CN103923481B

CN103923481B - 一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料及其制备和应用

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Publication number: CN103923481B
Application number: CN201410146910.0A
Authority: CN
Inventors: 傅南雁; 王桂美
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-04-14
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2034-04-14
Also published as: CN103923481A

Abstract

本发明公开了一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料及其制备和应用，其制备方法包括以下步骤：（1）将金刚烷修饰的苯胺衍生物和方酸混合，溶于适当的溶剂，接上分水器，N₂保护下回流数小时；（2）将步骤（1）所得的反应混合物冷却至室温，减压除去溶剂，得粗产品；（3）粗产品经石油醚洗涤多次，后经硅胶柱层析纯化，得金刚烷修饰的近红外方酸染料产物。该类方酸染料稳定性好，光学性能优异，经环糊精包合后能够有效地提高染料在水溶液中的溶解性，可作为荧光和比色双响应的pH探针，其中2-金刚烷基修饰的近红外方酸染料被成功地应用于活细胞的胞内成像以检测胞内pH值。

Description

一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料及其制备和应用

技术领域

本发明属于有机化学领域，具体涉及一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料及其制备方法和应用。

背景技术

近红外荧光染料的发射波长在650-900 nm之间，在该范围内生物分子自身荧光较弱，可避免生物背景干扰而获得较高的分析灵敏度（施锋; 李宏洋; 彭孝军. 生物分析用近红外荧光染料研究进展. 精细化工 2003, 20, 268-272.），并且波长>650 nm的红光可以穿透动物皮肤和组织，因此近红外染料作为荧光探针在生物分析和细胞成像中的应用引起了广泛关注。方酸染料是由方酸与富电子芳基化合物或苯胺衍生物缩合生成的1,3-二取代衍生物。该类化合物的显著特征是在可见光至近红外光区有窄而强的吸收带和较高的量子产率。这种光电特性主要来源于分子内强烈的供体-受体-供体（donor-acceptor-donor）间的电荷迁移作用。近年来，方酸染料以其优异的光学性能、良好的光稳定性备受关注，成为功能染料研究的热点之一。但像大多数近红外染料一样，它们有一个低的HOMO-LUMO能带，因此中心四元环的1,3-位容易受亲核试剂进攻而褪色；另外，方酸染料的平面结构使其在极性溶剂中容易聚集，从而引起吸收带展宽和荧光淬灭。这两个特征限制了它在生物领域的一些应用。有一种方法可以同时解决这些问题，就是将方酸染料包合在有保护作用的分子容器内，如大环化合物。Smith等在这方面做了较系统的研究，并对其合成、结构、性质以及应用做了综述（Arunkumar, E.; Forbes, C. C.; Smith, B. D. Improving the Properties of Organic Dyes by Molecular Encapsulation. Eur. J. Org. Chem. 2005, 4051-4059.）。Smith等合成的方酸染料－轮烷化合物，大环的两个亚二甲苯基几乎平行地落在亲电的中心四元环的两面，阻断了亲核试剂的进攻；含吡啶基的大环由于吡啶的氮原子可以与酰胺基上的氢形成分子内的氢键，其结构更加刚性、紧凑，可以提供更多的空间保护，从而导致更高的化学稳定性（Collins, C. G.; Peck, E. M.; Kramer, P. J.; Smith, B. D. Squaraine Rotaxane Shuttle as a Ratiometric Deep-Red Optical Chloride Sensor. Chem. Sci. 2013, 4, 257-2563; Gassensmith, J. J.; Baumes, J. M.; Smith, B. D. Discovery and Early Development of Squaraine Rotaxanes. Chem. Commun. 2009, 6329-6338.）。另外，由于大环的立体效应，使方酸染料彼此不易靠近，降低了分子间的电荷转移作用，因此在容易聚集的溶剂中，方酸染料仍显示相对窄的吸收峰（Arunkumar, E.; Forbes, C. C.; Noll, B. C.; Smith, B. D. Squaraine-Derived Rotaxanes: Sterically Protected Fluorescent Near-IR Dyes. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3288-3289.）。

