CN103320514B - 一种检测邻近snp的多重pcr方法 - Google Patents

Abstract

一种扩增邻近SNPs位点的多重PCR方法，涉及一种多重DNA扩增技术。本发明所提供的多重PCR方法，其特征在于：一条共用上游引物，两条内侧SNPs位点ARMS引物，两条外侧SNPs位点ARMS引物，一条外侧竞争性非延伸引物；所述的外侧竞争性非延伸引物3’末端经修饰后阻止聚合酶延伸，并与外侧ARMS引物竞争模板位点，消除了内扩增抑制现象。本发明的多重PCR方法能够有效的检测多个邻近SNPs位点，适用于普通多重PCR、多重荧光PCR、DNA杂交所需进行的多重PCR反应。

Description

一种检测邻近SNP的多重PCR方法

技术领域

本发明涉及一种新的检测SNP的方法，尤其涉及一种基于多重PCR方法检测两个邻近SNP位点时均衡两位点之间的扩增的设计方法，及其在核酸检测领域的应用。

背景技术

多聚酶链式反应(PCR)是以两段寡核苷酸为引物，由DNA聚合酶催化扩增位于两段引物之间的DNA片段的一项分子生物学技术。该技术自1983年建立以来，因其高灵敏度、高效率、高特异性的特点，已经成为当前生命科学研究与相关领域中的主体与关键方法。技术本身也不断完善，目前已经发展了一系列相关技术，如巢式PCR、实时定量PCR、差异显示PCR、免疫PCR、多重PCR等。其中多重PCR因其高特异性、高效率、低成本的优势，迅速渗透至生命科学的各个领域。

多重PCR（multiplexPCR）是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。这一概念由Chamberian等率先于1988年提出。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样品，所以一经提出，即得到众多研究者的青睐，并且发展迅速，在生命科学的各个领域，多重PCR已经成为一项成熟而重要的研究手段。

单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNP）主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。SNP可分成两种形式：一种是基因编码区，称为cSNP，易造成基因功能的突变；另一种是在非编码区，存在大量单碱基的变异。SNPs具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，它与许多疾病直接相关，在分子诊断、临床检验、法医学、遗传疾病等方面具有重要的应用价值。目前出现了许多SNPs检测技术，它们主要基于以下4种基本原理：（1）等位基因特异性杂交；（2）内切酶酶切技术；（3）引物延伸法；（4）寡核苷酸连接反应。每种分型实验的产物又可以有几种不同的检测方法，如：冷光法、荧光法、质谱法等。

扩增阻碍突变系统（AmplificationRegractoryMutationSystem，ARMS）技术于1989年建立，又称等位基因特异性PCR（Allele-specificPCR，AS-PCR），也叫序列特异性引物PCR（PCRwithSequenceSpecificPrimers，PCR-SSP），是验证性检测DNA序列变化的经典方法之一。

ARMS方法的基本构思是设计2条ARMS上游（或下游）引物，共用1条下游（或上游）引物构成PCR反应体系。等位基因特异性碱基置于引物3'末端，这是因为耐热TaqDNA聚合酶缺乏3'-5'外切校正活性。在PCR反应进行时，位于引物3'末端的特异性碱基分别结合于野生型和突变型等位基因的位点，若此碱基对形成错配，DNA链延伸反应就会因为3'-5'-磷酸二酯键形成障碍而受阻。但是ARMS引物3'末端碱基对不同错配区分能力不同，因此对有些突变的区分能力有限，后续有学者在ARMS引物设计时在引物内部尤其是3'端引入错配碱基，以便提高ARMS引物的特异性。

检测多个SNPs位点时，人们通常采用多重PCR结合ARMS的方法以提高效率和节约成本。利用该方法检测邻近SNPs位点时，如图1所示，可以在两个邻近SNPs位点（SNP1和SNP2）分别设计ARMS上游（或下游）引物，SNP1位点对应的外侧ARMS上游（或下游）引物命名为OutsidePrimers（简称OP），SNP2位点对应的内侧ARMS上游（或下游）引物命名为InsidePrimers（简称IP）；而下游（或上游）引物则共用一条引物，命名为CommonPrimer（简称CP）。根据OP与CP的PCR扩增产物（命名为OC）序列差异检测SNP1位点的分型，根据IP和CP的PCR扩增产物（命名为IC）序列差异检测SNP2位点的分型。

然而，如图2所示，在理想状态下，由于TaqDNA聚合酶的5’→3’外切酶活性，所有外侧ARMS上游（或下游）引物（OP）引导的延伸会对同向内侧ARMS上游（或下游）引物（IP）及其延伸产物（IC）产生阻碍作用：阻碍其引导的扩增，破坏其扩增产物的形成。这将导致对SNP2位点分型起关键作用的产物——IC型特异性产物的扩增被抑制，我们称之为内扩增抑制作用。在PCR早期的几个循环中，两对ARMS引物（OP和IP）均结合到模板上进行扩增时，这种作用最为明显，导致内侧ARMS上游（或下游）引物（IP）引导的扩增指数增长期滞后（尤其对于离外引物近的内引物），IC型特异性产物产量相对较低。内侧ARMS上游（或下游）引物引导的IC型产物量的降低，使得对SNP2位点分型困难。

