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

El término “citocina” es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúa sobre 65 otra célula como mediadores intercelulares. Son ejemplos de dichas citocinas las linfocinas, monocinas y hormonas

polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen la hormona de crecimiento, tal como la hormona de crecimiento humano, la hormona de crecimiento humano N-metionilo, y la hormona de crecimiento bovino, la hormona paratiroidea, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorelaxina, hormonas glucoproteicas tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH), el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento de fibroblastos, la prolactina, el lactógeno placentario, el 5 factor de necrosis tumoral - y -, y la sustancia inhibidora mulleriana, el péptido asociado a la gonadotropina de ratón, la inhibina, la activina, el factor de crecimiento endotelial vascular, la integrina, la trombopoyetina (TPO), los factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-, factor de crecimiento plaquetario, los factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF- y TNF:-, el factor de crecimiento similar a la insulina I y II, la eritropoyetina (EPO), los factores osteoinductivos, los interferones tales como interferón-, -, y -; los factores estimuladores de 10 colonias (CSF) tales como el CSF de macrófagos (M-CSF), CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), y el CSF de granulocitos (G-CSF), las interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, un factor de necrosis tumoral tal como TNF- o TNF-, y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y el ligando kit (KL). Tal como se usa en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o del cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia 15 nativa.

“Cantidad terapéuticamente eficaz” es la cantidad de CRIg activa, de agonistas y antagonistas de CRIg que se requiere para conseguir una mejora medible en el estado, por ejemplo, patología, de la enfermedad o afección a la que se dirigen, tales como, por ejemplo, una enfermedad o afección (ocular) asociada al complemento, o cáncer. 20

La expresión “secuencias control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante ligada operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y 25 potenciadores.

El ácido nucleico está, “unido operativamente” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente a ADN para un polipéptido si este se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o 30 potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está en una posición de modo que facilite la traducción. Generalmente, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se realiza uniendo en sitios de restricción convenientes. Si 35 dichos sitios no existen, los adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o enlazadores se usan de acuerdo con la práctica convencional.

La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación la determina fácilmente un experto habitual en la materia, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado, y de la 40 concentración salina. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para el emparejamiento apropiado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a emparejarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. A mayor grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, se puede usar mayor temperatura relativa. Como resultado, se deduce que 45 mayores temperaturas relativas podrían tender a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas las reducirían. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

50

Las “condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, como se definen en el presente documento, pueden identificarse por aquellas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura alta para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0,1 % a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50 % de formamida (v/v) con 0,1 % de albúmina del suero bovino/0,1 % de Ficoll/ 0,1 % de polivinilipirrolidona/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 55 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean 50 % de formamida, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1 % de pirofosfato de sodio, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonido (50 g/ml), 0,1 % de SDS y 10 % de sulfato de dextrano a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en SSC 0,2 x (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50 % de formamida a 55 ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 ºC. 60

Las “condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse tal como describen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de soluciones de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones de moderadamente rigurosas es la incubación durante toda la 65

noche a 37 ºC en una solución que comprende: 20 % de formamida, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, 10 % de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 ºC. El experto en la materia reconocerá como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. siempre que sea necesario para adaptar factores tales como la longitud de la sonda y similares. 5

La expresión “epítopo etiquetado” cuando se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de la invención fusionado a un “polipéptido con etiqueta”. El polipéptido con etiqueta tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo contra el cual se puede fabricar un anticuerpo, aunque es lo suficientemente corto como para no interferir con la actividad del polipéptido con el que se fusiona. El polipéptido con 10 etiqueta también es preferentemente bastante exclusivo, de modo que el anticuerpo no reacciona sustancialmente en cruzado con otros epítopos. Los polipéptidos con etiqueta adecuados generalmente tienen al menos seis restos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8 y 50 restos de aminoácidos (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 restos de aminoácidos).

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“Activo” o “actividad” en el contexto de las variantes de los polipéptidos de CRIg de la invención, se refiere a una forma (o formas) de dichos polipéptidos que conserva la actividad biológica y/o inmunológica de un polipéptido nativo o de origen natural de la invención. Una actividad biológica preferida es la capacidad de unirse a C3b, y/o de afectar al complemento o a la activación del complemento, en particular, inhibir la ruta alternativa del complemento y/o la convertasa C3. La inhibición de la convertasa C3 puede medirse, por ejemplo, midiendo la inhibición de la 20 renovación de C3 en suero normal durante la artritis inducida por colágeno - o por anticuerpos-, o midiendo la inhibición de la deposición de C3 en articulaciones artríticas.

La “actividad biológica” en el contexto de un anticuerpo, polipéptido u otra molécula que imite la actividad biológica de CRIg, y que pueda identificarse mediante los ensayos de exploración divulgados en el presente documento (por 25 ejemplo, una molécula pequeña orgánica o inorgánica, un péptido, etc.) se refiere, en parte, a la capacidad de dichas moléculas para unirse a C3b y/o de afectar al complemento o a la activación del complemento, en particular, inhibir la ruta alternativa del complemento y/o convertasa C3.

El término “agonista” de CRIg se usa en el más amplio sentido, e incluye cualquier molécula que imite una actividad 30 biológica cualitativa (tal como se define anteriormente en el presente documento) de un polipéptido de secuencia nativa de CRIg. Estos agonistas de CRIg incluyen específicamente CRIg-Ig, por ejemplo, polipéptidos de fusión de CRIg-Fc. Preferentemente, la actividad biológica es el bloqueo de una ruta del complemento, especialmente de la ruta alternativa del complemento.

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El término “antagonista” se usa en el más amplio sentido, e incluye cualquier molécula que bloquee parcial o completamente, inhiba, o neutralice una actividad biológica cualitativa de un polipéptido nativo, tal como un polipéptido de secuencia nativa de CRIg.

La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se 40 obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias.

Los “anticuerpos” (Acs) y las “inmunoglobulinas” (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características 45 estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad de unión con un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que pueden carecer de especificidad antigénica. Los polipéptidos del último tipo, por ejemplo, los produce, a bajos niveles, el sistema linfático y, a altos niveles, los mielomas. El término “anticuerpo” se usa en el más amplio sentido e incluye específicamente, sin limitación, anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, y anticuerpos 50 multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad biológica deseada.

Los “anticuerpos nativos” y las “inmunoglobulinas nativas” son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) 55 idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y cadena ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente separados. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (VH) seguido de diversos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene, en un extremo, un dominio variable (VL) y en su otro extremo un dominio constante; el domino 60 constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada.

El término “variable” se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren ampliamente 65 en su secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su

antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

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Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión antigénica o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. En particular, los ejemplos de fragmentos de anticuerpo contenidos en la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que 10 tiene los dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab’, que es un fragmento Fab que tiene uno o más restos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene los dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd’ que tiene los dominios VH y CH1 y uno o más restos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios VL y HL de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (vii) las regiones CDR aisladas; (viii) los fragmentos 15 F(ab’)2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab’ unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, Fv monocatenario; Fvmc) (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); y Huston et al., PNAS (EE.UU.) 85: 5879-5883 (1988)); (x) los “diacuerpos” con dos sitios de unión antigénica, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 20 93111161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90: 6444-6448 (1993)); (xi) los “anticuerpos lineales” que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos complementarios de cadena ligera, forman un par de regiones de unión antigénica (Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057 1062 (1995); y Patente de Estados Unidos Nº 5.641.870).

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La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos sitios de unión antigénica idénticos, denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un solo sitio de unión antigénica, y un fragmento “Fc” residual. La designación “Fc” refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación antigénica y aún es capaz de entrecruzarse con el antígeno.

30

El fragmento “Fv” es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión antigénico completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera, en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración en la que las tres CDR de cada dominio variable interacciona para definir un sitio de unión antigénico en la superficie del dímero VH-VL. En su conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión antigénica al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o 35 la mitad de un Fv que solo comprende tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y de unirse al antígeno, aunque a una menor afinidad que la del sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos restos en el 40 extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. En el presente documento, Fab’-SH es la designación de Fab’ en la que uno o más restos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos entre fragmentos de anticuerpos. 45

Las “cadenas ligeras” de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos los tipos claramente distintos, denominados kappa () y lambda (), basada en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

50

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a clases diferentes. Existente cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y algunas de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan , , ,  y , respectivamente. Las estructuras subunitarias y configuraciones 55 tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

El “dominio CH2” de una región Fc de una IgG humana (también denominado dominio “Cg2”) normalmente se extiende desde un resto de aminoácido que está aproximadamente en la posición 231 a un resto de aminoácido que está aproximadamente en la posición 340. El dominio CH2 es exclusivo ya que no se encuentra estrechamente 60 emparejado con otro dominio. En su lugar, dos cadenas de hidrato de carbono ramificadas unidas a N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado con que el hidrato de carbono puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento entre dominio-dominio y ayudar a estabilizar el domino CH2. Burton, Malec. Immunol. 22: 161-206 (1985). El dominio CH2 del presente documento puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o un dominio CH2 variante. 65

El “dominio CH3” comprende el tramo de restos del extremo C en un dominio CH2 en una región Fc (es decir, desde un resto de aminoácido en aproximadamente la posición 341 a un resto de aminoácido en aproximadamente la posición 447 de una IgG). La región CH3 del presente documento puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o un dominio CH3 variante (por ejemplo, un dominio de CH3 con una “protuberancia” introducida en una cadena del mismo y una “cavidad” correspondiente introducida en la otra cadena del mismo; véase la Patente de Estados 5 Unidos Nº 5.821.333. Dichos dominios CH3 variantes pueden usarse para fabricar anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), como se describe en el presente documento.

La “región bisagra” se define generalmente como una extensión de aproximadamente la Glu216, o aproximadamente la Cys226, a aproximadamente la Pro230 de la IgG1 humana (Burton, MoZee. Immunol.22: 161-10 206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y último resto de cisteína formando enlaces S-S entre las cadenas pesadas en las mismas posiciones. La región bisagra del presente documento puede ser una región bisagra de secuencia nativa o una región bisagra variante. Las dos cadenas polipeptídicas de una región bisagra variante generalmente conservan al menos un resto de cisteína por cadena polipeptídica, de modo que las dos cadenas polipeptídicas de la región bisagra variante 15 pueden formar un enlace disulfuro entre las dos cadenas. La región bisagra preferida en el presente documento es una región bisagra humana de secuencia nativa, por ejemplo, una región bisagra de IgG1 humana de secuencia nativa.

Una “región Fc funcional” posee al menos una “función efectora” de una región Fc de secuencia nativa. Las 20 “funciones efectoras” ejemplares incluyen la unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; RCB), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo un dominio variable de anticuerpo) y puede evaluarse usando diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones 25 efectoras de los anticuerpos.

Una “región Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza.

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Una “región Fc variante” comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido, en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de 35 aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La región Fc variante del presente documento poseerá generalmente, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 80 % con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental, o una identidad de secuencia de al menos 90 % con la misma, o una identidad de secuencia de al menos 95 % o más con la misma. 40

En el presente documento un “enlazador flexible” se refiere a un péptido que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos por uno o más enlaces peptídicos, y proporciona más libertad rotacional para dos polipéptidos (tales como dos regiones Fd) unidos de ese modo. Dicha libertad rotacional permite que dos o más sitios de unión antigénica, unidos entre sí por el enlazador flexible, accedan al antígeno (o antígenos) diana más eficazmente. Los 45 ejemplos de secuencias peptídicas enlazadoras flexibles incluyen gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser, y gly-gly-gly-ser.

Un polipéptido “aislado”, tal como un anticuerpo, es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y 50 otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido, incluyendo anticuerpos, se purificará (1) hasta más de 95% en peso del anticuerpo según se determina mediante el método de Lowry, y muy preferiblemente más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando tinción con azul de 55 Coomassie o, preferiblemente, con plata. El compuesto aislado, por ejemplo, anticuerpo u otro polipéptido, incluye el compuesto in situ con células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el compuesto aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

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La palabra “marcador”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directa o indirectamente con un compuesto, por ejemplo, anticuerpo o polipéptido, para generar un compuesto “marcado”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes), o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición sustrato, que es detectable. 65

Por “fase sólida” se entiende una matriz no acuosa a la que se puede adherir el compuesto de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas englobadas en este documento incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polialcohol vinílico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de 5 cromatografía de afinidad). Esta expresión también incluye una fase sólida discontinua de partículas distintas, tales como las descritas en la patente de Estados Unidos Nº 4.275.149.

Un “liposoma” es una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo, que es útil para administrar a un mamífero un fármaco (tal como los anticuerpos anti-ErbB2 que se divulgan en el presente 10 documento y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico). Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación bicapa, similar a la disposición lipídica de membranas biológicas.

Como se usa en el presente documento, el término “inmunoadhesina” designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una “adhesina”) con las funciones efectoras de 15 los dominios constantes de inmunoglobulinas. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es distinta del reconocimiento del antígeno y el sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es “heteróloga”), y una secuencia del dominio constante de inmunoglobulinas. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es generalmente una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del 20 dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tales como los subtipos IgG- 1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Un “factor o agente angiogénico” es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de vasos sanguíneos, por ejemplo, promueve la angiogénesis, el crecimiento de células endoteliales, la estabilidad de vasos sanguíneos y/o la 25 vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos, incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, VEGF y miembros de la familia de VEGF, P1GF, la familia PDGF, la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), los ligandos de TIE (Angiopoyetinas), efrinas, ANGPTL3, ANGPTL4, etc. También podría incluir factores que aceleran la cicatrización de heridas, tales como la hormona de crecimiento, el factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I), VIGF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), CTGF y miembros de su familia, y TGF- y TGF-. 30 Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D’Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1 enumera factores angiogénicos); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003).

Un “agente antiangiogénico” o “inhibidor de la angiogénesis” se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un 35 polinucleótido, un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de las mismas, que inhiben la angiogénesis, la vasculogénesis, o la permeabilidad vascular indeseada, bien directa o indirectamente. Por ejemplo, un agente antiangiogénico es un anticuerpo u otro antagonista contra un agente angiogénico tal como se define anteriormente, por ejemplo, anticuerpos contra VEGF, anticuerpos contra receptores de VEGF, moléculas pequeñas que bloquean la señalización del receptor de VEGF 40 (por ejemplo, PTK787/ZK2284, SU6668). Los agentes antiangiogénicos también incluyen inhibidores nativos de la angiogénesis, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D’Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003).

La expresión “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar (incluyendo la prevención) 45 una enfermedad o trastorno en un mamífero. Por lo tanto, en el caso de la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) o de la neovascularización coroidal (NVC), la cantidad eficaz del fármaco puede reducir o prevenir la pérdida de visión. Para la terapia de la DMRE, la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, mediante uno o más de lo siguiente: evaluar el cambio medio en la mejor agudeza visual corregida (MAVC) desde el inicio en un momento deseado, evaluar la proporción de sujetos que pierden menos de 15 letras de agudeza visual en un tiempo 50 deseado en comparación con el dato inicial, evaluar la proporción de sujetos que ganan más de o igual a 15 letras en agudeza visual en un tiempo deseado en comparación con el dato inicial, evaluar la proporción de sujetos con una agudeza visual de Snellen equivalente a 20/2000 o peor en un momento deseado, evaluar el Cuestionario NEI sobre Funcionamiento Visual, evaluar el tamaño de la NVC y la cantidad de pérdida de NVC en un momento deseado, tal como se evalúa mediante angiografía con fluoresceína, etc. Si la indicación es la prevención de la 55 progresión de DMRE seca a húmeda, o de DMRE a CMV, la cantidad eficaz del fármaco puede inhibir, ralentizar, o bloquear parcial o totalmente dicha progresión. En este caso, la determinación de la cantidad eficaz implica graduar la enfermedad, controlar la evolución de la progresión de la enfermedad, y ajustar la dosificación siempre que sea necesario con el fin de conseguir el resultado deseado.

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II. Descripción detallada

La presente invención concierne al uso de un nuevo receptor asociado a macrófagos con homología con el antígeno A33 y JAM1, que se clonó de una biblioteca de pulmones fetales y se identificó como un miembro de la superfamilia de Ig de un solo dominio transmembrana asociado con macrófagos (STigMA, por las siglas en inglés single 65 transmembrane Ig superfamily member macrophage associated) o polipéptido Receptor del Complemento de la

familia de las Inmunoglobulinas (CRIg, por las siglas en inglés Complement Receptor of the Immunoglobulin family polypeptide). El CRIg nativo humano se expresa como dos variantes de corte y empalme, una que contiene un dominio similar a IgV en el extremo N y un dominio similar a IgC2 en el extremo C y una forma de corte y empalme que carece del dominio del extremo C (SEC ID Nos: 4 y 6, respectivamente). Ambos receptores tienen un solo dominio transmembrana y un dominio citoplasmático, que contiene restos de tirosina que están fosforilados de 5 manera constitutiva en macrófagos in vitro. Se encontró un homólogo de ratón con un 67 % de homología de secuencia con un CRIg humano (SEC ID Nº: 8). El polipéptido CRIg humano de longitud completa también tiene una versión más corta, que carece de un segmento en el extremo N (SEC ID Nº: 2).

Tal como se muestra más adelante en los Ejemplos, CRIg se une al C3b del complemento e inhibe la convertasa 10 C3. CRIg se expresa selectivamente en macrófagos residentes en tejidos, y su expresión se regula positivamente con dexametasona e IL-10, y se regula negativamente con LPS e IFN-, e inhibe la artritis inducida por colágeno- y anticuerpo- independiente de respuestas de células B o T.

Además se ha encontrado que CRIg se expresa altamente en células de Kupffer, se une a las opsoninas de C3b e 15 iC3b y se requiere para la eliminación rápida de patógenos en la circulación. Estructuralmente, CRIg difiere de los receptores del complemento conocidos en que carece de secuencias de repetición consenso cortas de unión a C3b y C4b en CR1 y CR2, así como de los dominios similares a integrina presentes en C3 y CR4. Mientras que los receptores del complemento CR1-4 se expresan en una amplia variedad de tipos de células, la expresión de CRIg está confinada a macrófagos residentes en tejidos, incluyendo las células de Kupffer hepáticas. 20

Estudios de empobrecimiento realizados han establecido un papel para las células de Kupffer en la eliminación rápida, dependiente de C3, de Listeria inicialmente durante una infección (Kaufmann, Annu Rev. Immunol. 11: 129-163 (1993); Gregory et al., J. Immunol. 168: 308-315 (2002)) pero los receptores implicados en este proceso no se han identificado hasta ahora. Los estudios presentados en los ejemplos más adelante demuestran que el CRIg 25 expresado por macrófagos se une a C3b e iC3b depositado en la superficie del patógeno. Debido a esta actividad de unión doble a C3b y a iC3b, CRIg se requiere para la eliminación eficaz de Listeria monocytogenes (LM) opsonizada con ambos componentes de degradación de C3.

La importancia de CRIg en la eliminación hepática rápida de las partículas opsonizadas con C3 se sustenta 30 adicionalmente por la imposibilidad de los ratones CRIg knock out (ko) de eliminar eficazmente de la circulación la bacteria LM opsonizada con C3, conduciendo a elevar la carga de patógenos en diversos órganos y a aumentar la mortalidad. En ausencia de C3, los ratones CRIg ko de tipo silvestre (ts) eliminaron Listeria igualmente bien, indicando la dependencia de la función de CRIg en presencia de C3.

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El papel de los receptores del complemento CR1-4 en la eliminación de LM mediante células de Kupffer hepáticas no se ha establecido bien. CR1 y CR2 están ausentes en macrófagos residentes en tejidos y se expresan predominantemente en células dendríticas foliculares y en células B donde estos ejercen un papel en la regulación de las respuestas de células T y B (Krych-Goldber y Atkinson, Immunol. Rev. 180: 112-122 (2001); Molina et al., J. Exp. Med. 175: 121-129 (1992)) y Ejemplos). CR3 se expresa a bajos niveles en las CK, pero ratones ko que 40 carecen de la cadena beta común de CD18 tanto de CR3 como de CR4, dan como resultado receptores no funcionales que muestran susceptibilidad a infección más bien reducida en lugar de aumentada (Wu et al., Infect. Immun. 71: 5986-5993 (2003)). Por lo tanto CRIg representa un componente principal del sistema fagocítico retículoendotelial en la eliminación rápida de las partículas opsonizadas con C3.

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Además de su expresión en células de Kupffer hepáticas, CRIg está presente en subpoblaciones de macrófagos en diversos tejidos incluyendo el peritoneo, corazón, pulmón, glándula adrenal e intestino. Se sabe que estos macrófagos ejercer un papel principal en la fagocitosis de células muertas y restos celulares (Almeida et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1019: 135-140 (2004); Castellucci y Zaccheo, Prog. Clin. Biol. Res. 296: 443-451 (1989); Taylor et al., Annu. Rev. Immunol. 23: 901-944 (2005)). La expresión de CRIg en estos macrófagos residentes puede mediar la 50 opsonofagocitosis dependiente del complemento de diversas partículas. Esto se sustenta por el hallazgo de que los ratones CRIg ko muestran reducción de LM en sus tejidos cardiacos y hepáticos a pesar del aumento de carga circulatoria de LM. Por lo tanto, CRIg representa un nuevo receptor expresado en macrófagos tisulares y actúa como un portal para la eliminación rápida de patógenos opsonizados por el complemento.

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Los resultados presentados en los Ejemplos más adelante demuestran adicionalmente que CRIg se expresa en un conjunto intracelular de vesículas de reciclaje, asegurando de este modo un aporte continuo de CRIg en la superficie celular para que se produzca la unión a las partículas opsonizadas con C3. Además, endosomas que expresan CRIg se acumulan rápidamente en sitios de contacto de partículas donde pueden ayudar a suministrar membranas al fagosoma en formación. La importancia de CRIg en la fagocitosis de partículas opsonizadas con C3 se muestra por 60 la incapacidad de las CK que carecen de CRIg para unirse a C3b e iC3b dando como resultado la fagocitosis reducida de Listeria monocytogenes opsonizada con C3 (véanse los Ejemplos).

La localización subcelular y el tránsito intracelular de CRIg difieren de la de los receptores de C3 del complemento conocidos. Mientras que CRIg se localiza en endosomas de reciclaje constitutivo, CR1, CR3 y CR4 se localizan en 65 vesículas secretoras que se fusionan con la membrana plasmática tras la estimulación de las células con citocinas

(Sengelov et al., J. -Immunol. 153: 804-810 (1994); y Sengelov et al., Crit. Rev. Immunol. 15: 107-131 (1995)) e internalizan el ligando a través de un proceso macropicnocítico solo después del entrecruzamiento del receptor (Carpentier et al., Cell Regul. 2: 41-55 (1991); Brown et al., Curr. Opin. Immunol. 3: 76=82 (1991)). Como consecuencia, la expresión de CRIg en la superficie de las células está regulada negativamente después de la estimulación de las células, mientras que la expresión de CR1 y CR3 en la superficie celular aumenta después de la 5 estimulación. Este aumento sirve como una etapa importante en la unión y la fagocitosis, y como CRIg, CR3 se concentra en la copa fagocítica y en el fagosoma circundante de las partículas opsonizadas con C3 (Aderem y Underhill, Annu. Rev. Immunol. 17: 593-623 (1999)). El reciclaje constitutivo y la endocitosis del ligando mediante CRIg en macrófagos en reposo es coherente con un papel en la unión de las partículas opsonizadas con el complemento durante la fase inicial de una infección bacteriana antes de una respuesta inflamatoria (por ejemplo, la 10 acumulación de fagocitos activados), así como durante la eliminación de las partículas de la circulación en condiciones no inflamatorias.

El complemento juega un papel crucial en la defensa del organismo, y junto con otros componentes del sistema inmunitario, protege a los individuos de la invasión del organismo por patógenos. Sin embargo, el complemento 15 también puede ocasionar daños a tejidos hospedadores si no está correctamente activado o controlado. La activación inapropiada del complemento está implicada en la patogénesis de una diversidad de enfermedades, denominadas enfermedades o trastornos asociados al complemento, tales como enfermedades del complejo inmunitario y autoinmunitarias, y diversas afecciones inflamatorias, incluyendo el daño tisular inflamatorio mediado por el complemento. La patología de las enfermedades asociadas al complemento varía, y puede implicar la 20 activación del complemento durante un periodo de tiempo largo o corto, la activación de toda la cascada, de solamente una de las cascadas (por ejemplo, la ruta clásica o alternativa), solamente de algunos de los componentes de la cascada, etc. En algunas enfermedades las actividades biológicas de los fragmentos del complemento dan como resultado daño tisular y enfermedad. Por consiguiente, los inhibidores del complemento tienen un alto potencial terapéutico. Los inhibidores selectivos de la ruta alternativa serían ser particularmente útiles, 25 dado que la eliminación de patógenos y otros organismos de la sangre a través de la ruta clásica permanecería intacta.