金刚烷具有高度对称的刚性结构，以及亲脂的性质，因此金刚烷基的引入给方酸染料带来一些独特的性质。由于金刚烷骨架的直径大约为0.7 nm，与β-环糊精的空腔尺寸（0.7~0.8 nm）匹配，因此金刚烷衍生物能与β-环糊精形成较稳定的包合物，不仅改善了它们在水中的溶解性，而且β-环糊精的立体保护作用抑制了方酸染料分子在纯水溶剂中的聚集，使得荧光得以保持。

胞内pH值对细胞内的酶活性、离子运输、耐药性、细胞生长和凋亡等方面有着很多重要的影响。pH值异常通常与不正常的生理过程和疾病包括癌症及阿尔茨海默氏症等有关（Kim, H. J.; Heo, C. H.; Kim, H. M. Benzimidazole-Based Ratiometric Two-Photon Fluorescent Probes for Acidic pH in Live Cells and Tissues. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 17969-17977; Long, L.; Li, X.; Zhang, D.; Meng, S.; Zhang, J.; Sun, X.; Zhang, C.; Zhou, L.; Wang, L. Amino-Coumarin Based Fluorescence Ratiometric Sensors for Acidic pH and their Application for Living Cells Imaging. RSC Adv. 2013, 3, 12204-12209.）。因此监控活细胞内pH值的变化对于研究细胞内的生理过程具有重要意义。本发明涉及了一系列以金刚烷修饰的方酸染料的制备，其合成方法简单，反应条件容易控制，通过层析可获得高纯度的产物。该类方酸染料荧光探针稳定性好，光学性能优异，与β-环糊精包合后能够有效地提高染料在水溶液中的溶解性，可作为荧光和比色双响应的pH探针，其中2-金刚烷基修饰的近红外方酸染料可成功地应用于活细胞的胞内成像以检测胞内pH值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料及其制备和应用，该类方酸染料稳定性好，光学性能优异，经金刚烷基修饰的方酸染料能与β-环糊精形成较稳定的包合物，能够有效地提高染料在水溶液中的溶解性，可作为荧光和比色双响应的pH探针，其中2-金刚烷基修饰的近红外方酸染料被成功地应用于活细胞的胞内成像以检测胞内pH值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料具有如下所示的结构通式：

1-金刚烷基修饰的近红外方酸染料：

、n = 0或 1；

2-金刚烷基修饰的近红外方酸染料：

。

通过向苯胺侧链的氮接入金刚烷基，可以调节染料的溶解性能和聚集行为，从而影响染料的光物理性质。通过金刚烷衍生物与β-环糊精形成较稳定的包合物，可以改善它们在水中的溶解性，而且β-环糊精的立体保护作用抑制了方酸染料分子在纯水体系中的聚集，使得荧光得以保持，并用于pH探针的设计。

金刚烷基修饰的近红外方酸染料具有如下特征：染料的最大吸收位于620-645 nm，具有很高的摩尔吸光系数和荧光量子产率。在甲酸溶液中，由于方酸染料中心四元环上的氧原子及两端苯胺上的氮原子同时被质子化，体现在吸收光谱上，在400-600 nm间形成了一个“山”字形的宽峰；而由于乙酸的酸性较弱，其吸收峰仍然保持在620-645 nm波段内。值得一提的是，在乙醇/水混合体系中，2-金刚烷基修饰的方酸染料较1-金刚烷基修饰的方酸染料具有更高的溶解性和更好的分散性，在水含量80%以下的乙醇/水混合溶液中没有明显的聚集体生成。

所述的1-金刚烷基修饰的近红外方酸染料的制备方法，包括以下步骤：

（1）将1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物、n = 0或1，和方酸混合，溶于溶剂，接上分水器，N₂保护下回流；

（2）将步骤（1）所得的反应混合物冷却至室温，减压除去溶剂，得粗产品；

（3）粗产品经硅胶柱层析纯化，得金刚烷修饰的近红外方酸染料。

步骤（1）中：n = 0时，溶剂为甲苯和正丁醇，N₂保护，回流时间为12小时；n = 1时溶剂为原甲酸三乙酯和异丙醇，N₂保护，回流时间为17小时；步骤（3）中：硅胶柱层析所用的洗脱剂成分为：n = 0时，先用氯仿和甲醇，体积比为50:1进行粗分，再用氯仿和乙酸乙酯，体积比为10:1进行分离，产品除去溶剂后再用石油醚/二氯甲烷混合溶剂重结晶；n = 1时先用石油醚和乙酸乙酯，体积比4:1~1:1进行梯度淋洗，然后再用氯仿和乙酸乙酯，体积比为10:1洗脱剂分离，产品除去溶剂后再用石油醚/二氯甲烷混合溶剂重结晶。

