CN103330728A

CN103330728A - 一种雪莲黄酮胶囊的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103330728A
Application number: CN2013102992187A
Authority: CN
Inventors: 贾正平; 马慧萍; 樊鹏程; 景临林; 何晓英; 李琳; 高荣敏
Original assignee: 贾正平
Priority date: 2013-07-17
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2013-10-02

Abstract

本发明公开了一种利用从大苞雪莲中提取的总黄酮作为活性成分制备的胶囊剂在预防和治疗急性高原病中的应用，属于医药技术领域。本发明通过常压密闭缺氧、急性减压缺氧和低压氧舱模拟高原缺氧三种动物缺氧模型，考察了雪莲黄酮胶囊的抗高原缺氧作用。实验结果表明，雪莲黄酮胶囊可显著提高常压密闭缺氧和急性减压缺氧小鼠的存活时间，可明显缓解模拟急性高原缺氧环境下对小鼠心脑组织的损伤，具有良好的抗高原缺氧作用，其机理与调节能量代谢和提高抗氧化能力有关。

Description

一种雪莲黄酮胶囊的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药生产领域，具体涉及一种雪莲黄酮胶囊的制备方法及应用。

背景技术

包括急性高原病、高原脑水肿和高原肺水肿在内的急性高原反应严重影响着部队战斗力、高原旅游和地方经济建设，研制副作用小、疗效确切的新型抗高原缺氧药物具有极其重要的军事和社会意义。高原环境下的低压性缺氧可以刺激机体活性氧的生成增多，经由加重脂质过氧化反应，降低抗氧化酶系统的活性，从而对器官、组织、细胞和DNA造成氧化性损害。因此，减轻高原环境下的氧化性损伤，提高抗氧化系统的功能，改善机体的缺氧状态，预防严重高原并发症的发生，是高原疾病研究的重要方向和热点之一。黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物，广泛存在于自然界，绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，具有多种生物活性，且越来越多的研究表明植物体内的黄酮类物质在抗氧化方面具有显著优势。

文献报道雪莲的化学成分有黄酮类，生物碱类、倍半萜类及挥发油等，其中黄酮类化合物是雪莲的主要化学成分，具有显著的清除超氧阴离子自由基、清除羟基自由基、对抗NADH过氧化物酶氧化的生物活性，表现出较强的抗氧化、抗辐射、延缓衰老等作用，但有关从大苞雪莲中提取的总黄酮对预防和治疗急性高原病方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用从雪莲中提取的总黄酮作为活性成分制备的胶囊剂在预防和治疗急性高原病中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种雪莲黄酮胶囊的制备方法，包括以下步骤：

1）将雪莲原料药材粉碎至黄豆大小，得到药材粗粉；

2）将步骤1）得到的药材粗粉中，加入15倍药材粗粉重量的70%乙醇浸泡过夜，再回流提取2次，每次2小时，过滤后合并，得雪莲滤液；

3）将步骤2）得到的雪莲滤液浓缩约10～20倍，得到雪莲稠浸膏；

4）将步骤3）得到的雪莲稠浸膏按照重量百分比5-20%加入微粉硅胶，再以10-20目筛制成颗粒，得到雪莲黄酮颗粒；

5）将步骤4）得到的雪莲黄酮颗粒在温度50℃-80℃真空干燥6-8小时,用10-20目筛整粒后装入胶囊中，得到雪莲黄酮胶囊，每粒胶囊重量为0.5g，总黄酮含量为10%-20%。

本发明的第二个目的是还提供了一种雪莲黄酮胶囊的制备方法，包括以下步骤：

1）将雪莲原料药材粉碎至至黄豆大小，得到药材粗粉；

3）将步骤2）得到的雪莲滤液浓缩减压浓缩至无醇味,得到雪莲上柱溶液；

4）将步骤3）得到的雪莲上柱溶液上样于大孔吸附树脂柱进行吸附处理，上样速度为每分钟20-25滴，吸附12h后，先以蒸馏水冲洗大孔吸附树脂柱至无色，再用重量百分比为50%的乙醇溶液充分洗脱，收集得到雪莲乙醇洗脱液；