发明内容

本发明的目的为提供一种利用多重ARMS-PCR技术有效检测邻近SNPs位点的方法，本发明的方法可提高上述IC型特异性产物的产量，均衡OC型和IC型延伸产物的产量，提高邻近SNPs位点的分型效率。具体的技术方案是：

一种扩增邻近SNPs位点的多重PCR方法，包括如下步骤：在包含目标碱基序列的核酸试样中，加入引物、dNTPs、Taq酶、缓冲液；对试样进行扩增反应；对扩增产物进行检测和基因分型，所述的目标碱基序列中包括有沿核酸序列3’-5’方向的第一SNP位点和第二SNP位点，其特征在于，所述的引物包括：

(1)第一外侧引物和第一内侧引物，所述的第一外侧引物和第一内侧引物分别用于检测第一SNP位点和第二SNP位点，所述的第一外侧引物是由沿引物3’-5’方向的特异区和第一竞争区组成，竞争区的长度大于5个碱基；

(2)外侧竞争性非扩增引物，所述的外侧竞争性非扩增引物包括有沿引物3’-5’方向的碱基修饰、第二竞争区和调整区，所述的第二竞争区和第一竞争区都与目标碱基序列相同位置互补，所述的碱基修饰使外侧竞争性非扩增引物的3’端不发生PCR延长反应；

(3)共用引物；所述的共用引物是与所述第一外侧引物、第一内侧引物和外侧竞争性非扩增引物形成引物对，从而能够使所述核酸扩增的引物。

在核酸序列的3’-5’方向分别有需要检测的第一SNP位点和第二SNP位点，第一外侧引物可以与第一SNP位点的野生型或者突变型特异，第二内侧引物可以与第二SNP位点的野生型或者突变型特异。采用传统的多重PCR扩增方法时，易出现内扩增抑制作用，第二SNP位点的引物扩增效率明显受到抑制，导致第二SNP位点检测不准确的情况发生。采用本方案时，在引物中加入了外侧竞争性非扩增引物，其具有第二竞争区，第二竞争区的碱基序列是可以与第一竞争区与目标碱基序列上相同位置进行互补的，这样就可以与第一外侧引物竞争在核酸序列上的扩增。本发明中，第一竞争区和第二竞争区与目标碱基序列的相同位置互补是本质上的互补，具体是指：寡核苷酸具有在延伸反应的条件下能够与包括特定序列的目标核酸形成双键状态的碱基序列，但并不要求完全互补，也可以含有几个不匹配碱基对。本发明所述的匹配是指：双链状态的核酸序列碱基对形成为沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对的状态，不匹配是指：没有形成沃森-克里克碱基对的状态。沃森-克里克碱基对是指：脱氧核糖核酸的两个多核苷酸分子组成腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞核嘧啶(C)组，并通过氢键连接的碱基对。那么，第一竞争区和第二竞争区的碱基序列可以完全相同，也可以有几个碱基的不同，只要能与相同的目标碱基序列位置互补即可实现本发明的技术方案。同时，外侧竞争性非扩增引物的3’端具有碱基修饰，其无法使得在核酸链上扩增，从而提高了第一内侧引物扩增得到的产物量。为了保证竞争的效果，第一和第二竞争区的长度至少要有5个碱基。碱基数越多，竞争效果越好，竞争区的碱基数增加，与外侧引物竞争模板的能力更强，竞争效果增强。

一般来说，上述的多重PCR方法在对多个SNP位点检测时，外侧竞争性非扩增引物可以对外侧的SNP位点的扩增产物起到抑制作用，SNP位点可以是2个也可以是多个，但是对于2个相邻的SNP位点进行同时扩增检测时，效果更好，因为不会存在有其它的多个检测用的引物之间的相互影响和竞争。

作为对上述方法的改进，所述的引物中还包括有第二外侧引物和第二内侧引物，第一外侧引物对第一SNP位点的野生型或者突变型中的一种特异，第二外侧引物对另一种特异；第一内侧引物对第二SNP位点的野生型或者突变型中的一种特异，第二内侧引物对另一种特异；第二外侧引物是由沿引物3’-5’方向的特异区和第三竞争区组成，竞争区的长度大于5个碱基且第二外侧引物与第一外侧引物存在至少1个碱基的长度差异，第二内侧引物与第一内侧引物存在至少1个碱基的长度差异；共用引物与所述第一、第二外侧引物和第一、第二内侧引物和外侧竞争性非扩增引物形成引物对。采用这样的引物配置，就可以更好地对目标碱基序列进行检测，对核酸样本进行PCR扩增之后，能够从基因分型的结果中查看到目标碱基序列的第一SNP位点和第二SNP位点是属于野生型还是突变型，另外，由于第一、第二外侧引物之间和第一、第二内侧引物之间存在有碱基长度的差异，从而将碱基差异转化为序列长度差异，通过电泳的方法进行检测。另外，由于第二外侧引物与第一SNP位点特异，那么第二外侧引物上的第三竞争区和第一、第二竞争区能够和目标碱基序列的相同碱基序列位置相互补，这样外侧竞争性非扩增引物就可能对第一或者第二外侧引物起到竞争作用。第一、第二、第三竞争区本质上要与目标碱基序列上互补，也就是说，这三个竞争区之间可以完全相同，也可以存在几个碱基的不同。但是，优选情况下是第一、第二和第三竞争区的碱基序列都相同，这样可以形成更好的竞争作用。第一、第二和第三竞争区最少要包含5个以上的碱基。

