CN103329994A - 一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于活性乳饮料制备的技术领域，具体为一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料生产方法。在几个不同的阶段加入亚硒酸钠，优化了酵母与硒的最佳结合条件，既利于提高结合硒量，又利于酵母的生长，使无机硒结合成有机态的硒，通过板框压滤或离心法分离出酵母，烘干灭活即得到富硒酵母粉；以此作为原料，通过两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、以及嗜热链球杆菌、蜡样芽袍杆菌等益生菌进行二次发酵，通过微生物酶的二次转化，酵母细胞中残留的无机硒基本被完全转化为硒蛋白和含硒蛋白。从而获得一种富含有机硒的益生菌功能性食品饮料。该产品能同时发挥益生菌及其酵母有机硒两者的综合保健作用。

Description

一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料的生产方法
技术领域
本发明属于活性乳饮料制备的技术领域，具体为一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料生产方法。
背景技术
硒是生物体所必需的微量元素，人体内无法合成，人体本身的硒总含量为6-20mg。硒遍布各组织器官和体液，肾中浓度最高。男性体内的硒多集中在睾丸及前列腺输精管中，会随精液一起排出体外。由于人体内不存在长期贮藏硒的器官，机体所需的硒应该不断从饮食中得到足量的硒补充，硒浓度的平衡对许多器官、组织的生理功能有着重要的保护作用和促进作用。当硒缺乏时，很容易导致人体免疫能力下降，威胁人类健康和生命的四十多种疾病都与人体缺硒有关，如癌症、心血管病、肝病、白内障、胰脏疾病、糖尿病、生殖系统疾病等。
硒作为人体必需的矿物质营养素，具有很重要的生理功能。硒是保持谷胱甘肽过氧化物酶活性的必要成分，谷胱甘肽过氧化物酶催化谷胱甘肽参与过氧化反应，清除某些过氧化物的毒害；硒与维生素E在生化方面有复杂的补偿与协同作用，二者均以对方的存在作为其发挥生理效应的条件；硒还是甲状腺代谢T4向T3活性形式转化中5’-脱碘酶的活性成分；硒能使动物和人的体液和细胞免疫功能增强，增强T细胞介导的特异性免疫，有利于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导，并明显加强CTL的细胞毒活性，还能显著提高吞噬过程中吞噬细胞的存活率和吞噬率；硒能提高动物的繁殖性能，还能拮抗和减弱机体内砷、汞、铬等微量元素的毒性。缺硒能使淋巴器官(如胸腺、脾脏、盲肠、扁桃体和腔上囊等)变得结构疏松，吞噬细胞和淋巴细胞数目减少，网状细胞增生，导致不同程度的免疫抑制或衰退，而且缺硒时，白细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，杀死微生物能力降低，从而降低人和动物对传染病的抵抗力。
近年来研究表明，硒具有抗癌作用，高硒水平摄入可减少肿瘤的发生，每日摄入0.2mg的有机硒，癌症的死亡率下降了50%，其中硒对前列腺癌、肺癌和直肠癌防治十分明显，而未患癌症的人，总发病率下降了37%。另外，硒因为具有抗氧化作用，所以是最好的抗衰老物质，如果人体缺少了硒，就会“不再年轻”，会导致未老先衰。因此，硒被国内外医药界和营养学界尊称为"生命的火种"，享有“长寿元素”、“抗癌之王”、“心脏守护神”、“天然解毒剂”等美誉。
在美国一些硒水平不同的州，居民癌症死亡有统计意义上的明显差异，即土壤、谷物的硒水平越低，癌症死亡率越高。对美国17个州大城市与20个小城市调查研究表明，癌症死亡率与所调查地区的土壤及饮食中硒含量呈明显负相关。
全世界有四十多个国家和地区属于缺硒地区，我国是一个缺硒大国。据《中华人民共和国地方疾病与环境因素图集》揭示，从东北三省起斜穿至云贵高原，占我国国土面积的72%地区存在一条低硒地带，其中30%为严重缺硒地区，粮食等天然食物硒含量较低。华北、东北、西北等大中城市都属于缺硒地区。
通过对我国1094个县市（约占全国一半）的土壤样品的硒含量进行测定结果显示：达到国际公布的正常临界值0.1mg/kg的县只有1/3，即我国2/3地区属缺硒地区。其中含量≤0.02mg/kg的占29%，为严重缺硒地区。我国二十二个省市的部分地区，约七亿人生活在低硒地区，其中大部分地区食物中硒含量在0.02mg/kg以下。东南沿海是我国富硒地区，也只有0.10mg/kg，是联合国卫生组织规定的最低限。
中国2/3的人口严重缺硒，表现在硒摄入量严重不足。目前，我国人群食物中尚达不到每人每天40微克以上的标准补硒水平，尤其是缺硒地区人群，更难从食物中达到补硒的目的。营养学专家经过反复实验得出，人体中血硒的含量标准值为0.10mg/kg，低于此值就会发生缺硒症。而我国有29%地区人均含硒值在0.02mg/kg以下，定为极度缺硒地区，有43%的地区人体含硒值在0.03-0.04mg/kg之间，为缺硒地区，换而言之，我国有72%的地区共15个省区受到缺硒的威胁。联合国组织（FAO/WHO/IEA）制定了人体日常膳食供给量中应有400微克硒，而北京市民人均每日硒摄入量仅为60微克。东北大部分地区人均每日硒摄入量仅有10微克，是心脏病、克山病、大骨节病的高发区。我国居民普遍习惯以食用植物性食物为主。我国粮食主要种植地东北平原、长江三角洲、珠江三角洲均为低硒地区，其粮食产量占全国的70%，从而造成全国性缺硒。