6）将步骤5）得到的雪莲乙醇洗脱液在温度50℃-80℃真空干燥,粉碎至约15目，再以10-20目筛整粒后，装入胶囊得到雪莲黄酮胶囊，每粒胶囊重量为0.5g，总黄酮含量为40%-50%。

本发明的第三个目的是提供了上述雪莲黄酮胶囊的制备方法制备的雪莲黄酮胶囊在预防和治疗急性高原病中的应用。

进一步的，上述的应用，所述雪莲为大苞雪莲、水母雪莲或苞叶雪莲。

进一步的，上述的应用，所述雪莲黄酮胶囊是以雪莲总黄酮为活性成分，复配以要用辅料制得的。

本发明的有益效果为：本发明提供的雪莲黄酮胶囊的制备方法和其应用，通过常压密闭缺氧、急性减压缺氧和低压氧舱模拟高原缺氧三种动物缺氧模型，考察了雪莲黄酮胶囊的抗高原缺氧作用，实验结果表明，雪莲黄酮胶囊可显著提高常压密闭缺氧和急性减压缺氧小鼠的存活时间，可明显缓解模拟急性高原缺氧环境下对小鼠心脑组织的损伤，具有良好的抗高原缺氧作用，其机理与调节能量代谢和提高抗氧化能力有关。

为了更好地理解本发明，以下通过常压密闭缺氧模型、急性减压缺氧模型和低压氧舱模拟高原缺氧实验，评价雪莲黄酮胶囊的抗高原缺氧方面的作用。

、小鼠常压密闭缺氧实验：

1.1 实验材料：

1.1.1 动物：

SPF级BALB/c小鼠80只，雄性，8周龄，体重18-22g，购自兰州生物制品有限公司实验动物中心，合格证号: 14-002，饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。

仪器与试药：

大苞雪莲原药材购自青海西宁三江宝商贸有限公司，并经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定；250 mL广口瓶（统一用注水法校准，容积为250 ± 2.5ml）；凡士林（包头黄河石化有限责任公司，批号 050521）；钠石灰（英国Molecular Products Limited公司产品）；BP210S电子天平（荷兰赛多利斯有限公司生产）；乙酰唑胺（武汉远城科技发展有限公司，100114）；雪莲黄酮胶囊Ⅰ(兰州军区兰州总医院生产，批号：20120401，总黄酮含量：13.43%)；雪莲黄酮胶囊Ⅱ(兰州军区兰州总医院生产，批号：20120403，总黄酮含量：42.36%)。

实验方法：

取SPF级健康BALB/c小鼠80只，雄性，适应饲养3日后随机分为8组，每组10只，单次灌服给药。缺氧模型组灌服等体积生理盐水，阳性药组灌服乙酰唑胺200 mg/kg，雪莲黄酮胶囊Ⅰ组分别灌服100、200、400 mg/kg，雪莲黄酮胶囊Ⅱ分别灌服50、100、200 mg/kg。给药后50min，将小鼠放入盛有250ml广口瓶内(瓶内放入5 g钠石灰用于吸收CO₂)，每瓶放1只小鼠，用凡士林涂抹瓶口，密封，使之不漏气，立时开始计时，待小鼠呼吸停止时记录小鼠窒息死亡的时间。以小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间为指标，比较各剂量组的抗缺氧活性。

实验结果：

与缺氧模型组相比，两种总黄酮含量不同的雪莲黄酮胶囊高、中、低三个不同剂量组均可显著延长常压密闭缺氧小鼠的存活时间（P﹤0.01），呈剂量依赖性，且与乙酰唑胺组的延长率12.80%相比具有显著性差异（P﹤0.01）。雪莲黄酮胶囊对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响（ ±SD，n=10）结果如表1所示。

