CN103333677B

CN103333677B - 一种用于检测汞离子的单硫代方酸染料荧光探针及其制备

Info

Publication number: CN103333677B
Application number: CN201310252538.7A
Authority: CN
Inventors: 傅南雁
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN103333677A

Abstract

本发明公开了一种用于检测汞离子的单硫代方酸染料荧光探针及其制备方法和应用，将氧代方酸菁和劳森试剂按比例混合，溶于甲苯中，溶解后在惰性气体保护下回流反应1.5~4小时；所得反应混合物冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得粗产物；硅胶柱层析分离得到产物。本发明的单硫代方酸染料荧光探针稳定性好，且能实现对低浓度汞离子的快速、灵敏、专一检测，合成方法简单，生产成本低。

Description

一种用于检测汞离子的单硫代方酸染料荧光探针及其制备

技术领域

本发明属于化学分析测试技术领域，具体涉及一种用于检测汞离子的单硫代方酸染料荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

汞被公认为自然界中的有毒元素，由于重金属的滥用使汞污染大大威胁着自然环境和人类的水源。汞单质及汞离子在排入环境后，可以被水生微生物转化为甲基汞。甲基汞通过食物链在生物体内富集，进入人体后，使人产生严重的恶心、呕吐、腹痛以及肾功能损伤，危害极大。因此，汞离子的检测有着重要的意义。美国国家环境保护局（U.S. Environmental Protection Agency）规定人类饮用水的含汞量上限为2 ppb，因此，为了达到这一标准，科学家们一直致力于寻找新的检测方法，以求达到汞离子检测的高灵敏度和高选择性。

目前，常见的汞离子检测的仪器分析技术包括原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱法等。这些技术具有较高的灵敏度和选择性，并常用于定量分析，但是这些方法所涉及的仪器价格昂贵，保养维护繁琐，样品前处理复杂，需要经过长期培训的专业技术人员操作，不能进行实时、原位动态检测，所以应用受到一定的限制。而与上述的仪器分析技术相比，荧光方法具有非入侵的性质，较高的灵敏性和特异性，反应时间快，适用于实时的离子检测，越来越受到关注。

目前报道的汞离子探针多数基于PET、ICT等络合机理，其结构主要包括两个部分：一个是具有荧光信号输出功能的发光基团，另一个是离子受体，通常含有与汞离子有较强结合能力的氮或硫等配位原子（Nolan, E. M.; Lippard, S. J. Tools and Tactics for the Optical Detection of Mercuric Ion. Chem. Rev.2008, 108, 3443–3480.）。然而，汞离子的重金属效应会导致探针分子的荧光淬灭，在络合过程中受到亲氮亲硫的银离子、铅离子及锌离子等金属离子的竞争，且易受溶液的pH值、离子强度和氯离子、硫离子等阴离子的干扰，限制了该类探针的应用。而基于脱硫反应的汞离子探针是近年来发展的一类新型汞离子探针，它具有对溶液pH值不敏感、荧光强度比较大等优点（Ko, S.-K.; Yang, Y.-K.; Tae, J.; Shin, I. In Vivo Monitoring of Mercury Ions Using a Rhodamine-Based Molecular Probe. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 14150-14155; Yang, Y.-K.; Ko, S.-K.; Shin, I.; Tae, J. Fluorescent Detection of Methylmercury by Desulfurization Reaction of Rhodamine Hydrazide Derivatives. Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 4590-4593; Yang, Y.-K.; Yook, K.-J.; Tae, J. A Rhodamine-Based Fluorescent and Colorimetric Chemodosimeter for the Rapid Detection of Hg²⁺ Ions in Aqueous Media. J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 16760-16761; Song, K. C.; Kim, J. S.; Park, S. M.; Chung, K.-C.; Ahn, S.; Chang, S.-K. Fluorogenic Hg²⁺-Selective Chemodosimeter Derived from 8-Hydroxyquinoline. Org. Lett., 2006, 8, 3413-3416; Liu, B.; Tian, H. A Selective Fluorescent Ratiometric Chemodosimeter for Mercury Ion. Chem. Commun., 2005, 3156-3168; Choi, M. G.; Kim, Y. H.; Namgoong, J. E.; Chang, S.-K. Hg²⁺-Selective Chromogenic and Fluorogenic Chemodosimeter Based on Thiocoumarins. Chem. Commun., 2009, 3560-3562; Namgoong, J. E.; Jeon, H. L.; Kim, Y. H.; Choi, M. G.; Chang, S.-K. Hg²⁺-Selective Fluorogenic Chemodosimeter Based on Naphthoflavone. Tetrahedron Lett., 2010, 51, 167-169.）。但这类探针的最大不足在于需要高浓度汞离子的参与，较高的检测温度，较长的反应时间，且易受银离子和铅离子的干扰。因此，各方面性能优异且可以在低浓度下检测汞离子的荧光探针的设计依然具有极大的挑战性。