所述的1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物，n = 0或1的合成方法包括如下步骤：

（1）将，n = 0或1，NaBH₄和干燥的THF混合，冷却至0℃。然后在N₂保护下，滴加溶有I₂的THF溶液。滴完升至70℃，继续反应36小时，反应完毕冷却至室温，加入少量水淬灭反应；

（2）减压除去溶剂，加入乙醚，水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，减压脱除溶剂，得粗产物；

（3）将粗产物经硅胶柱纯化，得1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物，n = 0或1；

所述的1-金刚烷基修饰的酰胺衍生物、n = 0或1的合成方法包括如下步骤：

（1）将1-金刚烷基修饰的羧酸、n = 0或1和二氯亚砜混合，回流1~3小时，反应停止后，冷却，减压除去过量的二氯亚砜；

（2）加入干燥的甲苯，于室温下滴加N-甲基苯胺的甲苯溶液，滴加完毕继续搅拌1~3小时；

（3）减压除去溶剂后得粗产物；

（4）将粗产物经硅胶柱纯化，得、n = 0或1。

所述的2-金刚烷基修饰的近红外方酸染料的制备方法，包括以下步骤：

（1）将2-金刚烷基修饰的苯胺衍生物和方酸混合，溶于溶剂，接上分水器，N₂保护下回流；

步骤（1）中溶剂为甲苯和正丁醇，N₂气氛保护，反应温度120^oC，回流时间为24小时；步骤（3）中硅胶柱层析分离所用的洗脱剂为：先用石油醚和乙酸乙酯，体积比为4:1进行粗分，再用氯仿和甲醇，体积比为100:1~30:1，进行梯度淋洗。

所述的2-金刚烷基修饰的苯胺衍生物的合成方法包括以下步骤：

（1）在研钵中加入2-金刚烷酮和苯胺研磨，然后加入NaBH₄和硼酸继续研磨至反应结束；

（2）反应结束后，加水，用二氯甲烷萃取，有机相用无水Na₂SO₄干燥，旋蒸除掉溶剂得粗产物；

（3）将粗产物经硅胶柱纯化，得。

所述的金刚烷基修饰的近红外方酸染料，通过与β-环糊精生成水溶性包合物，用于荧光和比色双响应pH探针，其中2-金刚烷基修饰的方酸染料与β-环糊精的包合物被应用于细胞成像实验以检测胞内pH值。

本发明的显著优点在于：该类方酸染料荧光探针稳定性好，光学性能优异，与β-环糊精包合后能够有效地提高染料在水溶液中的溶解性，有效阻止聚集体的生成，可作为荧光和比色双响应的pH探针，其中2-金刚烷基修饰的方酸染料与β-环糊精的包合物被成功地应用于活细胞的胞内成像以检测胞内pH值。

附图说明

图1是浓度为2 μM的1-金刚烷基修饰的方酸染料（n = 0）在不同浓度β-环糊精的水溶液中的吸收光谱变化图；

图2是浓度为2 μM的1-金刚烷基修饰的方酸染料（n = 1）在不同浓度β-环糊精的水溶液中的吸收光谱变化图；

图3是浓度为2 μM 的2-金刚烷基修饰的方酸染料在不同浓度β-环糊精的水溶液中的吸收光谱变化图；

图4是浓度为1 μM的1-金刚烷基修饰的方酸染料（n = 0）在不同浓度β-环糊精的水溶液中的荧光光谱变化图；

图5是浓度为2 μM的1-金刚烷基修饰的方酸染料（n = 1）在不同浓度β-环糊精的水溶液中的荧光光谱变化图；

图6是浓度为4 μM的2-金刚烷基修饰的方酸染料在不同浓度β-环糊精的水溶液中的荧光光谱变化图；

图7是2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在不同pH值的荧光光谱变化图；

图8是2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在643 nm处的荧光强度随pH值变化趋势图；

图9是2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在不同pH值的吸收光谱变化图；

图10是2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在628 nm处的吸收强度随pH值变化趋势图；