作为本方法的一种改进，所述的第一、第二外侧引物和第一、第二内侧引物的3’端的第3～7位的碱基中有一个或者几个是错配碱基，错配原则是：如果3'端是“强”错配（A/G或C/T），则需要引入“弱”的错配（C/A或G/T）或中度”错配（A/A，C/C，G/G或T/T）或不需要引入错配，反之亦然；如果3'端是“中度”错配（A/A，C/C，G/G或T/T），则需要引入“中度”的错配或“强”错配。这样的目的可以是提高引物与核酸链匹配的特异性。

作为本方法的一种改进，所述的第一或第二竞争区从第一或第二外侧引物上沿引物3’-5’方向最后一个错配碱基的下一个碱基开始。由于外侧引物的3’末端为SNP位点、倒数第3位或第4位或第5位或第6位或第7位中的一个或者几个增加了错配，如果外侧竞争性非扩增引物竞争外侧ARMS引物的位点包含第一外侧引物3’端的倒数第3位或第4位或第5位或第6位或第7位错配位点，则存在更为明显竞争性作用，故而优先将竞争区设置于3’末端碱基人为引入错配的下一个碱基处开始。例如：如果3’末端起的第3、第5位设置为错配，那么竞争区至少要从第6位开始向5’方向排列。

在使用本方法时，外侧竞争性非扩增引物与第一、第二外侧引物的浓度需要进行调整，外侧竞争性非扩增引物浓度过大时，会产生抑制外侧引物扩增的情况；外侧竞争性非扩增引物浓度过小时，其无法产生足够的与外侧引物竞争的作用。由于不同模板序列及引物的扩增效果差异，进行PCR扩增时，外侧竞争性非延伸引物与第一、第二外侧引物的浓度比例需要优化调整。一般情况下，外侧竞争性非扩增引物与第一、第二外侧引物的浓度比可以控制在0.1倍～10倍范围内。

对于外侧竞争性非扩增引物，其3’端需要通过基团进行修饰，以使其不会在PCR反应中产生扩增，一般可以采用磷酸基、氨基、生物素基、巯基、ddNTP、肩臂或它们的类似物修饰以阻止其扩增。

作为本方法的一种改进，为保证外侧竞争性非扩增引物的竞争效果，外侧竞争性非扩增引物的Tm值是第一、第二外侧引物的Tm值的±5℃。

在对扩增产物进行检测时，可以采用琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细管电泳、DNA杂交或DNA芯片等方法。对扩增产物进行检测时采用琼脂糖电泳时，最好在第二外侧和第二内侧引物5’端增加10个以上碱基。对扩增产物进行检测时采用聚丙烯酰胺电泳时，最好在第二外侧和第二内侧引物5’端增加2个以上碱基。对扩增产物进行检测时采用毛细管电泳时，最好在第二外侧和第二内侧引物5’端增加1个以上碱基，在共用引物5’端进行荧光标记。从而将碱基差异转化为序列长度差异，通过电泳的方法进行检测。

技术效果

通过以上技术方案，本发明提供利用外侧引物和内侧引物同时准确检测两个邻近SNP位点的多重PCR方法。解决了外侧引物对内侧引物的扩增内抑制作用，均衡外侧引物和内侧引物的扩增效率，从而确保多重PCR扩增的均衡性。应用本发明可以结合多重PCR与ARMS方法相结合，单管PCR扩增同时检测多个SNP位点，尤其解决邻近SNP位点扩增不均衡的问题，提高检测效率，可广泛应用于基于核酸检测的各个领域。

附图说明

图1是表示现有多重PCR-ARMS方法检测邻近SNP位点的图。

图2是表示在PCR过程中，外侧ARMS引物对内侧ARMS引物及其扩增产物的内抑制作用的图。

图3是表示本发明所涉及的均衡内侧和外侧ARMS引物扩增方法的图。

图4是表示本发明中外侧ARMS上游（或下游）引物竞争性非扩增引物（CNEP）的设计方法的图。

图5是表示比较例扩增产物检测结果的图。

图6是表示实施例扩增产物检测结果的图。

图7是表示比较例与实施例扩增效果比较的图。

具体实施方式

以下，参照图3说明本发明的实施方式。

如图3所示，以PCR扩增过程中中采用第一或第二外侧引物以及外侧竞争性非扩增引物作为其特征。

如图4所示，外侧竞争性非扩增引物与第一外侧引物存在部分相同的序列(竞争区)，两者Tm值相差5℃以内，并且外侧竞争性非扩增引物不能为DNA聚合酶引发的延伸反应提供起点。对于外侧竞争性非扩增引物，优选3’末端与第一外侧引物3’末端倒数第5位一致，且Tm值与第一外侧引物接近。