Se sabe que C3b opsoniza de manera covalente las superficies de microorganismos que invaden el organismo, y actúa como un ligando para receptores del complemento presentes en células fagocíticas, que finalmente conduce a 30 la fagocitosis de los patógenos. En muchas situaciones patológicas, tales como las enumeradas anteriormente, el complemento se activará en las superficies celulares, incluyendo la pared vascular, el cartílago en las articulaciones, glomérulos renales o células que carecen de inhibidores del complemento intrínsecos. La activación del complemento conduce a inflamación causada por propiedades quimioatrayentes de las anafilotoxinas C3a y C5a y puede causar daños a las propias células generando un complejo de ataque a la membrana. Sin ceñirse a ninguna 35 teoría particular, se cree que CRIg inhibe la convertasa C3 mediante la unión a C3b, previniendo o reduciendo de ese modo enfermedades mediadas por el complemento, cuyos ejemplos se han enumerado anteriormente en el presente documento.

Compuestos de la invención 40

1. Polipéptidos CRIg de secuencia nativa y variantes

La preparación de moléculas nativas de CRIg, junto con sus secuencias de ácidos nucleicos y de polipéptidos, se ha explicado anteriormente. El Ejemplo 1 muestra la clonación del huCRIg de longitud completa de SEC ID Nº: 4. Los 45 polipéptidos de CRIg pueden producirse cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de CRIg. Por supuesto, se contemplan métodos alternativos, bien conocidos en la técnica, que pueden emplearse para preparar CRIg. Por ejemplo, la secuencia de CRIg, o partes de la misma, pueden producirse mediante síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 50 2149-2154 (1963)]. Puede realizarse la síntesis in vitro de proteínas usando técnicas manuales o automatizadas. La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando un sintetizador peptídico de Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Diversas partes de CRIg pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir CRIg de longitud completa. 55

Las variantes de CRIg pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN que codifica un polipéptido CRIg de secuencia nativa, o por síntesis del polipéptido CRIg deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales de CRIg, tal como cambiando el número o la posición de sitios de glucosilación o alterando las características de anclaje a la 60 membrana.

Pueden realizarse variaciones en los polipéptidos CRIg de secuencia nativa, descritos en el presente documento, usando, por ejemplo, cualquiera de las técnicas y normas para realizar mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, 65 deleción o inserción de uno o más codones que codifican un CRIg de secuencia nativa o variante que dan como

resultado un cambio en su secuencia de aminoácidos en comparación con un CRIg de secuencia nativa o variante correspondiente. Opcionalmente la variación es por sustitución de al menos un aminoácido por otro aminoácido en uno o más de los dominios de un polipéptido CRIg de secuencia nativa de. Puede encontrarse una orientación en la determinación de qué resto de aminoácido puede insertarse, sustituirse o deleccionarse sin afectar de modo adverso a la actividad deseada comparando la secuencia de CRIg con la de moléculas de proteínas homólogas conocidas y 5 minimizando el número de cambios realizados en la secuencia de aminoácidos en regiones de alta homología.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazamiento de leucina por una serina, es decir, reemplazos de aminoácidos conservativos. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el 10 intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y ensayando la actividad de las variantes resultantes en el ensayo in vitro descrito en los Ejemplos más adelante.

Las variaciones pueden realizarse usando métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis (dirigida) 15 mediada por oligonucleótidos, mutagénesis de exploración con alanina, y por PCR. Para producir el ADN variante de CRIg puede realizarse mutagénesis dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res, 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis de casete [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] u otras técnicas conocidas.

20

El análisis de exploración con aminoácidos también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos que pueden variar a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es generalmente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La 25 alanina también se prefiere generalmente debido a que es el aminoácido más común. Adicionalmente, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones ocultas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. Si la sustitución de la alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico.

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Se ha descubierto que la eliminación o la inactivación de toda, o de parte de, la región transmembrana y/o región citoplasmática no compromete la actividad biológica de CRIg. Por lo tanto, las variantes de CRIg con la región transmembrana y/o región citoplasmática delecionada/inactivada están específicamente dentro del ámbito del presente documento. De modo similar, la región IgC2 puede eliminarse sin comprometer la actividad biológica, tal como se demuestra mediante la existencia de una forma corta nativa de huCRIg biológicamente activa y un 35 homólogo murino.

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos CRIg de secuencia nativa y variantes se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar restos de aminoácidos de CRIg con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con 40 los restos N- o C- terminales del polipéptido CRIg. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar CRIg con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua, por ejemplo, para su uso en el método de purificación de anticuerpos anti-CRIg. Los agentes de entrecruzamiento normalmente usados, incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-acidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3’-45 ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como el metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de restos de glutaminilo y asparaginilo para los restos correspondientes de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de 50 grupos hidroxilo de restos de serilo y treonilo, la metilación de los grupos -amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

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Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos CRIg incluido dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el patrón de glucosilación nativo de los polipéptidos. “Alterar el patrón de glucosilación nativo” pretende, para los fines del presente documento, significar la deleción de una o más fracciones de hidratos de carbono que se encuentran en el CRIg de secuencia nativa y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no estén presentes en el CRIg de secuencia nativa, y/o la alteración de la relación y/o composición de los restos glucídicos unidos al sitio o 60 sitios de glucosilación. Un sitio de glucosilación nativo predicho en el CRIg murino se encuentra en la posición 170 en la secuencia NGTG.

Generalmente, la glucosilación de los polipéptidos es glucosilación unida a N o unida a O. La glucosilación unida a N se refiere a la unión de la fracción de hidrato de carbono con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las 65 secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido

excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para que se produzca la unión enzimática de la fracción de hidrato de carbono con la cadena lateral de la asparagina. La glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden estar implicadas la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina en la glucosilación unida a O. El CRIg de secuencia nativa tiene una N-glucosilación significativa. La adición de sitios de glucosilación al 5 polipéptido CRIg puede realizarse alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina, en la secuencia nativa de CRIg (para sitios de glucosilación unidos a O), o mediante la adición de una secuencia de reconocimiento para la glucosilación unida a N. La secuencia de aminoácidos de CRIg puede alterarse opcionalmente a través de cambios al nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido CRIg en bases preseleccionadas, de tal 10 manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para aumentar el número de fracciones de hidrato de carbono en el polipéptido CRIg es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dichos métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. 15 Rev. Biochem., páginas 259-306 (1981).

La eliminación de fracciones de hidrato de carbono presentes en un polipéptido CRIg puede realizarse química o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifican restos de aminoácidos que actúan como dianas para la glucosilación. Las técnicas de glucosilación química son conocidas en el campo y las describen, por 20 ejemplo, Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de los fracciones de hidrato de carbono en los polipéptidos puede alcanzarse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas, como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de CRIg comprende unir el polipéptido CRIg con una variedad de polímeros no 25 proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, por ejemplo, del modo expuesto en las Patentes de Estados Unidos Nos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

El CRIg de secuencia nativa y variantes de la presente invención también puede modificarse de modo que forme una molécula quimérica que comprenda CRIg, incluyendo fragmentos de CRIg, fusionada con otra secuencia 30 polipeptídica o de aminoácidos heteróloga. En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión de CRIg con un polipéptido con etiqueta que proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epitópica generalmente se coloca en el extremo amino o carboxilo del polipéptido CRIg. La presencia de dichas formas de epítopos etiquetados del polipéptido CRIg puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido con etiqueta. Además, al proporcionar una etiqueta epitópica se permite que el polipéptido CRIg 35 se purifique fácilmente por purificación de afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta y otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta epitópica. En la técnica se conocen bien diversos polipéptidos con etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen etiquetas de polihistidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gli); el polipéptido con etiqueta HA (hemaglutinina) gripal y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para la misma [Evan et al., 40 Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de glucoproteína D (gD) del virus del Herpes Simple y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos con etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epitópico KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; y un péptido epitópico de α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; y la etiqueta peptídica de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 45 87: 6393-6397 (1990)].

En otra realización, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido CRIg, o un fragmento del mismo, con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión puede ser en la región Fc de una molécula de IgG. Estos polipéptidos de fusión son 50 moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una “adhesina”) con las funciones efectoras de los dominios constantes de la inmunoglobulina, y con frecuencia reciben el nombre de inmunoadhesinas. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es distinta al sitio de reconocimiento y de unión al antígeno de un anticuerpo (es decir, es “heteróloga”), y una secuencia de dominio constante de una 55 inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina es generalmente una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina de la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como de los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

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En la técnica se conocen quimeras construidas a partir de una secuencia receptora unida a una secuencia apropiada de dominio constante de inmunoglobulina (inmunoadhesinas). Las inmunoadhesinas descritas en la bibliografía incluyen fusiones del receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84: 2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339: 68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA, 9: 347-353 (1990); Byrn et al., Nature, 344: 667-670 (1990)); L-selectina (receptor de alojamiento) 65 ((Watson et al., J. Cell. Biol., 110: 2221-2229(1990); Watson et al., Nature, 349: 164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al.,

Cell, 61: 1303-1313 (1990)); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med., 173: 721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell, 66: 1133-11144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539(1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol., 27: 2883-2886(1991); Peppel et al., J. Exp. Med., 174: 1483-1489(1991)); receptores de NP (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23060-23067(1991)); y receptor alfa de IgE. (Ridgway et al., J. Cell. Biol., 115:resum.1448 (1991)). 5

El diseño más simple y más sencillo de inmunoadhesina combina la región (o regiones) de unión de la proteína “adhesina” con las regiones bisagra y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Normalmente, cuando se preparan las quimeras de CRIg-inmunoglobulina de la presente invención, un ácido nucleico que codifica el polipéptido CRIg, o el dominio extracelular de un polipéptido CRIg, se fusionará en el extremo C con el ácido 10 nucleico que codifica el extremo N de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, sin embargo también son posibles fusiones N terminales.

Generalmente, en dichas fusiones el polipéptido quimérico codificado conservará al menos la bisagra y los dominios CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones 15 también se realizan en el extremo C de la parte Fc de un dominio constante, o inmediatamente en posición N-terminal del CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera.

El sitio exacto en el que se realiza la fusión no es crítico; se conocen bien sitios particulares y pueden seleccionarse para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de las quimeras CRIg-20 inmunoglobulina.

En algunas realizaciones, las quimeras CRIg-inmunoglobulina se ensamblan como monómeros, o hetero- u homo-multímeros, y particularmente como dímeros o tetrámeros, esencialmente como se ilustra en el documento WO 91/08298. 25

En una realización preferida, la secuencia de un polipéptido CRIg humano de secuencia nativa tal como, por ejemplo, huCRIg(largo) (SEC ID Nº: 4) o huCRIg(corto) (SEC ID Nº: 6), o una secuencia de dominio extracelular de CRIg (incluyendo el DEC de huCRIg(largo) y huCRIg(corto)) se fusiona con el extremo N de la parte C terminal de un anticuerpo (en particular el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por 30 ejemplo, inmunoglobulina G1 (IgG 1). Es posible fusionar toda la región constante de cadena pesada con la secuencia de CRIg o con el dominio extracelular de CRIg. Sin embargo, más preferentemente, en la fusión se usa una secuencia que comienza en la región bisagra inmediatamente cadena arriba del sitio de escisión con papaína (que define químicamente la parte Fc de la IgG; resto 216, considerando el primer resto de la región constante de cadena pesada 114, o sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una realización particularmente preferida, la 35 secuencia de aminoácidos de CRIg se fusiona con la región bisagra y CH2 y CH3, o con los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG1,IgG2 o IgG3. El sitio exacto en el que se realiza hace la fusión no es crítico, y el sitio óptimo puede determinarse por experimentación rutinaria. En las Figuras 59-61 se ilustran estructuras de inmunoadhesina CRIg-Ig específicas.

40

En algunas realizaciones, las quimeras CRIg-inmunoglobulina se ensamblan como un multímero, y particularmente como homo-dímeros o -tetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural básica de cuatro cadenas es la forma en la que existe la IgG, IgD, e IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de mayor peso molecular; la IgM generalmente existe como un pentámero de unidades básicas de cuatro cadenas que se mantienen unidas entre sí por enlaces 45 disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en suero en forma multimérica. En el caso del multímero, cada unidad de cuatro cadenas puede ser la misma o diferente.

Como alternativa, la secuencia de CRIg o del dominio extracelular de CRIg puede insertarse entre las secuencias de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina de modo que se obtiene una inmunoglobulina que 50 comprende una cadena pesada quimérica. En esta realización, la secuencia de CRIg, se fusiona con el extremo 3’ de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, bien entre la bisagra y el dominio CH2, o entre los dominios CH2 y CH3. Hoogenboom et al, Mol. Immunol., 28: 1027-1037 (1991) han descrito construcciones similares.

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Aunque en las inmunoadhesinas de la presente invención no se requiere la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina, puede estar presente una cadena ligera de inmunoglobulina bien asociada de manera covalente con un polipéptido de fusión CRIg-cadena pesada de inmunoglobulina, o directamente fusionada con el dominio extracelular de CRIg. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se coexpresa generalmente junto con el ADN que codifica la proteína de fusión CRIg-cadena pesada de inmunoglobulina. 60 Después de la secreción, el híbrido de cadena pesada y la cadena ligera se asociarán de manera covalente para proporcionar una estructura similar a una inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina unidos por enlaces disulfuro. Métodos adecuados para la preparación de dichas estructuras se divulgan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567 expedida el 28 de marzo de 1989. 65

En las Figuras 59, 60 y 67-70 se muestran secuencias de nucleótidos que codifican determinadas proteínas de fusión CRIg-Ig de la invención. Como se muestra en las Figuras 67-70, por ejemplo, las proteínas de fusión pueden contener un enlazador entre las secuencias de CRIg y de inmunoglobulina, tal como, por ejemplo, una secuencia peptídica corta, por ejemplo, DKTHT. Además, en algunas construcciones, puede delecionarse la secuencia entre la región transmembrana (TM) de CRIg y la región (Fc) de la inmunoglobulina (mencionada en el presente documento 5 como la secuencia “tallo”). La posición aminoacídica donde comienza el enlazador en las diversas construcciones de CRIg que se muestran en las Figuras 67-70 es la siguiente: huCRIg-largo-Fc + tallo: posición 267; huCRIg-largo-Fc - tallo: posición 233; huCRIg-corto-Fc + tallo: posición 173; huCRIg-corto-Fc - tallo: posición 140.

2. Preparación de polipéptidos CRIg de secuencia nativa y variantes 10

El ADN que codifica los polipéptidos CRIg de secuencia nativa puede obtenerse de una biblioteca de ADNc preparada de tejido que se cree que posee el ARNm de CRIg y que lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN de CRIg humano puede obtenerse convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada de tejido humano, como se describe en el Ejemplo 1. El gen que codifica CRIg también puede obtenerse de una 15 biblioteca genómica o por síntesis de oligonucleótidos.

Las bibliotecas pueden explorarse con sondas (tales como anticuerpos contra CRIg u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. La exploración de genotecas o de ADNc con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos 20 convencionales, como se describe en Sambrook et al., Molecular Closing: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo de aislar el gen que codifica CRIg es usar la metodología de PCR [Sambrook et al., anteriormente mencionado; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995).

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El ejemplo 1 describe técnicas para explorar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben tener la suficiente longitud y ser suficientemente claras de modo que se minimicen los positivos falsos. El oligonucleótido está preferentemente marcado de modo que puede detectarse después de la hibridación con el ADN en la biblioteca que se está explorando. Los métodos de marcaje son muy conocidos en la técnica, e incluyen el uso de radiomarcadores tales como ATP marcado con 32P, biotinilización o 30 marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, que incluyen rigurosidad moderada y rigurosidad alta, se proporcionan en Sambrook et al., anteriormente mencionado.

Las secuencias identificadas en dichos métodos de exploración de bibliotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como el GenBank u otras 35 bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (bien a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa puede determinarse a mediante el alineamiento de secuencias usando programas informáticos tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplean diversos algoritmos para medir la homología.

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El ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica proteínas pueden obtenerse explorando bibliotecas de ADNc o genómicas seleccionadas usando la secuencia de aminoácidos deducida que se divulga en el presente documento por primera vez, y, si fuera necesario, usando procedimientos convencionales de extensión con cebadores como se describe en Sambrook et al., anteriormente mencionado, para detectar precursores y productos intermedios de procesamiento de ARNm que no se hayan retrotranscrito en ADNc. 45

Las células hospedadoras se transfectan o se transforman con vectores de expresión o de clonación descritos en el presente documento para la producción de CRIg y se cultivan en medios con nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, pueden 50 seleccionarse por el experto en la materia sin experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y en Sambrook et al., anteriormente mencionado.

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El experto habitual en la técnica conoce bien métodos de transfección, por ejemplo, con CaPO4 y electroporación. Dependiendo de la célula hospedadora que se use, la transformación se realiza usando técnicas convencionales apropiadas para dichas células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., anteriormente mencionado, o la electroporación generalmente se usan para procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa 60 para la transformación de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) y en el documento WO 89/05859, publicado el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, puede emplearse el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos Nº 4.399.216 se han descrito aspectos generales de las transformaciones en sistemas de células hospedadoras de mamíferos. Las transformaciones en levaduras se 65 realizan generalmente de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para las diversas técnicas de transformación de células de mamíferos, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988). 5

Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores del presente documento incluyen células procariotas, levaduras, o eucariotas superiores. Las procariotas adecuadas incluyen, pero sin limitación, eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, de la familia Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Diversas cepas E. coli están disponibles al público, tales como E. coli K12 cepa 10 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635).

Además de procariotas, microbios eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son hospedadores adecuados para la clonación o expresión de vectores que codifican CRIg. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedador eucariota inferior que es de uso común. 15

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de CRIg glucosilado derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tales como S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles incluyen las células de ovario de hámster Chino (CHO) y COS. Los ejemplos más específicos incluyen células de 20 riñón de mono CV1 transformadas con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de riñón humano embrionario (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivos en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); y células tumorales de mama de ratón 25 (MMT 060562, ATCC CCL51). Se considera que la selección de la célula hospedadora apropiada se incluye en la experiencia de la técnica.

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica CRIg puede insertarse en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Diversos vectores se encuentran disponibles para el 30 público. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en uno o más sitios de endonucleasas de restricción apropiados usando técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de 35 terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligamiento convencionales conocidas por el experto en la materia.

Los polipéptidos CRIg pueden producirse de manera recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que 40 tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o esta puede ser una parte del ADN de CRIg que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o enterotoxina II termoestable al calor. Para la secreción en levaduras la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de levaduras, el líder del factor alfa (incluyendo los 45 factores líder de “Saccharomyces y Kluyveromyces”, el último descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.010.182) o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362,179 publicado el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, las secuencias señal de mamífero pueden usarse para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma o de una especie 50 relacionada, así como en líderes secretores virales.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Dichas secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la 55 mayor parte de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido 2: es adecuado para levaduras, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o VBP) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.

Los vectores de expresión y clonación generalmente contendrán un gen de selección, también denominado 60 marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metrotexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa en bacilos.

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Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico de CRIg, tales como la DHFR o la timidina quinasa. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea la DHFR de tipo silvestre es la línea celular CHO con actividad DHFR deficiente, preparada y propagada como describen Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para el uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de 5 levaduras YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].

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Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de CRIg para dirigir la síntesis de ARNm. Se conocen bien promotores reconocidos por una variedad de posibles células hospedadoras. Los promotores adecuados para su uso con hospedadores procariotas incluyen los sistemas promotores de β-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al, Nature, 281: 544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 15 4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80: 21-25 (1983)]. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo (S. D.) unida operativamente al ADN que codifica CRIg.

Los ejemplos adecuados de secuencias promotoras para el uso en levaduras hospedadoras incluyen los promotores 20 para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descaroxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. 25

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de controlar la transcripción a través de las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de la 30 maltosa y la galactosa. Adicionalmente, en el documento EP 73.657 se describen vectores y promotores adecuados para su uso en expresión en levaduras.

La transcripción de CRIg a partir de vectores en células hospedadoras de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar (documento 35 UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, un virus de la hepatitis B y el Virus de Simio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora. 40

La transcripción de un ADN que codifica los polipéptidos CRIg por eucariotas superiores puede aumentarse insertando en l vector una secuencia potenciadora. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, -fetoproteína e insulina). Sin 45 embargo, generalmente se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma del lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5’ o 3’ en la secuencia codificante de CRIg, pero preferentemente se localiza en un sitio 5’ del promotor. 50

Los vectores de expresión que se usan en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, vegetales, animales, humanas o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se encuentran normalmente disponibles a partir de las regiones 5’, ocasionalmente 3’, no traducidas, de los ADN o ADNc 55 eucariotas o virales Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica CRIg.

Aún, otros métodos, vectores y células hospedadoras, adecuados para la adaptación a la síntesis de CRIg en cultivos de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); 60 Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); y en los documentos EP 117.060; y EP 117.058.

La amplificación y/o expresión génica puede medirse directamente en una muestra, por ejemplo, por transferencia de Southern y de Northern convencional, para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Pro. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77: 5201-5205 (1980)], transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda 65 marcada apropiadamente, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Como

alternativa, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, que incluyen dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos pueden marcarse y el ensayo puede realizarse cuando el dúplex está unido a una superficie, de modo que tras la formación del dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

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De manera alternativa, la expresión génica puede medirse por métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o cortes tisulares y ensayos de cultivos celulares o de fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos, útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de muestras de fluidos, pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido CRIg de secuencia nativa o 10 contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento o contra la secuencia exógena fusionada con el ADN de CRIg y que codifica un epítopo específico de anticuerpo.

Las formas de CRIg pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de células hospedadoras. Si están unidas a la membrana, pueden liberarse de la membrana usando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, 15 Triton-X 100) o por escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión de CRIg pueden desestabilizarse por diversos medios físicos y químicos, tales como por ciclos de congelación-descongelación, tratamiento con ultrasonidos, desorganización mecánica, o agentes de lisis celular.

Puede desearse purificar CRIg de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos 20 son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sefarosa para eliminar los contaminantes tales como IgG; y columnas de metales quelantes para unir formas epitópicas etiquetadas del polipéptido CRIg. Pueden emplearse 25 diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa (o etapas) de purificación seleccionada dependerá, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del CRIg particular producido.

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3. Enfermedades diana

Los polipéptidos CRIg y las inmunoadhesinas CRIg-Ig, son particularmente útiles para la prevención y el tratamiento de afecciones oculares asociadas al complemento (todas las afecciones y enfermedades oculares en cuya patología interviene el complemento, incluyendo las rutas clásicas y alternativa, y en particular la ruta alternativa del 35 complemento), tales como, por ejemplo, las enfermedades maculares degenerativas, tales como todas las fases de la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), incluyendo las formas seca y húmeda (no exudativa y exudativa), neovascularización coroidal (NVC), uveítis, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con la isquemia, endoftalmitis, y otras enfermedades intraoculares neovasculares, tales como el edema macular diabético, la miopía patológica, la enfermedad de Hippel-Lindau, la histoplasmosis ocular, la Oclusión de la Vena Central de la 40 Retina (OVCR), la neovascularización corneal y la neovascularización retiniana. Un grupo preferido de afecciones oculares asociadas al complemento incluye, degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), incluyendo DMRE no exudativa (seca o atrófica) y exudativa (húmeda), neovascularización coroidal (NVC), retinopatía diabética (RD) y endoftalmitis.

