CN103328588B - 一种w/o乳液油墨组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

W/O乳液油墨组合物及其应用，该组合物按重量计包括：90-10%的油相和10-90%的水相，该油相和/或水相中溶解有与所述油相和/或所述水相极性相似的生物活性物质。该油墨组合物利用乳液油墨良好的印刷性能，以油墨作为载体将生物活性物质精确定位或固定于承载物上，解决了生物活性物质与非水性油墨相容性差的问题，以及水性生物油墨印刷性能差的问题，有效实现了生物活性物质的固定。可利用该油墨组合物生产临床诊断产品、分析试剂、生物传感器及其他生物产品。

Description

一种W/O乳液油墨组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种W/O乳液油墨组合物及其应用。
背景技术
含有生物活性物质的油墨通过印刷技术成膜，可以将生物活性物质固定在特定的载体上。由于生物活性物质多数属于亲水性，且有机溶剂会对生物活性产生影响，因此目前通过印刷技术固定生物活性物质的油墨多数是水性油墨或者水性乳液油墨。比如，专利US20060226008A1、专利US6258229，及专利US11/494805，都公开了一种水性配方用于丝网印刷将生物酶固定在基片上，制成生物传感器，其中油墨的连接剂都是水溶性的。
但是，目前所采用的水性油墨具有粘附效果差、印刷精确度差等尚未攻克的缺点，将其应用于精密生物产品领域还具有局限性。而且水溶性的连接剂在水相生物反应体系中，对生物物质和其他被固定的介质的稳定性尚值得商榷。
专利US6719923公开了一种水性油墨配方，水性连接剂成膜后变成了疏水性的，但连接剂可选择范围比较小。专利US5183742公开了一种固定生物酶的油性油墨配方，生物酶粉末、连接剂等试剂都分散或溶解在非水性溶剂里，因此存在生物相容性的问题。
专利US2839412公开了用于印刷的乳液油墨，专利CN100338158C公开了一种用于孔板印刷的W/O型乳液油墨，专利CN1243804C、专利CN1198891C分别公开了用于模板印刷的W/O型乳液油墨。随着研究深入，人们发现水相的加入赋予乳液油墨在模板印刷时相对于其他油墨更优的性能，即，保持小的因油墨温度变化的粘度变化，升高油墨的渗透速率，增加油墨的结构粘度，防止油墨流出印刷机，以及降低油墨在将印刷圆筒与印刷介质分离式的旋转性。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种W/O乳液油墨组合物及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
构造一种W/O乳液油墨组合物，按重量百分比计包括：90～10%的油相和10～90%的水相，其中，所述油相和/或所述水相中溶解有与所述油相和/或所述水相极性相似的生物活性物质。
本发明所述的组合物，其中，所述W/O乳液油墨组合物中按重量百分比计包括：10～50%的水相和90～50%的油相。
本发明所述的组合物，其中，所述W/O乳液油墨组合物中按重量百分比计包括：10～30%的水相和90～70%的油相。
本发明所述的组合物，其中，所述生物活性物质包括蛋白、多肽、寡肽、细胞、生物组织、酶、DNA、DNA片段、RNA、抗体、抗原、多糖、寡核苷酸、凝集素、生物素和脂类中的一种或几种。
本发明所述的组合物，其中，所述水相包括不阻碍乳液形成的水、电解质、高极性醇类、防腐剂、水蒸发防止剂、水溶性高分子中的一种或几种。
本发明所述的组合物，其中，所述油相包括非水溶性连接剂和溶剂，按重量百分比计，其中包含所述连接剂0.1%～70%；