方酸染料在可见光至近红外光区有窄而强的吸收带和较高的量子产率，这种光电特性主要来源于分子内强的供体-受体-供体间的电荷迁移作用。近年来，方酸染料以其优异的性能、良好的光稳定性备受青睐，成为功能染料的研究热点。用硫原子取代方酸染料中心四元环的氧原子，可以得到硫代方酸染料。由于低的n-π*跃迁，硫代方酸染料具有较高的系间窜越比率和较高的三线态量子产率，导致其仅具有非常微弱的荧光发射。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测汞离子的单硫代方酸染料荧光探针及其制备方法和应用，该单硫代方酸染料荧光探针稳定性好，且能实现对低浓度汞离子的快速、灵敏、专一检测，合成方法简单，生产成本低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测汞离子的单硫代方酸染料荧光探针具有如下所示的结构通式：

，R = -(CH₂)_n-CH₃, n = 0~5。

通过接入不同长度的烷基链，可以有效调节染料分子的溶解性、在水溶液中的聚集行为，以及与增溶剂和分散剂，如β-环糊精，CTAB，SDS，Triton X-100等的相互作用，提高探针分子的性能。

本发明所涉及的单硫代方酸染料荧光探针的具体特征如下：

探针分子的最大吸收在648-654 nm范围内，摩尔吸光系数在3.7-4.4×10⁵范围内，并在665-673 nm范围内有弱的荧光发射。该染料的光化学稳定性好；对汞离子具有很好的选择性，Li⁺, Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺, Al³⁺, Fe³⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺, Ag⁺等离子对检测没有影响；抗干扰能力强，H₂PO₄ ^-, HPO₄ ^2-, HCO₃ ^2-, S^2-, ClO₄ ^-, SO₄ ^2-, NO₂ ^-, NO₃ ^-, CO₃ ^2-, Cl^-, S₂O₃ ^2-, I^-, CH₃COO^-等阴离子和强络合剂EDTA的存在不干扰探针对汞离子的响应；探针分子对pH变化不敏感，在pH为5.5-10.5范围内，pH变化对探针分子对汞离子的响应没有影响；探针对汞离子的响应速度快，在氢键的辅助下，汞离子的脱硫反应可以在5分钟内完成，可实现汞离子的快速检测；且该探针对汞离子具有较高的灵敏度，在EtOH-HEPES (70/30, v/v, pH=7.2) 测试体系下，对汞离子的检测限可以达到5.1×10^-10M，低于美国国家环境保护局规定的饮用水汞离子含量的上限值 (2 ppb)。

制备如上所述的用于检测汞离子的单硫代方酸染料荧光探针的方法包括以下步骤：

，通式中：R = -(CH₂)_n-CH₃, n = 0~5。

（1）将氧代方酸菁和劳森试剂按比例混合，溶于甲苯中，溶解后在惰性气体保护下回流反应1.5-4小时；

（2）将步骤（1）所得反应混合物冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得粗产物；

（3）硅胶柱层析分离得到产物。

步骤（1）中氧代方酸菁和劳森试剂的摩尔比为1:1.8~1:2.0。

步骤（3）中硅胶柱层析分离所用的洗脱剂是体积比为20:1~10:1的石油醚和乙酸乙酯。

所述的单硫代方酸染料荧光探针基于氢键辅助脱硫反应用于环境样品及细胞中的汞离子快速定性定量检测。

本发明的显著优点在于：基于硫代方酸染料与其氧代类似物间较大的荧光性能差异，利用汞离子诱导脱硫反应实现低浓度汞离子的检测。为了促进脱硫反应的进行，在探针设计上，引入了含有分子内氢键的单硫代方酸染料结构，通过氢键辅助的脱硫反应，有效地解决了此类“活性”探针的不足，实现了对低浓度汞离子的快速、灵敏、专一的检测。