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La DMRE es una degeneración de la mácula relacionada con la edad, que es la causa principal de la disfunción visual irreversible en individuos mayores de 60 años. Existen dos tipos de DMRE, la DMRE no exudativa (seca) y exudativa (húmeda). La forma seca, o no exudativa, implica cambios atróficos e hipertróficos en el epitelio pigmentario retiniano (EPR) por debajo de la retina central (mácula) así como depósitos (drusas) en el EPR. Los pacientes con DMRE no exudativa pueden progresar a la forma húmeda, o exudativa, de la DMRE, en cuyos vasos 50 sanguíneos anómalos, denominados membranas neovasculares coroidales (MNVC), se desarrollan bajo la retina, rezuman fluido y sangre, y finalmente causan una cicatriz cegadora en forma de disco en y bajo la retina. La DMRE no exudativa, que habitualmente es precursora de la DMRE exudativa, es más común. La presentación de la DMRE no exudativa varía; pudiendo estar presentes drusas duras, drusas blandas, atrofia geográfica del EPR, y aglutinación pigmentaria. Los componentes del complemento se depositan en el EPR inicialmente en la DMRE y son 55 los principales constituyentes de las drusas.

La presente invención concierne específicamente al tratamiento de la DMRE de alto riesgo, incluyendo la DMRE de categoría 3 y de categoría 4. La DMRE de categoría 3 se caracteriza por la ausencia de DMRE avanzada en los dos ojos, teniendo al menos un ojo una agudeza visual de 20/32 o mejor con al menos una drusa grande (por ejemplo de 60 125 m), drusas de extensión intermedia (tal como se mide por el área de la drusa), o atrofia geográfica (AG) que no implica el centro de la mácula, o cualquier combinación de estas. La DMRE de categoría 3 (que aún se considera DMAR “seca”) tiene un alto riesgo de conversión a neovascularización coroidal (NVC).

La DMRE de alto riesgo de categoría 4 (clasificada como DMAR “húmeda”) se caracteriza por una agudeza visual de 65 20/32 o mejor y sin DMRE avanzada (AG que implica al centro de la mácula o características de neovascularización

coroidal) en el índice ocular. El otro ojo se caracteriza por DMRE avanzada, o agudeza visual menor de 20/32 atribuible a maculopatía por DMRE. Normalmente, si la DMRE de alto riesgo no se trata, rápidamente progresa a neovascularización coroidal (NVC), a una velocidad aproximadamente 10-30 veces mayor que la velocidad de progresión para la DMRE de categoría 1 o 2 (no de alto riesgo).

5

El CRIg y las inmunoadhesinas CRIg-Ig, encuentran utilidad particular en la prevención de la progresión de la DMRE (en particular, DMRE de categoría 3 o categoría 4) a NVC, y/o en la prevención del desarrollo/progresión de DMRE o NVC en el otro ojo no afectado o menos afectado. En este contexto, el término “prevención” se usa en el más amplio sentido para incluir, el bloqueo completo o parcial y la ralentización de la progresión de la enfermedad, así como el retraso de la aparición de las formas más graves de la enfermedad. Los pacientes con alto riesgo de desarrollar o 10 progresar a DMRE de alto riesgo (categoría 4) o a NVC se benefician especialmente de este aspecto de la invención.

Se sabe que el polimorfismo en el factor H del complemento (FHC) está asociado con el riesgo de un individuo a desarrollar DMRE y/o NVC. Las mutaciones en el FHC pueden activar el complemento, que a su vez puede conducir 15 a DMRE/NVC. Se ha notificado recientemente que el polimorfismo del factor H del complemento (FHC) representa el 50 % del riesgo atribuible de DMRE (Klein et al., Science 308: 385-9 (2005)). Se ha descubierto un haplotipo común en el FHC (HFl/FHC) que predispone a los individuos a la degeneración macular relacionada con la edad (Hageman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 102(2): 7227-7232 (2005)). La DMRE se ha segregado como un rasgo autosómico dominante, mapeando el locus de la enfermedad en el cromosoma 1q25-q31, entre los marcadores 20 DIS466 y D1S413, con una puntuación LOD máxima de aproximadamente 3,20 (Klein et al., Arch Opthalmol. 116(8): 1082-9(1998); Majewski et al., Am. J. Hum. Genet. 73(3): 540-50 (2003); Seddon et al., Am J. Hum. Genet. 73(4): 780-90 (2003); Weeks et al., Am. J. Ophthalmol. 132(5): 682-92 (2001); Iyengar et al, Am. J. Hum. Genet. 74(1): 20-39 (2004)); en el cromosoma 2q3/2q32, entre los marcadores D12S1391 y D2S1384, con una puntuación LOD máxima de 2,32/2,03 (Seddon et al., anteriormente mencionado); en el cromosoma 3p13, entre los marcadores 25 D12S1300 y D12S1763, con una puntuación LOD máxima de 2,19 (Majewski et al., anteriormente mencionado; Schick et al., Am. J Hum. Genet. 72(6): 1412-24 (2003)); en el cromosoma 6q14, entre los marcadores D6S1056 y DS249, con una puntuación LOD máxima de 3,59/3,17 (Kniazeva et al., Am. J. Ophthlmol. 130(2): 197-202 (2000)); en el cromosoma 9q33, en el marcador D9S934, con una puntuación LOD máxima de 2,06 (Mejwski et al., anteriormente mencionado); en el cromosoma 10q26, en el marcador D10S1230, con una puntuación LOD máxima 30 de 3,06 (Majewski et al., anteriormente mencionado; Iyengar et al., anteriormente mencionado; Kenealy et al., Mol. Vis. 10: 57-61 (2004); en el cromosoma 17q25, en el marcador D17S928, con una puntuación LOD máxima de 3,16 (Weeks et al., anteriormente mencionado); y en el cromosoma 22q12, en el marcador D22S1045, con una puntuación LOD máxima de 2,0 (Seddon et al., anteriormente mencionado). Por consiguiente, la exploración genética es una parte importante para identificar pacientes que son particularmente buenos candidatos para el 35 tratamiento preventivo, incluyen la prevención de la progresión de la enfermedad a una forma más grave, tal como de DMRE a NVC.

Además, a la vista de las contundentes pruebas de una relación de la activación del complemento y la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), la presente invención proporciona un nuevo método para la prevención y 40 el tratamiento de la NVC y la DMRE mediante la inhibición del complemento, en particular, mediante la inhibición de la ruta alternativa.

4. Métodos de tratamiento

45

Para la prevención, el tratamiento o la reducción de la gravedad de una enfermedad ocular asociada al complemento (inmunorelacionada), la dosificación apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de la enfermedad a tratar, tal como se define anteriormente, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad, de si el agente se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, del historial clínico del paciente, de la respuesta al compuesto y del criterio del médico tratante. El compuesto se administra adecuadamente al paciente 50 una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Preferentemente, es deseable determinar la curva de respuesta a la dosis y ensayar la composición farmacéutica de la invención, primero in vitro, y después en modelos animales útiles antes de realizar su ensayo en seres humanos.

Por ejemplo, dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, la dosificación de aproximadamente 1 g/kg a 55 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 - 20 mg/kg) de polipéptido, es una dosificación inicial candidata para la administración al paciente, por ejemplo, bien mediante una o más administraciones distintas, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas. Sin embargo, 60 pueden utilizarse otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección ocular, los compuestos de la invención se administran generalmente mediante inyección ocular, intraocular y/o intravítrea. También pueden usarse otros 65 métodos de administración, que incluyen, pero sin limitación, administración tópica, parenteral, subcutánea,

intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal e intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea.

Para la administración ocular, intraocular o intravítrea las composiciones pueden prepararse mediante métodos y usos de ingredientes conocidos en la técnica. Un requisito principal para el tratamiento eficaz es la adecuada penetración a través del ojo. A diferencia de las enfermedades de la parte anterior del ojo, donde los fármacos 5 pueden administrarse por vía tópica, las enfermedades de la retina requieren una estrategia más específica de sitio. Las gotas y pomadas oculares raramente penetran en la parte posterior del ojo y la barrera hemato-ocular obstaculiza la penetración de los fármacos administrados por vía sistémica en el tejido ocular. Por consiguiente, normalmente el método de elección para el suministro de fármacos para tratar enfermedades de la retina, tales como la DMRE o la NVC, es la inyección intravítrea directa. Las inyecciones intravítreas se repiten normalmente a 10 intervalos que dependen de la afección del paciente y de las propiedades y semivida del fármaco suministrado. Para la penetración intraocular (por ejemplo, intravítrea), normalmente se prefieren moléculas de tamaño más pequeño. En el caso de CRIg, todas las formas, incluyendo el DEC de las formas corta y larga de huCRIg, sus fusiones con Ig (Fc), las formas larga y corta de huCRIg de longitud completa, y todas sus fusiones con Ig (Fc) son adecuadas para el suministro intraocular (incluyendo el intravítreo). 15

La eficacia del tratamiento de las afecciones oculares asociadas al complemento, tales como la DMRE o la NVC, puede medirse mediante diversos criterios de valoración que se usan comúnmente en la evaluación de las enfermedades intraoculares. Por ejemplo, puede evaluarse la pérdida de visión. La pérdida de visión puede evaluarse, por ejemplo, aunque sin limitación, midiendo el cambio medio en la mejor agudeza visual corregida 20 (MAVC) desde el inicio en un momento deseado (por ejemplo, en el que la MCAV se basa en la Gráfica de Agudeza Visual del Estudio del Tratamiento Precoz de la Retinopatía Diabética (ETPRD) y en la evaluación de una distancia de ensayo de 4 metros), midiendo la proporción de sujetos que pierden menos de 15 letras en la agudeza visual en un momento deseado en comparación con el dato inicial, midiendo la proporción de sujetos que ganan más o igual a 15 letras en la agudeza visual en un momento deseado en comparación con el dato inicial, midiendo la proporción 25 de sujetos con una agudeza visual de Snellen equivalente a 20/2000 o peor en un momento deseado, midiendo el Cuestionario NEI sobre Funcionamiento Visual, midiendo el tamaño de la NVC y la cantidad de pérdida de NVC en un momento deseado, por ejemplo, mediante angiografía con fluoresceína, etc. Pueden hacerse evaluaciones oculares, por ejemplo, que incluyan, pero sin limitación, por ejemplo, la realización de un examen ocular, la medición de la presión intraocular, la evaluación de la agudeza visual, la medición de la presión con lámpara de hendidura, la 30 evaluación de la inflamación intraocular, etc.

Las composiciones del presente documento pueden combinarse con una o más molaridades de tratamiento adicionales para la prevención o el tratamiento de la enfermedad o afección a la que se dirigen. Por lo tanto, por ejemplo, si el objetivo es la prevención o el tratamiento de afecciones oculares asociadas al complemento, la 35 administración de CRIg (incluyendo todas las formas y sus regiones EC y/o fusiones con Ig) puede combinarse con o complementar la administración del anticuerpo anti-VEGF-A ranibizumab (Lucenitis™, Genentech, Inc.), que está en desarrollo clínico para el tratamiento de la DMRE. En un ensayo clínico en Fase III que ha concluido recientemente, además de reunir el criterio de valoración de eficacia del estudio de mantener la visión en pacientes con DMRE húmeda, el 25 por ciento (59/238) de los pacientes tratados con 0,3 mg de Lucentis y el 34 por ciento 40 (81/240) de los tratados con 0,5 mg de Lucentis™ mejoraron la visión con una ganancia de 15 letras o más en comparación con aproximadamente el 5 por ciento (11/238) de los pacientes en el grupo control, tal como se mide con la Gráfica de Agudeza Visual del Estudio del Tratamiento Precoz de la Retinopatía Diabética (ETPRD). Aproximadamente el 40 por ciento (188/478) de los pacientes tratados con Lucentis™ alcanzaron una puntuación de la agudeza visual de 20/40 o mejor a los 12 meses en comparación con el 11 por ciento (26/238) en el grupo control. 45 A los 12 meses, los pacientes tratados con Lucentis™ ganaron una media de siete letras en la agudeza visual en comparación con cuando se incorporaron al estudio, mientras que los pacientes del grupo control perdieron una media de 10,5 letras.

5. Ensayos de exploración y modelos animales 50

El CRIg y las fusiones de CRIg y del DEC de CRIg con Ig, pueden evaluarse en diversos ensayos basados en células y en modelos animales de enfermedades o trastornos asociados al complemento.

Un modelo animal de degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) consiste en ratones con una mutación 55 nula en los genes Ccl-2 o Ccr-2. Estos ratones desarrollan características fundamentales de la DMRE, incluyendo la acumulación de lipofuscina en drusas y debajo del epitelio pigmentado retiniano (EPR), la atrofia de fotorreceptores y la neovascularización coroidal (NVC). Estas características se desarrollan por encima de los 6 meses de edad. El CRIg y los agonistas de CRIg pueden someterse a ensayo con respecto a la formación de drusas, atrofia de fotorreceptores y neovascularización coroidal. 60

La NVC, puede ensayarse en diversos modelos de neovascularización coroidal inducida por láser. Por ejemplo, la NVC puede inducirse en ratas y en monos Cinomolgos mediante fotocoagulación con láser intensa, lo que da como resultado la neovascularización coroidal. El progreso y el tratamiento de esta afección pueden evaluarse, por ejemplo, mediante angiografía con fluoresceína, mediante evaluación histopatológica e inmunohistoquímica y 65 mediante ensayos farmacocinéticos, hemolíticos, de exploración con anticuerpos y de activación del complemento

de suero extraído de los animales antes y después del tratamiento, en diferentes intervalos de tiempo. La eficacia de la administración preventiva puede controlarse mediante métodos similares, incluyendo control de filtración vascular mediante angiografía con fluoresceína, inhibición de la deposición de complemento en el sitio de la quemadura por láser, examen ocular, fotografía ocular, extracción de humor vítreo y tejido retinal, y similares. Más adelante se proporcionan detalles adicionales en los ejemplos. 5

6. Composiciones farmacéuticas

Las moléculas activas de la invención, pueden administrarse para el tratamiento de afecciones oculares asociadas al complemento en forma de composiciones farmacéuticas. 10

Las formulaciones terapéuticas de la molécula activa, como se define en las reivindicaciones, se preparan para su conservación mezclando la molécula activa que tiene el grado de pureza deseado con transportadores, excipientes o estabilizantes opcionales, farmacéuticamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los transportadores, excipientes o 15 estabilizantes adecuados no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol, ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 20 aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales 25 como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

También pueden usarse lipofecciones o liposomas para suministrar el polipéptido a las células.

La formulación del presente documento también puede contener más de un compuesto activo, según sea necesario 30 para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente compuestos que tienen actividades complementarias que no se afectan de modo adverso entre sí. Como alternativa, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, un agente inhibidor de citocinas o del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin al que se destinan.

35

Las moléculas activas también pueden incluirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidades de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. 40 (1980).

Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto puede llevarse a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.

45

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o alcohol poli(vinílico)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y -etil-L-50 glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros, tales como acetato de etilenvinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el 55 organismo durante mucho tiempo, estos pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 ºC, produciendo una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias razonables para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de relación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, puede alcanzarse la estabilización modificando restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones 60 ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

Para la administración intraocular, generalmente se usan formulaciones para inyección, que se proporcionan normalmente con seis semanas de diferencia. Antes de cada inyección se anestesia el ojo. 65

Sin embargo, también es posible usar implantes con formulaciones de liberación sostenida de CRIg o una fusión de CRIg-Ig o del DEC de CRIg-Ig, para liberación intravítrea.

Los siguientes ejemplos se ofrecen solo con fines ilustrativos, y de ningún modo no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

5

Ejemplos

Salvo que se indique otra cosa, los reactivos disponibles en el comercio que se mencionan en los ejemplos, se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria descriptiva, mediante números de referencia de la ATCC, es la Colección 10 Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.

Ejemplo 1

Aislamiento de clones de ADNc que codifican el CRIg humano (PR0362) 15

Se usaron las secuencias del dominio extracelular (DEC) (incluyendo la señal de secreción, si hubiese alguna) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de datos de proteínas públicas Swiss-Prot para investigar bases de datos de etiquetas de secuencias expresadas (EST, Expressed Sequence Tags). Las bases de datos EST incluyeron bases de datos EST públicas (por ejemplo GenBank) y una base de datos de ADN EST 20 patentada (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó usando el programa informático BLAST o BLAST-2 (por ejemplo, Altshul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) como una comparación de las secuencias de DEC de la proteína con una traducción de 6 fases de la secuencia EST. Aquellas comparaciones que dieron como resultado en el BLAST una puntuación de 70 (o en algunos casos de 90) o mayor que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en secuencias de ADN consenso con el 25 programa “phrap” (Phi1 Green, University of Washington, Seattle, Washington.

Una secuencia de ADN consenso se ensambló con respecto a otras secuencias EST usando el programa phrap. Esta secuencia consenso se denominó ADN42257 (SEC ID Nº: 9) (véase la Figura 32) en el presente documento. Basándose en la secuencia consenso ADN42257 (SEC ID Nº: 9) mostrada en la Figura 32, se sintetizaron 30 oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR una biblioteca de ADNc que contenían la secuencia de interés, y 2) para usarlos como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa para CRIg. Los cebadores directo e inverso de la PCT generalmente varían de 20 a 30 nucleótidos y a menudo se diseñan para dar un producto PCR de aproximadamente 100-1000 pb de longitud. Las secuencias de las sondas generalmente tienen una longitud de 40-55 pb. En algunos casos, se sintetizaron oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia 35 consenso era mayor de aproximadamente 1-1,5 kpb. Con el fin de explorar diversas bibliotecas para un clon de longitud completa, las bibliotecas de ADN se exploraron mediante amplificación por PCR, según Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par de cebadores de PCR. Después, se usó una biblioteca positiva para aislar clones que codificaba el gen de interés usando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.

40

Se sintetizaron los pares de cebadores (directo e inverso):

cebador de PCR directo 1 (42257.d1) 5’-TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG-3’ (SEC ID Nº: 10)

cebador de PCR directo 2 (42257.d2) 5’-GTCGGAAGACATCCCAACAAG-3’ (SEC ID Nº: 11)

cebador de PCR inverso 1 (42257.i1) 5’-CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC-3’ (SEC ID Nº: 12) 45

cebador de PCR inverso 2 (42257.i2) 5’-AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC-3’ (SEC ID Nº: 13)

Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridación oligonucleotídica sintética a partir de la secuencia consenso ADN42257 que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos:

50

Sonda de hibridación (42257.s1)

5’-TGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGAT-3’ (SEC ID Nº: 14).

Con el fin de explorar diversas bibliotecas para una fuente de un clon de longitud completa, el ADN de las bibliotecas se exploró mediante amplificación por PCR con los pares cebadores de PCR anteriormente identificados. Después, 55 se usó una biblioteca positiva para aislar clones que codificaba el gen de CRIg usando el oligonucleótido sonda y uno de los cebadores de PCR.

Para la construcción de las bibliotecas de ADNc se aisló ARN de tejido cerebral fetal humano (LIB 153). Las bibliotecas de ADNc usadas para aislar los clones de ADNc se construyeron por métodos convencionales usando 60 reactivos disponibles en el comercio, tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo dT que contenía un sitio NotI, se unió por extremo romo a adaptadores con hemiquinasa de SalI, se escindieron con NotI, se separaron por tamaño apropiadamente mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio de SfiI; véase, Homes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos de XhoI y NotI. 65

La secuenciación de ADN de los clones aislados tal como se describe produjo la secuencia de ADN para un polipéptido CRIg aislado (denominado en el presente documento UNQ317 (ADN45416-1251) (SEC ID Nº: 1).

La secuencia completa de nucleótidos de UNQ317 (ADN45416-1251) se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1). El clon UNQ367 (ADN45416-1251) (SEC ID Nº: 1) contiene una sola fase de lectura abierta con un sitio aparente de 5 inicio de la traducción en las posiciones nucleotídicas 1082-1084 (Figura 1, SEC ID Nº: 1). El precursor polipeptídico predicho tiene una longitud de 321 aminoácidos (Figura 1, SEC ID Nº: 2). La proteína CRIg que se muestra en la Figura 1 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente el 35.544 daltons y un pI de aproximadamente 8,51. El análisis del polipéptido CRIg de 321 aminoácidos, como se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 2), confirma la presencia de un sitio de unión a glucosaminoglicano en aproximadamente el aminoácido 149 a aproximadamente el 10 aminoácido 152 y un dominio transmembrana de aproximadamente el aminoácido 276 a aproximadamente el aminoácido 306. El clon UNQ317 (ADN45416-1251) se ha depositado en la ATCC con el Nº de depósito: 209620.

Similar a los miembros de la familia JAM, CRIg (PRO362), más recientemente mencionado como CRIg, es una molécula transmembrana de tipo 1 y un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. El dominio extracelular 15 de la forma larga del CRIg humano (huCRIg(L)) codifica ambos dominios terminales de IgG de tipo V y de tipo C2 (Smith y Xue, J. Mol. Biol. 274: 530-545 (1997)), mientras que la forma corta (huCRIg(C)) solo codifica un único tipo V de la Ig, pareciéndose al CRIg murino (muCRIg) (Figura 50A). El dominio citoplasmático C terminal de CRIg humano y murino contiene motivos de internalización consenso AP-2 (YARL y DSQALI, respectivamente Bonafacino y Traub Ann Rev Biochem 72 página 395 (2003)). Los HuCRIg y muCRIg comparten el 67 % de la homología total 20 de secuencia residiendo el 83 % de la homología en el dominio IgV. Entre los miembros de la familia JAM, huCRIg es el más estrechamente relacionado con JAM-A. La similitud de secuencia se confina a un tramo de restos conservados que forman el pliegue del dominio de Ig (Figura 50A). Tanto el CRIg humano como el murino se localizan en el cromosoma X en la posición Xq12 y tienen una posición sinténica en el cromosoma flanqueada por hefastina y moesina. 25

Ejemplo 2

Producción y purificación de proteínas

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Los dominios extracelulares de CRIg hu (humano) y mu (murino) se clonaron en un vector de expresión pRK5 modificado que codifica la región Fc de la IgG1 humana o murina cadena abajo de la secuencia de CRIg. La parte Fc de la IgG1 de ratón que contiene una mutación doble (D265A, N297A) que impide la unión del receptor de Fc (Gong et al, J. Immunol. 174: 817-826 (2005)) se usó para controlar la regulación del receptor de Fc. Como controles se usaron la proteína de fusión Fc IREM-1 humana y CLM-1 de ratón o un anticuerpo anti-IgG gp120 murino. El 35 CRIg etiquetado con LFH se preparó fusionando el DEC de CRIg con una cremallera de leucina de levadura, un Flag e histidina (6) en el extremo C. Las proteínas se sobreexpresaron en células CHO mediante transfecciones transitorias. Las células crecieron en biorreactores completamente automatizados usando medios basados en medio de Eagle modificado con F-12/Dulbecco complementado con suero con contenido Ultra-Bajo de IgG (Invitrogen) y Primatone HS (Sigma). El cultivo se mantuvo durante de 7-12 días hasta que las proteínas de fusión Fc recogidas se 40 purificaron por cromatografía de afinidad con proteína A y posterior filtración en gel Sephacryl S-300. La proteína de fusión LFH se purificó sobre una columna de níquel. La proteína CRIg-DEC humana se purificó por afinidad sobre una columna de Gliceril-CPG (173700404) de Millipore a la cual se absorbió el anticuerpo monoclonal 3C9. La proteína se eluyó a un pH de 3,0 y se generaron los CRIg hu y mu-HIS por clonación del DEC de CRIg en un vector de expresión de baculovirus que contenía histidinas (6) en el extremo C. El ADN plasmídico se transfectó en células 45 Sf9, el sobrenadante se usó para infectar células H5 y las proteínas se purificaron sobre una columna de níquel. Las identidades de todas las proteínas purificadas se verificaron mediante análisis de la secuencia del extremo N y la con concentración de lipopolisacárido fue <5 Eu/mg para todas las preparaciones de CRIg humano y murino.