图11是2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在活HeLa细胞中的荧光成像图；（a）为经含有2-金刚烷基修饰的方酸染料与β-环糊精包合物的pH4.5的PBS缓冲液孵育的HeLa细胞的明场照片；（b）为（a）的荧光照片；（c）为（a）与（b）的叠加照片；（d）为经含有2-金刚烷基修饰的方酸染料与β-环糊精包合物的细胞培养液孵育的HeLa细胞的明场照片；（e）为（d）的荧光照片；（f）为（d）与（e）的叠加照片；（g）为经含有2-金刚烷基修饰的方酸染料与β-环糊精包合物的pH8.0的PBS缓冲液孵育的HeLa细胞的明场照片；（h）为（g）的荧光照片；（i）为（g）与（h）的叠加照片。

具体实施方式

实施例1

1-金刚烷基修饰的酰胺衍生物、n = 0的制备：

在50 mL的圆底烧瓶中，加入1-金刚烷甲酸（1.00 g，5.55 mmol），二氯亚砜5 mL，于85^°C回流1 h。反应完冷却至室温，减压蒸馏除过量的二氯亚砜。在上述反应瓶中加入干燥的甲苯5 mL，于室温下滴加N-甲基苯胺（1.00 mL，9.23 mmol）的甲苯溶液10 mL，2 h左右滴加完毕，滴完继续搅拌1 h。反应停止后，水洗数次，干燥后减压除去溶剂，然后硅胶柱层析分离，展开剂为石油醚:乙酸乙酯（v/v）=50:1，得白色固体1.20 g，产率80%。熔点: 104-105℃; IR (KBr): 3059 (Ar-H), 2901, 2850 (C-H), 1628 (C=O) cm^-1; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 1.52 (m, 6H), 1.74 (d, J = 2.6 Hz, 6H), 1.83 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 7.20 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30-7.40 (m, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): δ 28.2, 28.4, 36.2, 36.3, 36.5, 40.1, 43.7, 128.5, 129.1, 129.3, 145.2, 177.9。

实施例2

1-金刚烷基修饰的酰胺衍生物、n = 1的制备：

在50 mL的反应瓶中，加入1-金刚烷乙酸（1.00 g，5.15 mmol），二氯亚砜5 mL，回流3 h。反应停止后，冷却，减压除去过量的二氯亚砜，得到的产物直接用于下一步反应。在上述反应瓶中加入干燥的甲苯10 mL，于室温下滴加N-甲基苯胺（1.50 mL，13.8 mmol）的甲苯溶液10 mL，2 h左右滴加完毕，滴完继续搅拌3 h。减压除去溶剂后，硅胶柱层析分离，梯度淋洗，先用石油醚:乙酸乙酯（v/v）=100:1淋洗，除去过量的N-甲基苯胺，然后用石油醚:乙酸乙酯（v/v）=30:1作展开剂洗脱，得白色固体1.43 g，产率98%。熔点: 90-91℃; IR (KBr): 2910, 2889, 2846, 1649, 1595, 1496, 1410, 1383, 1358, 1277, 1117, 775, 700 cm^-1, ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.55-1.66 (m, 15H), 1.92 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 3.25 (s, 3H), 7.15 (d, J = 7.6Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.6 Hz, 2H)。

实施例3

1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物、n = 0的制备：

在50 mL的三口瓶中加入1-金刚烷基修饰的酰胺衍生物，n = 0（0.54 g，2.00 mmol），NaBH₄（0.18 g, 4.76 mmol）和10 mL干燥的THF，冷至0^°C。然后在N₂保护下，滴加20 mL溶有I₂（1.00 g，3.94 mmol）的THF溶液，2.5 h内滴完。滴完升至70^°C，继续反应36 h。反应完毕冷至室温，加入少量水淬灭反应。减压除去大部分溶剂后，加入30 mL乙醚，水洗，无水MgSO₄干燥。减压除去溶剂后，硅胶柱层析分离，以石油醚作淋洗剂，得无色黏稠液体80 mg，产率为16%。IR (KBr): 2895, 2883, 2844, 2817, 1610, 1597, 1506, 1448, 1360, 1236, 1182, 743, 689 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.53-1.71 (m, 12H), 1.97 (s, 3H), 2.96 (s, 3H), 3.01 (s, 2H), 6.65 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.20 (dd, J ₁= 7.2 Hz, J ₂= 7.6 Hz, 2H)。