硒源可分为有机硒源和无机硒源，无机硒源包括：亚硒酸钠、硒酸钠、硒化钠、亚硒酸钙等，有机硒源主要有硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸以及各种含硒蛋白质。无机硒作为硒补充强化剂的吸收和利用不是很理想，其生物有效性低，毒性较大，中毒量与需要量之间范围小，因而被严格限制其使用量。如今，日本、美国等发达国家已经禁止在食品甚至动物饲料中添加亚硒酸钠等无机硒。
同无机硒强化剂相比，生物有机硒安全性高，不易发生中毒，易被人体吸收利用，补硒效率高，特别受欢迎。富硒酵母就是在培养酵母的过程中加入硒元素，酵母生长时吸收利用了硒，使硒与酵母体内的蛋白质和多糖有机结合转化为生物有机硒，从而消除了化学硒（如亚硒酸钠）对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。富硒酵母也是迄今为止国内最高效、最安全、营养最均衡的补硒制剂。富酵母硒是目前补硒的最好来源，较之无机硒、富硒茶和麦硒等，酵母硒的含量稳定而丰富、无副作用、吸收利用率高。
富硒酵母具有如下特点：1、富硒酵母硒含量高，富硒酵母的硒含量达到1000-2500mg/kg（即1000-2500ppm），远高于麦硒（约11mg/kg）其蛋白质含量大于45%，维生素B1为3.2mg/kg，维生素B2为33.2mg/kg，是一种很好的功能性食品原料。2、富硒酵母硒生理活性远高于化学硒，如对肿瘤的抑制效果较亚硒酸钠显著。3、其利用率高，分析表明，人体摄入富硒酵母后血液中硒含量的提高明显高于亚硒酸钠；富硒酵母中生物硒含量占总硒量的90%以上，非常适合人体吸收利用。4、毒性低,富硒酵母的毒性大大低于亚硒酸钠，无论是对大鼠的生长抑制还是引起组织病变均是如此。动物试验还表明，富硒酵母没有致畸和致突变方面的毒性。
目前已经有将无机硒转化为有机硒的文献记载，如专利号为2006100972884的专利文件，记载了一种富含硒氨基酸的益生菌酸奶的生产方法，其采用益生菌培养基中加入亚硒酸钠溶液（无机硒），通过益生菌发酵将无机硒转化为硒代氨基酸，其存在的问题是，由于两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、以及嗜热链球杆菌等益生菌对无机硒的转化能力有限，所以该专利达到的无机硒转化率仅为50%，由于成品中仍然存在没有转化的无机硒，而且比例很高，具有一定的毒性。其成品中总硒含量也只有0.1-0.3毫克/升的水平。并且由于该专利采用亚硒酸钠无机硒作为益生菌发酵原料，亚硒酸钠对益生菌生长有一定的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料的生产方法。在几个不同的阶段加入亚硒酸钠，优化了酵母与硒的最佳结合条件，既利于提高结合硒量，又利于酵母的生长，使无机硒结合成有机态的硒，通过板框压滤或离心法分离出酵母，烘干灭活即得到富硒酵母粉；以此作为原料，通过两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、以及嗜热链球杆菌、蜡样芽袍杆菌等益生菌进行二次发酵，通过微生物酶的二次转化，酵母细胞中残留的无机硒基本被完全转化为硒蛋白和含硒蛋白。从而获得一种富含有机硒的益生菌功能性食品饮料。该产品能同时发挥益生菌及其酵母有机硒两者的综合保健作用。
本发明的技术方案为：
一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料的生产方法，首先以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为菌种，以麦芽汁为培养基，培养基内含亚硒酸钠盐，在酵母生长的环境下培养后，分离出富硒酵母经浓缩和烘干灭活得到富硒酵母粉；再以富硒酵母粉为原料，通过益生菌进行二次发酵，制得富含有机硒的益生菌活性乳饮料。
所述的培养基配方为：选择8％-20％总糖量的麦芽汁，内含亚硒酸钠盐，培养基的pH为5.5-7.0。
富硒酵母生产工艺步骤包括：依次为斜面菌种培养、液体菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐发酵培养、收集富硒酵母细胞经浓缩干燥灭活得到富硒酵母粉；所述的发酵罐发酵培养步骤中补加亚硒酸钠盐，继续发酵培养。
所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装有总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时；补加亚硒酸钠盐终浓度为300-600微克／毫升,再在25-32℃搅拌培养10-12小时。
所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时，补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升,在25-32℃搅拌培养5-6小时；再补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升，继续在25-32℃搅拌培养10-12小时。