Ejemplo 3 50

Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos policlonales se generaron inmunizando conejos de Nueva Zelanda con 200 g de huCRIg(L)-His en adyuvante completo de Freud seguido de un refuerzo 6 semanas después de la primera inmunización. Los 55 anticuerpos monoclonales contra muCRIg y huCRIg se generaron inmunizando ratas Wistar y ratones Balb/c con 50 g de proteína de fusión CRIg etiquetada con histidina mediante inyección en la almohadilla plantar. Los clones se seleccionaron basándose en su reactividad con CRIg-DEC humano y murino mediante ELISA, FACS, transferencia de Western e inmunohistoquímica. A menos que se indique lo contrario, los anticuerpos obtenidos se usaron en los ensayos posteriores. 60

Ejemplo 4

Infiltrados de células inflamatorias en piel de cobaya

65

El siguiente ejemplo muestra que huCRIg (PRO362) es proinflamatorio ya que estimula infiltrados de células inflamatorias (es decir, neutrófilas, eosinófilas, monocíticas, linfocíticas) en piel de cobayas. El ensayo que se describe en el presente documento controla la capacidad de esta proteína para inducir un infiltrado de células inflamatorias en la piel de una cobaya. Los compuestos que estimulan la infiltración inflamatoria son útiles terapéuticamente cuando la potenciación de una respuesta inflamatoria es beneficiosa. Los compuestos que inhiben 5 la proliferación de linfocitos son útiles terapéuticamente cuando la supresión de una respuesta inflamatoria es beneficiosa. Un agente terapéutico puede tener forma, por ejemplo, de anticuerpos quiméricos murinos-humanos, humanizados o humanos contra CRIg, moléculas pequeñas, péptidos, etc. que imitan la actividad biológica de CRIg, proteínas de fusión CRIg-Ig, región extracelular de CRIg, y similares.

10

Se anestesió a cobayas lampiñas (Charles River Labs) que pesaban 350 gramos o más con ketamina (75-80 mg/kg de peso corporal) y xilacina (5 mg/kg de peso corporal) por vía intramuscular. Las muestras de las proteínas huCRIg y control se inyectaron por vía intradérmica en el dorso de cada animal a un volumen de 100 l por sitio de inyección. Hubo aproximadamente 16-24 sitios de inyección por animal. Se inyectó por vía intracardiaca 1 ml de colorante azul Evans (al 1 % en solución salina fisiológica tamponada). Los animales se sometieron a eutanasia 6 15 horas después y se realizó una biopsia de cada sitio de inyección cutánea y se fijó en formalina. Las pieles se prepararon para la evaluación histopatológica. Cada sitio se evaluó para determinar la infiltración de células inflamatorias en la piel. Los sitios con células inflamatorias visibles se puntuaron como positivos. Las muestras que inducían un infiltrado de células inflamatorias se puntuaron como sustancias proinflamatorias. En este ensayo el CRIg dio positivo, lo que indica actividad antiinflamatoria. 20

Ejemplo 5

Expresión del ARNm y del polipéptido CRIg (PRO362)

25

A. Hibridación in situ e inmunohistoquímica

La expresión del ARNm de CRIg se evaluó por hibridación in situ, inmunohistoquímica y RT-PCR en diversos tipos de tejidos.

30

Para la hibridación in situ, los tejidos se fijaron (formalina al 4 %), se incluyeron en parafina, se seccionaron (3-5 m de espesor), se desparafinaron, se desproteinizaron (20 g/ml) con proteinasa K (15 minutos a 37 ºC), y se procesaron para la hibridación in situ. Las sondas de los polipéptidos de la invención se produjeron mediante PCR. Los cebadores incluyeron sitios de inicio de la ARN polimerasa de T7 o T3 para permitir la transcripción in vitro de sondas en sentido o antisentido a partir de los productos amplificados. Las sondas en sentido o antisentido 35 marcadas con 33P-UTP se hibridaron durante la noche (55 ºC), se lavaron (SSC 0,1 X durante 2 horas a 55 ºC), se sumergieron en emulsión de rastreo nuclear NBT2 (Eastman Kodak, Rochester, NY), se expusieron (4-6 semanas 4 ºC), y se desarrollaron y tiñeron con colorante con hematoxilina y eosina de contraste. Se muestran normalmente imágenes pares de campo brillante y oscuro representativas.

40

La tinción inmunohistoquímica se realizó en secciones congeladas de 5 mm de espesor usando un Autocolorante de DAKO. La actividad endógena de la peroxidasa se bloqueó con la Solución de Bloqueo de Kirkegaard y Perry (1:10,4 minutos a 20 ºC). Se usó SNC al 10 % en TBS/Tween 20 al 0,05 % (DAKO) para dilución y bloqueo. Se usó AcM anti-CRig 4F722.2 (anti-PRO362) o IgG de ratón a 0,13 mg/ml. Se usó IgG de cabra anti-ratón biotinilada (Vector Labs), Burlingame, CA) a 1:200 y se detectó con el Kit Convencional ABC Elite de Vector Labs (Vector Labs, 45 Burlingame, CA). Los portaobjetos se revelaron usando diaminobencidina potenciada con metal de Pierce (Pierce Chemicals, Rockford, IL). La inmunohistoquímica doble para la expresión de CRIg (PRO362) y CD68 se realizó en secciones congeladas para demostrar la localización de la expresión de CRIg en macrófagos. Se utilizaron el AcM anti-CRIg 4F7.22.2 y el AcM anti-CD68 KP-1 de (DAKO) y se detectaron con los marcadores ficoeritrina y FITC, respectivamente. 50

La expresión se examinó en una amplia variedad de tipos de tejidos y células de seres humanos y de otros mamíferos.

a. Tejido normal 55

Los tejidos adultos normales humanos que se examinaron incluyeron amígdalas, ganglios linfáticos, bazo, riñón, vejiga urinaria, pulmón, corazón, aorta, arteria coronaria, hígado, vesícula biliar, próstata, estómago, intestino delgado, colon, páncreas, glándula tiroidea, piel, glándula adrenal, placenta, útero, ovario, testículos, retina y cerebro (cerebelo, tronco cerebral, corteza cerebral). También se ensayaron tejidos fetales humanos normales que 60 incluyeron cerebro, bazo, intestino y tiroides de E12-E16 semanas. Además, se investigó la expresión en hígado murino.

b. Tejido inflamado

65

Los tejidos inflamados examinados por hibridación in situ incluyeron tejidos con enfermedad inflamatoria crónica tales como pulmones con asma crónica, bronconeumonía crónica, bronquitis crónica/enfermedad pulmonar obstructiva crónica, riñones con nefritis intersticial linfocítica crónica, e hígados con inflamación crónica y cirrosis debida a infección crónica por hepatitis C, hepatitis autoinmunitaria o cirrosis alcohólica.

5

c. Neoplasmas primarios

Los neoplasmas humanos primarios que se examinaron por hibridación in situ para la expresión de PRO362 incluyeron carcinoma mamario, carcinoma pulmonar de células escamosas, adenocarcinoma pulmonar, adenocarcinoma prostático, y adenocarcinoma colónico. 10

2. Resultados

Se descubrió que CRIg (PRO362) se expresaba en secciones congeladas de hígado de ratón (Figura 6), en secciones congeladas de hígado humano (Figura 7) y en diversas células similares a macrófagos tisulares, 15 incluyendo macrófagos del colon (Figura 8A), en células de Kupffer (Figura 8B), en macrófagos adrenales (Figura 8C), en células de Hofbauer (Figura 8D), en células sinoviales (Figura 9), en macrófagos alveolares, en macrófagos residentes en la lámina propia intestinal y en macrófagos intersticiales en muchos tejidos. CRig también se expresaba significativamente en la microglia cerebral (Figura 10). La expresión de CRIg aumentó significativamente en estos tejidos cuando se activó debido a la presencia de neoplasia o enfermedad inflamatoria, incluyendo artritis 20 reumatoide (Figura 9), enfermedad inflamatoria intestinal, hepatitis crónica (Figura 12), neumonía, asma crónica (Figura 11), glioma y bronquitis.

Para examinar adicionalmente la expresión de CRIg, se realizó tinción inmunohistoquímica en diversos tipos de tejidos. La tinción inmunohistoquímica doble para CRIg y CD68 se realizó en macrófagos tisulares, incluyendo 25 macrófagos de la glándula adrenal, células de Kupffer hepáticas, células de la microglia cerebral, y células de Hofbauer placentarias para determinar si CRIg y CD68 se expresan en los mismos tejidos.

Se descubrió que CRIg se coexpresaba junto con CD68 en macrófagos de la glándula adrenal (Figura 13), en células de Kupffer hepáticas (Figura 14), en células de la microglia cerebral (Figura 15) y en células de Hofbauer 30 placentarias (Figura 16).

Ejemplo 6

Implicación de CRIg (PRO362) en inflamación crónica 35

El nuevo receptor asociado con macrófagos con homología con el antígeno A33 y JAM1 se clonó como se describe en el Ejemplo 1 y más adelante, y se identificó como un polipéptido asociado a macrófagos miembro de la superfamilia de Ig de un solo dominio transmembrana (CRIg o PRO362).

40

CRIg se expresa como dos variantes de corte y empalme. Una variante es un polipéptido de 399 aminoácidos que contiene un dominio N terminal similar a IgV y un dominio C terminal similar a IgC2, que se denomina huCRIg o huCRIg-largo (SEC ID Nº: 4). La forma cortada y empalmada, que tiene 355 aminoácidos de longitud, que carece del dominio C terminal, se denomina huCRIg-corto (SEC ID Nº: 6). Ambos receptores tienen un solo dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que contiene restos de tirosina que están fosforilados de manera 45 constitutiva en macrófagos in vitro.

El presente estudio demuestra que CRIg se expresa selectivamente en un subconjunto de macrófagos residentes en tejidos y que está asociado con inflamación crónica.

50

Materiales y métodos

Células

La sangre se obtuvo por punción venosa de voluntarios adultos sanos después de dar su consentimiento tras recibir 55 la información oportuna y se separó usando Ficoll-Paque PLUS (Amersham Pharmacia Biotech) según las instrucciones del fabricante. Las CMSP se obtuvieron de la interfase, se lavaron en PBS frío, y se lisaron con NaCl al 0,2 % durante 30 segundos y se neutralizaron con NaCl al 1,6 %. Se contaron las células y se mantuvieron en hielo hasta su uso. Para aislar subconjuntos de sangre periférica, se usaron kits de MACS intactos (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La diferenciación a un fenotipo de macrófago se indujo 60 cultivando monocitos CD14+ durante hasta 2 semanas en medio HG-DMEM que contenía suero humano autólogo al 10 % (v/v), suero bovino fetal al 20 % y 1 glutamina 10 mM, penicilina y estreptomicina. El medio se reemplazó el día 5. Para el análisis por citometría de flujo, las células se disociaron de la placa de cultivo usando solución de disociación celular enfriada en hielo (Sigma). Los lisados para los análisis de transferencia de Western se prepararon añadiendo 0,5 ml de tampón de lisis directamente a los pocillos. Los lisados se mezclaron con el tampón 65

de la muestra que contenía SDS y beta-mercaptoetanol, se procesaron en un gel de Tris-Glicina y se transfectaron a una membrana de nitrocelulosa. La viabilidad celular se evaluó por exclusión con azul de tripano.

Citometría de flujo

5

Para su uso en el análisis de citometría de flujo las células se bloquearon durante 30 minutos a 4 ºC con PBS que contenía suero bovino fetal al 2 % y 5 g/ml de IgG humana (Calbiochem, San Diego, CA). A continuación, las células se incubaron con 3C9, un anticuerpo monoclonal anti-CRIg (anti-PRO362). Después de lavar en PBS, las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con ficoeritrina (PE) contra CD11b, CD14, CD163, CD15, CD68 que se obtuvieron de Pharmingen. 10

Estudios de adhesión célula - célula

Un vector de expresión pRK, que contenía CRIg de longitud completa, se expresó de modo estable en una línea de células T Jurkat humana usando selección con neomicina y clasificación con autoclón, como se describe en 15 cualquier otra parte. Las células se precargaron con el colorante fluorescente BCECF (Molecular Probes, Oregón) y se añadieron a una placa de 96 pocillos Maxisorb (CORNING™) recubierta con una monocapa de células endoteliales humanas de la vena del cordón umbilical (HUVEC) tratadas con o sin TNFα 10 ng/ml. Las células se mezclaron suavemente cargando los pocillos con tampón de incubación (HBSS que contenía CaCl 10 mM, magnesio 10 mM y NaCl 1,5 mM) seguido de inversión de la placa en un trozo de papel de transferencia. Después 20 de 3 lavados, se hizo un recuento de la fluorescencia en un fluoroespectrómetro. La lectura de la fluorescencia es representativa del número de células que permanecen adheridas a las células HUVEC.

Análisis de transferencia de Northern

25

Se exploraron transferencias de Northern (CLONTECH) de tejidos múltiples con una sonda de ADNc de CRIg de longitud completa cebado aleatoriamente marcada con 32P usando el kit de Ambion de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las transferencias se expusieron a una exploración de formación de imágenes de fósforo durante 4 horas a 22 ºC. Las transferencias se separaron y se volvieron a explorar con una sonda comercialmente disponible para  actina humana o de ratón (Clontech) para evaluar la carga y la cantidad de ARN 30 en cada carril, y se analizaron con un PhosphorImager Storm® (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Análisis por RT-PCR en tiempo real

Para el análisis por PCR cuantitativa (TAQMAN™), se recomendó ARNm total de tejidos humanos o de células 35 primaras (100 ng) (PerkinElmer Life Sciences) con cebadores basados en la secuencia codificante de CRIg.

Producción de proteína de fusión con Fc e His

Se clonó el CRIg humano en el vector de expresión de baculovirus pHIF (Pharmingen). La proteína de fusión CRIg - 40 etiquetada con HIS consistía en el dominio extracelular de CRIg fusionado a 8 histidinas. La proteína de fusión etiquetada con His se purificó del sobrenadante de células de insecto infectadas con baculovirus cultivadas en suspensión usando resina de afinidad a níquel.

Producción de anticuerpos monoclonales y policlonales 45

Para los presentes experimentos, se inmunizaron hembras BALBc y recibieron un refuerzo con 10 g de CRIg-His8 por medio de inyecciones en la almohadilla plantar, como previamente describen Ghilardi et al, J. Biol. Chem. 277: 16831-16836 (2002). Se exploraron clones sencillos contra His-CRIg mediante ELISA. Los clones seleccionados se ensayaron contra miembros de la familia JAM y la región Fc de la IgG humana. Los clones se titularon hasta 50 densidades unicelulares y se volvieron a explorar. Se descubrió que el clon 3C9 (IgG1) reaccionada selectivamente contra CRIg. Los clones se usaron para la generación de ascitis y se purificaron sobre proteína G (Amersham Pharmacia Biotech); la concentración de las proteínas se determinó usando el reactivo BCA de Pierce (Pierce, Rockford, IL).

55

Los anticuerpos policlonales se generaron inyectando 150 g de CRIg-His en Conejos de Nueva Zelanda. Los títulos séricos se determinaron mediante ELISA. El suero se recogió en el pico de los niveles circulantes de IgG y se purificó sobre una columna de proteína A.

Hibridación in situ 60

Se diseñaron cebadores de PCR (superior 5’-TCTCTGTCTCCAAGCCCACAG (SEC ID Nº: 18), e inferior, 5’-CTTTGAG-GAGTCTTTGACC (SEC ID Nº: 19) para amplificar un fragmento de 700 pb de huJAM4. Los cebadores incluyeron los sitios de inicio de la ARN polimerasa de T7 o T3 para permitir la transcripción in vitro de sondas en sentido y antisentido, respectivamente, de los productos amplificados. Los tejidos humanos normales incluyeron 65 amígdalas, ganglios linfáticos, bazo, riñón, pulmón y corazón. Los tejidos con enfermedad inflamatoria crónica

incluyeron pulmón con asma crónica, bronquitis crónica, hígados con inflamación crónica y cirrosis debida a infección crónica por hepatitis C. Los tejidos se fijaron en formalina al 4 %, se incluyeron en parafina, se seccionaron (3-5 m de espesor), se desparafinaron, se desproteinizaron con 20 g/ml de proteinasa K (15 min a 37 ºC) y se procesaron para la hibridación in situ, como se describe en cualquier otra parte.

5

Inmunohistoquímica

El hígado humano se obtuvo en Ardais Corporation, Lexington, MA. La tinción inmunohistoquímica se realizó en secciones hepáticas congeladas de 5-6 m de espesor usando un autocolorante de DAKO. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con solución de bloqueo de Kirkegaard y Perry (1:10, 4 min 20 ºC). Se usó suero normal de 10 cabra (SNC) al 10 % en TBS/Tween-20 al 0,05 % para la dilución y el bloqueo. Se usó el AcM 3C9 a 1 ug/ml. Los portaobjetos se revelaron usando diaminobencidina potenciada con metal (Pierce Chemicals).

Para la tinción de las secciones por inmunofluorescencia, estas se bloquearon con PBS/SNC al 10 % y se incubaron con el AcM 3C9 durante 1 h a 20 ºC. Como agente de detección se usó un anticuerpo secundario anti-conejo de 15 ratón marcado con FITC conjugado con FITS. Para el procedimiento de doble tinción, se tiñeron las secciones posteriormente con un anticuerpo monoclonal conjugado con PE contra CD68 humano.

Resultados

20

Como se describe en el Ejemplo 1, huCRIg se clonó a partir de una biblioteca de ADNc fetal humano usando cebadores degenerados que reconocían los dominios de Ig conservados de JAM1 humano. La secuenciación de varios clones reveló una fase de lectura abierta de 321 aminoácidos (Figura 1, SEC ID Nº: 2). Las búsquedas a través de Blast confirmaron la similitud con Z39Ig, una proteína transmembrana de tipo 1 (Langnaese et al., Biochim Biophys Acta 1492: 522-525 (2000)). Más tarde se descubrió que a esta proteína de 321 aminoácidos la faltaba 25 algunos de los restos de aminoácidos del extremo C. Se determinó que la proteína huSIgMA de longitud completa tenía 399 restos de aminoácidos, como se muestra en la Figura 2 (SEC ID Nº: 4). La región extracelular de CRIg consistía en 2 dominios similares a Ig, que comprendían, un dominio combinado V N-terminal y un dominio combinado C2 C-terminal. Usando cebadores en 3’ y 5’, se clonó una variante de corte y empalme de CRIg, CRIg-corto (305 aminoácidos, Figura 3, SEC ID Nº: 6), que carecía del dominio IgG proximal a la membrana. 30

Clonación del CRIg murino y comparación de secuencia con el CRIg humano

Usando la fase de lectura abierta completa del huCRIg y el algoritmo tblastn, se investigó en bases de datos de etiquetas de secuencias expresadas (EST) murinas. La secuenciación de ADN de 3 clones dio lugar a fases de 35 lectura abierta completas idénticas de 280 aminoácidos. Los cebadores de las regiones 3’ se usaron para clonar un transcrito de longitud completa de una biblioteca de bazo de ratón. El clon murino se asemejaba a la forma de corte y empalme de huCRIg en que éste carecía del dominio similar a Ig del extremo C. El dominio IgV extracelular estaba bien conservado entre el receptor humano y el murino con un 93 % de identidad. El dominio citoplasmático murino estaba mal conservado siendo 20 aminoácidos más corto que su homólogo humano y tenía una identidad del 40 40 %. El ácido nucleico que codificaba el CRIg murino (muCRIg) y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la Figura 4 y como SEC ID Nos: 7 y 8, respectivamente.

CRIg se expresa en un subconjunto de macrófagos residentes en diversos tejidos y su expresión aumenta cuando hay inflamación 45

El análisis de transferencia de Northern de huCRIg mostró dos transcritos de 1,5 y 1,8 kb (Figura 17), con la expresión más alta en la glándula adrenal, pulmón, corazón y placenta, y con la expresión más baja en otros órganos, tales como médula espinal, glándula tiroidea, glándula mamaria y ganglio linfático. En todos los tejidos, el transcrito de 1,8 kb fue el transcrito que se expresó más abundantemente y presumiblemente, codifica la forma larga 50 de CRIg. Se detectó un solo transcrito de aproximadamente 1,4 kb en riñón y corazón de ratón.

Análisis de PCR en tiempo real TAQMAN™

Para identificar líneas celulares específicas que expresaban CRIg, se usaron PCR cuantitativa en tiempo real y 55 cebadores/sondas específicos para el dominio de Ig N-terminal. Se descubrió expresión de ARNm baja pero detectable en la línea celular mieloide HL-60 tratada con PMA y en la línea celular monocítica THP-1. La expresión estaba ausente en líneas de células B y T (Figura 18A).

Expresión de CRIg en monocitos diferenciados. 60

Para establecer detalles acerca de cuándo se expresaba CRIg en monocitos/macrófagos en diferenciación, se determinaron los niveles de ARNm de CRIg en monocitos no adherentes y monocitos adherentes, inducidos para diferenciarse en presencia de suero humano autólogo. Los niveles de ARNm de CRIg aumentaron gradualmente a lo largo del tiempo y alcanzaron niveles máximos 7 días después de la siembra en placa (Figura 18B). En esta fase de 65

diferenciación, los niveles de ARNm fueron 100 veces mayores en comparación con los de los monocitos indiferenciados.

La transferencia de Western de lisados de monocitos/macrófagos mostró un aumento de la expresión de la proteína CRIg (Figura 18C) en paralelo con el aumento de la expresión de ARNm de CRIg, indicando que CRIg se expresaba 5 cuando los monocitos se diferenciaban para formar macrófagos. Una banda de 48 kDa y una banda de 40 kDa apareció en la transferencia, presumiblemente representando las formas corta y larga del CRIg humano.

Caracterización molecular de CRIg

10

El CRIg migró de forma similar en condiciones reductoras y no reductoras indicando que se expresaba como un monómero (Figura 19A). Solamente se observaron ligeros cambios en los patrones de migración cuando el CRIg se desglucosilaba usando PNGasa F, indicando una N glucosilación insignificativa. El CRIg se fosforiló cuando las células que sobreexpresaban CRIg se trataron con pervanadato (Figura 19B). El CRIg fosforilado migró como una proteína con un Pm ligeramente mayor (55 kDa). En células HEK 293 humanas, el dominio citoplasmático de CRIg 15 fosforilado con tirosina no acumula Syk quinasa (resultados no mostrados).

Análisis por citometría de flujo de la expresión de CRIg en células mononucleares de sangre periférica

Para determinar el patrón de expresión de CRIg en los leucocitos circulantes, se realizaron análisis de citometría de 20 flujo en linfocitos aislados de sangre de donantes sanos usando el anticuerpo monoclonal anti-CRIg humano 3C9. Los anticuerpos se prepararon inmunizando ratones Balb/C con el dominio extracelular de CRIg humano etiquetado con 8 His. El anticuerpo es un anticuerpo no bloqueante que puede usarse para detectar la proteína nativa en secciones congeladas fijadas con acetona directamente conjugado con ALEXA™ A488. Se realizó tinción de contraste con anticuerpos conjugados con PE para algunos antígenos de la superficie de células inmunitarias. CRIg 25 estaba ausente en la superficie de todos los leucocitos, incluyendo linfocitos citolíticos naturales (NK cells) B y T, monocitos y granulocitos (Figura 20). Sin embargo CRIg se expresaba en monocitos cultivados durante 7 días en medio de diferenciación de macrófagos.

Regulación de la expresión de CRIg en monocitos 30

Para estudiar la regulación de la expresión de CRIg, se cultivaron macrófagos durante 7 días en presencia de diversas citocinas pro- y anti-inflamatorias y se determinaron los niveles de expresión de CRIg por PCR en tiempo real o análisis de flujo. La expresión del ARNm de CRIg aumentó después del tratamiento de los macrófagos durante 2 días con IL-10 y TGF- y estaba regulada negativamente por IL-4, IL13 y LPS (Figura 21A). El tratamiento con 35 dexametasona aumentó la expresión 5 veces en comparación con macrófagos control no tratados. Con el fin de determinar la regulación de CRIg expresado en la superficie celular, se realizó análisis de citometría de flujo en monocitos de sangre periférica tratados con diversas citocinas y dexametasona durante 5 días. Se detectó CRIg usando el clon 3C9 del anticuerpo monoclonal conjugado con ALEXA™ A488. Las células se tiñeron conjuntamente con anticuerpos anti CD-14. Se encontró aumento de expresión de CRIg en la superficie después del tratamiento de 40 los monocitos con IL-10 y LPS durante 5 días (Figura 21B). Se descubrió un drástico aumento en la expresión de CRIg en la superficie después del tratamiento con dexametasona.

