CN103333850A - 对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，包括如下步骤：（1）分离基础培养基的制备；（2）灭菌；（3）复壮；（4）筛选；（5）驯化。本发明筛选方法得到的侧孢芽孢杆菌对复合肥的耐受能力有显著提高。

Description

对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种侧孢芽孢杆菌的筛选方法，特别涉及一种对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法。

背景技术

侧孢芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）是一种好氧的产孢细菌，可以产生舟形内含物，属于芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性，可变为阴性。侧孢芽孢杆菌是经国家农业部微生物检测中心批准使用的一种天然菌种。可用于土壤微生物肥料和生产养殖上。例如：中国专利文献CN101200385A、CN101200387A、CN101462901A和CN1966670A公开了利用侧孢芽孢杆菌制取微生物有机肥料，能够明显抑制有害病菌病毒的生长繁殖，增强作物根系活力，促进作物生长，对减少化肥农药用量、保护环境有明显作用。但是，如果将侧孢芽孢杆菌与化肥一起使用，化肥中的无机盐将会使得侧孢芽孢杆菌不能存活下来，失去了其微生物肥料的作用。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，提高侧孢芽孢杆菌对复合肥的耐受能力。

本发明的技术方案是这样实现的：对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分离基础培养基的制备；

（2）灭菌；

（3）复壮；

（4）筛选；

（5）驯化。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（1）中，基础培养基采用营养琼脂培养基。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（1）中，营养琼脂培养基的组成如下：8-12克蛋白胨，2-4克牛肉粉，0.3-0.7克ZnSO₄，0.3-0.7克Na₂B₄O₇.10H₂O，0.5-1.5克黄腐酸钾，3.0-7.0克复合肥及800-1200mL水；制备好的营养琼脂培养基的pH为7.3±0.1。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（2）中，营养琼脂培养基经过高温灭菌，灭好菌的营养琼脂培养基倒平板准备培养皿，试管培养基摆斜面制备营养琼脂试管斜面，冷却，备用。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（3）中，超净工作台开紫外灯灭菌，实验室甲醛熏蒸，吸无菌水加入冻干管中，将侧孢芽孢杆菌菌种干粉做成菌悬液，在火焰封口的状态下倒入步骤（2）中制备好的营养琼脂试管斜面上，将菌悬液平铺在斜面培养基上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（4）中，在菌种操作间，将超净工作台开紫外灯灭菌，进行无菌操作，用接种针在步骤（3）中培养好的试管斜面菌种挑起菌落，在步骤（2）中准备好的培养皿中划线，将划好线的培养皿放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，观察是否有典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落形成；将典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落，转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，待用。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（5）中，按照复合肥质量分数为0.5-3.5%、3.6-6.5%、6.6-9.4%、9.5-12.5%、12.6-15.5%、15.6-18.5%、18.6-21.5%和21.6-24%在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿；在步骤（4）中培养好的营养琼脂试管斜面上，挑菌种首先在复合肥质量分数为0.5-3.5%的培养皿划线培养，将培养的单菌落转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上培养，培养结束后作为菌种在下一个复合肥浓度的培养皿中划线培养，依次类推。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（4）和步骤（5）中，开紫外灯灭菌至少30分钟。

上述对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（5）中，按照复合肥质量分数为2%、5%、8%、11%、14%、17%、20%和23%在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿。

本发明中涉及的侧孢芽孢杆菌的原始来源：CGMCC1.0864，【菌株历史】←中国科学院微生物研究所，中科院菌种保藏中心购买。

本发明的有益效果是：本发明筛选方法得到的侧孢芽孢杆菌对复合肥的耐受能力有显著提高。

具体实施方式

实施例1

对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分离基础培养基的制备：基础培养基采用营养琼脂培养基；营养琼脂培养基的组成如下：10克蛋白胨，3.0克牛肉粉，0.5克ZnSO₄，0.5克Na₂B₄O₇.10H₂O，1克黄腐酸钾，5.0克复合肥及1000mL水；制备好的营养琼脂培养基的pH为7.3±0.1。

（2）灭菌：营养琼脂培养基经过高温灭菌，灭好菌的营养琼脂培养基倒平板准备培养皿，试管培养基摆斜面制备营养琼脂试管斜面，冷却，备用。

（3）复壮：超净工作台开紫外灯灭菌30分钟以上，实验室甲醛熏蒸，吸无菌水加入冻干管中，将侧孢芽孢杆菌菌种干粉做成菌悬液，在火焰封口的状态下倒入步骤（2）中制备好的营养琼脂试管斜面上，将菌悬液平铺在斜面培养基上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天。

（4）筛选：在菌种操作间，将超净工作台开紫外灯灭菌30分钟以上，进行无菌操作，用接种针在步骤（3）中培养好的试管斜面菌种挑起菌落，在步骤（2）中准备好的培养皿中划线，将划好线的培养皿放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，观察是否有典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落形成；将典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落，转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，待用。