在多重PCR扩增反应之前，在混合PCR体系中添加第一、第二外侧引物、第一、第二内侧引物和共用引物。并且，在混合液中添加外侧竞争性非扩增引物。

添加外侧竞争性非扩增引物时，第一、第二外侧引物与外侧竞争性非扩增引物同时与模板中相同的位置（SNP1）结合，同时第一、第二内侧引物结合在SNP2位置。进而，如图3所示，部分模板与第一、第二外侧引物结合并延伸，同时抑制第一、第二内侧引物的延伸；另一部分模板与外侧竞争性非扩增引物结合但不延伸，从而保护内侧第一、第二内侧引物的延伸。进而在PCR结束时可以同时获得第一、第二外侧引物与共用引物的延伸产物（OC）和第一、第二内侧引物与共用引物的延伸产物（IC）。

第一实施例部分

本实施例及对照例中所用的模板DNA是利用磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司）提取。

所有第一SNP位点和第二SNP位点的引物、共用引物、外侧竞争性非扩增引物均购自上海生工生物工程有限公司。

共用引物在5’端进行FAM荧光修饰。

外侧竞争性非扩增引物在3’端进行C3Spacer修饰。

反应混合物ReactionMix包含dNTP、Mg²⁺、缓冲溶液等，采用常规配置即可，由无锡中德美联生物技术有限公司配制。PCR后的电泳解析采用ABI3130遗传分析仪（ABI公司制）。

以下的实施例和比较例中，检测的SNP位点为人的SLC26A4基因所存在的1975G>C和2027T>A两个邻近的SNP位点。SLC26A4，即溶质转运家族26-成员4（solutioncarrierfamily26，member4），是临床比较常见的非综合征型耳聋相关基因，可导致呈常染色体隐性遗传的非综合征型耳聋DFNB4和Pendred综合征，此类患者绝大部分伴有EVA（大前庭水管）或Mondini畸形（耳蜗阶间隔发育不良2型）。对于不同人群EVA患者的SLC26A4基因筛查发现，在中国人群中1975G>C和2027T>A两个SNP位点突变为较常见的突变类型，婚前及产前对以上两个位点的筛查预测孩子患耳聋可能性，对于优生优育有着重要意义。

SLC26A4基因的部分序列如下，其中第132位为1975G>C位点，命名为SNP2a；第184位为2027T>A位点，命名为SNP1a。

1TTGAGCCTGATGAGGATATTGAAGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAACC

51AAGGAAATAGAGATTCAAGTGGATTGGAACTCTGAGCTTCCAGTCAAAGT

101GAACGTTCCCAAAGTGCCAATCCATAGCCTTGTGCTTGACTGTGGAGCTA

151TATCTTTCCTGGACGTTGTTGGAGTGAGATCACTGCGGGTGGTAAGGTTC

201TGGTTTTCTGAATTATACATTTGGAGCTTTGGCA

对照例1

采用多重PCR-ARMS方法检测这两个相邻SNP位点，选用共用引物(命名为CP1)，序列为(5’-3’)TTGAGCCTGATGAGGATATTGAAG(SEQNO.5)，5’端FAM荧光染色。

SNP1a位点的两条ARMS引物(第一外侧引物、第二外侧引物)：扩增T碱基的引物(命名为OP-T1)，序列为(5’-3’)ACCAGAACCTTACCACCCtCA(SEQNO.1)，倒数第三位引入强错配，Tm为58.4℃，其中划横线部分17bp为竞争区，剩余4bp为特异区，OP-T1与CP1扩增片段大小为204bp；扩增A碱基的引物命名为(OP-A1)，序列为(5’-3’)tAtaCAGAACCTTACCACCaGCT(SEQNO.2)，倒数第四位引入强错配，同时在引物5’端外挂四个碱基以将碱基差异转化为序列长度差异，Tm为55.7℃，其中划横线部分15bp为竞争区，剩余3’端4bp为特异区，OP-A1与CP1扩增片段大小为206bp。

SNP2a位点的两条ARMS引物(第一内侧引物、第二内侧引物)：扩增G碱基的引物(命名为IP-G1)，序列为(5’-3’)GAAAGATATAGCTCCACAGTCAAcCAC(SEQNO.3)，倒数第四位引入中错配，TM为62.2℃，IP-G1与CP1扩增片段大小为158bp；扩增C碱基的引物(命名为IP-C1)，序列为(5’-3’)tataGAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGgAG(SEQNO.4)，倒数第三位引入中错配，同时在引物5’端外挂四个碱基以将碱基差异转化为序列长度差异，Tm为61.8℃，IP-C1与CP1扩增片段大小为162bp。用以上引物进行ARMS-PCR扩增。

ARMS-PCR体系的组成如下：

PCR温度（热循环）的谱1如下表所示

图5（1）示出谱1的毛细管荧光电泳结果。由OP-T1和CP1的组合得到的DNA片段（检测SNP1a位点）的荧光值为975RFU，由IP-G1和CP1的组合得到的DNA片段（检测SNP2a位点）的荧光值为57RFU。内侧ARMS引物的扩增产物量非常低，明显受到外侧ARMS引物的内抑制作用。

实施例1

本实施例中采用了与比较例中相同的共用上游引物（CP1）；SNP1a位点的两条ARMS引物：扩增T碱基的引物（OP-T1）和扩增A碱基的引物（OP-A1）；SNP2a位点的两条ARMS引物：扩增G碱基的引物（IP-G1），扩增C碱基的引物（IP-C1）。