Distribución subcelular de CRIg

45

Para estudiar la distribución subcelular de CRIg, durante 15 días se mantuvieron en cultivo macrófagos derivados de monocitos (MDM) después de los cuales estos se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal (clon 3C9) o con un anticuerpo policlonal de conejo 4F7 seguido de un anticuerpo secundario conjugado con FITC y un anticuerpo anti CD63 marcado con PE. La microscopía confocal mostró alta expresión de CRIg en el citoplasma perinuclear, solapándose con la expresión de la proteína de la membrana lisosomal CD63 (Figura 22). También se expresó CRIg 50 en los bordes anterior y posterior de los macrófagos donde su patrón de tinción no se solapaba con los de CD63.

Expresión de CRIg en tejidos normales y enfermos

Se estudió la expresión de CRIg en macrófagos residentes en tejidos y los cambios en su expresión en tejidos con 55 enfermedades inflamatorias crónicas. Usando hibridación in situ, se determinó la expresión del ARNm de CRIg en paneles de tejidos humanos fijados en paraformaldehído. Se descubrieron altos niveles de expresión en macrófagos alveolares obtenidos de una autopsia pulmonar de un paciente con neumonía o asma crónica (Figura 23, A, B, C, y D). Se descubrió alto nivel de expresión de ARNm en células de Kupffer en el hígado de un paciente con hepatitis crónica (Figura 23, E y F). 60

En un estudio anterior (Walker, Biochimica et, Biophysica Acta 1574: 387-390(2002)), y explorando bibliotecas electrónicas, se descubrió alta expresión de ARNm de CRIg en el sinovio de pacientes con artritis reumatoide. Por lo tanto, se estudió el patrón de expresión de CRIg en el sinovio obtenido de pacientes con artritis reumatoide, osteoartritis y enfermedad ósea degenerativa. Se descubrió alta expresión de ARNm de CRIg en células sinoviales 65 obtenidas de un paciente con osteoartritis (Figura 24, B). Las células sinoviales de las capas superficiales tuvieron la

expresión más alta de CRIg (Figura 24, D). Además, se usó el anticuerpo policlonal 6F1 para estudiar la expresión de CRIg en secciones congeladas de sinovio humano obtenido de un paciente con artritis reumatoide. CRIg se expresaba en un subconjunto de células sinoviales (20-40 %) y en macrófagos tisulares en el sinovio (Figura 25, A, B, C. Estas células fueron, más probablemente, células sinoviales similares a macrófagos de tipo A. No había tinción en el sinovio control (Figura 25, D). 5

La expresión de la proteína CRIg se descubrió en macrófagos en diversos tejidos diferentes. Las secciones congeladas preparadas a partir de células CHO que expresaban de manera estable CRIg muestran localización de CRIg en la membrana (Figura 26 A). La proteína CRIg se descubrió en macrófagos alveolares (Figura 26, B), en histiocitos de la lámina propia del intestino delgado (Figura 26, C), en células de Hofbauer en la placenta (Figura 26, 10 D), en macrófagos en la glándula adrenal (Figura 26, E) y en células de Kupffer en el hígado (Figura 26, F).

Las placas ateroscleróticas contenían un alto número de macrófagos o de células macrofágicas espumosas que se adherían fuertemente a la pared luminal de la aorta. Considerando el papel de CRIg en la adhesión de los macrófagos al endotelio, se estudió la expresión de CRIg en placas ateroscleróticas. Se tiñeron secciones alternas 15 de placas con anti-CD63 (Figura 27, A y B) o con anti-CRIg (Figura 27, C y D). Se descubrieron patrones de tinción solapantes de anti-CD63 y CRIg en células espumosas alineadas en la pared de los vasos indicando un papel de CRIg en la aterosclerosis.

Para determinar si CRIg se expresaba selectivamente en macrófagos, se realizó doble tinción con 20 inmunofluorescencia en macrófagos intersticiales del corazón (Figura 28). Tal como se muestra en la superposición (Figura 28, tercer panel) la mayor parte de los macrófagos intersticiales positivos para CRIg también fueron positivos para CD68. No todos los macrófagos CD68 positivos fueron positivos para CRIg, indicando que el último era específico para un subtipo de macrófagos residentes en los tejidos.

25

Para determinar cuantitativamente los niveles de expresión de ARNm en el síndrome de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), se extrajo ARNm de tejido de colon obtenido de pacientes con colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn o de pacientes sin manifestación de EII. Se realizó PCR en tiempo real usando cebadores específicos para CRIg, para medir los niveles de expresión relativa. Los niveles de expresión fueron 16 veces más altos en un paciente con colitis ulcerosa, y 5 veces más altos en un paciente con enfermedad de Crohn, en comparación con un tejido control 30 (Figura 29, A). De modo similar, se determinaron los equivalentes de ARN relativos en tejido de pulmón y se descubrió que eran más altos en tejidos de un paciente con enfermedad pulmonar oclusiva crónica (EPOC: 14 veces por encima de lo normal) y que no diferían significativamente de lo normal en un paciente con asma (Figura 29, B).

Es bien sabido que las moléculas de la superfamilia de Ig actúan como mediadoras en el reconocimiento de la 35 superficie celular y adhesión de célula a célula. Dado que la expresión de CRIg fue alta en macrófagos intersticiales que se alinean en los vasos sanguíneos, se estudió la implicación de CRIg en la adhesión celular endotelial de macrófagos. Una línea de células Jurkat, transfectada de manera estable con CRIg-largo de longitud completa (Figura 30A), se cargó con el colorante fluorescente BCECF y se añadió a los pocillos de una placa maxisorb de 96 pocillos en la que se había cultivado una monocapa de células HUVEC. La adhesión se midió a través de la cantidad 40 de fluorescencia retenida después de 3 lavados suaves. Las células Jurkat que expresaban CRIg fueron más adherentes tanto al endotelio control como al estimulado con TNF-, en comparación con las células Jurkat transfectadas de manera estable con un plásmido control (Figura 30B).

Análisis 45

En este estudio se describe, por primera vez, la distribución tisular, la regulación de la expresión y la caracterización molecular de un nuevo miembro de la superfamilia de Ig, CRIg/Z39Ig, y se confirma su expresión selectiva en macrófagos residentes en tejidos.

50

La expresión de CRIg se descubrió en macrófagos residentes que tenían un fenotipo completamente diferenciado. Su expresión estaba aumentada en tejidos con inflamación crónica al igual que en los de artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria intestinal. El aumento de la expresión de CRIg en estas enfermedades, que a menudo se caracterizaban como enfermedades de tipo Th2, puede estar en línea con la regulación de su expresión mediante citocinas Th2 in vitro. Si este aumento de expresión se debe a un aumento de la presencia de macrófagos positivos 55 a CRIg o a un aumento de expresión de los macrófagos inflamatorios, está aún por determinar.

CRIg puede actuar con mediador en una de las funciones efectoras de los macrófagos humanos, que incluyen el reconocimiento bacteriano, la fagocitosis, la presentación de antígenos y la liberación de citocinas. Estos resultados indicaron un papel de CRIg en la adhesión, y posiblemente en la movilidad, de los macrófagos en la pared celular 60 endotelial de los vasos.

La expresión de CRIg estaba aumentada en enfermedades inflamatorias no microbianas como la colitis ulcerosa y la enfermedad pulmonar oclusiva crónica (EPOC) pero estaba regulada negativamente en macrófagos aislados después de tratamiento con LPS o con otro componente de la pared celular bacteriana, tal como el ácido lipoteicóico 65 y la lipoproteína bacteriana. El tratamiento prolongado, durante 2 días, con LPS produjo un aumento en la expresión

de CRIg. Esto podía deberse a un efecto autocrino de la IL-10 secretada por macrófagos estimulados con LPS. Se observó una regulación positiva llamativa de CRIg, tanto a niveles de ARNm como de proteínas, después de tratamiento de monocitos o macrófagos con dexametasona. Se ha descubierto que unos pocos receptores de superficie de monocitos/macrófagos aumentan su expresión después de tratamiento con dexametasona. Un ejemplo es CD163, pero su inducción por dexametasona es mucho menos drástica. La regulación positiva de CRIg mediante 5 citocinas antiinflamatorias IL10 y TGF fue de considerable interés e indica que CRIg puede actuar como mediador en el papel antiinflamatorio de los glucocorticosteroides.

Como se describe en el presente documento, CRIg se expresó en un subconjunto de macrófagos CD68 positivos que pueden representar macrófagos activados. Usando anticuerpos bloqueantes y activadores contra CRIg y la 10 proteína de fusión CRIg-Fc, se ha investigado su papel en la función efectora de macrófagos, en la adhesión y migración y su papel en enfermedades inflamatorias crónicas, y se describe en el Ejemplo 7.

Solamente unos pocos marcadores de la superficie celular se expresaron específicamente en macrófagos diferenciados, tales como CD68 y CD163. Aunque CD68 se expresó aparentemente en todas las poblaciones de 15 macrófagos humanos, el antígeno pudo también detectarse en otras células mieloides y también en determinadas células no mieloides. Por lo tanto, CRIg representa el primer antígeno de la superficie celular que se expresa selectivamente en un subconjunto de macrófagos maduros intersticiales.

Ejemplo 7 20

Proteínas de fusión CRIg en artritis inducida por colágeno (AIC) en ratones DBA-1J

Este experimento tenía el objetivo de comparar proteínas de fusión CRIg con las de IgG1 murina control en el desarrollo de enfermedad y progresión de AIC (artritis inducida por colágeno, un sistema de modelo animal 25 experimental de artritis reumatoide).

Como se explica en el Ejemplo 4, CRIg se expresa alta y específicamente en un subconjunto de macrófagos y se encuentra en gran cantidad en tejidos con inflamación crónica. El CRIg murino tiene alta expresión en macrófagos y sinoviocitos en las articulaciones inflamadas de ratones con artritis inducida por colágeno. Estudios realizados in 30 vitro han mostrado que CRIg está implicado en la adhesión de los macrófagos al endotelio. La proteína de fusión CRIg-Fc influye en el transcurso de una enfermedad autoinmunitaria, en este caso artritis inducida por colágeno en ratones, bien influyendo en las propiedades de los macrófagos tisulares o influyendo en la respuesta inmunitaria de otras células (por ejemplo, células T, células B, células epiteliales, células endoteliales). Esto puede dar como resultado el alivio de la inflamación, hinchazón y desgaste de hueso prolongado en las articulaciones. 35

Se generó una proteína de fusión muCRIg-Fc fusionando la bisagra, dominios CH2 y CH3 de la IgG1 murina, con el dominio extracelular (1-200 aa) del CRIg murino. Se usó una fusión que contenía una mutación doble que impedía que el receptor de Fc se uniera, para controlar la regulación del receptor de Fc. La secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión muCRIg-Fc se muestra como SEC ID Nº: 17. (Las secuencias codificantes de huCRIg-Ig y de 40 huCRIg-corto-Ig similares se muestran como SEC ID Nos: 15 y 16, respectivamente). La proteína se produjo en células CHO mediante transfecciones transitorias de ADN plasmídico. La proteína de fusión se purificó procesando el sobrenadante celular sobre una columna de proteína A seguido de cromatografía de intercambio iónico para eliminar agregados. La semivida en suero se estimó inyectando una sola dosis de CRIg-Fc de 4 mg/kg a un ratón C57B6 seguido de obtención del suero del ratón a intervalos de tiempo específicos. Los niveles en suero de CRIg 45 murino-Fc se determinaron mediante un ELISA de tipo sándwich usando AcM anti CRIg que reconocían diferentes epítopos del dominio extracelular de CRIg.

Especies de modelos animales: Ratón

50

Cepa (cepas): DBA-1J

Proveedor (proveedores): JACKSON

Intervalo de edad: de 7 a 8 semanas de vida

Se escogió el ratón como especie para estudiar la artritis inducida por colágeno (AIC) debido a que la AIC es una 55 poliartritis inflamatoria con características clínicas y patológicas similares a las de la artritis reumatoide (AR) en seres humanos. Este modelo animal se ha utilizado en muchos laboratorios y la histopatología de la AIC se asemeja a la observada en la AR con proliferación sinovial que progresa a formación de pannus, degeneración/destrucción del cartílago y desgaste óseo marginal con deformidad articular posterior. También, el animal es el mamífero filogenéticamente más inferior. Además, no existe ningún modelo in vitro disponible para imitar la patogénesis 60 compleja, multifactorial, de la AR.

Diseño experimental

Grupos de tratamiento: 65

1) isotipo mIgG1 6 mg/kg en solución salina subcutánea (SC) 200 l 3 veces/semana durante 7 semanas (n=8).

2) isotipo muCRIg 4 mg/kg en solución salina SC 100 l 3 veces/semana durante 7 semanas (n=8).

Se inmunizó a los ratones por vía intradérmica con CII bovino (100 ug, Sigma, St Louis) emulsionado en CFS (Difco). Los ratones volvieron a exponerse a CII en API (Difco) 21 días más tarde. Comenzando el día 24, un grupo 5 de ratones (n = 7) recibió 100 ug de muCRIg (PRO362) Fc tres veces a la semana durante seis semanas, y el segundo grupo (n = 8) recibió 100 ug de IgG1 murina, como control. Se examinó a los ratones diariamente para determinar los signos de inflamación articular y se puntuaron del siguiente modo: 0, normal; 1, eritema e hinchazón leve confinada a la articulación del tobillo; 2, eritema e hinchazón leve que se extendía del tobillo a las articulaciones del metatarso y del metacarpo; 3, eritema e hinchazón moderada que se extendía del tobillo a las articulaciones del 10 metatarso y del metacarpo, 4, eritema e hinchazón grave que se extendía del tobillo a los dedos. La máxima puntuación artrítica por pata fue de 4, y la máxima puntuación por ratón fue de 16 (Figura 31).

Se inmunizó a todos los ratones con 100 g de colágeno bovino de tipo II en 100 l de Adyuvante completo de Freund (CFA) el día 0. El colágeno de tipo II en CFA se inyectó por vía intradérmica en la base de la cola en el lado 15 derecho. El día 21, se proporcionó por vía i.d. una 2ª inmunización con 100 g de colágeno bovino de tipo II en 100 l de adyuvante incompleto de Freund en el lado izquierdo de la cola. El personal de investigación examinaba a los todos los días (de L a V). Como dispositivo de enriquecimiento y para proporcionar un extra acolchamiento a los animales se usaron nidificaciones (nestlets). Siempre que fue necesario, se proporcionó alimento humedecido en el fondo de las jaulas. Los animales debilitados se sacrificaron después de consultar con el personal veterinario. Al final 20 del estudio se tomaron rayos X faxitrón terminales y una microCT (microfotografía computarizada) y se evaluaron las lesiones/desgastes articulares. Además, los animales se pesaron antes y después del tratamiento.

El día 35 y al final del estudio, se extrajo sangre de los ratones de los Grupos 1 a 8 para determinar la pK en suero y para determinar el título de anticuerpos anti colágeno de tipo II (100 l de sangre orbital). 25

El día 70 se extrajo sangre por vía intracardiaca definitivamente a todos los ratones con isoflurano al 3% para realizar un hemograma terminal, para un recuento leucocitario diferencial y para la evaluación de pK en suero (G3).

Los ratones se sacrificaron el día 70, después de la inducción de artritis. Se recogieron las cuatro extremidades para 30 efectuar las radiografías, la microCT y la histopatología.

Resultados

La inyección sistémica de la proteína de fusión CRIg, muCRIg-Fc, a un ratón con artritis inducida por colágeno 35 (modelo animal para la artritis reumatoide) mostró una reducción significativa (véase la Figura 31: valor p = 0,0004) en la progresión de la AIC en el grupo de ensayo de ratones que recibieron la proteína de fusión CRIg (cuadrados) frente al grupo de ratones control que recibieron IgG1 (círculos). La artritis inducida por colágeno se indujo mediante inyección de colágeno bovino de tipo II emulsionado en adyuvante completo de Freud. Se dio una inmunización de refuerzo 21 días después de la primera inmunización. Se trató a los animales 3 veces por semana bien con la 40 proteína de fusión CRIg-Fc o con anti gp120 IgG1. La dosificación fue de 4 mg/kg en 100 ul de PBS subcutáneo. El tratamiento comenzó el día 21 y continuó hasta el día 70. Se observó a los ratones diariamente para determinar la hinchazón de pata trasera como un signo de artritis. La gravedad de la artritis se calificó en una escala de 1 a 16 del siguiente modo: 0 = Sin pruebas de eritema ni de hinchazón, 1 = Eritema e hinchazón leve confinada al mediopié (tarso) o tobillo, 2 = Eritema e hinchazón leve que se extiende del tobillo al mediopié, 3 = Eritema e hinchazón 45 moderada que se extiende del tobillo a las articulaciones del metatarso, 4 = Eritema e hinchazón grave que abarca el tobillo, el pie y los dedos.

Experimento de repetición

50

El protocolo anteriormente descrito se modificó para repetir y confirmar los resultados del experimento anterior en el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC). El protocolo modificado incluyó la investigación del posible efecto de la exposición a radiación como resultado de la formación de imágenes de microCT in vivo durante la enfermedad y durante el desarrollo de la progresión.

55

Setenta ratones DBA1/J (de 7 a 8 semanas de vida, Jackson Laboratories) se dividieron en 5 grupos de tratamiento, dos grupos (G1 y G3) con 15 ratones por grupo, dos grupos (G4 y G5) con 10 ratones por grupo, y un grupo (G2) con 20 ratones.

Grupos de tratamiento: 60

G1: isotipo muIgG1 4 mg/kg en solución salina 100 l, s.c., 3 veces por semana durante 7 semanas (n=15).

G2: isotipo muCRIg-IgG1 4 mg/kg en solución salina 100 l, s.c., 3 veces por semana durante 7 semanas (n=20).

G3: isotipo muTNFRII-IgG1 4 mg/kg en solución salina 100 l, s.c., 3 veces por semana durante 7 semanas (n=15). 65

G4: isotipo muIgG1 4 mg/kg en solución salina 100 l, s.c., 3 veces por semana durante 7 semanas, anestesia con microCT in vivo (n=10).

G5: isotipo muTNFRII-IgG1 1,0 mg/kg en solución salina 100 l, s.c., 3 veces por semana durante 7 semanas, anestesia con microCT in vivo (n=10).

5

El TNF es una citocina secretada por fagocitos mononucleares, células T estimuladas con Ag, linfocitos citolíticos naturales (células NK) y mastocitos. Está implicado en respuestas inflamatorias e inmunitarias normales. El TNF- juega un papel importante en la patogénesis de la artritis reumatoide (AR). Se descubrieron niveles elevados de TNF en fluido sinovial de pacientes con AR. En este protocolo, se usó mTNFRII-Fc como control positivo, para bloquear la interacción entre el TNF y sus receptores de la superficie celular. 10

Todos los ratones de los grupos G1 a G5 se inmunizaron con 100 g de colágeno bovino de tipo II en 100 l de Adyuvante Completo de Freund (CFA) el día 10. El colágeno de tipo II en CFA se inyectó por vía intradérmica en el lado derecho de la base de la cola. El día 21, se proporcionó una segunda inmunización con 100 g de colágeno bovino de tipo II en 100 l de Adyuvante incompleto de Freund por vía intradérmica en el lado izquierdo de la cola. 15

Los animales se examinaron todos los días. Los ratones de los grupos G4-5 se anestesiaron con isoflurano y se les realizó una microCT in vivo semanalmente. Los rayos X faxitrón terminales y la microCT se tomaron al final del estudio, y se evaluaron las lesiones/desgastes articulares.

20

El día 35 y al final del estudio, a los ratones de los grupos G1-5 se les extrajo sangre para evaluar la pK en suero y el título de anticuerpos anti colágeno de tipo II (100 l de sangre orbital). El día 70 se extrajo sangre por vía intracardiaca definitivamente a todos los ratones con isoflurano al 3% para realizar un hemograma terminal, para un recuento leucocitario diferencial y para la evaluación de pK en suero (G3).

25

Los ratones se sacrificaron el día 70, después de la inducción de artritis. Se recogieron las cuatro extremidades para efectuar radiografías, la microCT y la histopatología.

La Figura 33 muestra una reducción significativa de la hinchazón articular en los ratones tratados con CRIg-Fc.

30

La inmunohistoquímica realizada en tejido fijado en formalina, incluido en parafina (tinción H&E), obtenida de los animales tratados con muCRIg-Fc el día 70, muestra inhibición de inflamación articular como resultado del tratamiento. La Figura 34 muestra secciones teñidas con H&E de una articulación del metatarso de un ratón DBA1/J 70 días después de la inmunización con colágeno de tipo II. A. Se descubrió un infiltrado masivo de células inflamatorias en las zonas que rodeaban las vainas del tendón y en la zona que rodeaba la cavidad articular; B. 35 Detalle de A; C. Bajo grado de infiltrado inflamatorio en la articulación de un ratón tratado con CRIg-Fc. Se encontraron pocas células inflamatorias en las zonas que rodeaban las vainas del tendón y la cavidad articular; D. Detalle de B.

La Figura 35 muestra que el volumen óseo cortical se conservó en las articulaciones de los ratones tratados con 40 muCRIg-Fc. Los ratones de los grupos tratados con IgG control y CRIg-Fc se sacrificaron 70 días después de la inyección con colágeno, y las articulaciones se escanearon mediante CT. El desgaste óseo y la pérdida de densidad ósea en las articulaciones de los ratones representativos de los grupos tratados con CRIg-Fc y con control, se muestran a la izquierda de la figura en comparación con los animales tratados con muIgG1. La conservación del volumen óseo cortical fue significativamente mayor en los animales tratados con muCRIg-Fc. Las imágenes son de 45 una interpretación de la superficie tridimensional creada a partir de los datos de CT usando el programa informático de análisis de imágenes Analyze.

La Figura 36 muestra que el tratamiento con CRIg-Fc no altera el número ni la morfología de macrófagos residentes en tejidos. Los hígados y pulmones de los ratones tratados bien con anti-gp120 IgG1 (figuras de la izquierda) o 50 CRIg-Fc (figuras de la derecha) se diseccionaron, se fijaron en formalina y se incluyeron en cera de parafina. Se tiñeron secciones de siete micrómetros usando un anticuerpo contra F4/80. El examen cuidadoso de las secciones muestra los mismos números de macrófagos F4/80 positivos en ambos grupos de tratamiento. Además, no se observaron diferencias en la morfología de los macrófagos.

55

La Figura 37 muestra que el tratamiento con muCRIg-Fc no afecta a los títulos en suero de los anticuerpos anti-colágeno. Los títulos en suero de los anticuerpos anti-colágeno se determinaron 70 días después de la inmunización. No se encontraron diferencias en los títulos en suero de las subclases de anticuerpos IgG1, IgG2a e IgM en los animales tratados con CRIg-Fc frente a los tratados con anti gp120. Esto significa que CRIg-Fc no afecta a las respuestas de los anticuerpos en los ratones inmunizados con colágeno de tipo II. La Figura 38 muestra que 60 muCRIg-Fc disminuye el número de macrófagos inflamatorios circulantes. La sangre periférica se obtuvo de animales tratados con CRIg-Fc y anti gp-120, 70 días después de la inmunización y se analizó por citometría de flujo usando marcadores para monocitos inflamatorios y no inflamatorios. Los animales tratados con CRIg-Fc mostraron un aumento significativo del número de monocitos inflamatorios y una disminución del número de monocitos no inflamatorios en comparación con el grupo tratado con anti gp120. 65

En conclusión, los resultados de los experimentos descritos en el presente Ejemplo demuestran que la proteína de fusión muCRIg-Fc inhibe la artritis inducida por colágeno. En particular, los resultados muestran que CRIg-Fc inhibe la hinchazón articular, inhibe la inflamación, conserva el volumen óseo articular cortical, y disminuye el número de macrófagos inflamatorios circulantes. 5

Otros experimentos han mostrado que CRIg-Fc no afecta a las respuestas de las células B o T in vivo.

Ejemplo 8

10

Proteínas de fusión de CRIg en AIC mediada por anticuerpos en ratones

La artritis mediada por anticuerpos se diferencia de la artritis inducida por colágeno en que en lugar de inyectar el antígeno (colágeno bovino de tipo II), se inyectan anticuerpos que reconocen el colágeno de tipo II. De este modo, se superan las respuestas adaptativas de células B y T para inducir directamente funciones efectoras en macrófagos 15 y neutrófilos a través del receptor de Fc y la activación mediada por el complemento.