所述的益生菌为两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球杆菌和蜡样芽胞杆菌。
制备蜡样芽胞杆菌菌种液：取肉膏蛋白胨培养基（LB）在121℃下灭菌20分钟，冷却至40℃以下，按培养基体积的2%的接种蜡样芽胞杆菌种子液，在37℃下，200r/m振荡培养24h，制得含蜡样芽胞杆菌的菌种液。
一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料生产方法，其详细步骤为：
（一）发酵培养富硒酵母：
(1)、斜面菌种培养：富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁固体斜面上，在25-32℃培养24-48小时后，放入4℃保存；
(2)、液体菌种培养：将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为10-20微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25—32℃振荡培养16-24小时，即为液体菌种；
(3)、一级液体种子培养：将液体菌种按5-20％的体积接种量接入总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-32℃振荡培养12-16小时，即为一级液体种子培养物；
(4)、二级液体种子培养：将一级种子培养液按5-20％的体积接种量接入装有总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的卡氏发酵罐，在25-32℃搅拌培养12-16小时，即为二级液体种子培养物；
(5)、发酵罐发酵培养：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装有总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时，补加亚硒酸钠盐终浓度为300-600微克／毫升；在25-32℃搅拌培养10-12小时；
(6)、收集酵母细胞及干燥：采用板框压滤或离心收集富硒酵母细胞，在85-100℃条件下烘干；
(7)、粉碎：用粉碎机将烘干的富硒酵母细胞粉碎得到富硒酵母粉；
（二）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备：
1）制备两歧双歧杆菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种双歧杆菌种子液，在37℃下厌氧发酵培养24h，制得含两歧双歧杆菌的菌种液，备用；
2）制备保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌种子液，其中保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液体积之比为1:1:2，在40℃条件下厌氧发酵培养4-5h，制得保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液，备用；
3）制备蜡样芽胞杆菌菌种液：取肉膏蛋白胨培养基（LB）在121℃下灭菌20分钟，冷却至40℃以下，按培养基体积的2%的接种蜡样芽胞杆菌种子液，在37℃下，200r/m振荡培养24h，制得含蜡样芽胞杆菌的菌种液，备用；
4）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备
将鲜牛乳过滤除去杂质，冷却至4℃后贮存，配制时在其中加入鲜牛乳重量4-8%的蔗糖，鲜牛乳重量0.2-1%的寡糖，在15-25Mpa下均质，于120-140℃下灭菌5-15秒，冷却至40-50℃；加入鲜牛乳重量的2-5%灭活的富硒酵母，充分搅拌均匀，然后接入鲜牛乳体积1-2%的两歧双歧杆菌菌种液和鲜牛乳体积1-2%的保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液，以及鲜牛乳体积1-2%的蜡样芽胞杆菌,在40-42℃下发酵3.5-6h，最后在2-8℃下冷藏8-24h，即得所需产品。
所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时，补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升,在25-32℃搅拌培养5-6小时；再补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升，继续在25-32℃搅拌培养10-12小时。
对于得到的益生菌活性乳饮料，可以采用多种形式的包装成为富含有机硒的益生菌功能性活性乳饮料产品。
本发明得到益生菌活性乳饮料硒含量检测：无机硒含量通过与3．3—二氨基联苯胺(DAB)络合反应．形成稳定的Se—DAB络合物，甲苯萃取后，通过分光光度法420nm检测含量。