实施例4

1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物、n = 1的制备：

在反应瓶中加入1-金刚烷基修饰的酰胺衍生物，n = 1（0.57 g, 2.01 mmol），NaBH₄（0.20 g, 5.29 mmol）和15 mL干燥的THF，冷至0°C。然后在N₂保护下，滴加10 mL溶有I₂（0.75 g, 2.95 mmol）的THF溶液，2.5 h内滴完。滴完升至70^°C，继续反应36 h。反应完毕冷至室温，加入少量水淬灭反应。减压除去大部分溶剂后，加入30 mL乙醚，水洗，无水MgSO₄干燥。减压除去溶剂后，硅胶柱层析提纯，以石油醚:乙酸乙酯（v/v）=100:1作淋洗剂，得无色黏稠液体187 mg，产率35%。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.29-1.33 (m, 2H), 1.55 (d, J = 2.4 Hz, 6H), 1.68 (dd, J ₁ = 11.8 Hz, J ₂ = 31.0 Hz, 6H), 1.96 (s, 3H), 2.86 (s, 3H), 3.31-3.35 (m, 2H), 6.63-6.67 (m, 3H), 7.18-7.22 (m, 2H); ESI-MS: m/z 270.7 ([M+H]⁺)。

实施例5

2-金刚烷基修饰的苯胺衍生物的制备：

在研钵中加入2-金刚烷酮（1.50 g, 10.0 mmol），苯胺（0.91 mL, 0.93 g, 10.0 mmol），研磨10 min，然后加入NaBH₄（0.38 g, 10.0 mmol），硼酸 (0.62 g, 10.0 mmol)，继续研磨20 min，并用TLC检测直至原料点消失。反应结束后，加水30 mL，用二氯甲烷萃取，无水Na₂SO₄干燥，旋蒸除掉溶剂。粗产品以石油醚:乙酸乙酯（v/v）= 30:1做淋洗剂，柱层析得N-(2-金刚烷基)苯胺无色固体1.41 g，产率62%。熔点: 57-58 ^oC; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.61-2.05 (m, 14H), 3.57 (s, 1H), 6.62-6.70 (m, 3H), 7.16-7.20 (m, 2H)。

实施例6

1-金刚烷基修饰的方酸染料、n = 0的制备：

在50 mL的反应瓶中加入方酸（11.4 mg，0.10 mmol），1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物，n = 0（51.1 mg，0.20 mmol），甲苯10 mL，正丁醇10 mL，接上分水器，N₂保护下回流12 h。反应结束后，冷至室温，减压除去大部分溶剂，硅胶柱二次层析分离，先用氯仿:甲醇（v/v）=50:1粗分，再以氯仿:乙酸乙酯（v/v）=10:1为淋洗剂分离，得蓝色固体33 mg，产率56%。IR (KBr): 2902, 2846, 1614, 1589, 1387, 1182 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.60-1.73 (m, 24H), 2.00 (s, 6H), 3.20 (s, 6H), 3.27 (s, 4H), 6.86 (d, J = 9.2 Hz, 4H), 8.39 (d, J = 9.2 Hz, 4H); ESI-MS: m/z589.4 ([M+H]⁺); HRMS(ESI): Calcd for C₄₀H₄₉N₂O₂([M+H]⁺): 589.3788, Found: 589.3775。