La AIC mediada por anticuerpos puede inducirse mediante inyección i.v. de una combinación de cuatro anticuerpos monoclonales diferentes generados por las líneas celulares de hibridoma B de ratón Arthrogen-CIA® (Terato et al., J. Immunol. 148: 2103-8 (1992)). Tres de los anticuerpos monoclonales reconocen epítopos autoantigénicos 20 agrupados dentro de un fragmento de 84 restos de aminoácidos, LyC2 (el fragmento artritogénico más pequeño del colágeno de tipo II) de CB11 y el cuarto anticuerpo monoclonal reaccionan con LyC1. Los cuatro anticuerpos reconocen los epítopos conservados compartidos por diversas especies de colágeno de tipo II y reaccionan en cruzado con colágenos de tipo II homólogos y heterólogos (Terato et al., anteriormente mencionado; Terato et al., Autoimmunity 22: 137-47 (1995)). El cóctel de anticuerpos monoclonales inductor de artritis Arthrogen-CIA® se 25 encuentra disponible en el comercio (Chemicon International, Inc., Temecula, CA, Nº de catálogo 90035).

Protocolo

10 ratones BALB-c (CR/Hollister) de 4-5 semanas, se dividieron en dos grupos con 5 ratones cada uno de ellos. 30

Se trató a los animales diariamente con 100 g de muCRIg-Fc o 100 g de control-Fc (anti-gp120 IgG1), comenzando el día antes de la inyección del coctel de anticuerpos (día -1) y continuando hasta el día 14. El día 14, los animales se examinan al menos dos veces al día, y se guardan las anotaciones de las observaciones registradas. El grado de la enfermedad se puntuó por observación visual. 35

Sistema de puntuación visual:

0 = Sin evidencias de eritema e hinchazón

1 = Eritema e hinchazón leve confinada al mediopíe 40

2 = Eritema e hinchazón leve que se extiende del tobillo hasta el mediopíe

3 = Eritema e hinchazón moderada que se extiende del tobillo a las articulaciones del metatarso.

4 = Eritema e hinchazón grave que abarca el tobillo, el píe y los dedos

Como dispositivo de enriquecimiento y para proporcionar un extra acolchamiento a los animales se usaron 45 nidificaciones (nestlets)

Todos los animales se sacrificaron el día 14, y las articulaciones se recogieron para realizar tinción inmunohistoquímica o tinción con hematoxilina-eosina. La sangre se muestreó para realizar análisis hematológico.

50

Resultados

La Figura 39 muestra infiltración de macrófagos en articulaciones después de artritis inducida por anticuerpos (AIA), generada con tinción F4/80 en articulaciones congeladas no descalcificadas. A los ratones hembra Balb/C se les inyectaron 2 mg de anticuerpos anti colágeno (andrógeno) i.v. seguido 3 días después de inyección con 25 ug de 55 LPS i.p. Catorce días después de la inyección de anticuerpos, se sacrificó a los ratones y se extrajeron las patas, y se incluyeron en alcohol polivinílico. Se cortaron secciones de 7 m de espesor de las articulaciones congeladas y se tiñeron con anticuerpos contra CRIg murino y contra F4/80, un marcador específico de macrófagos.

La Figura 40 demuestra que el muCRIg previene la hinchazón articular después de artritis inducida por anticuerpos 60 en ratones Balb/c. La artritis se indujo mediante el método de Terato y colaboradores (Terato et al., (1992), anteriormente mencionado; Terato et al., (1995) anteriormente mencionado) usando una mezcla de 4 anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo conservado en colágeno de tipo II (Chemicon). A los ratones hembra Balb/C, de 6 semanas de vida, se les inyectaron i.v. 2 mg de anticuerpo anti CII seguido 3 días después de una inyección i.p. de 25 g de LPS. Los animales se trataron diariamente bien con proteína de fusión CRIg murino-Fc o 65 con una proteína de fusión control-Fc. La dosificación fue de 4 mg/kg en 100 l de PBS subcutáneo. El tratamiento

comenzó el día antes de la inyección del anticuerpo anticolágeno y continuó hasta que los ratones se sacrificaron el día 14. Los ratones se examinaban diariamente después de la inyección con LPS para evaluar la hinchazón de las patas traseras como un signo de artritis. La gravedad de la artritis se puntuó sobre una escala de 1 a 16 del siguiente modo: 0 = Sin evidencia de eritema e hinchazón, 1 = Eritema e hinchazón leve confinada al mediopíe (tarsal) o tobillo, 2 = Eritema e hinchazón leve que se extiende del tobillo al mediopíe, 3 = Eritema e hinchazón 5 moderada que se extiende del tobillo a las articulaciones del metatarso, 4 = Eritema e hinchazón grave que abarca el tobillo, el pie y los dedos

El tratamiento terapéutico se realizó de modo similar al tratamiento profiláctico salvo que el inicio del tratamiento fue el día 4 en lugar del día 1. El tratamiento con muCRIg-Fc redujo los niveles de citocinas inflamatorias en las patas de 10 los ratones con AIA. La medición de la concentración de las citocinas, C3a y C5a, en las patas traseras artríticas se realizó de acuerdo con el método de Kagari et al, J. Immunol. 169: 1459-66 (2002). En resumen, a los tiempos indicados después de la inducción de la artritis inducida por anticuerpos, se recogieron las patas y se congelaron en nitrógeno líquido. Posteriormente, se pulverizaron las patas en una placa metálica enfriada con nitrógeno líquido y se dispersaron en PBS enfriado en hielo que contenía PMSF al 0,1 % (Sigma). Las muestras se homogeneizaron en 15 hielo con un homogeneizador Vitatron (NL), las partes insolubles se eliminaron centrifugando a 14.000 g durante 10 min y recogiendo el sobrenadante. Las citocinas del sobrenadante se midieron usando ELISA para citocinas de BD Pharmingen.

El tratamiento con muCRIg-Fc inhibe la deposición de C3 del complemento pero no de IgG2a en cartílago en AIA. A 20 los ratones hembra Balb/C se les inyectaron 2 mg de anticuerpos anti colágeno (artrógeno) i.v. seguido 3 días más tarde por inyección de 25 ug de LPS i.p. 14 días después de la inyección de los anticuerpos, los ratones se sacrificaron y se extrajeron las patas, se incluyeron en alcohol polivinílico y se congelaron en isopentano enfriado en hielo seco. Se cortaron secciones de 7 um de espesor a partir de las articulaciones congeladas y se tiñeron con un anticuerpo policlonal acoplado a FITC contra C3 murino (Calbiochem) y con un anticuerpo policlonal acoplado a 25 A594 contra la IgG2a murina (Jackson Immunoresearch). Se fotografiaron las secciones en un microscopio de fluorescencia Leitz.

Los resultados de inmunohistoquímica realizados con la tinción de H&E se muestran en la Figura 41. Los ratones tratados con control (muIgG1) tuvieron artritis de moderada a grave (panel izquierdo), los ratones tratados con 30 muCRIg tuvieron una mínima artritis, o no la tuvieron (panel derecho). Los resultados muestran que muCRIg inhibe la inflamación articular en artritis inducida por anticuerpos.

En conclusión, los animales tratados con CRIg murino-Fc tuvieron puntuaciones clínicas significativamente reducidas en comparación con los animales tratados con anti-gp120 IgG1. CRIg demostró eficacia tanto profiláctica 35 como terapéutica en este modelo animal. La disminución de la gravedad de la artritis también estaba reflejada por una disminución de las células inflamatorias, especialmente neutrófilos, en las articulaciones. Hubo un número aumentado de neutrófilos en la circulación que posiblemente reflejaba una disminución de la migración de los neutrófilos en las articulaciones. El muCRIg inhibió la producción local de IL-1 e IL-6 en paralelo con la manifestación clínica de AR. El tratamiento con muCRIg no afectó a la deposición de complejo inmunitario, pero 40 inhibió la deposición de C3 del complemento en el cartílago. Se descubrió que la función efectora era independiente de la unión al receptor de Fc. El huCRIg-corto-Fc también demostró actividad profiláctica significativa.

Ejemplo 9

45

El CRIg-Fc murino se une a glóbulos rojos de oveja opsonizados con C3 (E-IgM)

Se recubrieron GRO (Glóbulos rojos de oveja) (MP Biomedicals, ICN/Cappel) con IgM de rata (E-IgM) (Forssman Ag, Pharmingen). Las E-IgM se opsonizaron con suero normal de ratón o con suero de ratón C3 knockout. Las E-IgM opsonizadas se incubaron con distintas concentraciones de CRIg murino-Fc. La unión de la proteína de fusión a 50 E-IgM se controló por citometría de flujo usando un anticuerpo marcado con FITC para la parte Fc de la proteína de fusión.

Como se muestra en la Figura 43, el CRIg murino se unió de un modo dependiente de la dosis a las E-IgM opsonizadas con el suero normal de ratón pero no a las E-IgM opsonizadas con suero deficiente en C3, indicando la 55 unión selectiva de CRIg al C3 murino o a un fragmento de C3.

Ejemplo 10

La unión de CRIg humano-Fc a E-IgM es dependiente de C3 60

Se recubrieron GRO (MP Biomedicals, ICN/Cappel) con IgM de rata (E-IgM) (Forssman Ag, Pharmingen). Las E-IgM se opsonizaron con suero humano deficiente en C3 o en C5. Las E-IgM opsonizadas se incubaron con distintas concentraciones de CRIghumano-Fc. La unión de la proteína de fusión a E-IgM se controló por citometría de flujo usando un anticuerpo marcado con FITC para la parte Fc de la proteína de fusión. 65

Tal como se muestra en la Figura 44, el CRIg humano se unió de manera dependiente de la dosis a E-IgM opsonizada con suero deficiente en C5 pero no a E-IgM opsonizadas con suero deficiente en C3, indicando la unión selectiva de CRIg al C3 humano o a un fragmento de C3. Se obtuvieron resultados similares con el DEC de CRIg.

Ejemplo 11 5

Unión de partículas opsonizadas con suero a células CHO que expresan CRIg

Se mezclaron 50 l de suero de hembras C57B6 + 20 ug/ml de mCRIg-mFc (PUR5270-B) o mPIGR-mFc (4699) conjuntamente. Se añadieron partículas de A488, zmosano, S. aureus o E. coli de Molecular Probes durante 60 10 minutos a 37 ºC en PBS/gelatina al 0,2 %/glucosa al 0,18 %/MgCl2 1 mM (PBSgg++). Las partículas opsonizadas se lavaron 2x en PBS y se añadieron a las células CHO que expresaban CRIg murino (clon 5C10) o JAM2 humano en presencia o ausencia de la proteína CRIg-Fc o control-Fc durante 30 minutos a 37 ºC. Las células se lavaron 2x en PBS y se analizó la unión de partículas a la superficie celular en un Calibrador FACS.

15

Tal como se muestra en la Figura 45, las partículas opsonizadas con suero con suficiente C3 se unieron a las células CHO que expresaban CRIg pero no a las células CHO que expresaban JAM2. La unión se anuló en presencia de una proteína de fusión CRIg-Fc pero no en presencia de una proteína de fusión control-Fc indicando que el sitio de unión para CRIg a C3b reside en el dominio extracelular.

20

Ejemplo 12

MuCRIg Fc se une a C3b

Se realizaron ensayos de resonancia de plasmón superficial controlados en tiempo real usando un instrumento 25 Biacore®-2000, y los datos se analizaron usando el programa informático BiaEvaluation 3.0 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Las microplacas de dextrano carboxilado (microplacas detectoras CM5, para uso en investigación de Biacore AB) se usaron en todos los ensayos. Las células de flujo de las microplacas CM5 se usaron bien para un procedimiento de acoplamiento con aminas convencional o se prepararon para el acoplamiento enzimático directo de C3b usando un procedimiento de activación-desactivación convencional sin añadir ninguna proteína entre las 30 etapas. La etapa de activación se realizó con una solución reciente que contenía N-hidroxisuccinimida y N-etil-N’-(dimetilaminopropil)-carbodiimida (Biacore AB, 7-15-min de inyección a un caudal de 5 l/min) y continuó por desactivación con HCl-etanolamina (1,0 M a pH 8,5) (Biacore AB, 7-15-min de inyección). Se usó Hepes salino tamponado (Biagrade, Biacore AB) o VBS como tampón de flujo a través. Después de estas etapas iniciales se usó HBS o VBS como tampón de flujo continuo a 5 l/min; solamente se usaron tampones desgasificados. 35

Acoplamiento con aminas de las Proteínas en la microplaca Biacore® — C3b, iC3b, C3c y C3d se acoplaron en la microplaca CM5 usando un procedimiento de acoplamiento con aminas convencional tal como recomienda el fabricante. Las proteínas a acoplar se dializaron contra tampón acetato 10 mM (pH 5,0-5,7) para conseguir una carga neta negativa para el acoplamiento con aminas. Brevemente, se activó la superficie de la microplaca con N-40 etil-N’-(dimetilaminopropil)-carbodiimida (7-15-min de inyección , 5 l/min), y se inyectó bien C3b (50 g/ml, 20 l), o C3c (70 g/ml, 30 l) o C3d (130 g/ml, 20 l) purificado para conseguir un nivel apropiado de acoplamiento para los experimentos de unión, es decir, de 1.000 a 5.000 unidades de resonancia (UR). Después, las celdas de flujo se desactivaron tal como se describe anteriormente. Antes de realizar los experimentos, las células de flujo se lavaron a fondo con VBS y NaCl 3 M en tampón acetato 10 mM, pH 4,6. 45

Ensayos de Unión Usando Biacore® - se ensayó la unión de CRIg-Fc a C3b, C3c y C3d acoplado a aminas. Para las inyecciones en el Biacore® se dializaron los reactivos contra VBS, se diluyeron con VBS y se filtraron (0,20 m Minisart®, Sartorius Corp., Edgewood, NY) o se centrifugaron (10 minutos a 14.000 x g). Las concentraciones de proteína de los reactivos dializados se midieron usando el Ensayo de Proteínas BCA (Pierce). Las proteínas de 50 fusión se inyectaron por separado a través de una celda de control de flujo (celda de flujo activado y desactivado sin ninguna proteína acoplada, “canal del blanco”) y a través de la celda de flujo con la proteína acoplada usando un caudal de 5 l/min a 22 ºC. Todos los ensayos de unión se realizaron al menos por duplicado usando micloplacas detectoras preparadas independientemente.

55

Tal como se muestra en la Figura 46, el CRIg-Fc murino muestra unión específica de C3b a la microplaca detectora con una Kd calculada de 250 nM.

Ejemplo 13

60

La proteína de fusión CRIg de ratón y de ser humano - Fc se une al C3b del complemento

Se recubrieron placas Maxisorb durante toda la noche C1, C3a,b,c,d, C4, C6 con 3 ug/ml en PBS. Se bloquearon las placas durante 2 h en PBS + BSA al 4 % y se incubaron con diversas concentraciones de la proteína de fusión CRIg humano o murino-Fc durante 1 h a Ta en PBS+BCA al 4 %+Tween al 0,1 %. Se lavaron las placas y se incubaron 65

con un anticuerpo de cabra anti-Fc de ratón o anti-Fc de ser humano conjugado con peroxidasa. Después de los lavados, se incubaron las placas con sustrato TNB y se leyó la DO en un lector de placas.

Los resultados que se muestran en la Figura 47 representan un aumento dependiente de la concentración en la unión de CRIg murino y humano a C3b, C3c y C3bi y la ausencia de unión a C1, C2, C4, C3a y C3d. 5

Ejemplo 14

La proteína de fusión CRIg de ratón y de ser humano - Fc inhibe la deposición de C3 en zimosano

10

La inhibición de la ruta alternativa se estudió usando un método que utiliza análisis por citometría de flujo de la deposición de C3 en partículas de zimosano A (Sigma) (Quigg et al., J. Immunol. 160: 4553-4560 (1998)). Brevemente, primero se activaron 50 mg de partículas de zimosano en 10 ml de NaCl 0,15 M llevando a ebullición durante 60 minutos, seguido de dos lavados en PBS. En cada condición del ensayo de la ruta alternativa, se añadieron 2 x 107 partículas a los tubos de reacción que contenían una concentración final de EGTA 10 mM y MgCl2 15 5 mM. Después, se añadieron las muestras descritas en el texto, que contenían bien EDTA 10 mM (control negativo) o cantidades crecientes de CRIg murino-Fc. Se añadieron 10 microlitros de suero de BALB/c como una fuente del complemento, y todas las muestras se llevaron a 100 l con PBS. Las muestras se incubaron a 37 ºC durante 20 minutos, y la reacción se detuvo añadiendo EDTA 10 mM. Las partículas se centrifugaron, y los sobrenadantes se recogieron y se congelaron para el análisis posterior. Las partículas se lavaron después dos veces con PBS frío, 20 BSA al 1 %, y después se incubaron con anticuerpo de cabra anti-C3 de ratón conjugado con FITC (Cappel, Durham, NC) durante 1 h en hielo. Las muestras se lavaron después dos veces en PBS frío, BSA al 1 %, se resuspendieron en PBS, y después se analizaron por citometría de flujo usando un citómetro EPICS (Coulter, Hialeah, FL). El porcentaje de inhibición se calculó usando la fórmula [1 - [fluorescencia media del canal de la muestra - fondo (condición del EDTA 10 mM)/fluorescencia media del canal del control positivo (sin Crry-Ig) - fondo]] 25 x 100.

Los sobrenadantes de la reacción también se analizaron por transferencia de Western para determinar el grado de escisión de C3. En este análisis, se mezclaron 5 l del sobrenadante con la misma cantidad de tampón de carga de SDS-PAGE con 2-ME al 10 %. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 7,5 %, se 30 transfirieron a un papel de quimioluminiscencia potenciada de Hybond (ECL) (Amersham, Arlington Heights, IL) durante toda la noche en Tris 0,19 M, glicina 0,025 M, tampón de metanol al 20 %. Después de esto, se bloquearon las membranas en PBS, Tween al 0,1 % con leche al 10 % durante 1 h. El AcM anti-C3 RmC11H9 (Quigg et al., anteriormente mencionado) que se había titulado previamente se añadió después a la transferencia en el mismo tampón con BSA al 1 %. Después de realizar el lavado, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de rata conjugado 35 con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) (preabsorbido contra IgG de ratón) durante 1 h, y después se lavó la transferencia y se reveló usando el sistema de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham).

La inhibición de la activación del complemento por CRIg-Fc en las partículas de zimosano se analizó después por 40 citometría de flujo para detectar el C3 unido a la superficie (Figura 48A), o una alícuota del sobrenadante de la reacción de zimosano se analizó por transferencia de Western y se detectó usando un AcM anti-C3 (Figura 48B). Las posiciones de las cadenas de C3 y C3’ intactas en B se muestran mediante flechas a la derecha. El carril de EDTA 10 mM representa el control negativo, y se muestran las dosis crecientes de CRIg-Fc en la parte superior de los carriles 2 a 7. 45

Ejemplo 15

CRIg inhibe la hemólisis de GRC por la ruta alternativa

50

Para la ruta alternativa: se lavaron glóbulos rojos de conejo (GRC) en tampón veronal (Bio Whittacker) que contenía gelatina al 0,1 % y se suspendieron hasta 1x10e9 células/ml en GVB. Se añadieron 10 l de la suspensión celular a 10 l de suero empobrecido en C1q que contenía los inhibidores. La mezcla se incubó durante 35 min a 37 ºC en una sala cálida mientras que se agitaba. Se añadieron 200 ul de GVB que contenía EDTA 10 mM, se centrifugaron las células a 2500 rpm durante 5 min y se leyeron alícuotas de 100 l a una de longitud de onda de 412 nm. 55

Para la ruta clásica, se incubaron eritrocitos de oveja opsonizados con IgM (E-IgM) en suero deficiente en fB. La metodología fue similar a la de las mediciones de la ruta alternativa.

Los resultados que se exponen en la Figura 49 muestran que el CRIg murino inhibe la hemólisis inducida por la ruta 60 alternativa pero no afecta a la hemólisis de la ruta clásica. Se obtuvieron resultados similares con el CRIg humano.

Ejemplo 16

CRIg inhibe selectivamente la ruta alternativa del complemento 65

Ensayos hemolíticos usando suero completo

La ruta alternativa del complemento se evaluó con eritrocitos (Er) de conejo, como describen Kostavasili et al. (J. Immunol. 158: 1763-71 (1997)). Brevemente, los Er (Colorado Serum, Denver, CO) se lavaron 3x en GVB y se 5 resuspendieron a 1x109/ml. Se añadieron 10 l de Er a 10 l de GVB/EGTA (EGTA 0,1 M/MgCl2 0,1 M), inhibidores, 10 l de suero humano empobrecido en Clq y se ajustó el volumen a 100 l con GVB después se incubó a 37 ºC durante 30 minutos. Se añadieron 250 l de GVB/EDTA 10 mM para detener la reacción, y se centrifugaron durante 5 minutos a 500 x g. La hemólisis se determinó mediante por absorbancia de 200 g del sobrenadante a 412 nm. El porcentaje de lisis se normalizó considerando el 100 % de lisis igual a la lisis que se produce en ausencia del 10 inhibidor.

Para determinar el efecto de CRIg sobre la ruta clásica del complemento, se siguió un procedimiento similar, excepto que los Er se reemplazaron con E-IgM y el ensayo se realizó en suero humano deficiente en fB en GVB++.

15

Medición de la escisión de C3 mediada por la convertasa C3

El efecto de CRIg sobre la escisión de la fase fluida de C3 mediante la convertasa C3 (C3b.Bb) (de Kostavasili et al., anteriormente mencionado) se examinó incubando 0,4 M de C3 purificado con huCRIg-largo, huCRIg-corto, muCRIg o factor H en GVB (20 l de volumen) a 37 ºC durante 15 minutos. Después, se añadieron 0,4 M de factor 20 B y 0,04 M de factor D en presencia de MgEGTA 50 mM, en un volumen total de 30 l para activar la ruta. Después de 30 minutos a 37 ºC, se detuvo la mezcla de reacción con 30 l de tampón de muestra de Laemmli (BioRad) que contenía 2-ME, llevado a ebullición durante 3 minutos, y sometido a electroforesis en un gel de SDS-PAGE al 8 % (Invitrogen). Se visualizaron las proteínas tiñendo el gel con el colorante SimplyBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA). El gel se escaneó para el análisis densitométrico, y se calculó el porcentaje de C3 escindido. Los controles se 25 incubaron en GVBE (GVB con EDTA 10 mM) para inhibir la escisión.

El ensayo en placa de microtitulación para la ruta alternativa DAA se realizó tal como se ha descrito previamente (Krych-Goldberg et al. J. Biol. Chem. 274: 31160-8 (1999)). Las placas de microtitulación se recubrieron durante toda la noche con 5 g/ml de C3b (Advanced Research Technologies) en solución salina tamponada con fosfato. Se 30 blanquearon las placas durante 2 horas a 37 ºC con fosfato salino tamponado que contenía albúmina de suero bovino al 1 % y Tween 20 al 0,1 % y se incubaron durante 15 minutos a 37 ºC con 10 ng de factor B, 1 ng de factor D y NiCl2 0,8 mM en tampón veronal 2,5 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 71 mM y Tween 20 al 0,05 %. Utilizando el mismo tampón, se realizaron incubaciones secuenciales de 1 hora con 0,01-1 g de CRIg-Fc, 0,129 g de anticuerpo de cabra anti-factor B humano y 100 g de una dilución 1:15.000 de anticuerpo anti-cabra conjugado con 35 peroxidasa de rábano picante (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). Se reveló el color con O-fenilendiamina. En este ensayo, el DAF y el factor H se comportaron como se esperaba, como mediadores de actividad de aceleración de degradación, y la liberación de C3a se detectó usando el kit RIA des-Arg de Amersham Pharmacia Biotech.