由于有机硒不与DAB络合反应，可通过高氯酸与硫酸混合液消化变为无机硒，再通过DAB络合法测得总硒含量。有机硒含量通过总硒含量减去无机硒含量获得。
本发明得到的益生菌活性乳饮料中总硒含量为5-10毫克/升，其中有机硒（硒氨基酸）含量占总硒量90%以上。富含硒氨基酸的益生菌活性乳饮料中益生菌的cfu可达109/mL以上，其中两歧双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和蜡样芽胞杆菌的cfu数分别超过：107/mL、108/mL、108/mL、108/mL和107/mL。
本发明的有益效果为：
1)本发明首先以酿酒酵母为菌种，将90%以上无机硒转化为生物有机硒（硒代氨基酸），酵母富硒能力强，从而解决了无机硒作为硒补充强化剂的吸收和利用不理想、其生物有效性低、毒性较大的问题。
2)本发明进一步以富硒酵母为原料，通过两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球杆菌以及蜡样芽袍杆菌等益生菌进行二次发酵，通过微生物酶的二次转化，酵母细胞中残留的少量无机硒基本被完全转化为硒代氨基酸。
3)本发明通过培养基原料中添加富硒酵母而不是无机硒来培养两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球杆菌以及蜡样芽袍杆菌等益生菌，从而避免了有害的无机硒对益生菌生长的影响，并通过调整菌液的制备条件，发酵条件，达到很好发酵的效果。结果表明本发明制备的富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中的两歧双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌cfu均保持了较高的水平。蜡样芽袍杆菌是耗氧量大的益生菌，它可大量消耗发酵培养基中的氧，使益生菌培养环境趋于无氧状态，这样就更有利于双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖。
4)富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中总硒含量为5-10毫克/升，其中有机硒（硒氨基酸）含量占总硒量90%以上。远高于类似文献的总硒含量为0.1-0.3毫克/升的水平，而其有机硒（硒氨基酸）含量也仅占总硒量50%。
5)本发明所制成的产品，可有效补充人体重要的微量元素-有机硒，同时又结合乳酸益生菌调节肠胃，增加吸收的功能，从而使硒这种"生命的火种"、"抗癌明星"得到更加充分的利用，显然能够更好的改善机体内生态环境。
总之，本发明的益生菌活性乳饮料，在几个不同的阶段加入亚硒酸钠，优化了酵母与硒的最佳结合条件，既利于提高结合硒量，又利于酵母的生长，使无机硒结合成有机态的硒，通过板框压滤或离心法分离出酵母，烘干灭活即得到富硒酵母粉；以此作为原料，通过两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、以及嗜热链球杆菌、蜡样芽袍杆菌等益生菌进行二次发酵，通过微生物酶的二次转化，酵母细胞中残留的无机硒基本被完全转化为硒蛋白和含硒蛋白。从而获得一种富含有机硒的益生菌功能性食品饮料。该产品能同时发挥益生菌及其酵母有机硒两者的综合保健作用。
具体实施方式
下面将通过具体的实施例来详细描述本发明的技术方案。除非特别指明，本发明中所用的实验方法和试剂均为本领域技术人员所公知的方法和试剂。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、分离加工条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
发酵培养含有高生物量和高硒含量的富硒酵母：
（一）发酵培养富硒酵母：
(1)、斜面菌种培养：富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为8％、亚硒酸钠盐浓度为50微克／毫升的麦芽汁固体斜面上，在32℃培养24小时后，放入4℃保存。
(2)、液体菌种培养：将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有总糖含量为8％、亚硒酸钠盐浓度为10微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于32℃振荡培养16小时，即为液体菌种。
(3)、一级液体种子培养：将液体菌种按5％的体积接种量接入总糖含量为8％、亚硒酸钠盐浓度为50微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在32℃振荡培养12小时，即为一级液体种子培养物。
(4)、二级液体种子培养：将一级种子培养液按5％的体积接种量接入装有总糖含量为8％、亚硒酸钠盐浓度为50微克／毫升的麦芽汁培养基的卡氏发酵罐，在32℃搅拌培养12小时，即为二级液体种子培养物。
(5)、发酵罐发酵培养：将二级种子培养液按20％的体积接种量接入装有总糖含量为8％、亚硒酸钠盐浓度为50微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在32℃搅拌培养10小时，补加亚硒酸钠盐终浓度为500微克／毫升（亚硒酸钠，50毫克／毫升，流加速度0.3-0.5升／分钟）；在32℃搅拌培养10小时。