增加针对SNP1a位点的ARMS引物所设计的竞争性非扩增引物命名为CNEP1，序列为(5’-3’)GAAAACCAGAACCTTACCACC-C3Spacer(SEQNO.6)，Tm为55.6℃，其中划线部分17bp为竞争区，剩余5’端4bp为调整区，在该序列3’末端采用C3Spacer修饰。用以上引物进行如下所示的ARMS-PCR扩增。

实施例中，竞争性引物的Tm值为55.6℃，外侧引物的Tm值分别为58.4℃和55.7℃，竞争区的长度为15-17bp。

ARMS-PCR体系的组成如下：

PCR温度（热循环）的谱与比较例相同。

图6（1）示出谱1的毛细管荧光电泳结果。由OP-T1和CP1的组合得到的DNA片段（检测SNP1a位点）的荧光值为582RFU，由IP-G1和CP1的组合得到的DNA片段（检测SNP2a位点）的荧光值为588RFU。内外侧ARMS引物均能扩增而且产物量比较均衡。

由图6可知CNEP1在PCR过程中与OP-T1竞争，保证了IP-G1的扩增，从而均衡了内侧ARMS引物与外侧ARMS引物的扩增效率。

图7(1)是根据内侧扩增片段的荧光值与外侧扩增片段的荧光值的比值计算得出。与图5（1）所示的ARMS-PCR结果相比较，图6（1）所示的加入CNEP1后的ARMS-PCR产生的内扩增产物与外扩增产物的比值提升了16.3倍。

综合以上结果可以看出，在只加入ARMS引物检测邻近SNP时由于扩增内抑制作用，导致内侧引物扩增效率受到严重影响。而加入CNEP时缓解了外侧ARMS引物对内侧ARMS引物的内抑制作用，均衡了内侧和外侧ARMS引物的扩增效率，提高了SNP位点的检测准确性。

第二实施例部分

本实施例及对照例中所用的模板DNA是利用磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司）提取。

所有第一SNP位点和第二SNP位点的引物、共用引物、外侧竞争性非扩增引物均购自上海生工生物工程有限公司。

共用引物在5’端进行ROX荧光修饰。

外侧ARMS竞争性非扩增引物在3’端进行-NH₂C6修饰。

反应混合物ReactionMix包含dNTP、Mg²⁺、缓冲溶液等，采用常规配置即可，由无锡中德美联生物技术有限公司配制。PCR后的电泳解析采用ABI3130遗传分析仪（ABI公司制）。

以下的实施例和比较例中，检测的SNP位点为人的线粒体12s-MTRNR1基因所存在的1494C>T和1555A>G两个邻近的SNP位点。线粒体DNA突变是导致呈母系遗传的药物性耳聋的最常见原因。在已报道的与遗传性非综合征型耳聋相关的线粒体DNA（mtDNA）突变中，以12s-MTRNR1基因的1555A>G突变最为常见。近几年关于12s-MTRNR1基因1494C>T的研究也成为我国学者研究线粒体基因突变致聋的热点。避免该基因突变携带者使用氨基糖甙类抗生素是预防及减少此类耳聋发生的关键。

12s-MTRNR1基因的部分序列如下，其中第122位为1494C>T位点，命名为SNP2b；第183位为1555A>G位点，命名为SNP1b。

1TACCCCAGAAAACTACGATAGCCCTTATGAAACTTAAGGGTCGAAGGTGG

51ATTTAGCAGTAAACTAAGAGTAGAGTGCTTAGTTGAACAGGGCCCTGAAG

101CGCGTACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGTATACTTCAAAGGACATTT

151AACTAAAACCCCTACGCATTTATATAGAGGAGACAAGTCGTAACATGGTA

201AGTGTACTGGAAAGTGCACTTGGACGAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAA

251GCACCCAACTTACACTTAGGAGATTTCAACTTAACTTGACCGCTCTGA

对照例2

采用多重PCR-ARMS方法检测这两个相邻SNP位点，选用共用引物(命名为CP2)，序列为(5’-3’)ACATTTTCTACCCCAGAAAACTACG(SEQNO.11)，5’端ROX荧光染色。

SNP1b位点的两条ARMS引物(第一外侧引物、第二外侧引物)：扩增A碱基的引物(命名为OP-A2)，序列为(5’-3’)CAGTACACTTACCATGTTACtACTTGT(SEQNO.7)，倒数第七位引入强错配，Tm为57.4℃，其中划横线部分12bp为竞争区，剩余15bp为特异区，OP-A2与CP2扩增片段大小为217bp；扩增G碱基的引物命名为(OP-G2)，序列为(5’-3’)atatCAGTACACTTACCATGTTACGAaTTGC(SEQNO.8)，倒数第五位引入强错配，同时在引物5’端外挂四个碱基以将碱基差异转化为序列长度差异，Tm为61.8℃，其中划横线部分12bp为竞争区，剩余3’端15bp为特异区，OP-A1与CP1扩增片段大小为221bp。