40

Ensayo de convertasa C5

C3b se depositó en zimosano resuspendiendo 1 x 1010 partículas de zimosano en 0,2 ml de C3 a 10 mg/ml y añadiendo 5 g de tripsina, después de una incubación de 10 minutos a 22 ºC. La deposición de C3b por tripsina se repitió y las células se lavaron seis veces con 5 ml de GVB. Las partículas de zimosano se resuspendieron en 100 l 45 de GVB y se mezclaron con 50 l de GVB que contenía los factores B (35 g) y D (0,5 g) y 50 l de NiCl2 10 mM. Después de 5 minutos de incubación a 22 ºC, se añadieron 5 l de EDTA 0,2 M. El C3b unido se amplificó añadiendo 50 l de C3 (500 g) e incubando las células durante 30 minutos a 22 ºC. Las partículas de zimosano que portaban C3b se lavaron y se repitió el procedimiento de amplificación hasta que se obtuvieran los números deseados de C3b/zimosano. 50

Debido a que la formación de la convertasa C5 duraba menos de un minuto, se formó la enzima en la misma mezcla de reacción en la que se realizaron los ensayos. Las velocidades enzimáticas se determinaron en condiciones saturantes de factores B y D, y C6, en tubos de microcentrífuga recubiertos de silicona de 0,5 ml tal como se describe anteriormente. Las mezclas de ensayo que contenían concentraciones variables de C5 (preincubadas 55 durante 20 minutos a 37 ºC para eliminar el fondo de actividad similar a C5b,6 generado por congelación/descongelación), factor B (1,2 g, 516 nM0, factor D (0,1 g, 167 nM), C6 (2,5 g, 833 nM0, y NiCl2 0,5 mM. La reacción comenzó con la adición de ZimC3b, ESC3b o ERC3b. Dependiendo de la densidad de C3b por célula, la concentración de células se ajustó de modo que se tuvieran 9-35 ng de C3b unido en un volumen final de 25 g de GVB dando como resultado 2-8 nM de concentración enzimática. Después de 15 minutos de incubación a 60 37 ºC, la escisión adicional de C5 se impidió transfiriendo los tubos de ensayo a un baño con hielo y añadiendo GVBE enfriado en hielo. Las mezclas del ensayo diluidas apropiadamente se titularon inmediatamente para la formación de C5b,6 mediante ensayos hemolíticos usando CE. El C5b,6 se cuantificó usando curvas patrón generadas con C5b,6 purificado. Los controles establecieron que la temperatura fría y la dilución fueron suficientes para reducir la escisión de C5 durante las etapas posteriores a niveles indetectables. La lisis de los eritrocitos de 65

conejo (EC) o de los eritrocitos de oveja (EO) mostró contribuir en <2 % a los títulos de C5b,6 usando la lisis de CE como criterio de valoración final.

C5b,6 se midió hemolíticamente usando la sensibilidad de CE a la lisis hemolítica mediante el C5b-9 humano. Para una alícuota (25 l) de la muestra diluida de los ensayos de la convertasa C5 se añadió una mezcla de 1,2 x 107 CE 5 y 5 l de suero humano normal (SHN) agrupado como una fuente de proteínas del complemento C7-C9 en un volumen final de 225 l de GVBE. Las mezclas de reacción se incubaron durante 10 minutos a 37 ºC después de los cuales las células no lisadas se eliminaron por centrifugación durante 1 minuto a 10.000 x g. La cantidad de hemoglobina liberada se cuantificó espectrofotométricamente a 414 nm. Se midió 100% de la lisis como CE lisadas en Nonidet P-40 al 2 %. Los controles que contenían C5 y C6 pero no convertasa C5, se restaron como el fondo. 10 Los controles que contenían convertasa C5 pero no C5 o C6 purificadas demostraron que no se formó una cantidad significativa de C5b,6 del SHN usado como una fuente de C7-9 durante la lisis de las CE.

Resultados

15

Los resultados se muestran en las Figuras 49(A)-(E).

La Figura 49(A) muestra que CRIg inhibe la hemólisis de eritrocitos de conejo en suero deficiente en C1q (ruta alternativa) pero no de los eritrocitos de oveja opsonizados con IgM en suero deficiente en fB (ruta clásica) indicando que CRIg inhibe selectivamente la ruta alternativa del complemento. 20

Tal como se muestra en la Figura 49(B), CRIg inhibe la actividad de la convertasa de C3 de la fase fluida. El gel muestra inhibición de la escisión de la cadena alfa de 115 kDa de C3 con aumento de la concentración de CRIg humano-DEC (10-100 nM).

25

Las Figuras 49(C) y (D) muestran que CRIg no actúa como un cofactor de la escisión de C3 mediada por el cofactor I ni como un acelerador de degradación de la convertasa C3.

Los datos que se exponen en la Figura 49(E) muestran que CRIg inhibe la ruta alternativa de la convertasa C5 formada en partículas de zimosano. 30

Ejemplo 17

CRIg se expresa en un subconjunto de macrófagos tisulares

35

Se generaron anticuerpos monoclonales específicos de CRIg humano y de ratón y se utilizaron para definir la expresión de CRIg, tal como se describe en el Ejemplo 3. Aunque CRIg estaba ausente en monocitos C14+ de sangre periférica, se detectó fácilmente en macrófagos derivados de monocitos por citometría de flujo (Figura 50B). huCRIg estaba ausente en células T CD4+ y CD8+, células B CD19+, células NK CD56+, granulocitos CD15+ de sangre periférica (Figura 51A). De modo similar al huCRIg, muCRIg estaba ausente en los leucocitos de sangre 40 periférica y esplénicos, incluyendo células mieloides CD11b+, pero se detectaba en células de Kupffer hepáticas (CK, Figura 50B). La expresión de las proteína huCRIg(L) y (S) se confirmó a 55 y 48 K como proteínas Mr en monocitos diferenciados en macrófagos (Figura 50C). De modo similar el CRIg de ratón se detectó a 48 K como una glucoproteína Mr en macrófagos peritoneales (MP). MuCRIg tiene un sitio de N-glucosilación predicho y está glucosilado, representando un desplazamiento de movilidad en un gel de 5 kDa (resultados no mostrados). 45

Como la expresión del ARNm de CRIg se detectó altamente en hígado, la expresión de CRIg en hígado se analizó adicionalmente por inmunohistoquímica. CRIg se expresó en CK CD68+ en hígado humano y de ratón pero también se detectó en macrófagos de la glándula adrenal, placenta, sinovio, intestino y peritoneo (datos no mostrados). CRIg estaba ausente en macrófagos esplénicos humanos, en células de Langerhan, en células microgliales y en 50 macrófagos derivados de médula ósea, así como en una variedad de líneas celulares de macrófagos de ser humano y de ratón (THP-1, RAW275, PU1.1, J774; resultados no mostrados). En conjunto, estos resultados indican que CRIg se expresa altamente en una población de macrófagos residentes en diversos tejidos.

Ejemplo 18 55

CRIg se une a C3b e iC3b

Materiales y Métodos

60

Proteínas del complemento

El C3 humano y de ratón se aisló de acuerdo con el método de Hammer et al. (J. Biol. Chem. 256(8): 3995-4006 (1981)) con una columna de Proteína A adicional para eliminar las IgG contaminantes. Para obtener hC3b, hC3 se incubó con CVF, hfB, ug, hfD en una relación molar de 10:10:1 a 37 ºC durante una hora en presencia de MgCl2 10 65 mM. El fragmento hC3b se aisló posteriormente mediante un intercambiador aniónico fuerte monoQ 5/50 (Amersham

Biosciences, Piscataway, NY) y una columna de filtración en gel Superdex S-200 10/300 GL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para dar una pureza de >95% basada en el gel tenido con azul de Coomassie. Para generar dímeros de C3b, el C3b preparado como se ha indicado anteriormente se hizo reaccionar durante 3 días a 4 ºC en PBS a pH 7,0 con bismaleidohexano (Pierce) en metanol en una relación molar de 2.2:1. Se generó la reticulación a través del grupo sulfihidrilo libre rompiendo el enlace tioéster. Con este procedimiento, el rendimiento 5 fue superior al 50 %. Los dímeros se purificaron mediante una columna de filtración en gel Superdex S-200 10/300 GL (Amersham Biosciences, Piscataway, NY). Los dímeros tuvieron una pureza del 95 % basada en el gel teñido con Azul de Coomassie. El C3 hidrolizado se produjo con una adición de metilamina 2 M a un pH de 7,0 a C3 en PBS con EDTA 10 mM para dar una concentración final de 50 mM en el volumen de reacción. La reacción se procesó durante 4 horas a 37 ºC, después de dicho tiempo se purificó sobre una columna de filtración en gel 10 Superdex S-200 10/300 GL (Amersham Biosciences, Piscataway, NY), se purificaron iC3b y C3c (Advanced Research Technologies) sobre una columna de filtración en gel Superdex S-200 10/300 GL para separar los monómeros de los dímeros. El C3d, los Factores B, D y P, los componentes C1-9 del complemento, los eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpo y el factor de veneno de cobra se obtuvieron en Advanced Research Techologies (San Diego, CA). 15

Resultados

La expresión de CRIg en una población de células altamente fagocíticas, incitó a los inventores a explorar si CRIg estaba implicado en la unión de partículas opsonizadas. Se ha demostrado que el complemento y los receptores de 20 Fc actúan como mediadores en la fagocitosis (revisado por Aderem y Underhill, Annu. Rev. Immunol. 17: 593-623 (1999), Underhill y Ozinsky, Annu Rev. Immunol. 20: 825-852 (2002)). Con el fin de determinar si CRIg se une al C3 del complemento, se analizaron eritrocitos de oveja recubiertos bien con IgG de conejo (E-IgG) o con IgM de ratón (E-IgM) para determinar su capacidad de formar rosetas con una línea de células T Jurkat que expresaba CRIgL en presencia de suero humano deficiente en C3 o C5. Las células Jurkat que expresaban CRIg(L) pero no las de 25 control, formaron rosetas con E-IgM en presencia (C3+), pero no en ausencia (C3-) de C3 (Figura 52A), no parecía que CRIg estuviera implicado en la unión mediada por el receptor de Fc dado que los Es opsonizados con IgG no formaron rosetas con las células Jurkat que expresaban CRIg (resultados no mostrados).

Para ensayar si CRIg podía unirse directamente a los componentes del complemento en las superficies celulares, se 30 generó una forma soluble de CRIg humano en la cual el DEC de CRIg se fusionó con la parte Fc de la IgG1 humana. La proteína de fusión huCRIg-largo-Fc, pero no la control-Fc, se unió a E-IgM opsonizadas en presencia, pero no en ausencia, de C3 (Figura 52B). La unión se restableció cuando se reconstituyó suero deficiente en C3 con C3 humano purificado. El dominio de Ig de tipo V fue suficiente para la unión dado que tanto huCRIg(S)-Fc como muCRIg-Fc fueron capaces de unirse a E-IgM (resultados no mostrados). 35

Como un resultado de la activación del complemento que incluye una cascada de reacciones enzimáticas, C3 se escinde en sus múltiples productos de degradación C3b, iC3b, C3c, C3dg y C3d, cada uno de los cuales puede servir como un compañero de unión para CRIg. Usando una placa ELISA de unión, huCRIg(L) y huCRIg(S)-Fc, pero no control-Fc demostraron unión saturable a C3b e iC3b (Figura 52C), pero no a C3, C3a, C3c o C3d (resultados no 40 mostrados). Se observó una unión similar para huCRIgL-DEC, que carecía de la parte Fc, y muCRIg-Fc, y la unión a iC3b fue mayor que a C3b (resultados no mostrados). A la inversa, el C3b soluble también se unió a la placa recubierta con huCRIg(L)-Fc y compitió para el huCRIg(L)-DEC (resultados no mostrados). Por lo tanto, CRIg puede unirse a C3b e iC3b en solución o cuando C3b e iC3b están unidos a un sustrato. Dado que C3b está presente como una forma multimérica cuando se deposita en las superficies celulares, la unión de CRIg se evaluó adicionalmente 45 para dímeros de C3b (C3b2) ensamblados artificialmente. El C3b2 se unió a huCRIg (L) con una Kd de 131 nM (Figura 52D) y a huCRIg(S) con una Kd de 44 nM, medido por resonancia de plasmón superficial (Figura 52D).

Para complementar estos estudios bioquímicos, se evaluó la especificidad de unión de CRIg de la superficie celular para productos derivados de C3. Una forma dimérica de C3b2 marcada A488 se unió a la superficie de células THP-50 1 CRIg+, pero no CRIg- (Figura 52E). La unión fue específica dado que compitió por la adición de C3b2, monómero C3b, soluble no marcado, y huCRIg(L)-DEC pero no por el C3 nativo. Además de la unión a fragmentos solubles del complemento, muCRIg expresado en la superficie de una línea celular CHO también se unió a diversas partículas opsonizadas en suero C3 suficiente, pero no en C3 deficiente (Figura 51B). En conjunto, estos estudios demuestran que CRIg expresado en la superficie celular así como el CRIg soluble (CRIg-FC) es un receptor para iC3b e C3b. 55

Ejemplo 19

La expresión de CRIg en células de Kupffer es necesaria para que se produzca la unión de fragmentos de C3 solubles o unidos a partículas 60

Materiales y métodos

1. Generación de ratones CRIg genosuprimidos (knock out (ko))

65

Todos los animales se mantuvieron en condiciones Estériles Libres de Patógenos y los experimentos realizados con animales fueron aprobaros por el comité de uso y cuidado institucional de animales de Genentech. Se generaron células madre embrionarias CRIg ko por electroporación de un vector diana linealizado reemplazando el exón 1 por un gen resistente a neomicina (Figura 53A) en células madre embrionarias (ME) C2B6. Los clones resistentes a neomicina se seleccionaron, y la recombinación homóloga se confirmó por transferencia de Southern. Siete de 100 5 clones explorados fueron positivos para la recombinación homóloga. Dos clones diana se inyectaron en blastocistos C57VL/6 y se transfirieron a madres adoptivas seudogestantes, y los ratones macho quiméricos resultantes se cruzaron con hembras C57BL/6 para obtener ratones +/-. La transmisión de la línea germinal se verificó para las 2ES clonadas por análisis de transferencia de Southern o por el ADN de la cola de la descendencia F1 (Figura 42B). El entrecruzamiento de ratones +/- se realizó para generar ratones CRIg -/-. Los fenotipos de los dos clones fueron 10 idénticos. Para la genotipificación rutinaria mediante un método por PCR, se usaron un cebador común en sentido 5’-CCACTGGTCCCAGAGAAAGT-3’ (SEC ID Nº: 22), y un cebador antisentido específico de tipo silvestre (5’-CACTATTAGGTGGCCCAGGA-3’) (SEC ID Nº: 23) y específico knock out (5’-GGGAGGATTGGGAAGACAAT-3’) (SEC ID Nº: 24), amplificando un fragmento de 306 pb del alelo de tipo silvestre y un fragmento de 406 pb para el alelo mutante. La generación de ratones C3 ko se ha descrito anteriormente (Naughton et al., Immunol. 156: 3051-15 3056 (1996). Para generar ratones CRIg/C3 doble knock out, se cruzaron ratones C3 ko en un fondo mixto de s129/B6 (F2) con ratones CRIg ko. Las hembras heterocigotas de F1 para ambos alelos se cruzaron posteriormente con machos heterocigotos C3, hemicigotos para el alelo CRIg. La descendencia de este emparejamiento se usó en los estudios. Los ratones C57B6 usados para el análisis de la expresión de CRIg por citometría de flujo se adquirieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor). 20

2. Transferencia de western y desglucosilación

Se lisaron macrófagos humanos y murinos en PBS que contenía SDS al 1 %, Triton X-100 al 0,1 % y un coctel inhibidor de proteasas (Boehringer). Después de centrifugar a 10.000 g, la fracción soluble se procesó en un gel de 25 SDS y se transfirió a membranas de nitrocelulosa. La proteína CRIg se visualizó usando anticuerpos anti CRIg y anticuerpos secundarios conjugados con HRPO seguido de detección de la quimioluminiscencia del anticuerpo unido mediante ECL (Amersham). Para determinar el estado de glucosilación de CRIg, las células que expresaban CRIg-gD se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-gD, se trataron con PNGasa, O-glucosidasa y neuraminidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biolabs, NE) y se sometieron a análisis de transferencia de Western 30 usando anticuerpos anti-gD marcados con biotina.

Resultados

Para estudiar la función biológica de CRIg, se generaron ratones con una mutación nula en el gen de CRIg mediante 35 recombinación homóloga tal como se describe anteriormente y como se muestra en la Figura 42A. La deleción se confirmó por transferencia de Southern (Figura 53B), transferencia de Western de lisados celulares de exudados peritoneales (Figura 54A) y citometría de flujo (Figura 54B). Nacieron ratones con las relaciones Mendelianas esperadas y no mostraron anomalías fenotípicas ni histopatológicas globales. Los números absolutos de células inmunitarias en diferentes compartimentos linfoides fueron similares en sangre, bazo y ganglios linfáticos de los 40 animales de ts y ko (Figura 53C). Además, no se observaron diferencias en el número de CK F4/80+ y en los macrófagos del corazón cuando se analizaron por citometría de flujo e inmunohistoquímica, respectivamente (resultados no mostrados). En las CK los niveles de expresión de otras proteínas de unión al complemento, incluyendo las cadenas  y  del CR3 y el gen y relacionado con el receptor del complemento (Crry) no estaban alterados (Figura 54C). De modo similar, la expresión baja o indetectable de CR1, CR2 o CD11c, la cadena beta de 45 CR4, fuero comparables entre las CK de ts o ko (Figura 53D).

A continuación se ensayó la capacidad de unión de las CK CRIg de ts y CRIg ko de los productos de degradación de C3. Los fragmentos de C3 (C3b, C3b2 e iC3b) se depositaron fácilmente en la superficie de las CK CRIg de ts (Figura 54B). Por el contrario, no se detectó unión de C3b, C3b2, iC3b ni iC3b2 en las CK CRIg ko. Se detectó 50 escasa unión, o ninguna, de C3 y C3c con las CK de ts o ko (Figura 53E).

Para ampliar el análisis de la unión de los fragmentos solubles de C3 a la unión de los fragmentos de C3 unidos a las superficies celulares, se examinó el papel de CRIg sobre las CK con respecto a la unión de eritrocitos recubiertos con IgM opsonizados con C3. Las CK CRIg ko demostraron una reducción de 60 % en la formación de rosetas con 55 E-IgM cuando se compararon con las CK CRIg de ts (Figura 54D). CR3 tuvo una menor contribución con respecto a la actividad de unión total ya que se observó una reducción adicional (<20 %) en la formación de rosetas con la adición del anticuerpo bloqueante para CR3. Por lo tanto, la expresión de CRIg es necesaria para que se produzca la unión de los productos de degradación de C3 y las partículas opsonizadas por C3 a células de Kupffer.

60

Ejemplo 20

CRIg se internaliza y se expresa en endosomas de reciclaje

Como la unión de las partículas opsonizadas con C3 a sus receptores puede desencadenar su endocitosis posterior 65 (Fearon et al., J. Exp. Med. 153: 1615-1628 (1981); Sengelov, Crit Rev. Immunol. 15: 107-131 (1995)), se usaron

anticuerpos policlonales que desactivan al fluorocromo Alexa488 (Austin et al., Mol. Biol. Cell 15: 5268-5282 (2004)) para analizar si CRIg y C3b se internalizan en las CK. Se preincubaron AcM anti CRIg conjugados con A488 con CK a 4 ºC. La adición de anticuerpos anti-A488 a 4 ºC suprimió la fluorescencia de los anticuerpos anti CRIg unidos a la superficie, como se muestra en la Figura 47A, panel 1. Cuando los AcM anti-CRIg conjugados con A488 se incubaron con CK a 37 ºC durante 30 minutos después de incubación con anticuerpos anti-A488, la fluorescencia no 5 se suprimió (Figura 55A, panel 4) indicando que los anticuerpos anti CRIg se internalizaban después de transferir las células de 4 ºC a 37 ºC y por lo tanto no eran accesibles a los anticuerpos anti-A488 desactivados. Se descubrió un resultado similar para C3b (Figura 55A, paneles 3 y 6). La internalización de anticuerpos anti-CRIg no fue dependiente de la presencia de C3 dado que la captación del anticuerpo se produjo en CK aisladas de ratones C3 ko (Figura 55A, paneles 2 y 5) y en ausencia de suero (resultados no mostrados). La inmunohistoquímica confirmó 10 adicionalmente la presencia de anticuerpos anti CRIg y C3b en el citoplasma de CK de ratones CRIg de ts, pero no en los ko (Figura 55B). A lo largo del tiempo, cuando las CK recubiertas con anticuerpos anti CRIg conjugados con A488 se incubaron en presencia de anticuerpos anti-A488 extracelulares, se observó un descenso de la fluorescencia a lo largo del tiempo y este sugiere que los anticuerpos anti-CRIg se reciclan nuevamente en la superficie celular (Figura 55C). La evolución de reciclaje fue nuevamente independiente de C3 dado que la cinética 15 de la desactivación fue similar en presencia y en ausencia de C3 (resultados no mostrados). Por el contrario, los anticuerpos contra la proteína lisosomal Lamp1 permanecieron intracelulares y no disminuyeron con el tiempo. Estos resultados indican que CRIg actúa como un receptor para C3b localizado en un conjunto de membranas de reciclaje constitutivas.

20

Para determinar adicionalmente los compartimentos subcelulares en los que se recicla CRIg, se visualizaron macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM) usando microscopía de deconvolución que usaba transferrina como marcador para endosomas de reciclaje y Lamp1 como marcador para lisosomas. Los MDM cultivados durante 7 días expresan CRIg en el 60 % de las células que muestran unión saturable de C3b (Figura 55A) que puede competir con el dominio extracelular de huCRIg(L) (resultados no mostrados). Los macrófagos recubiertos con 25 anticuerpo anti-CRIg a 4 ºC demuestran expresión focal de CRIg en las extensiones filopodiales ricas en F-actina (cabezas de flecha, Figura 56A, paneles 1-3). Además, el anticuerpo de CRIg se colocalizó con C3b en la superficie celular (resultados no mostrados). La transferencia de células de 4 ºC a 37 ºC seguido de incubación durante 10 minutos a 37 ºC (Figura 56B) dio como resultado una internalización rápida del anticuerpo de CRIg y C3b en un compartimento endosomal transferrina+ localizado en la periferia de la célula (Figura 56B, paneles de 1-4, flechas) y 30 bordeando el compartimento Lamp1+ (flechas Figura 57D, panel 1-4). CRIg permaneció localizado dentro del compartimento endosomal y no se degradó en el lisosoma con tiempos de búsqueda prolongados de hasta 24 horas (resultados no mostrados). La incubación de los macrófagos con anticuerpos anti-CRIg no influyó en la distribución de CRIg dado que el anticuerpo de CRIg internalizado se solapó completamente con el conjunto total de CRIg detectado después de la fijación con un anticuerpo policlonal (Figura 57C, paneles 1-3) y fue independiente de la 35 presencia de C3 en el medio (Figura 57C, panel 4). En conjunto, estos resultados indican que CRIg está presente en endosomas de reciclaje y tempranos y que la internalización de CRIg tiene lugar en ausencia de ligando o de anticuerpo de entrecruzamiento.

Dado que la mayor parte de C3b e iC3b se depositó en partículas expuestas a suero (Brown, Curr. Opin. Immunol. 3: 40 76-82 (1991)), a continuación se exploró la localización de endosomas positivos a CRIg en macrófagos durante la fagocitosis de partículas opsonizadas con C3. Después del encuentro con glóbulos rojos de oveja opsonizados con iC3b (E-IgM), CRIg se redistribuyó rápidamente (10 minutos) de las vesículas positivas a transferrinas a los primeros fagosomas visibles como un anillo alrededor de los eritrocitos envueltos (Figura 56C, paneles 1 y 4, flechas). Dos horas después de la incubación de los macrófagos con partículas opsonizadas con C3, los fagosomas habían 45 madurado tal como se muestra por su translocación dentro del compartimento liposomal (Figura 56C, paneles de 5-8). CRIg se expresaba a altos niveles en las membranas fagosómicas que circunda las partículas opsonizadas con C3 (Figura 56C, paneles 5 y 8, flechas) y en la mayor parte de los macrófagos ya no estuvieron presentes dentro del compartimento endosomal transferrina+. Mientras que CRIg seguía presente en un subconjunto de fagosomas en el compartimento lisosomal, su expresión no se solapaba con la de LAMP-1 (Figura 56C, paneles 7 y 8, cabezas de 50 flechas). La ausencia de CRIg en las membranas LAMP-1+ no fue probablemente el resultado de la degradación lisosomal de CRIg dado que los inhibidores de proteasa estuvieron continuamente presentes durante la incubación. En algunos de los macrófagos que habían ingerido las E-IgM pero que carecían de fagosomas CRIg+, el CRIg+ se colocalizó con el compartimento transferrina+ (flecha gruesa, Figura 56C5, paneles 5 y 8, flechas finas) lo que sugiere que CRIg+ regresa al compartimento de reciclaje después de la transferencia de las E-IgM al compartimento 55 lisosomal.