附图说明

图 1是(a)通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）在pH为7.2的乙醇/HEPES (70:30, v/v)缓冲体系中加入不同金属离子的吸收光谱变化；(b)不同金属离子加入到含通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）的pH为7.2的乙醇/ HEPES (70:30, v/v)缓冲体系中的实际效果图。

图 2是通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）在pH为7.2的乙醇/ HEPES (70:30, v/v)缓冲体系中加入不同金属离子的荧光光谱变化，插图为滴加金属离子荧光变化实际效果图。

图 3是通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）在pH为7.2的乙醇/ HEPES (70:30, v/v)缓冲体系中滴加Hg²⁺的荧光光谱变化图，插图为滴汞荧光强度的变化曲线。

图 4是通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）在pH为7.2的乙醇/ HEPES (70:30, v/v)缓冲体系中共存金属离子对汞离子检测的干扰。

图 5是通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）在pH为7.2的乙醇/ HEPES (70:30, v/v)缓冲体系中共存阴离子对汞离子检测的干扰。

图 6是通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）在pH为7.2的乙醇/ HEPES (70:30, v/v)缓冲体系对不同类型的汞离子的时间响应。

图 7是不同pH的HEPES的缓冲体系对通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）用于汞离子检测的影响。

图 8是通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=1）在不同浓度的环糊精中荧光光谱变化。

图 9是通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=1）在使用环糊精提高水溶性的前提下，作为荧光探针用于Hale细胞的共聚焦显微成像。其中：(a) Hale细胞用荧光探针在37^oC孵育0.5 h的明场图像；(b) Hale细胞用荧光探针在37^oC孵育0.5 h的荧光图像；(c)为(a)和(b)照片的叠加；(d) Hale细胞用荧光探针在37^oC孵育0.5 h用PBS洗涤三次后在含汞的PBS体系中继续孵育0.5 h的明场图像；(e) Hale细胞用荧光探针在37^oC孵育0.5 h用PBS洗涤三次后在含汞的PBS体系中继续孵育0.5 h的荧光图像；(f)为(d)和(e)照片的叠加。

具体实施方式

实施例1

通式中所示的单硫代方酸染料通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）的制备

在100 mL三口瓶中加入1,3-二-[4-(N,N-二正丁氨基)-2-羟苯基]-2,4-环丁烯二酮(166 mg, 0.32 mmol)，劳森试剂 (233 mg, 0.58 mmol)，以及35 mL无水甲苯，氮气保护下加热回流4 h。减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析提纯，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯 (20:1, v/v)，得绿色固体约37 mg，产率约22%，熔点186-188°C。FTIR (KBr): ν_max 2955, 1682, 1614, 1397, 1345, 1285, 1216, 1186, 1109, 910, 889, 802, 773, 718 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 0.97 (t, J = 7.3 Hz, 12H), 1.37 (dq, J = 14.7, 7.4 Hz, 8H), 1.70-1.58 (m, 8H), 3.44-3.32 (m, 8H), 6.10 (dd, J = 4.1, 2.4 Hz, 2H), 6.41-6.28 (m, 2H), 8.17 (d, J = 9.3 Hz, 0.6H), 8.94 (d, J = 9.4 Hz, 0.6H), 9.22 (d, J = 9.3 Hz, 0.8H), 11.07 (s, 0.8H), 11.68 (s, 0.6H), 11.76 (s, 0.6H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 13.85, 20.23, 29.86, 51.35, 51.43, 98.39, 98.47, 107.38, 107.43, 107.56, 110.07, 110.54, 110.70, 131.42, 132.32, 134.33, 156.63, 156.81, 156.86, 163.83, 164.24, 164.48, 174.86, 177.18, 177.22, 179.46, 185.04, 185.49, 197.03, 201.98; ESI-MS: m/z 537.2 ([M+H]⁺).