（5）驯化：按照复合肥（此复合肥中N、P₂O₅、K₂O的质量分数均为15%）质量分数为2%、5%、8%、11%、14%、17%、20%和23%在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿；在步骤（4）中培养好的营养琼脂试管斜面上，挑菌种首先在复合肥质量分数为2%的培养皿划线培养，将培养的单菌落转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上培养，培养结束后作为菌种在下一个复合肥浓度的培养皿中划线培养，依次类推。

根据实验结果表明复合肥的浓度（质量分数）在20%时，本菌株能生长良好。

检测方法：营养琼脂培养基加入质量分数为20%浓度的复合肥，高压灭菌后，用灭菌后的培养皿倒平板。划线或者稀释平板涂布，34℃±0.5℃培养，3—5天生长出单菌落。

生物学鉴定：侧孢芽孢杆菌：为革兰氏阳性、杆菌，2～5×0.5～0.8μm，椭圆或柱状芽孢，位于菌体的中部。运动。重要的鉴别特征，形成附着于孢子一侧的一个独木舟状体。其成因是孢子占据了纺锤状包囊的一侧。侧胞复红可着色，包囊溶解后，侧胞依然牢固地附着于孢子上。在营养洋菜上中等生长，变成暗的和不透明的，在葡萄糖洋菜上生长较厚，可变成皱褶的，有葡萄糖时可进行厌氧生长。可分解甘露醇产酸，不分解阿拉伯糖及木糖不产酸。不产生二羟丙酮。

驯化前后对比：将驯化前的菌株和驯化后的菌株分别接入液体培养基培养，待95%以上芽孢形成下摇床准备平板计数。结果如表1：

表1驯化前后侧孢芽孢杆菌存活情况

驯化前菌株的存活率为0%，筛选驯化后菌株存活率为71.7%，表明经过本实施例筛选方法得到的侧孢芽孢杆菌对复合肥的耐受能力有显著提高。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

营养琼脂培养基的组成如下：10.5克蛋白胨，3.5克牛肉粉，0.6克ZnSO₄，0.6克Na₂B₄O₇.10H₂O，1.2克黄腐酸钾，4.0克复合肥及1000mL水。

在步骤（5）中，按照复合肥（此复合肥中N、P₂O₅、K₂O的质量分数均为15%）质量分数为3.5%、6.5%、9.4%、12.5%、15.5%、18.5%、21.5%和24%营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿。

根据实验结果表明复合肥的浓度（质量分数）在18.5%时，本菌株能生长良好。

检测方法：营养琼脂培养基加入质量分数为18.5%浓度的复合肥，高压灭菌后，用灭菌后的培养皿倒平板。划线或者稀释平板涂布，34℃±0.5℃培养，3—5天生长出单菌落。

生物学鉴定：侧孢芽孢杆菌：为革兰氏阳性、杆菌，2～5×0.5～0.8μm，椭圆或柱状芽孢，位于菌体的中部。运动。重要的鉴别特征，形成附着于孢子一侧的一个独木舟状体。其成因是孢子占据了纺锤状包囊的一侧。侧胞复红可着色，包囊溶解后，侧胞依然牢固地附着于孢子上。在营养洋菜上中等生长，变成暗的和不透明的，在葡萄糖洋菜上生长较厚，可变成皱褶的，有葡萄糖时可进行厌氧生长。可分解甘露醇产酸，不分解阿拉伯糖及木糖不产酸。不产生二羟丙酮。

驯化前后对比：将驯化前的菌株和驯化后的菌株分别接入液体培养基培养，待95%以上芽孢形成下摇床准备平板计数。结果如表2：

表2驯化前后侧孢芽孢杆菌存活情况

驯化前菌株的存活率为0%，筛选驯化后菌株存活率为64.3%，表明经过本实施例筛选方法得到的侧孢芽孢杆菌对复合肥的耐受能力有显著提高。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

营养琼脂培养基的组成如下：8克蛋白胨，2克牛肉粉，0.7克ZnSO₄，0.3克Na₂B₄O₇.10H₂O，0.5克黄腐酸钾，3.0克复合肥及800mL水。

在步骤（5）中，按照复合肥（此复合肥中N、P₂O₅、K₂O的质量分数均为15%）质量分数为0.5%、3.6%、6.6%、9.5%、12.6%、15.6%、18.6%和21.6%在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿。

根据实验结果表明复合肥的浓度（质量分数）在18.6%时，本菌株能生长良好。

检测方法：营养琼脂培养基加入质量分数为18.6%浓度的复合肥，高压灭菌后，用灭菌后的培养皿倒平板。划线或者稀释平板涂布，34℃±0.5℃培养，3—5天生长出单菌落。

生物学鉴定：侧孢芽孢杆菌：为革兰氏阳性、杆菌，2～5×0.5～0.8μm，椭圆或柱状芽孢，位于菌体的中部。运动。重要的鉴别特征，形成附着于孢子一侧的一个独木舟状体。其成因是孢子占据了纺锤状包囊的一侧。侧胞复红可着色，包囊溶解后，侧胞依然牢固地附着于孢子上。在营养洋菜上中等生长，变成暗的和不透明的，在葡萄糖洋菜上生长较厚，可变成皱褶的，有葡萄糖时可进行厌氧生长。可分解甘露醇产酸，不分解阿拉伯糖及木糖不产酸。不产生二羟丙酮。