Considerados en conjunto, estos resultados indican que CRIg se acumula desde los endosomas a sitios de ingestión de partículas y participa en las fases iniciales de la formación del Fagosoma, pero sale del fagosoma después de la fusión del fagosoma con el lisosoma para volver al compartimento endosomal. 60

Ejemplo 21

Los ratones que carecen de CRIg son susceptibles a infección por Listeria monocytogenes

65

Materiales y métodos

1. Microorganismos, infección de ratones y evaluación del crecimiento de Listeria por determinación del recuento de las UFC

En todos los experimentos se usó la bacteria L. monocytogenes (LM) virulenta (ATCC cepa 43251). La virulencia de 5 la bacteria se mantuvo mediante pases en serie en ratones BALB/c. Se obtuvieron aislados recientes de bazos infectados, que crecieron en infusión de cerebro y corazón (líquido) o en placas con infusión de cerebro corazón (Difco Laboratories, Detroit, MI). Las bacterias se lavaron varias veces, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril, y después se conservaron en pequeñas alícuotas a -80 ºC en PBS que contenía glicerol al 40 %. Los ratones recibieron por vía intravenosa, en la vena de la cola, un inóculo de L. 10 monocytogenes a diversas dosis. Para la observación del crecimiento bacteriano en los diversos órganos, se inyectaron por vía intravenosa 1 x 104 unidades formadoras de colonias (UFC) de Listeria, una dosis no letal bien a ratones CRIg ko o a ratones CRig de ts. El número de bacterias viables en el inóculo, homogeneizados del hígado y bazo, y las células infectadas, se determinó sembrando en placas de agar con infusión de cerebro corazón (Difco Laboratories) diluciones en serie con factor 10. Después de incubar durante 24 horas a 27 ºC se contaron los 15 números de UFC.

2. Determinación de la captación de Listeria con A488 en células de Kupffer

La bacteria L. monocytogenes viva se marcó con un kit de marcaje de A-488 de acuerdo con las instrucciones del 20 fabricante (Molecular Probes, Oregón). El número de bacterias Listeria vivas después del procedimiento de marcaje se evaluó por recuento de colonias. A ratones CRIg de ts o ko para CRIg se les inyectó, por vía intravenosa, 10 millones de UFC de LM. Una hora después, se perfundieron los hígados y se aislaron las células de Kupffer de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Las células se tiñeron con un anticuerpo contra F4/80 marcado con PE, y las células positivas se aislaron usando perlas anti PE (Miletnyi) seguido de clasificación con un citómetro 25 de flujo MoFlo (Dako-Cytomation, Ft. Collins, CO). Las células F4/80 positivas se recogieron en cubreobjetos y se calculó el número de bacterias internalizadas marcadas usando microscopía óptica y confocal. Se contó el número de bacterias por célula en 400 células de 4 campos diferentes por cubreobjetos. El índice fagocítico se calculó multiplicando el número medio de bacterias por célula por el porcentaje de células de Kupffer que contenían al menos una bacteria. El resultado muestra la media y las desviaciones típicas del índice fagocítico obtenido de cuatro 30 animales diferentes.

Resultados

Basándose en la unión de CRIg a partículas opsonizadas con C3b/iC3b, para explorar un papel de CRIg en la 35 fagocitosis de partículas opsonizadas con el complemento in vivo, ratones CRIg de ts y KO para se infectaron con diversas dosis de Listeria monocytogenes (LM), una bacteria facultativa gram positiva que, cuando se expone a suero, activa la ruta alternativa del complemento que deposita predominantemente C3b e iC3b en la superficie bacteriana (Croize et al., Infec Immunol. 61: 5134-5139 (1993)). Los ratones CRIg KO fueron significativamente más susceptibles a la infección por LM, como se muestra por una mortalidad aumentada (Figura 58A). Por otro lado, el 40 tratamiento con la proteína de fusión CRIg-Ig aumentó la susceptibilidad de los ratones CRIg ts, pero no la de los ratones CRIg ko (Figura 62).

En línea con un papel de CRIg en la unión y en la fagocitosis de partículas opsonizadas por C3 del complemento, los ratones CRIg ko tuvieron una eliminación reducida de LM de la sangre que dio como resultado un aumento de la 45 carga de LM en bazo y pulmón (Figura 58B). También hubo una disminución de la carga de LM en hígado y corazón de ratones infectados lo que probablemente refleja la presencia de macrófagos que expresan CRIg en estos tejidos (Figura 58B). Las respuestas a la inflamación fueron elevadas en ratones CRIg ko reflejadas por niveles aumentados en suero de TNF-, TNF- e IL-6 (Figura 58C). En coherencia con la necesidad de CRIg para la eliminación de partículas opsonizadas con C3, las CK que expresan CRIg ko demostraron unión y fagocitosis significativamente 50 reducida de LM en comparación con las CK que expresan CRIg de ts (Figura 58D). Finalmente, el aumento de la carga de Listeria detectado en la sangre de ratones CRIg ko fue dependiente de C3 ya que infección de ratones C3 ko anulaba la diferencia en el título bacteriano en ratones CRIg ko frente al ts (Figura 58E). De modo interesante, los niveles de bacterias en circulación fueron significativamente menores en ratones C3 ko en comparación con ratones C3 suficientes, y probablemente esto refleja el aumento de la implicación de mecanismos independientes de C3 55 responsables de la eliminación de Listeria en ratones C3 ko. Sin embargo, la eliminación rápida en ausencia de C3, no da como resultado una eliminación eficaz de patógenos a largo plazo dado que los ratones deficientes en C3 mueren al cabo de 2 días después de la infección con bacterias gram positivas (Cunnion et al., J Lab. Clin. Med. 143: 358-365 (2004)). Estos resultados indican contundentemente que el CRIg expresado en células de Kupffer hepáticas juega un papel crítico en la eliminación rápida de la circulación del patógeno opsonizado con C3 del 60 complemento.

Ejemplo 22

Inhibición de la hemólisis inmunitaria mediada por el complemento con moléculas muCRIg 65

Está bien establecido que los eritrocitos de conejo activan específicamente la ruta alternativa del complemento, con una lisis resultante de células por el complejo C5b-9 (Polhill, et al., J. Immunol. 121(1), 363-370 (1978)). En particular, los eritrocitos de conejo inician la cascada alternativa del complemento, y la formación resultante de MAC causa la lisis de estas células. Si un compuesto de ensayo es capaz de inhibir la ruta alternativa, entonces la adición del reactivo a los eritrocitos de conejo bañados en suero (en este caso suero de mono Cinomolgo o suero humano 5 empobrecido en C1q) debería impedir la lisis celular. Esto puede ensayarse controlando los cambios de absorbancia de luz a una longitud de onda 412 nm producidos por la liberación de hemoglobina de los eritrocitos lisados. En los experimentos con suero de mono Cinomolgo, se recogió sangre de la vena femoral de los monos Cinomolgos. No se usó anticoagulante. Se dejó coagular las muestras a temperatura ambiente, se centrifugaron y el suero se recogió y se conservó en un congelador ajustado para mantener la temperatura de -60 a -80 ºC. Los glóbulos rojos de conejo 10 (GRC) se lavaron tres veces en GVB ((tampón veronal 1x (Biowhittaker), gelatina al 0,1 %), y se resuspendieron a 1 x 109/ml en GVB. Se añadieron GVB, huCRIg (corto, largo o DEC largo), después de la adición de 10 l de GVB+/EGTA (GVB, EGTA 0,1 M, MgCl2 0,1 M). Se añadieron 10 l de suero de mono Cinomolgo o empobrecido en C1q (Quidel), seguido de la adición de 10 l de GRC, y la mezcla se mezcló con golpecitos con el dedo. Después de incubar durante 45 min a 37 ºC, en una sala cálida con agitación, se añadieron 250 l de GVB/EDTA 10 mM, y la 15 mezcla se centrifugó a 2500 rpm durante 5 minutos. Se usaron alícuotas de 250 l y se leyeron a 412 nm. Los resultados mostrados en las Figuras 63 A y B (suero de Cino) y en las Figuras 64-66 (suero humano) demuestran que los compuestos CRIg sometidos a ensayo inhiben el complemento.

hST-L: CRIg-largo humano

hST-S: CRIg-corto humano 20

hST-L DEC: DEC CRIg-largo humano

hPIGR: receptor polimérico de inmunoglobulina humana

fH: factor del complemento H.

Ejemplo 23 25

Ensayo de proteínas de fusión CRIg murino-Fc en un modelo de ratón de neovascularización coroidal

La neovascularización coroidal (NVC) puede inducirse experimentalmente por quemaduras láser en la retina. En el presente estudio, 40 ratones C57BL-6 (Charles River Laboratory) se dividieron en dos brazos de tratamiento. 30

Grupo 1 (control): inyección i.p. de gap120 mIgG1 12 mg/kg los días -1, 1, 3 y 5.

Grupo 2: inyección i.p. de CRIg murino (mCRIg) 12 mg/kg los días -1, 1, 3 y 5.

35

En cada brazo, se anestesió a los animales por inyección subcutánea (s.c.) de una mezcla de ketamina (25 mg/g) y xilacina (1,28 mg/g). Se dilataron las pupilas usando una sola gota de tropicamida al 1 %. Después se inmovilizó a los animales en un molde de plástico. Se usó un láser de diodo (tamaño de punto 100-m) para generar tres puntos láser en el ojo alrededor del nervio óptico, usando un Láser de Diodo OcuLight GL (532 nm), una lámpara de hendidura Zeiss de 30 W y un micromanipulador. El ojo derecho se sometió a láser con 120 mW, 0,1 segundos y 40 100 m de tamaño de punto. Una burbuja formada en el punto láser indica la rotura de la membrana de Brach.

Los puntos láser se evaluaron el día 7 después del tratamiento con láser, usando microscopia confocal. En este momento, los animales se anestesiaron con isofluorano, y a través del corazón se realizó una perfusión de 0,5 ml de PBS que contenía 50 mg/ml de dextrano marcado con fluoresceína (Sigma). Se extirparon los ojos y se fijaron en 45 formalina tamponada con fosfato al 10 %, las retinas se descartaron y el cáliz ocular restante se montó horizontalmente en un portaobjetos. El examen histopatológico incluyó tinción inmunohistoquímica de los montajes coroidales horizontales para visualizar los fragmentos del complemento y la elastina y realizar el análisis del tamaño del complejo NVC controlando la vasculatura teñida con dextrano-FITC en los ojos con microscopia confocal.

50

Los resultados se muestran en las Figuras 71 A y B, donde los orificios por quemadura del ojo derecho se puntúan en una escala de 0 a 3 y de 0 a 5, respectivamente.

Ejemplo 24 55

Ensayo de los DEC de CRIg y de las proteínas de fusión CRIg-Fc en monos Cinomolgos sometidos a daño retinal inducido por láser

En este estudio se utilizaron 24 monos Cinomolgos, macho o hembra, 12 machos y 12 hembras. La edad de los 60 animales oscilaba entre 2 a 7 años y su peso entre 2 a 5 kg.

Tabla 2

Designación de Grupos y Niveles de Dosis

Número de Animales a los que se realiza Necropsiaa

Fase de dosificación 2 Fase de dosificación 1 Fase de dosificación 1 Nivel de Dosisb

Grupo

Nº de Animales Día 6 Día 18 Día 32 (mg/kg/dosis)

1 (Control)c

12 3 3 6 0

2 (Tratado)

12 3 3 6 10

a La dosificación de los animales programados para sacrificar 2 días después del tratamiento con láser (Dosificación de fase 2) se inicia aproximadamente 2 semanas después de comenzar el estudio de la Fase de Dosificación 1. b El volumen de la dosis es en ml/kg/dosis. c El grupo 1 solo recibe vehículo.

5

La administración es por inyección intravenosa a través de la vena cefálica. Los animales reciben la dosis al menos una vez antes del tratamiento con láser, y tres veces semanalmente durante el resto del estudio. Las dosis se realizan en función del peso corporal más recientemente registrado, y están en el intervalo de 10 a 15 mg/kg.

El Día 4, la mácula de cada ojo de todos los animales se sometió a tratamiento láser mediante CORL con 10 quemaduras láser verde de diodo 532 nm (OcuLight GL, IRIDEX Corp Inc, Mountain View, California) usando un sistema de suministro de lámpara de hendidura y una lente de contacto de fondo plano Kaufman-Wallow (Ocular Instruments Inc, Bellevue, Wash). El láser y el equipo de soporte se obtienen en CORL. Los animales se anestesian con ketamina y xilacina. Se localizan nueve áreas simétricamente en la mácula de cada ojo. Los parámetros del láser incluyen un tamaño de punto de 75 micras y una duración de 0,1 segundos. La potencia usada se evalúa por la 15 capacidad de producir una ampolla y una pequeña hemorragia. A menos que se observe hemorragia con el primer tratamiento láser, se coloca un segundo punto de láser adyacente al primero siguiendo el mismo procedimiento con láser (excepto que se ajustan los vatios). Para las áreas no adyacentes a la fóvea la potencia inicial ajustada es de 500 mW; si se coloca un segundo punto, la potencia se ajusta a 650 mW. Para el área adyacente a la fóvea las potencias ajustadas son de 400 mW (inicial) y 550 mW (segunda). A criterio del cirujano retinal, los ajustes de la 20 potencia pueden ajustarse en función de las observaciones en el momento del tratamiento con láser.

Exámenes oftalmológicos clínicos

Antes de iniciar el tratamiento, y los días 8, 15, 22 y 29, se realiza un examen clínico oftalmológico a cada animal. Se 25 anestesió a los animales con ketamina, y se dilataron los ojos con un agente midriático. La parte adyacente y anterior de ambos ojos se examinó usando un biomicroscopio con lámpara de hendidura. Se examinó el fondo ocular de los dos ojos usando un oftalmoscopio indirecto. A criterio del oftalmólogo, los ojos pueden examinarse usando otra instrumentación adecuada y pueden tomarse fotografías.

30

Fotografías oculares

Se tomaron fotografías oculares (FO) una vez el día del tratamiento láser (post-láser), en la Fase de Dosificación 1 Días 10, 17, 24 y 31, y en la Fase de Dosificación 2 Día 6 (el día de la necropsia). Cuando se hace conjuntamente con la angiografía de fluoresceína durante la Fase de Dosificación 1, primero se toman las FO. 35

Los animales se anestesian con ketamina y se mantienen con el anestésico isoflurano cuando se hace conjuntamente con la angiografía de fluoresceína y se anestesian con ketamina y xilacina cuando se hace solo (es decir, después del tratamiento de láser). Los ojos se dilatan con un agente midriático. Se toman fotografías a color de cada ojo y se incluyen las anomalías de la retina y oculares pertinentes, fotografías estereoscópicas del polo 40 posterior y fotografías no estereoscópicas de dos campos centrales-periféricos (temporal y nasal).

Angiografía con fluoresceína

La angiografía con fluoresceína se realiza una vez antes de iniciar el tratamiento de todos los animales y en la Fase 45 de Dosificación los Días 10, 17, 24 y 31 (6, 13, 20 y 27 días postláser).

Antes de realizar la angiografía con fluoresceína los animales se someten a ayuno. Se anestesia a los animales con ketamina y se les mantiene con isofluorano, y los ojos se dilatan con un agente midriático. Los animales se entuban debido a la posibilidad de que vomiten tras la inyección de fluoresceína. Los animales reciben una inyección 50 intravenosa de fluoresceína. Se toman las fotografías al comienzo y al final de la inyección de fluoresceína. Después de la inyección de fluoresceína, se toma una serie rápida de estereofotografías del polo posterior del ojo derecho seguido de pares estereoscópicos del polo posterior del ojo izquierdo antes de 1 minuto, y después en cada ojo a aproximadamente 1 a 2, y 5 minutos. Entre aproximadamente 2 y 5 minutos, se toman fotografías no

estereoscópicas de dos campos centrales-periféricos (temporal y nasal) de cada ojo. Si se observa filtración de fluoresceína en el momento del minuto 5, se toma un par de fotografías estereoscópicas aproximadamente a los 10 minutos.

La evaluación de los angiogramas de fluoresceína se realiza de acuerdo con el siguiente sistema de clasificación 5 para confirmar el exceso de permeabilidad (filtración de fluoresceína) o cualquier otra anomalía.

Grado de Lesión

Definición

I

Sin hiperfluorescencia

II

Hiperfluorescencia sin filtración

III

Hiperfluorescencia precoz o filtración media-transitoria y tardía

IV

Hiperfluorescencia brillante precoz o filtración media-transitoria y tardía más allá de los bordes del área tratada

Depósito del material

10

El siguiente material se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. (ATCC):

Designación

Nº de Dep. de la ATCC Fecha del Depósito

ADN45416-1251

209620 5 de febrero de 1998

Este depósito se realizó según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del 15 Depósito de Microorganismos con la Finalidad del Procedimiento de Patentes y la Normativa estipulada en el mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza la conservación de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito estará disponible en la ATCC en los términos del Tratado de Budapest y estará sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente y sin restricciones de la descendencia del cultivo del depósito al público después de la expedición de la Patente de EE.UU. pertinente o 20 después de su apertura a inspección pública de cualquier Solicitud de Patente de EE.UU. o extranjera, sea lo que sea lo que ocurra primero, y garantiza la disponibilidad de la descendencia a una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas registradas de los EE.UU. para tener derecho a la misma de acuerdo con las normas 35 USC’122 y del Comisionado conforme a las mismas (incluyendo la 37 CFR § 1.14 con referencia particular a 886 OG 638). 25

El beneficiario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muere o se pierde o se destruye al cultivar en condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán puntualmente por otros de los mismos cuando se notifique. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para llevar a la práctica la invención infringiendo los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de 30 acuerdo con esta ley de patentes.

La anterior memoria descriptiva escrita se considera suficiente para permitir que un experto en la materia lleve a la práctica la invención. El alcance de la presente invención no está limitado por las construcciones depositadas, dado que la realización depositada pretender ser solo una ilustración de determinados aspectos de la invención y 35 cualquiera de las construcciones que sean funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del alcance de la presente invención. El depósito del material del presente documento no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en el presente documento sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se interpretará como una limitación del alcance de las reivindicaciones con respecto a las ilustraciones específicas que esta representa. 40

En efecto, diversas modificaciones de la invención además de las que se muestran y se describen en el presente documento, serán obvias para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y se incluirán en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

45

Claims (40)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido CRIg, o una inmunoadhesina CRIg que comprende un polipéptido CRIg fusionado a una secuencia de inmunoglobulina, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección ocular asociada al complemento, en donde el polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg son un inhibidor selectivo de la ruta alternativa del 5 complemento.
2. 2. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CRIg se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos CRIg de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, y los dominios extracelulares (DEC) de dichos polipéptidos. 10
3. 3. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido CRIg es el DEC de un polipéptido CRIg de SEC ID Nº: 2, 4, 6 u 8.
4. 4. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 3, en donde dicho polipéptido CRIg es el DEC 15 de un polipéptido CRIg de SEC ID Nº: 4 o 6.
5. 5. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 1, en la que la secuencia de inmunoglobulina es una secuencia de región constante de inmunoglobulina.

   20
6. 6. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 5, en la que la secuencia de región constante de la inmunoglobulina es la de una cadena pesada de inmunoglobulina.
7. 7. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 6, en la que la secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se fusiona a una región extracelular de un polipéptido CRIg de SEC ID Nº: 2, 4, 6 u 8 para producir 25 una proteína de fusión CRIg-Ig.
8. 8. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 7, en la que dicha secuencia de región constante de inmunoglobulina es la de una IgG.

   30
9. 9. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 8, en la que dicha IgG es una IgG-1 o una IgG-3.
10. 10. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 9, en la que la secuencia de región constante de cadena pesada de IgG-1 comprende al menos una región bisagra, CH2 y CH3.

    35
11. 11. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 9, en la que la secuencia de región constante de cadena pesada de IgG-1 comprende una región bisagra, CHI, CH2 y CH3.
12. 12. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 7, en la que la proteína de fusión CRIg-Ig comprende un enlazador entre las secuencias de CRIg y de Ig. 40
13. 13. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 7, en la que la proteína de fusión CRIg-Ig esta codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 20, 21, 25, 26, 27 y 28.
14. 14. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 1, en donde la afección ocular asociada al 45 complemento se selecciona del grupo que consiste en degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), neovascularización coroidal (NVC), uveítis, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, endoftalmitis, edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis ocular, Oclusión de la Vena Central de la Retina (OVCR), neovascularización corneal y neovascularización retiniana.

    50
15. 15. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 14, en donde la enfermedad ocular asociada al complemento es degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) o neovascularización coroidal (NVC).
16. 16. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 15, para su uso en la prevención de la NVC.

    55
17. 17. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 15, para su uso en la prevención de la progresión de la DMRE.
18. 18. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 17, para su uso en la prevención de la progresión de la DMRE a NVC. 60
19. 19. Un polipéptido CRIg, o una inmunoadhesina CRIg, que comprende un polipéptido CRIg fusionado a una secuencia de inmunoglobulina, para su uso en la prevención del desarrollo o de la progresión de la degeneración macular relacionada con la edad (DMRE) en un sujeto con riesgo de desarrollar una DMRE o que presenta un diagnóstico de DMRE en al menos un ojo. 65
20. 20. El polipéptido CRIg de la reivindicación 19, que es tal como se define en la reivindicación 3 o en la reivindicación 4.
21. 21. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 19, en la que el polipéptido de fusión comprende el dominio extracelular de un polipéptido de SEC ID Nº: 4 o 6 fusionado a una secuencia de región constante de cadena pesada 5 de inmunoglobulina.
22. 22. La inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de fusión se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos de fusión codificados por las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 20, 21, 25, 26, 27 y 28. 10
23. 23. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en donde el sujeto es un ser humano.
24. 24. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 23, en dondeel sujeto humano presenta un 15 diagnóstico de DMRE en al menos un ojo.
25. 25. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 24, en donde dicha DMRE es DMRE seca de categoría 3 o de categoría 4.

    20
26. 26. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 25, en donde dicho sujeto se ha identificado como que está expuesto a un riesgo a desarrollar NVC.
27. 27. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 26, en donde dicho sujeto está genéticamente expuesto a un riesgo a desarrollar NVC. 25
28. 28. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 28, en donde dicho sujeto humano presenta un diagnóstico de DMRE en los dos ojos.
29. 29. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 28, en el que dicho sujeto humano tiene una 30 DMRE de categoría 3 o categoría 4 en los dos ojos.
30. 30. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 23, que ralentiza la progresión de la DMRE.
31. 31. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 25, que retrasa la progresión de la DMRE a 35 NVC.
32. 32. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 23, que previene la progresión de la DMRE a NVC.

    40
33. 33. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 24, en donde el sujeto humano presenta un diagnóstico de DMRE en un solo ojo.
34. 34. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 33, que retrasa el desarrollo de la DMRE en el otro ojo. 45
35. 35. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 33, que previene el desarrollo de la DMRE en el otro ojo.
36. 36. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 23, que es para una administración por 50 inyección intravítrea.
37. 37. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 23, que es para una administración junto con un agente adicional para la prevención o el tratamiento de la DMRE o de la NVC.

    55
38. 38. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg de la reivindicación 37, en donde dicho agente adicional es un anticuerpo anti-VEGF-A.
39. 39. Un polipéptido CRIg, o una inmunoadhesina CRIg que comprende un polipéptido CRIg fusionado a una secuencia de inmunoglobulina, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la degeneración macular 60 relacionada con la edad (DMRE) seca.
40. 40. El polipéptido CRIg o la inmunoadhesina CRIg para su uso como se define en la reivindicación 39, que es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11.

    65