Figure 2013102992187100002DEST_PATH_IMAGE002

。

小鼠常压密闭缺氧实验是在密闭缺氧条件下，从动物整体水平上考察药物能否延长小鼠的存活时间，可反映药物的抗缺氧活性。实验结果表明，灌服两种总黄酮含量不同的雪莲黄酮胶囊均能不同程度地延长常压密闭缺氧小鼠的存活时间，呈剂量依赖性，延长时间均明显长于乙酰唑胺，且总黄酮含量高者活性更好，说明雪莲黄酮胶囊具有良好的抗缺氧活性，所含总黄酮是其主要活性部位。

、小鼠急性减压缺氧实验：

2.1 实验材料：

2.1.1 动物：

SPF级健康BALB/c小鼠160只，雄性，8周龄，体重18-22g，购自兰州生物制品有限公司实验动物中心，合格证号：14-002，饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。

仪器与试药：

FLYDWC50-IIA型低压低氧动物实验舱（中航工业贵州雷航空军械有限责任公司）；乙酰唑胺（武汉远城科技发展有限公司，批号：20100114）；雪莲黄酮胶囊Ⅰ(兰州军区兰州总医院生产，批号：20120401，总黄酮含量：13.43%)；雪莲黄酮胶囊Ⅱ(兰州军区兰州总医院生产，批号：20120403，总黄酮含量：42.36%)。

实验方法：

取SPF级健康BALB/c小鼠160只，雄性，适应饲养3日后随机分为8组，每组20只，单次灌服给药。给药方法参照1.2。给药后50min，将小鼠放入低压低氧动物实验舱。减压时以20m/s的速度升至10000米海拔，维持缺氧60min，记录60min内各组小鼠的死亡数量。以小鼠在急性减压缺氧条件下的死亡率为指标，比较各剂量组的抗缺氧活性，并对实验结果进行卡方检验。

实验结果：

缺氧模型组小鼠全部死亡，雪莲黄酮抗胶囊高、中、低三个不同剂量组小鼠死亡率与缺氧模型组相比均显著下降(P＜0.01)，且呈剂量依赖性，其中雪莲高剂量组和中剂量组小鼠死亡率低于乙酰唑胺组。雪莲黄酮胶囊对急性减压缺氧小鼠存活时间的影响（

±SD，n=20）结果如表2所示。

。

急性减压缺氧实验是在模拟海拔10000m条件下，从整体水平上观察药物延长动物存活时间，评价药物对动物缺氧耐受力的提高程度的一种方法。实验结果表明，灌服两种总黄酮含量不同的雪莲黄酮胶囊能显著降低小鼠在海拔10000m急性缺氧条件下的死亡率，且总黄酮含量高者活性更好，进一步说明雪莲黄酮胶囊具有良好的抗缺氧活性，所含总黄酮是雪莲黄酮胶囊具有抗缺氧活性的主要有效部位。

、雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠相关生化指标的影响：

3.1 实验材料：

3.1.1 动物：

SPF级健康Balb/c小鼠100只，雄性，8周龄，体重18-22g，由兰州生物制品研究所实验动物中心提供，合格证号：14-002，饲养于兰州军区兰州总医院实验动物科。

仪器：

FLYDWC50-IIA型低压低氧动物实验舱（中航工业贵州雷航空军械有限责任公司）；IMS-20制冰机（常熟雪科电器有限公司）； HP8453二级管阵列紫外可见分光光度计 (美国惠普公司)；水浴锅（上海医疗器械七厂）；高速离心机（德国Appendorf公司）；L486型-80℃超低温冰箱（海尔BioChemical仪器有限公司）；Milli-Q去离子水制备仪（Millipore Ltd）；Delta 320电子pH计（Mettler Toledo Ltd）； Vortex5涡旋仪（海门市其林贝尔仪器）。

药品与试剂：

乙酰唑胺（武汉远城科技发展有限公司，批号：20100114）；雪莲黄酮胶囊Ⅰ(兰州军区兰州总医院生产，批号：20120401，总黄酮含量：13.43%)；雪莲黄酮胶囊Ⅱ(兰州军区兰州总医院生产，批号：20120403，总黄酮含量：42.36%)；乳酸（LD）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：20111109）；乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号： 20111116）；T-AOC测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20111122）；ATP酶活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20111122）；BCA法蛋白测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：20111122 ）。