驯化前后对比：将驯化前的菌株和驯化后的菌株分别接入液体培养基培养，待95%以上芽孢形成下摇床准备平板计数。结果如表3：

表3驯化前后侧孢芽孢杆菌存活情况

驯化前菌株的存活率为0%，筛选驯化后菌株存活率为63%，表明经过本实施例筛选方法得到的侧孢芽孢杆菌对复合肥的耐受能力有显著提高。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

营养琼脂培养基的组成如下：8克蛋白胨，4克牛肉粉，0.3克ZnSO₄，0.7克Na₂B₄O₇.10H₂O，1.5克黄腐酸钾，7.0克复合肥及1200mL水。

在步骤（5）中，按照复合肥（此复合肥中N、P₂O₅、K₂O的质量分数均为15%）质量分数为3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%和24%在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿。

根据实验结果表明复合肥的浓度（质量分数）在21%时，本菌株能生长良好。

检测方法：营养琼脂培养基加入质量分数为21%浓度的复合肥，高压灭菌后，用灭菌后的培养皿倒平板。划线或者稀释平板涂布，34℃±0.5℃培养，3—5天生长出单菌落。

生物学鉴定：侧孢芽孢杆菌：为革兰氏阳性、杆菌，2～5×0.5～0.8μm，椭圆或柱状芽孢，位于菌体的中部。运动。重要的鉴别特征，形成附着于孢子一侧的一个独木舟状体。其成因是孢子占据了纺锤状包囊的一侧。侧胞复红可着色，包囊溶解后，侧胞依然牢固地附着于孢子上。在营养洋菜上中等生长，变成暗的和不透明的，在葡萄糖洋菜上生长较厚，可变成皱褶的，有葡萄糖时可进行厌氧生长。可分解甘露醇产酸，不分解阿拉伯糖及木糖不产酸。不产生二羟丙酮。

驯化前后对比：将驯化前的菌株和驯化后的菌株分别接入液体培养基培养，待95%以上芽孢形成下摇床准备平板计数。结果如表4：

表4驯化前后侧孢芽孢杆菌存活情况

驯化前菌株的存活率为0%，筛选驯化后菌株存活率为65.1%，表明经过本实施例筛选方法得到的侧孢芽孢杆菌对复合肥的耐受能力有显著提高。

上述实施例中，所用复合肥组成为尿素：磷酸一铵：磷酸二铵：硫酸钾的重量比例是22.78:18.07:18.07:33.33。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明创造所作的举例，而并非对本发明创造具体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造权利要求的保护范围之中。

Claims (9)

1.对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分离基础培养基的制备；

（2）灭菌；

（3）复壮；

（4）筛选；

（5）驯化。

2.根据权利要求1所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（1）中，基础培养基采用营养琼脂培养基。

3.根据权利要求2所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（1）中，营养琼脂培养基的组成如下：8-12克蛋白胨，2-4克牛肉粉，0.3-0.7克ZnSO₄，0.3-0.7克Na₂B₄O₇.10H₂O，0.5-1.5克黄腐酸钾，3.0-7.0克复合肥及800-1200mL水；制备好的营养琼脂培养基的pH为7.3±0.1。

4.根据权利要求3所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（2）中，营养琼脂培养基经过高温灭菌，灭好菌的营养琼脂培养基倒平板准备培养皿，试管培养基摆斜面制备营养琼脂试管斜面，冷却，备用。

5.根据权利要求4所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（3）中，超净工作台开紫外灯灭菌，实验室甲醛熏蒸，吸无菌水加入冻干管中，将侧孢芽孢杆菌菌种干粉做成菌悬液，在火焰封口的状态下倒入步骤（2）中制备好的营养琼脂试管斜面上，将菌悬液平铺在斜面培养基上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天。

6.根据权利要求5所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（4）中，在菌种操作间，将超净工作台开紫外灯灭菌，进行无菌操作，用接种针在步骤（3）中培养好的试管斜面菌种挑起菌落，在步骤（2）中准备好的培养皿中划线，将划好线的培养皿放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，观察是否有典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落形成；将典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落，转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，待用。

7.根据权利要求6所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（5）中，按照复合肥质量分数为0.5-3.5%、3.6-6.5%、6.6-9.4%、9.5-12.5%、12.6-15.5%、15.6-18.5%、18.6-21.5%和21.6-24%在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿；在步骤（4）中培养好的营养琼脂试管斜面上，挑菌种首先在复合肥质量分数为0.5-3.5%的培养皿划线培养，将培养的单菌落转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上培养，培养结束后作为菌种在下一个复合肥浓度的培养皿中划线培养，依次类推。

8.根据权利要求1-7任一所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（4）和步骤（5）中，开紫外灯灭菌至少30分钟。

9.根据权利要求7所述的对复合肥耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，在步骤（5）中，按照复合肥质量分数为2%、5%、8%、11%、14%、17%、20%和23%在营养琼脂培养基里相应增加复合肥的浓度，分别制备成培养皿。