所述溶剂为挥发性溶剂或者是挥发性溶剂与非挥发性溶剂的混合物，其中所述挥发性溶剂的含量为油相中液体成分的10%～95%。
本发明所述的组合物，其中，按重量百分比计，所述连接剂含量为0.5%～20%，所述挥发性溶剂的含量为油相中液体成分的60%～90%。
本发明所述的组合物，其中，所述连接剂包括：聚酯树脂、烷基树脂、聚苯乙烯树脂、环氧树脂、聚氯乙烯树脂、聚乙烯醇树脂、丙烯酸系树脂、马来酸树脂、醇酸树脂、萜烯树脂、松香系树脂、纤维素衍生物和天然多聚物中的一种或多种的混合物；
所述溶剂为有机溶剂，包括酮类溶剂、酯类溶剂、醇类溶剂、醚酯类溶剂、萜烃类溶剂、苯类溶剂中的一种或几种。
本发明所述的组合物，其中，所述油相内还包括乳化剂、填充剂和增塑剂中的一种或多种。
本发明还提供了一种采用前面所述W/O乳液油墨组合物固定生物活性物质的方法，其中，包括以下步骤：
以含有需要固定的生物活性物质的W/O乳液油墨组合物为载体；
通过印刷技术将所述W/O乳液油墨组合物均匀分散在基片上；
所述W/O乳液油墨组合物中的连接剂成膜后，将生物活性物质包埋固定在目标基片上。
本发明所述的方法，其中，所述印刷技术为丝网印刷、移印、漏印或喷墨印刷技术；
所述目标基片包括石英、玻璃、金属、陶瓷、塑料、硅胶、化学功能化的玻璃、聚合物覆盖的玻璃中的一种或几种。
本发明中，对于与水相极性相似的生物活性物质，利用乳液将其与生物相容性差的油相成分隔开，使两者位于不同相内，减少相互作用，从而降低油相有机物对这种生物活性物质的影响；对于与油相极性相似的生物活性物质，油相成分对其影响不大则将其溶解在油相中，或者以O/W的形式分散在水相中，这样可以利用乳液油墨良好的印刷性能，以油墨作为载体将生物活性物质精确定位或者固定于承载物上，解决了生物活性物质与非水性油墨相容性差的问题，以及水性生物油墨印刷性能差的问题，有效实现了生物活性物质的固定。从而达到利用现代高效、高产量、低成本的印刷技术来快速大量生产临床诊断产品、分析试剂、生物传感器以及其他生物产品的目的。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明较佳实施例的酶电极对不同浓度葡萄糖的即时电流扫描曲线；
图2是本发明较佳实施例的Anti-EGF浓度对数值对OD405值的曲线。
具体实施方式
本发明较佳实施例的W/O乳液油墨组合物，连续相为油相或者非极性相，分散相为水相或者相对极性相，按重量百分比计，W/O乳液油墨组合物包括：90～10%的油相和10～90%的水相。其中，油相和/或水相中分别与溶解有油相和/或水相极性相似的生物活性物质。
其中，生物活性物质是指能够实现其自然或者预期的生物学功能的物质，生物活性物质可以处于活性状态，包括：蛋白、多肽、寡肽、细胞、生物组织、酶、DNA、DNA片段、RNA、抗体、抗原、多糖、寡核苷酸、凝集素、生物素和脂类中的一种或几种。
非极性生物活性物质，如脂类、酶的非极性底物、非极性维生素等，可以直接溶解在油相中；而与油相相容性不好的非极性生物活性物质，或者说油相成分会明显降低其生物活性的非极性生物活性物质，可以O/W的形式分散在水相中，最终形成O/W/O乳液油墨。极性生物活性物质，则可以直接溶解在水相中。生物活性物质可以单独存在油相或者水相中，乳液油墨的油相和水相中也可以同时含有不同的生物活性物质。
这样，利用乳液将与水相极性相似的生物活性物质与生物相容性差的油相成分隔开，使两者位于不同相内，减少相互作用，从而降低油相有机物对生物活性物质的影响；而对于与油相极性相似的生物活性物质，油相成分对其影响不大则将其溶解在油相中，或者以O/W的形式分散在水相中，这样可以利用乳液油墨良好的印刷性能，以油墨作为载体将生物活性物质精确定位或者固定于承载物上，解决了生物活性物质与非水性油墨相容性差的问题，以及水性生物油墨印刷性能差的问题