实施例2

通式中所示的单硫代方酸染料通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=1）的制备

在50 mL三口瓶中加入1,3-二-[4-(N,N-二乙氨基)-2-羟苯基]-2,4-环丁烯二酮(82 mg, 0.20 mmol)，劳森试剂(162 mg, 0.40 mmol)，以及30 mL无水甲苯，在N₂保护下加热回流1.5 h。TLC跟踪反应原料点消失，减压蒸馏除去溶剂，然后用石油醚洗涤残留物，除去可溶性杂质，硅胶柱层析提纯，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯(10:1, v/v)，得绿色固体约56 mg，产率约66%，熔点260-262 °C。FTIR (KBr): νmax 2955, 2931, 1679, 1601, 1387, 1333, 1293, 1272, 1238, 1210, 1181, 1142, 1074, 1009, 959, 857, 805, 779, 713 cm^-1；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.28 (t, J = 7.1 Hz, 12H) , 3.51 (q, J = 7.1 Hz, 8H), 6.16 (s, 2H), 6.46-6.34 (m, 2H), 8.22 (d, J = 11.5 Hz, 0.6H), 8.99 (d, J = 7.3 Hz, 0.6H), 9.26 (d, J = 8.6 Hz, 0.7H), 11.12 (s, 0.7H), 11.72 (s, 0.5H), 11.79 (s, 0.6H); ESI-MS: m/z 537.2 ([M+H]⁺)；ESI-MS: m/z 425.2 ([M+H]⁺).

实施例3

方酸染料在近红外具有强吸收和高效的荧光发射，使其具有广泛的应用，作为优越的方酸染料探针通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）基于化学反应对于汞离子的特异性识别使得其成为良好的汞离子探针。图1和图2分别给出了方酸染料探针通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）pH为7.2的乙醇/ HEPES (70:30, v/v)缓冲体系中对于不同金属离子的响应效果，汞离子的存在会引起明显的吸收光谱和荧光光谱位移，荧光增强，实现对于汞离子的检测。在对于汞离子的定性检测的基础上，实现了对于汞离子的定量测试。实验给出了汞滴定的荧光变化曲线图3，由滴定曲线可以看出，在0-6当量范围内对于汞离子的检测具有良好的线性，光谱实验数据证明染料探针通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=3）可以作为检测汞离子理想的荧光探针。

实施例4

有机染料自身在纯水体系中溶解性问题使得其在实际应用中受限，因此提高有机小分子荧光探针在纯水体系中的溶解性对于该类染料在实际样品中的应用具有重要的意义，通过分子组装是提高弱水溶性物质溶解性的有效途径之一。常用的方案有引入表面活性剂进行增溶或者将有机染料包合在分子容器中。本文通过使用β-环糊精作为分子容器解决了方酸染料探针通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃, n=1）在纯水体系中的溶解性问题，图8给出了环糊精存在下染料单体荧光的出现，且随环糊精浓度的增大荧光增强，为后期实际样的检测开辟了有效的途径。

应用例1

取闽江水作为实际样，分成三份，每份分别加入不同浓度的汞离子。每份再分成五个样品，根据工作曲线，分别测得汞离子浓度结果，取它们的平均值。如表1所示，每份汞离子的回收率都接近100%。可见，通式所示的单硫代方酸染料（R = -(CH₂)_n-CH₃, n=3）作为荧光化学传感器，不仅可以定性识别Hg²⁺，而且可以定量测定水溶液中的Hg²⁺浓度，这使其具有非常广阔的应用前景。

表1 通式所示的单硫代方酸染料（R = -(CH₂)_n-CH₃, n=3）对闽江水样的加标回收试验结果

应用例2

实施例4利用环糊精解决了方酸染料在纯水体系中的溶解性问题，而且环糊精作为常用的药物添加剂，具有良好的生物相容性，可以有效地提高细胞对染料的吸收，因此，使用环糊精包合的方酸染料探针通式（其中R=-(CH₂)_n-CH₃,n=1）可用于细胞成像检测汞离子。其中：(a) Hale细胞用荧光探针在37℃孵育0.5 h的明场图像；(b) Hale细胞用荧光探针在37℃孵育0.5 h的荧光图像；(c)为(a)和(b)照片的叠加；(d) Hale细胞用荧光探针在37℃孵育0.5 h用PBS洗涤三次后在含汞的PBS体系中继续孵育0.5 h的明场图像；(e) Hale细胞用荧光探针在37℃孵育0.5 h用PBS洗涤三次后在含汞的PBS体系中继续孵育0.5 h的荧光图像；(f)为(d)和(e)照片的叠加。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.单硫代方酸染料荧光探针的应用，其特征在于：基于氢键辅助脱硫反应将单硫代方酸染料荧光探针用于环境样品及细胞中的汞离子快速定量检测；

所述的单硫代方酸染料荧光探针具有如下所示的结构通式：

，R = -(CH₂)_n-CH₃, n = 0~5。