SNP2位点的两条ARMS引物(第一内侧引物、第二内侧引物)：扩增C碱基的引物(命名为IP-C2)，序列为(5’-3’)ATGTCCTTTGAAGTATACTTGAGtAGG(SEQNO.9)，倒数第四位引入强错配，TM为57.6℃，IP-C2与CP2扩增片段大小为156bp；扩增T碱基的引物(命名为IP-T2)，序列为(5’-3’)tataATGTCCTTTGAAGTATACTTGAGGcGA(SEQNO.10)，倒数第三位引入强错配，同时在引物5’端外挂四个碱基以将碱基差异转化为序列长度差异，TM为64.3℃，IP-C2与CP2扩增片段大小为160bp。用以上引物进行ARMS-PCR扩增。

ARMS-PCR体系的组成如下：

PCR温度（热循环）的谱2如表2所示

表2

图5（2）示出谱2的毛细管荧光电泳结果。由OP-A2和CP2的组合得到的DNA片段（检测SNP1b位点）的荧光值为2595RFU，由IP-C2和CP2的组合得到的DNA片段（检测SNP2b位点）的荧光值为716RFU。内侧ARMS引物的扩增产物量非常较低，受到外侧ARMS引物的内抑制作用。

实施例2

本实施例中采用了与比较例中相同的共用上游引物（CP2）；SNP1b位点的两条ARMS引物：扩增A碱基的引物（OP-A2）和扩增G碱基的引物（OP-G2）；SNP2b位点的两条ARMS引物：扩增C碱基的引物（IP-C2），扩增T碱基的引物（IP-T2）。

增加针对SNP1b位点的ARMS引物所设计的竞争性非扩增引物命名为CNEP2，序列为(5’-3’)CAAGTGCACTTTCCAGTACACTTAC-NH2C6(SEQNO.12)，Tm为58.2℃，其中划线部分12bp为竞争区，剩余5’端13bp为调整区，在该序列3’末端采用-NH2C6修饰。用以上引物进行如下所示的ARMS-PCR扩增。

实施例中，竞争性引物的Tm值为58.2℃，外侧引物的Tm值分别为57.4℃和61.8℃，竞争区的长度为12bp。

ARMS-PCR体系的组成如下：

PCR温度（热循环）的谱与比较例相同。

图6（2）示出谱2的毛细管荧光电泳结果。由OP-A2和CP2的组合得到的DNA片段（检测SNP1b位点）的荧光值为1303RFU，由IP-C2和CP2的组合得到的DNA片段（检测SNP2b位点）的荧光值为1040RFU。内外侧ARMS引物均能扩增而且产物量比较均衡。

由图6可知CNEP2在PCR过程中与OP-A2竞争，保证了IP-C2的扩增，从而均衡了内侧ARMS引物与外侧ARMS引物的扩增效率。

图7是根据内侧扩增片段的荧光值与外侧扩增片段的荧光值的比值计算得出。与图5（2）所示的ARMS-PCR结果相比较，图6（2）所示的加入CNEP2后的ARMS-PCR产生的内扩增产物与外扩增产物的比值提升了1.9倍，这一结果由图7（3）及图7（3）示出。

综合以上结果可以看出，在只加入ARMS引物检测邻近SNP时由于扩增内抑制作用，导致内侧引物扩增效率受到严重影响，改变PCR退火温度对缓解内抑制现象效果不明显。而加入CNEP时缓解了外侧ARMS引物对内侧ARMS引物的内抑制作用，均衡了内侧和外侧ARMS引物的扩增效率，提高了SNP位点的检测准确性。

第三实施例部分

本实施例及对照例中所用的模板DNA是利用磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司）提取。

所有第一SNP位点和第二SNP位点的引物、共用引物、外侧竞争性非扩增引物均购自上海生工生物工程有限公司。

共用引物在5’端进行FAM荧光修饰。

外侧ARMS竞争性非扩增引物在3’端进行磷酸化修饰。

反应混合物ReactionMix包含dNTP、Mg²⁺、缓冲溶液等，采用常规配置即可，由无锡中德美联生物技术有限公司配制。PCR后的电泳解析采用ABI3130遗传分析仪（ABI公司制）。

以下的实施例和比较例中，检测的SNP位点为水稻可溶性淀粉酶基因SSIIIa所存在的4074G>A和4117T>G两个邻近的SNP位点。水稻可溶性淀粉酶是控制水稻支链淀粉生物合成的关键酶之一，对支链淀粉结构的形成和稻米品质起着重要作用。近几年关于SSIIIa基因的SNP位点研究成为我国学者研究水稻品质基因及分子育种的热点。有研究表明SSIIIa基因的支链淀粉结构与糊化起始温度与4074G>A和4117T>G两个邻近的SNP位点显著相关。

水稻可溶性淀粉酶基因SSIIIa部分序列如下，其中第4074位为4074G>A位点，命名为SNP1c；第4117位为4117T>G位点，命名为SNP2c。

1GATGTTTTTGACCAAATAAGTTACTATTTCACATCCTAAGACATGTTATA

51AAATTCATCCAAACTCAGTATTCTTTCAAATATACAATAATTAATTTGAC

101CAGTTAGATCATTCTTCACTTTGAACTTGTGCCTTAAGCTGACTGTTTTG

151ACCAAACGAATTGATGGCCCACCCAGTTAGCAGTTAGCACTATTTATTGG

201AACTTCTGTTATACCATATTATATTATTCAAGGAAAAATGTAGTTGTTCA

251CTGTCATGTATATATCTTGATGTTTTGAACATCAGATATATGTTGTGAAG

对照例

采用多重PCR-ARMS方法检测这两个相邻SNP位点，选用共用引物(命名为CP3)，序列为(5’-3’)TATACATGACAGTGAACAACTACAT(SEQNO.17)，5’端FAM荧光染色。