水相在乳液油墨中不仅增加了油墨与生物活性物质的相容性，还赋予油墨更稳定的性能（粘度变化小），但油相组分含量偏高能增加干燥速度，降低印刷时有机物质对生物活性物质的伤害。优选地，W/O乳液油墨组合物中包含10～50%的水相和90～50%的油相。
同时疏水环境更有利于干燥后生物物质的稳定保存，从而提高产品的有效期。更优选地，W/O乳液油墨组合物中包含10～30%的水相和90～70%的油相。
优选地，油相中至少含有非水溶性连接剂和溶剂，按重量百分比计，其中包含连接剂0.1%～70%；溶剂为挥发性溶剂或者是挥发性溶剂与非挥发性溶剂的混合物，其中挥发性溶剂的挥发速度与乳液油墨的干燥速度成正比，其含量为油相中液体成分的10%～95%。
优选地，按重量百分比计，连接剂含量为0.5%～20%，挥发性溶剂的含量为油相中液体成分的60%～90%。
本实施例中，W/O乳液油墨使得连接剂的选择范围比生物相容性较好的水性油墨扩大了，能更好的改善油墨的印刷性能。连接剂成分是树脂或者其他可成膜的聚合物，其功能是在油墨干燥后在生物活性物质需要附着的表面成膜，将生物活性物质固定在膜内或者膜的空隙间。其中，连接剂包括：聚酯树脂、烷基树脂、聚苯乙烯树脂、环氧树脂、聚氯乙烯树脂、聚乙烯醇树脂、丙烯酸系树脂、马来酸树脂、醇酸树脂、萜烯树脂、松香系树脂，纤维素衍生物，如乙基纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素；天然多聚物，如不溶性淀粉、不溶性多糖中的一种或多种的混合物。
优选地，溶剂是有机溶剂，包括酮类溶剂，如环己酮、丙酮、丁酮；酯类溶剂，如醋酸乙酯、醋酸丁酯；醇类溶剂，如正丁醇；醚酯类溶剂、萜烃类溶剂、苯类溶剂中的一种或几种。溶剂的加入可以溶解连接剂、调节乳液油墨的干燥速度、调节油墨流动性、增加乳液稳定性。溶剂可以仅是挥发性溶剂，也可以是挥发性溶剂和非挥发性溶剂的混合物。且溶剂的添加量取决于乳液油墨中的油相/水相比率，以及连接剂的种类及添加量。
优选地，油相内还包括乳化剂、填充剂和增塑剂中的一种或多种。但乳化剂、填充剂、增塑剂并非必须成分。其中，乳化剂可以是任意的表面活性剂，其种类可以是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂中的一种或他们的任意两种或多种组合。表面活性剂的功能一是稳定乳液，二是作为润湿剂增加疏水连接剂的亲水性。按重量百分比计，表面活性剂的添加量为0.5%～10%，优选为2%～5%。填充剂、增塑剂添加在油相内，用于改变油墨的流变性、改善印刷性能。
优选地，水相的构成成分只要是不阻碍乳液形成的公知的物质均可以使用，且水相内排除会严重降低生物物质活性的成分。例如，水相可包括不阻碍乳液形成的水、电解质、高极性醇类、防腐剂、水蒸发防止剂、水溶性高分子中的一种或几种。
本发明的另一实施例中，还提供了一种采用前面所述的W/O乳液油墨组合物固定生物活性物质的方法，包括以下步骤：以含有需要固定的生物活性物质的W/O乳液油墨组合物为载体；通过印刷技术将W/O乳液油墨组合物均匀分散在基片上；W/O乳液油墨组合物中的连接剂成膜后，将生物活性物质包埋固定在目标基片上。
其中，印刷技术为丝网印刷、移印或漏印或喷墨印刷技术；目标基片可以是需要固定生物活性物质的固体材料，是平面的或者非平面的。目标基片材质可以是但不限于以下种类：石英、玻璃、金属、陶瓷、塑料、硅胶、化学功能化的玻璃、聚合物覆盖的玻璃等。
下面通过具体的实施例说明本发明的W/O乳液油墨组合物的制备过程，及采用所制备的W/O乳液油墨组合物印刷固定后的生物活性物质活性检测过程，需要说明的是，以下所举例子仅为本发明的几个较佳实施例，并不用于限定本发明。