实验方法：

取SPF级健康雄性BALB/c小鼠100只，饲养适应3日后随机分成正常对照组，缺氧模型组，阳性对照组（200mg/kg），雪莲黄酮胶囊Ⅰ组(400mg/kg)和雪莲黄酮胶囊Ⅱ组(200mg/kg)，每组10只。单次灌胃给药，正常对照组小鼠不缺氧，给药后50min将其余各组小鼠放入低压低氧动物实验舱模拟8000m海拔缺氧环境。减压时以10m/s的速度升至8000米海拔，维持缺氧9h，完成减压缺氧后于10min内快速放气使舱内气压与外界大气压相同。小鼠完成减压后立即脱臼处死，迅速取心脏和大脑，于液氮中超低温冷藏备用，用于测LD，LDH、MDA、T-AOC、K⁺Na⁺-ATPase和Ga²⁺Mg²⁺-ATPase。各指标测定方法均按照试剂盒说明书操作。

实验结果：

3.3.1 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠能量代谢的影响：

与正常对照组相比，缺氧模型组心肌和脑组织LD含量和LDH活力显著升高（P﹤0.01）；与缺氧模型组相比，预先用雪莲黄酮胶囊处理的小鼠心肌和脑组织LD含量显著降低（P﹤0.01），LDH活力虽有所升高，但无明显差异（P﹥0.05）。乙酰唑胺与雪莲黄酮胶囊的变化趋势类似。雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠能量代谢的影响（±SD，n=10）结果如表3所示。

Figure 2013102992187100002DEST_PATH_IMAGE001

。

与正常对照组相比，缺氧模型组心肌和脑组织Na⁺K⁺-ATPase、Ca²⁺Mg²⁺-ATPase活力明显下降（P<0.01）；与缺氧模型组比较，预先用雪莲黄酮胶囊给药处理的小鼠脑组织Na⁺K⁺-ATPase、Ca²⁺Mg²⁺-ATPase活力显著提高（P<0.01）。乙酰唑胺与雪莲黄酮胶囊的变化趋势类似。海拔8000米急性低压缺氧暴露不同时间对脑组织ATP酶的影响（

±SD，n=10）结果如表4所示。

。

雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠自由基代谢的影响：

与正常对照组相比，缺氧模型组心肌和脑组织MDA含量显著升高（P﹤0.01），T-AOC活力显著下降（P﹤0.01）。与缺氧模型组相比，预先用雪莲黄酮胶囊处理的小鼠心肌和脑组织MDA含量显著降低（P﹤0.01），T-AOC活力显著提高（P﹤0.01）。乙酰唑胺与雪莲黄酮胶囊的变化趋势类似。雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠脑组织自由基代谢的影响（

±SD，n=10）结果如表5所示。

Figure 2013102992187100002DEST_PATH_IMAGE006

。

实验结果表明，采用低压氧舱模拟海拔8000m高原缺氧环境，缺氧9h后，心肌和脑组织LD含量升高、LDH下降，K⁺Na⁺-ATPase、Ga²⁺Mg²⁺-ATPase活性明显下降，而雪莲黄酮胶囊可以逆转这些变化趋势，说明在一定程度上能缓解糖酵解产生大量LD所致的细胞损害，同时还可显著降低缺氧小鼠心肌和脑组织自由基水平，提高抗氧化相关酶的活力，从而对缺氧小鼠起到保护作用，具有良好的抗高原缺氧作用。

综上所述，雪莲黄酮胶囊具有良好的抗高原缺氧作用，其机理可能与其提高机体的抗氧化应激能力和能量代谢的正向调节有关。

具体实施方式

实施例1

将药材粉碎成粗粉，加15倍量70%乙醇浸泡过夜，回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液浓缩成浸膏，按10%加入微粉硅胶，用20～10目筛制成颗粒，50℃干燥，用10～20目筛整粒后，装胶囊，每粒约重0.5g。总黄酮含量10%～20%。