SNP1c位点的两条ARMS引物(第一外侧引物、第二外侧引物)：扩增G碱基的引物(命名为OP-G3)，序列为(5’-3’)AATAAGTTACTATTTCACATCCTtAG(SEQNO.13)，倒数第三位引入中错配，Tm为52℃，其中划横线部分6bp为竞争区，剩余17bp为特异区，OP-G3与CP3扩增片段大小为248bp；扩增A碱基的引物命名为(OP-A3)，序列为(5’-3’)attaAATAAGTTACTATTTCACATCCTAtA(SEQNO.14)，倒数第二位引入中错配，同时在引物5’端外挂四个碱基以将碱基差异转化为序列长度差异，Tm为54.9℃，其中划横线部分6bp为竞争区，剩余3’端18bp为特异区，OP-A3与CP3扩增片段大小为252bp。

SNP2位点的两条ARMS引物(第一内侧引物、第二内侧引物)：扩增T碱基的引物(命名为IP-T3)，序列为(5’-3’)AAACTCAGTATTCTTTCAAAcAT(SEQNO.15)，倒数第三位引入强错配，Tm为50.5℃，IP-T3与CP3扩增片段大小为201bp；扩增G碱基的引物(命名为IP-G3)，序列为(5’-3’)attaAAACTCAGTATTCTTTCAAATtG(SEQNO.16)，倒数第二位引入中错配，同时在引物5’端外挂四个碱基以将碱基差异转化为序列长度差异，Tm为56.2℃，IP-G3与CP3扩增片段大小为205bp。用以上引物进行ARMS-PCR扩增。

ARMS-PCR体系的组成如下：

PCR温度（热循环）的谱3如表3所示

表3

图5（3）示出谱3的毛细管荧光电泳结果。由OP-G3和CP3的组合得到的DNA片段（检测SNP1c位点）的荧光值为4550RFU，由IP-T3和CP3的组合得到的DNA片段（检测SNP2c位点）的荧光值为1350RFU。内侧ARMS引物的扩增产物量非常较低，受到外侧ARMS引物的内抑制作用。

实施例3

本实施例中采用了与比较例中相同的共用上游引物（CP3）；SNP1c位点的两条ARMS引物：扩增G碱基的引物（OP-G3）和扩增A碱基的引物（OP-A3）；SNP2c位点的两条ARMS引物：扩增C碱基的引物（IP-T3），扩增T碱基的引物（IP-G3）。

增加针对SNP1c位点的ARMS引物所设计的竞争性非扩增引物命名为CNEP3，序列为(5’-3’)GGATGTTTTTGACCAAATAAG，3’端磷酸化(SEQNO.18)，Tm为52.1℃，其中划线部分6bp为竞争区，剩余5’端15bp为调整区，在该序列3’末端采用磷酸化修饰。用以上引物进行如下所示的ARMS-PCR扩增。

实施例中，竞争性引物的Tm值为52.1℃，外侧引物的Tm值分别为52℃和54.9℃，竞争区的长度为6bp。

ARMS-PCR体系的组成如下：

PCR温度（热循环）的谱与比较例相同。

图6（3）示出谱3的毛细管荧光电泳结果。由OP-G3和CP3的组合得到的DNA片段（检测SNP1c位点）的荧光值为2980RFU，由IP-T3和CP3的组合得到的DNA片段（检测SNP2c位点）的荧光值为2520RFU。内外侧ARMS引物均能扩增而且产物量比较均衡。

由图6可知CNEP2在PCR过程中与OP-G3竞争，保证了IP-T3的扩增，从而均衡了内侧ARMS引物与外侧ARMS引物的扩增效率。

图7是根据内侧扩增片段的荧光值与外侧扩增片段的荧光值的比值计算得出。与图5（3）所示的ARMS-PCR结果相比较，图6（3）所示的加入CNEP3后的ARMS-PCR产生的内扩增产物与外扩增产物的比值提升约了1.9倍，这一结果由图7（5）及图7（6）示出。

综合以上结果可以看出，在只加入ARMS引物检测邻近SNP时由于扩增内抑制作用，导致内侧引物扩增效率受到严重影响，改变PCR退火温度对缓解内抑制现象效果不明显。而加入CNEP时缓解了外侧ARMS引物对内侧ARMS引物的内抑制作用，均衡了内侧和外侧ARMS引物的扩增效率，提高了SNP位点的检测准确性。

SEQUENCELISTING

<110>无锡中德美联生物技术有限公司

<120>一种检测邻近SNP的多重PCR方法

<130>none

<160>18

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

accagaaccttaccaccctca21

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tatacagaaccttaccaccagct23

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaaagatatagctccacagtcaaccac27

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tatagaaagatatagctccacagtcaaggag31

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ttgagcctgatgaggatattgaag24

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gaaaaccagaaccttaccacc21

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cagtacacttaccatgttactacttgt27

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

atatcagtacacttaccatgttacgaattgc31

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

atgtcctttgaagtatacttgagtagg27

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tataatgtcctttgaagtatacttgaggcga31