实施例1
配制含有葡萄糖氧化酶的W/O乳液油墨组合物。
配制流程如下：将1g醋酸纤维素溶解于9g环己酮中，在醋酸纤维素/环己酮混合液中加入1g TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚，采用搅拌器搅拌均匀，将600mg葡萄糖氧化酶溶解在1ml pH7.0的磷酸缓冲液中，边搅拌边缓慢滴加入油相混合物中，搅拌乳化30min。
采用光学显微镜观察乳化液滴在油相中的分散情况，所制备的含有葡萄糖氧化酶的W/O乳液油墨组合物分散良好且稳定性好，可在室温密封条件下保持15天左右。
将所制备的含有葡萄糖氧化酶的W/O乳液油墨组合物用于葡萄糖氧化酶生物传感器的酶电极中，从而检测被固定葡萄糖氧化酶的活性。本实施例中载体为PVC基片，采用Ag/AgCl为参比电极、碳电极为工作电极，碳电极上依次印刷银导电层、碳导电层和1,1二甲基二茂铁修饰的碳导电层。最后将葡萄糖氧化酶乳液油墨丝网印刷到碳电极工作区制成酶电极。根据葡萄糖氧化还原反应的氧化峰的位置将酶电极的工作电位定于0.40V vs.Ag/AgCl，利用电化学系统即时电流扫描方法，检测酶电极对被测葡萄糖样品在某一时段内的电流响应值。
图1所示为酶电极在不同葡萄糖浓度下的即时电流扫描曲线。结果显示在某一时间区间内电流值与检测的葡萄糖浓度成正比，说明了葡萄糖氧化酶在葡萄糖的氧化还原反应中的催化活性。
实施例2
配制含有EGF(表皮生长因子)的W/O乳液油墨。
配制流程如下：将1g醋酸纤维素溶解于9g环己酮中，在醋酸纤维素/环己酮混合液中加入0.5g Triton X-100和0.5g吐温20，采用搅拌器搅拌均匀，加入300mg/ml浓度的EGF溶液1ml，边搅拌边缓慢滴加入油相混合物中，搅拌乳化30min。
采用光学显微镜观察乳化液滴在油相中的分散情况，所制备的含有EGF的W/O乳液油墨组合物分散良好且稳定性好，可在4℃密封条件下保持15天左右。
将所制备的W/O乳液油墨组合物平铺于聚苯乙烯（PS）基板上，在室温下干燥20min。组合物中的醋酸纤维素干燥后在基板上成膜，EGF被固定在基板的表面。利用辣根过氧化物酶标记的EGF抗体与EGF的免疫反应检测大分子生物物质与被固定抗原的相互作用。
检测结果如图2所示，图2中示出了不同浓度的EGF抗体与EGF进行酶联免疫反应后标记的辣根过氧化物酶与底物ABTS（2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐）进行显色反应的数据。其中，横坐标为表皮生长因子抗体浓度对数值，纵坐标OD405-630nm为溶液以630nm为次波长，405nm为主波长时的-吸光度值，结果显示随着EGF抗体的浓度增加显色反应的OD405值相应增加，说明EGF抗体能与固定的EGF有效的发生免疫反应。
实施例3
配制含有DNA的W/O乳液油墨。
配制流程如下：将1g醋酸纤维素溶解于9g环己酮中，在醋酸纤维素/环己酮混合液中加入0.5g SPAN83，搅拌器搅拌均匀，200mg pET-15b质粒DNA（5.7kb）溶解于1ml ddH2O中，边搅拌边缓慢滴加入油相混合物中，搅拌乳化30min。
采用光学显微镜观察乳化液滴在油相中的分散情况，所制备的含有葡萄糖氧化酶的W/O乳液油墨组合物分散良好且稳定性好，可在4℃密封条件下保持5天左右。
采用丝网印刷技术将所制备的W/O乳液油墨组合物按网版的设计图案印刷在目标玻璃基片上，在室温下干燥20min。醋酸纤维素干燥后在基片上成膜，DNA被固定在玻璃基片上。利用EB（溴化乙锭）染色法检验DNA二级结构的完整性。EB的染色原理是能够嵌入到dsDNA的大沟之中，形成复合物而在紫外光下发出荧光，如果DNA的双螺旋二级结构被破坏或者降解的话，EB是不能有效染色的。