(6)、收集酵母细胞及干燥：采用板框压滤或离心收集富硒酵母细胞，在85-100℃条件下烘干。
(7)、粉碎：用粉碎机将烘干的富硒酵母细胞粉碎得到富硒酵母粉。
（二）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备：
1）制备两歧双歧杆菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种双歧杆菌种子液，在37℃下厌氧发酵培养24h，制得含两歧双歧杆菌的菌种液，备用。
2）制备保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌种子液，其中保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液体积之比为1:1:2，在40℃条件下厌氧发酵培养5h，制得保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液，备用。
3）制备蜡样芽胞杆菌菌种液：取肉膏蛋白胨培养基（LB）在121℃下灭菌20分钟，冷却至40℃以下，按培养基体积的2%的接种蜡样芽胞杆菌种子液，在37℃下，200r/m振荡培养24h，制得含蜡样芽胞杆菌的菌种液，备用。
4）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备
将1000L鲜牛乳过滤除去杂质，冷却至4℃后贮存，配制时在其中加入蔗糖60kg(6%,w/v)，寡糖500g(0.5%,w/v)，在15-25Mpa下均质，于120-140℃下杀菌5-15秒，冷却至40-50℃；加入灭活的富硒酵母40kg（4%,w/v），充分搅拌均匀，然后接入两歧双歧杆菌菌种液，15L(1.5%,v/v)和保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液，15L(1.5%,v/v)，蜡样芽胞杆菌,15L(1.5%,v/v)，在40-42℃下发酵3.5-6h，最后在2-8℃下冷藏8-24h，即得所需产品。
硒含量检测：无机硒含量通过与3，3—二氨基联苯胺(DAB)络合反应，形成稳定的Se—DAB络合物，甲苯萃取后，通过分光光度法420nm检测含量。
由于有机硒不与DAB络合反应，可通过高氯酸与硫酸混合液消化变为无机硒，再通过DAB络合法测得总硒含量。有机硒含量通过总硒含量减去无机硒含量获得。
上述方法获得的富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中总硒含量为5-40毫克/升，其中有机硒（硒氨基酸）含量占总硒量90%以上。富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中益生菌的cfu可达6.5×109/毫升，其中双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和蜡样芽胞杆菌的cfu数分别为：5×107/毫升、7.7×108/毫升、6.8×108/毫升和8.5×108/毫升、1.5×107/毫升。
实施例2
发酵培养含有高生物量和高硒含量的富硒酵母：
（一）发酵培养富硒酵母：
(1)、斜面菌种培养：富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为20％、亚硒酸钠盐浓度为100微克／毫升的麦芽汁固体斜面上，在25℃培养24小时后，放入4℃保存。
(2)、液体菌种培养：将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有总糖含量为20％、亚硒酸钠盐浓度为20微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25℃振荡培养24小时，即为液体菌种。
(3)、一级液体种子培养：将液体菌种按20％的体积接种量接入总糖含量为20％、亚硒酸钠盐浓度为100微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25℃振荡培养12小时，即为一级液体种子培养物。
(4)、二级液体种子培养：将一级种子培养液按20％的体积接种量接入装有总糖含量为20％、亚硒酸钠盐浓度为100微克／毫升的麦芽汁培养基的卡氏发酵罐，在25℃搅拌培养12小时，即为二级液体种子培养物。
(5)、所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10％的体积接种量接入装总糖含量为20％、亚硒酸钠盐浓度为100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25℃搅拌培养10小时，补加亚硒酸盐终浓度为300微克／毫升（亚硒酸钠，50毫克／毫升，流加速度0.3-0.5升／分钟）,在25℃搅拌培养5小时；再补加亚硒酸盐终浓度为600微克／毫升（亚硒酸钠，50毫克／毫升，流加速度0.3-0.5升／分钟），继续在25-32℃搅拌培养10-12小时。