实施例7

1-金刚烷基修饰的方酸染料、n = 1的制备：

在50 mL的反应瓶中，加入方酸（15.4 mg, 0.135 mmol），1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物，n = 1（72.6 mg, 0.269 mmol），原甲酸三乙酯2 mL，异丙醇10 mL，N₂保护下回流17 h。反应完毕，冷却，减压除去溶剂后硅胶柱层析提纯。先用石油醚:乙酸乙酯（v/v）= 4:1~1:1梯度淋洗，除去低极性的杂质，然后再用氯仿:乙酸乙酯（v/v）=10:1为淋洗剂，收集蓝色带，产品除去溶剂后再用石油醚/二氯甲烷混合溶剂重结晶，得蓝色固体37 mg，产率44%。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 1.40-1.44 (m, 4H), 1.57-1.79 (m, 24H), 2.03 (d, J = 1.2 Hz, 6H), 3.14 (s, 6H), 3.51-3.55 (m, 4H), 6.75 (d, J = 9.2 Hz, 4H), 8.40 (d, J = 9.2 Hz, 4H); ESI-MS: m/z617.4 ([M+H]⁺); HRMS(ESI): Calcd for C₄₂H₅₃N₂O₂([M+H]⁺): 617.4101, Found: 617.4090。

实施例8

2-金刚烷基修饰的方酸染料的制备：

在装有分水器的50 mL圆底烧瓶中，加入N-金刚烷基苯胺（114 mg, 0.50 mmol），方酸（29 mg, 0.25 mmol），甲苯/正丁醇 (1:1，v/v) 20 mL，氮气保护下，升温至120^oC，回流24 h，TLC跟踪监测直至原料消失。反应结束，减压蒸除溶剂，先以石油醚:乙酸乙酯（v/v）= 4:1作淋洗剂，除去低极性杂质，再以氯仿:甲醇（v/v）=100:1~30:1进行梯度淋洗，柱层析分离得蓝色晶体47 mg，产率35%。熔点: >300 ^oC; IR (KBr): 3310, 2907, 1610, 1583, 1539, 1489, 1469, 1364, 1353, 1333, 1311, 1160, 1131, 1105, 1058, 848 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃:CD₃OD (v/v) = 4:1): δ 1.67-2.09 (m, 28H), 2.66 (s, 2H) 3.87 (s, 2H), 7.46 (d, J = 6.4 Hz, 4H), 8.23 (d, J = 8.8 Hz, 4H); ESI-MS: m/z 531.9 ([M-H]^-); HRMS(ESI): Calcd for C₃₆H₄₁N₂O₂([M+H]⁺): 533.3168, Found: 533.3173。

通过向苯胺侧链的氮接入金刚烷基，可以调节染料的溶解性能和聚集行为，从而影响染料的光物理性质。通过金刚烷衍生物能与β-环糊精形成较稳定的包合物，可以改善它们在水中的溶解性，而且β-环糊精的立体保护作用抑制了方酸染料分子在纯水中的聚集，使得荧光得以保持。从2-金刚烷基修饰的方酸染料与β-环糊精包合物的ESI质谱数据可看出， m/z 2824.0的峰对应了方酸染料与β-环糊精形成的1:2包合物的准分子离子峰[β-CD+SQ+β-CD+Na]⁺（C₁₂₀H₁₈₀N₂NaO₇₂，计算值2824.04）。

图1-3分别描述了通式中所示的金刚烷修饰的方酸染料在不同浓度的β-环糊精水溶液中的吸收光谱。从谱图可以发现1-金刚烷基修饰的方酸染料（n = 0, 1）在水溶液中的吸收曲线的基线都有提高，产生此现象的原因是染料具有较差的溶解性，使得其水溶液的透光度整体降低导致吸收曲线的基线整体升高。而2-金刚烷基修饰的方酸染料在500-700 nm范围内出现相对强度较低的宽峰，说明其水溶性与另外两种相比相对较好，但在水溶液中是以聚集体形式存在的。通过加入不同浓度的β-环糊精可以使金刚烷修饰的方酸染料的紫外吸收明显增强，1-金刚烷基修饰的方酸染料，n = 0, 1的最大吸收峰在650 nm，2-金刚烷基修饰的方酸染料的最大吸收峰在628 nm。由此可以判断β-环糊精的存在能够有效地提高金刚烷修饰的方酸染料在水溶液中的溶解性。