检测结果：实验结果中没有添加DNA的油墨印刷后的条带EB染色后在紫外光下还是白色的，而添加pET-15b的油墨印刷后的条带EB染色后在紫外光下发出淡红色荧光。这说明乳液油墨通过印刷可以将DNA固定在玻璃基片，且固定后的DNA分子仍可以与外部的其他分子相互作用。
实施例4
配制含胆固醇的W/O乳液油墨组合物。
胆固醇不溶于水，在W/O乳液油墨的制备过程中，预先将200mg胆固醇与油相成分醋酸纤维素/环己酮/Triton X-100(W：W：W=1:9:1)10ml混合溶解,搅拌器搅拌均匀，缓慢滴加水溶液1ml，搅拌乳化30min。
采用光学显微镜观察乳化液滴在油相中的分散情况，所制备的含有胆固醇的W/O乳液油墨组合物分散良好且稳定性好，可在4℃密封条件下保持15天左右。
本实施例中基片为PVC材质，Ag/AgCl为参比电极、碳电极为工作电极。碳电极上依次印刷银导电层、碳导电层和亚铁氰化钾修饰的碳导电层。最后将含胆固醇的W/O乳液油墨组合物印刷在碳电极表面，形成胆固醇膜。反应液即检测样品为胆固醇氧化酶溶液。在室温和恒定电压下，先测定空白组（碳电极表面的醋酸纤维素膜不含胆固醇）的电流响应值，再测定胆固醇组（碳电极表面的醋酸纤维素膜含有胆固醇）的电流响应值。
检测结果显示，胆固醇组的电流响应值（0.30μA）高于空白组的电流响应值(0.05μA)，说明反应液中的胆固醇氧化酶与固定的胆固醇能有效的进行氧化还原反应。
实施例5
配制含油相和水相分别含有胆固醇和辣根过氧化物酶的W/O乳液油墨组合物。
配制方法与实施例4类似，预先将200mg胆固醇与油相成分醋酸纤维素/环己酮/Triton X-100(W：W：W=1:9:1)10ml混合溶解；预先将200mg辣根过氧化物酶溶于1ml PH6.8磷酸缓冲液；搅拌器均匀搅拌油相，缓慢滴加酶溶液1ml，搅拌乳化30min。
采用光学显微镜观察乳化液滴在油相中的分散情况，所制备的含有胆固醇的W/O乳液油墨组合物分散良好且稳定性好，可在4℃密封条件下保持15天左右。
本实施例中基片为PVC材质，Ag/AgCl为参比电极、碳电极为工作电极。碳电极上依次印刷银导电层、碳导电层和亚铁氰化钾修饰的碳导电层。最后将W/O乳液油墨组合物印刷在碳电极表面，形成生物敏感膜。反应液即检测样品为胆固醇氧化酶溶液。
在室温和恒定电压下，分别测定空白组（碳电极表面的醋酸纤维素膜不含胆固醇/辣根过氧化物酶）、胆固醇组（碳电极表面的醋酸纤维素膜含有胆固醇，制作方法见实施例4）和胆固醇/辣根过氧化物酶组（碳电极表面的醋酸纤维素膜含胆固醇/辣根过氧化物酶）、的电流响应值。
检测结果显示，各组的电流相应值由高到低依次为胆固醇/辣根过氧化物酶组（0.62μA）、胆固醇组（0.31μA）、空白组(0.05μA)，说明反应液中的胆固醇氧化酶与固定的胆固醇能有效的进行氧化还原反应，而固定在电极上的辣根过氧化物酶可以有效的提高氧化还原反应效率，使其电流响应信号提高。
本发明中，对于与水相极性相似的生物活性物质，利用乳液将其与生物相容性差的油相成分隔开，使两者位于不同相内，减少相互作用，从而降低油相有机物对这种生物活性物质的影响；对于与油相极性相似的生物活性物质，油相成分对其影响不大则将其溶解在油相中，或者以O/W的形式分散在水相中，这样可以利用乳液油墨良好的印刷性能，以油墨作为载体将生物活性物质精确定位或者固定于承载物上，解决了生物活性物质与非水性油墨相容性差的问题，以及水性生物油墨印刷性能差的问题，有效实现了生物活性物质的固定。从而达到利用现代高效、高产量、低成本的印刷技术来快速大量生产临床诊断产品、分析试剂、生物传感器以及其他生物产品的目的。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (11)