(6)、收集酵母细胞及干燥：采用板框压滤或离心收集富硒酵母细胞，在85-100℃条件下烘干。
(7)、粉碎：用粉碎机将烘干的富硒酵母细胞粉碎得到富硒酵母粉。
富含有机硒的益生菌功能性活性乳饮料的制备。
（二）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备：
1）制备两歧双歧杆菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种双歧杆菌种子液，在37℃下厌氧发酵培养24h，制得含两歧双歧杆菌的菌种液，备用。
2）制备保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌种子液，其中保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液体积之比为1:1:2，在40℃条件下厌氧发酵培养5h，制得保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液，备用。
3）制备蜡样芽胞杆菌菌种液：取肉膏蛋白胨培养基（LB）在121℃下灭菌20分钟，冷却至40℃以下，按培养基体积的2%的接种蜡样芽胞杆菌种子液，在37℃下，200r/m振荡培养24h，制得含蜡样芽胞杆菌的菌种液，备用。
4）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备
将1000L鲜牛乳过滤除去杂质，冷却至4℃后贮存，配制时在其中加入蔗糖80kg(8%,w/v)，寡糖1000g(1%,w/v)，在15-25Mpa下均质，于120-140℃下杀菌5-15秒，冷却至40-50℃；加入灭活的富硒酵母50kg（5%,w/v），充分搅拌均匀，然后接入两歧双歧杆菌菌种液，20L(2%,v/v)和保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液，20L(2%,v/v)，蜡样芽胞杆菌,20L(2%,v/v)，在40-42℃下发酵3.5-6h，最后在2-8℃下冷藏8-24h，即得所需产品。
硒含量检测：无机硒含量通过与3，3—二氨基联苯胺(DAB)络合反应，形成稳定的Se—DAB络合物，甲苯萃取后，通过分光光度法420nm检测含量。
由于有机硒不与DAB络合反应，可通过高氯酸与硫酸混合液消化变为无机硒，再通过DAB络合法测得总硒含量。有机硒含量通过总硒含量减去无机硒含量获得。
上述方法获得的富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中总硒含量为5-40毫克/升，其中有机硒（硒氨基酸）含量占总硒量90%以上。富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中益生菌的cfu可达6.5×109/毫升，其中双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和蜡样芽胞杆菌的cfu数分别为：4.5×107/毫升、8.3×108/毫升、8.5×108/毫升和10.8×108/毫升、1.7×107/毫升。
实施例3
（一）发酵培养富硒酵母：
(1)、斜面菌种培养：富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为10％、亚硒酸钠盐浓度为80微克／毫升的麦芽汁固体斜面上，在30℃培养36小时后，放入4℃保存。
(2)、液体菌种培养：将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有总糖含量为10％、亚硒酸钠盐浓度为20微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于30℃振荡培养20小时，即为液体菌种。
(3)、一级液体种子培养：将液体菌种按10％的体积接种量接入总糖含量为10％、亚硒酸钠盐浓度为80微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在30℃振荡培养14小时，即为一级液体种子培养物。
(4)、二级液体种子培养：将一级种子培养液按10％的体积接种量接入装有总糖含量为10％、亚硒酸钠盐浓度为80微克／毫升的麦芽汁培养基的卡氏发酵罐，在30℃搅拌培养14小时，即为二级液体种子培养物。
(5)、所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10％的体积接种量接入装总糖含量为10％、亚硒酸钠盐浓度为80微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在30℃搅拌培养10小时，补加亚硒酸盐终浓度为300微克／毫升（亚硒酸钠，50毫克／毫升，流加速度0.3-0.5升／分钟）,在30℃搅拌培养5小时；再补加亚硒酸盐终浓度为500微克／毫升（亚硒酸钠，50毫克／毫升，流加速度0.3-0.5升／分钟），继续在30℃搅拌培养12小时。
(6)、收集酵母细胞及干燥：采用板框压滤或离心收集富硒酵母细胞，在85-100℃条件下烘干。