图4-6是通式中所示的金刚烷修饰的方酸染料在不同浓度β-环糊精的水溶液中荧光光谱变化图，可以发现三种方酸染料在不含β-环糊精的水溶液中几乎全部处于荧光淬灭状态，随着水溶液中β-环糊精的浓度的增加荧光强度不断增强，这进一步证明β-环糊精的存在可以有效地将三种弱水溶性的方酸染料引入到水溶液中，并解聚集以单体形式存在。

图7是通式中所示的2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在不同pH值的荧光光谱变化图，图8是通式中所示的2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在643 nm处的荧光强度随pH值变化趋势图。由谱图发现β-环糊精包合的2-金刚烷基修饰的方酸染料在pH小于5.0范围内荧光强度保持最大，最大发射峰位于643 nm，而在pH大于8.0的范围内荧光强度最小，最大发射峰位于637 nm处，在pH为5.0-8.0范围内其荧光强度随pH增大而逐渐减小。图9是通式中所示的2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在不同pH值的吸收光谱变化图，图10是通式中所示的2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在628 nm处的吸收强度随pH值变化趋势图。通过研究pH对β-环糊精包合2-金刚烷基修饰的方酸染料的光谱性质影响，发现该体系能够用作pH比色荧光双响应探针。

图11是通式中所示的2-金刚烷基修饰的方酸染料经β-环糊精包合后在活HeLa细胞中的荧光成像图。使用β-环糊精包合的2-金刚烷基修饰的方酸染料对HeLa细胞进行荧光标记，并且将染色后的细胞在不同pH条件下进行培养。通过荧光成像实验观察发现上述细胞在酸性培养液中具有强的荧光，而在中性和碱性条件下几乎没有荧光发射。说明该体系适合于生物样品中pH的在线检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料，其特征在于：所述的近红外方酸染料为：

，n = 0或1。

2.一种金刚烷基修饰的近红外方酸染料，其特征在于：所述的近红外方酸染料为：

。

3.一种制备如权利要求1所述的金刚烷基修饰的近红外方酸染料的方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中：n = 0时，溶剂为甲苯和正丁醇，N₂保护，回流时间为12小时；n = 1时溶剂为原甲酸三乙酯和异丙醇，N₂保护，回流时间为17小时；步骤（3）中：硅胶柱层析所用的洗脱剂成分为：n = 0时，先用氯仿和甲醇，体积比为50:1进行粗分，再用氯仿和乙酸乙酯，体积比为10:1进行分离，产品除去溶剂后再用石油醚/二氯甲烷混合溶剂重结晶；n = 1时先用石油醚和乙酸乙酯，体积比4:1~1:1进行梯度淋洗，然后再用氯仿和乙酸乙酯，体积比为10:1洗脱剂分离，产品除去溶剂后再用石油醚/二氯甲烷混合溶剂重结晶。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的1-金刚烷基修饰的苯胺衍生物，n = 0或1的合成方法包括如下步骤：

（1）将，n = 0或1，NaBH₄和干燥的THF混合，冷却至0℃；然后在N₂保护下，滴加溶有I₂的THF溶液，滴完升至70℃，继续反应36小时，反应完毕冷却至室温，加入少量水淬灭反应；

（3）减压除去溶剂后得粗产物；

（4）将粗产物经硅胶柱纯化，得、n = 0或1。

6.一种制备如权利要求2所述的金刚烷基修饰的近红外方酸染料的方法，其特征在于：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1）中溶剂为甲苯和正丁醇，N₂气氛保护，反应温度120℃，回流时间为24小时；步骤（3）中硅胶柱层析分离所用的洗脱剂为：先用石油醚和乙酸乙酯，体积比为4:1进行粗分，再用氯仿和甲醇，体积比为100:1~30:1，进行梯度淋洗。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的2-金刚烷基修饰的苯胺衍生物的合成方法包括以下步骤：

（3）将粗产物经硅胶柱纯化，得。

9.一种如权利要求1所述的金刚烷基修饰的近红外方酸染料的应用，其特征在于：在制备荧光和比色双响应的pH探针上的应用。

10.一种如权利要求2所述的金刚烷基修饰的近红外方酸染料的应用，其特征在于：在制备荧光和比色双响应的pH探针上的应用，所述的pH探针应用于活细胞的胞内成像以检测胞内pH值。