1.一种W/O乳液油墨组合物，按重量百分比计包括：90～10％的油相和10～90％的水相，其特征在于，按重量百分比计所述油相包括0.5-10％的乳化剂，所述油相和/或所述水相中溶解有与所述油相和/或所述水相极性相似的生物活性物质，所述生物活性物质包括蛋白、多肽、寡肽、细胞、生物组织、酶、DNA、DNA片段、RNA、抗体、抗原、多糖、寡核苷酸、凝集素、生物素和脂类中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述W/O乳液油墨组合物中按重量百分比计包括：10～50％的水相和90～50％的油相。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述W/O乳液油墨组合物中按重量百分比计包括：10～30％的水相和90～70％的油相。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述乳化剂是两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂中的一种或他们的组合。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述水相包括不阻碍乳液形成的水、电解质、高极性醇类、防腐剂、水蒸发防止剂、水溶性高分子中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述油相包括非水溶性连接剂和溶剂，按重量百分比计，其中包含所述连接剂0.1％～70％；
所述溶剂为挥发性溶剂或者是挥发性溶剂与非挥发性溶剂的混合物，其中所述挥发性溶剂的含量为油相中液体成分的10％～95％。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，按重量百分比计，所述连接剂含量为0.5％～20％，所述挥发性溶剂的含量为油相中液体成分的60％～90％。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述连接剂包括：聚酯树脂、烷基树脂、聚苯乙烯树脂、环氧树脂、聚氯乙烯树脂、聚乙烯醇树脂、丙烯酸系树脂、马来酸树脂、醇酸树脂、萜烯树脂、松香系树脂、纤维素衍生物和天然多聚物中的一种或多种的混合物；
所述溶剂为有机溶剂，包括酮类溶剂、酯类溶剂、醇类溶剂、醚酯类溶剂、萜烃类溶剂、苯类溶剂中的一种或几种。
9.一种采用如权利要求1-8中任一项所述W/O乳液油墨组合物固定生物活性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以含有需要固定的生物活性物质的W/O乳液油墨组合物为载体；
通过印刷技术将所述W/O乳液油墨组合物均匀分散在基片上；
所述W/O乳液油墨组合物中的连接剂成膜后，将生物活性物质包埋固定在目标基片上。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述印刷技术为丝网印刷、移印、漏印或喷墨印刷技术；
所述目标基片包括石英、玻璃、金属、陶瓷、塑料、硅胶中的一种或几种。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述玻璃包括化学功能化的玻璃、聚合物覆盖的玻璃中的一种或几种。
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