(7)、粉碎：用粉碎机将烘干的富硒酵母细胞粉碎得到富硒酵母粉。
富含有机硒的益生菌功能性活性乳饮料的制备：
（二）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备：
1）制备两歧双歧杆菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种双歧杆菌种子液，在37℃下厌氧发酵培养24h，制得含两歧双歧杆菌的菌种液，备用。
2）制备保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌种子液，其中保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液体积之比为1:1:2，在40℃条件下厌氧发酵培养5h，制得保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液，备用。
3）制备蜡样芽胞杆菌菌种液：取肉膏蛋白胨培养基（LB）在121℃下灭菌20分钟，冷却至40℃以下，按培养基体积的2%的接种蜡样芽胞杆菌种子液，在37℃下，200r/m振荡培养24h，制得含蜡样芽胞杆菌的菌种液，备用。
4）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备
将1000L鲜牛乳过滤除去杂质，冷却至4℃后贮存，配制时在其中加入白砂糖40kg(4%,w/v)，寡糖200g(0.2%,w/v)，在15-25Mpa下均质，于120-140℃下杀菌5-15秒，冷却至40-50℃；加入灭活的富硒酵母20kg（2%,w/v），充分搅拌均匀，然后接入两歧双歧杆菌菌种液，10L(1%,v/v)和保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液，10L(1%,v/v)，蜡样芽胞杆菌,10L(1%,v/v)，在40-42℃下发酵3.5-6h，最后在2-8℃下冷藏8-24h，即得所需产品。
硒含量检测：无机硒含量通过与3．3—二氨基联苯胺(DAB)络合反应．形成稳定的Se—DAB络合物，甲苯萃取后，通过分光光度法420nm检测含量。
由于有机硒不与DAB络合反应，可通过高氯酸与硫酸混合液消化变为无机硒，再通过DAB络合法测得总硒含量。有机硒含量通过总硒含量减去无机硒含量获得。
上述方法获得的富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中总硒含量为5-40毫克/升，其中有机硒（硒氨基酸）含量占总硒量90%以上。富含硒氨基酸的益生菌功能性活性乳饮料中益生菌的cfu可达7.7×109/毫升，其中两歧双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和蜡样芽胞杆菌的cfu数分别为：8.4×107/毫升、10.6×108/毫升、9.7×108/毫升和11.9×108/毫升、2.4×107/毫升。

Claims (9)

1.一种富含有机硒的益生菌活性乳饮料的生产方法，首先以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为菌种，以麦芽汁为培养基，培养基内含亚硒酸钠盐，在酵母生长的环境下培养后，分离出富硒酵母经浓缩和烘干灭活得到富硒酵母粉；再以富硒酵母粉为原料，通过益生菌进行二次发酵，制得富含有机硒的益生菌活性乳饮料。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述的培养基配方为：选择8％-20％总糖量的麦芽汁，内含亚硒酸钠盐，培养基的pH为5.5-7.0。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，富硒酵母生产工艺步骤包括：依次为斜面菌种培养、液体菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐发酵培养、收集富硒酵母细胞经浓缩干燥灭活得到富硒酵母粉；所述的发酵罐发酵培养步骤中补加亚硒酸钠盐，继续发酵培养。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装有总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时；补加亚硒酸钠盐终浓度为300-600微克／毫升,再在25-32℃搅拌培养10-12小时。
5.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时，补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升,在25-32℃搅拌培养5-6小时；再补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升，继续在25-32℃搅拌培养10-12小时。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述的益生菌为两歧双歧杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球杆菌和蜡样芽胞杆菌。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，将蜡样芽胞杆菌制备为蜡样芽胞杆菌菌种液，步骤如下：取肉膏蛋白胨培养基在121℃下灭菌20分钟，冷却至40℃以下，按培养基体积的2%的接种蜡样芽胞杆菌种子液，在37℃下，200r/m振荡培养24h，制得含蜡样芽胞杆菌的菌种液。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其详细步骤为：