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

acattttctaccccagaaaactacg25

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

caagtgcactttccagtacacttac25

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aataagttactatttcacatccttag26

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

attaaataagttactatttcacatcctata30

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

aaactcagtattctttcaaacat23

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

attaaaactcagtattctttcaaattg27

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tatacatgacagtgaacaactacat25

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ggatgtttttgaccaaataag21

Claims (6)

1.一种扩增邻近SNPs位点的多重PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括有：引物、dNTPs、Taq酶、缓冲液；所述的试剂盒用于扩增目标碱基序列中沿核酸序列3’-5’方向的第一SNP位点和第二SNP位点，所述的引物包括：

(1)第一外侧引物和第一内侧引物，所述的第一外侧引物和第一内侧引物分别用于检测第一SNP位点和第二SNP位点，所述的第一外侧引物是由沿引物3’-5’方向的特异区和第一竞争区组成，竞争区的长度大于5个碱基；

(2)外侧竞争性非扩增引物，所述的外侧竞争性非扩增引物包括有沿引物3’-5’方向的碱基修饰、第二竞争区和调整区，所述的第二竞争区和第一竞争区都与目标碱基序列相同位置互补，所述的碱基修饰使外侧竞争性非扩增引物的3’端不发生PCR延长反应；

(3)共用引物；所述的共用引物是与所述第一外侧引物、第一内侧引物和外侧竞争性非扩增引物形成引物对，从而能够使所述核酸扩增的引物；

所述的引物中还包括有第二外侧引物和第二内侧引物，第一外侧引物对第一SNP位点的野生型或者突变型中的一种特异，第二外侧引物对另一种特异；第一内侧引物对第二SNP位点的野生型或者突变型中的一种特异，第二内侧引物对另一种特异；第二外侧引物是由沿引物3’-5’方向的特异区和第三竞争区组成，竞争区的长度大于5个碱基且第二外侧引物与第一外侧引物存在至少1个碱基的长度差异，第二内侧引物与第一内侧引物存在至少1个碱基的长度差异；共用引物与所述第一、第二外侧引物和第一、第二内侧引物和外侧竞争性非扩增引物形成引物对；

所述的第一、第二外侧引物和第一、第二内侧引物的3’端的第3～7位的碱基中有一个或者几个是错配碱基；

所述的第一或第二竞争区从第一或第二外侧引物上沿引物3’-5’方向最后一个错配碱基的下一个碱基开始；

所述的外侧竞争性非扩增引物与第一、第二外侧引物的浓度比在0.1：1～10：1范围内；

所述的外侧竞争性非扩增引物的Tm值是第一、第二外侧引物的Tm值的±5℃。

2.根据权利要求1所述的扩增邻近SNPs位点的多重PCR试剂盒，其特征在于：所述的多重PCR方法是指对2个相邻的SNP位点进行检测的方法。

3.根据权利要求1所述的扩增邻近SNPs位点的多重PCR试剂盒，其特征在于：所述外侧竞争性非扩增引物的3’端采用磷酸基、氨基、生物素基、巯基、ddNTP或者肩臂修饰。

4.根据权利要求2所述的扩增邻近SNPs位点的多重PCR试剂盒，其特征在于：当采用琼脂糖电泳对扩增产物进行分析时，在第二外侧和第二内侧引物5’端增加10个以上碱基；当采用聚丙烯酰胺电泳对扩增产物进行分析时，第二外侧和第二内侧引物5’端增加2个以上碱基；当采用毛细管电泳对扩增产物进行分析时，在第二外侧和第二内侧引物5’端增加1个以上碱基。

5.一种检测人的线粒体12s-MTRNR1基因上SNP位点的试剂盒，其特征在于，包括有如下两个SNP位点的引物，以及一条外侧竞争性非扩增引物，引物序列是：

1555A>G

第一外侧引物：CAGTACACTTACCATGTTACtACTTGT

第二外侧引物：atatCAGTACACTTACCATGTTACGAaTTGC

1494C>T

第一内侧引物：ATGTCCTTTGAAGTATACTTGAGtAGG

第二内侧引物：tataATGTCCTTTGAAGTATACTTGAGGcGA

共用引物：ACATTTTCTACCCCAGAAAACTACG

外侧竞争性非扩增引物：CAAGTGCACTTTCCAGTACACTTAC；

所述的外侧竞争性非扩增引物的3’端采用-NH₂C6修饰。

6.一种检测水稻可溶性淀粉酶基因SSIIIa的SNP位点的试剂盒，其特征在于，包括有如下两个SNP位点的引物，以及一条外侧竞争性非扩增引物，引物序列是：

4074G>A

第一外侧引物：AATAAGTTACTATTTCACATCCTtAG

第二外侧引物：attaAATAAGTTACTATTTCACATCCTAtA

4117T>G

第一内侧引物：AAACTCAGTATTCTTTCAAAcAT

第二内侧引物：attaAAACTCAGTATTCTTTCAAATtG

共用引物：TATACATGACAGTGAACAACTACAT

外侧竞争性非扩增引物：GGATGTTTTTGACCAAATAAG

所述的外侧竞争性非扩增引物的3’端采用磷酸化修饰。