实施例2

将药材粉碎成粗粉，加15倍量70%乙醇浸泡过夜，回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，回收乙醇至无醇味，将浓缩液上样于 HPD400型大孔吸附树脂柱，以每分钟20～25滴的速度上样，吸附12h后，先以蒸馏水冲洗上述大孔树脂至无色，然后用50%乙醇洗脱充分，收集乙醇洗脱液，50℃干燥，粉碎，用10～20目筛整粒后，装胶囊，每粒约重0.5g。总黄酮含量40%～50%。

实施例3

将药材粉碎成粗粉，加15倍量70%乙醇浸泡过夜，回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，回收乙醇至无醇味，将浓缩液上样于 HPD500型大孔吸附树脂柱，以每分钟20～25滴的速度上样，吸附12h后，先以蒸馏水冲洗上述大孔树脂至无色，然后用50%乙醇洗脱充分，收集乙醇洗脱液，50℃干燥，粉碎，用10～20目筛整粒后，装胶囊，每粒约重0.5g。总黄酮含量40%～50%。

实施例4

将药材粉碎成粗粉，加15倍量70%乙醇浸泡过夜，回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，回收乙醇至无醇味，将浓缩液上样于HPD700型大孔吸附树脂柱，以每分钟20～25滴的速度上样，吸附12h后，先以蒸馏水冲洗上述大孔树脂至无色，然后用50%乙醇洗脱充分，收集乙醇洗脱液，50℃干燥，粉碎，用10～20目筛整粒后，装胶囊，每粒约重0.5g。总黄酮含量40%～50%。

实施例5

将药材粉碎成粗粉，加15倍量70%乙醇浸泡过夜，回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，回收乙醇至无醇味，将浓缩液上样于HPD722型大孔吸附树脂柱，以每分钟20～25滴的速度上样，吸附12h后，先以蒸馏水冲洗上述大孔树脂至无色，然后用50%乙醇洗脱充分，收集乙醇洗脱液，50℃干燥，粉碎，用10～20目筛整粒后，装胶囊，每粒约重0.5g。总黄酮含量40%～50%。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种雪莲黄酮胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将雪莲原料药材粉碎至黄豆大小，得到药材粗粉；

2）将步骤1）得到的药材粗粉中，加入15倍药材粗粉重量的70%乙醇浸泡1～24小时，再回流提取2次，每次2小时，过滤后合并，得雪莲滤液；

3）将步骤2）得到的雪莲滤液减压浓缩约10～20倍量，得到雪莲稠浸膏；

4）将步骤3）得到的雪莲稠浸膏按照重量百分比5-20%加入微粉硅胶，再以10～20目筛制成颗粒，得到雪莲黄酮颗粒；

5）将步骤4）得到的雪莲黄酮颗粒在温度50℃-80℃真空干燥6～8小时,用10～20目筛整粒后装入胶囊中，得到雪莲黄酮胶囊，每粒胶囊重量为0.5g，总黄酮含量为10%-20%。

2.一种雪莲黄酮胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将雪莲原料药材粉碎至黄豆大小，得到药材粗粉；

3）将步骤2）得到的雪莲滤液减压回收乙醇至无醇味,得到雪莲上柱溶液；

5）将步骤4）得到的雪莲乙醇洗脱液在温度50℃-80℃真空干燥,粉碎至约15目，再以10-20目筛整粒后，装入胶囊得到雪莲黄酮胶囊，每粒胶囊重量为0.5g，总黄酮含量为40%-50%。

3.根据权利要求1或2所述的雪莲黄酮胶囊的制备方法制备的雪莲黄酮胶囊在预防和治疗急性高原病中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述雪莲为大苞雪莲、水母雪莲或苞叶雪莲。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述雪莲黄酮胶囊是以雪莲总黄酮为活性成分，复配以要用辅料制得的。