（一）发酵培养富硒酵母：
(1)、斜面菌种培养：富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁固体斜面上，在25-32℃培养24-48小时后，放入4℃保存；
(2)、液体菌种培养：将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为10-20微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25—32℃振荡培养16-24小时，即为液体菌种；
(3)、一级液体种子培养：将液体菌种按5-20％的体积接种量接入总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-32℃振荡培养12-16小时，即为一级液体种子培养物；
(4)、二级液体种子培养：将一级种子培养液按5-20％的体积接种量接入装有总糖含量为8-20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的卡氏发酵罐，在25-32℃搅拌培养12-16小时，即为二级液体种子培养物；
(5)、发酵罐发酵培养：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装有总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时，补加亚硒酸钠盐终浓度为300-600微克／毫升；在25-32℃搅拌培养10-12小时；
(6)、收集酵母细胞及干燥：采用板框压滤或离心收集富硒酵母细胞，在85-100℃条件下烘干；
(7)、粉碎：用粉碎机将烘干的富硒酵母细胞粉碎得到富硒酵母粉；
（二）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备：
1）制备两歧双歧杆菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种双歧杆菌种子液，在37℃下厌氧发酵培养24h，制得含两歧双歧杆菌的菌种液，备用；
2）制备保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液：取牛乳在121℃下灭菌15分钟，冷却至40℃以下，按牛乳体积的5%接种保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌种子液，其中保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液体积之比为1:1:2，在40℃条件下厌氧发酵培养4-5h，制得保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的菌种液，备用；
3）制备蜡样芽胞杆菌菌种液：取肉膏蛋白胨培养基在121℃下灭菌20分钟，冷却至40℃以下，按培养基体积的2%的接种蜡样芽胞杆菌种子液，在37℃下，200r/m振荡培养24h，制得含蜡样芽胞杆菌的菌种液，备用；
4）富含有机硒的益生菌活性乳饮料的制备
将鲜牛乳过滤除去杂质，冷却至4℃后贮存，配制时在其中加入鲜牛乳重量4-8%的蔗糖，鲜牛乳重量0.2-1%的寡糖，在15-25Mpa下均质，于120-140℃下杀菌5-15秒，冷却至40-50℃；加入鲜牛乳重量的2-5%灭活的富硒酵母，充分搅拌均匀，然后接入鲜牛乳体积1-2%的两歧双歧杆菌菌种液和鲜牛乳体积1-2%的保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球杆菌的混合菌菌种液，以及鲜牛乳体积1-2%的蜡样芽胞杆菌,在40-42℃下发酵3.5-6h，最后在2-8℃下冷藏8-24h，即得所需产品。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述的发酵罐发酵培养，其步骤为：将二级种子培养液按10-20％的体积接种量接入装总糖含量为8—20％、亚硒酸钠盐浓度为50-100微克／毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养10-12小时，补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升,在25-32℃搅拌培养5-6小时；再补加亚硒酸盐终浓度为300-600微克／毫升，继续在25-32℃搅拌培养10-12小时。
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