CN103319622A - 白首乌多糖的酪氨酸酶抑制活性及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从中药白首乌中提取、分离得到的总多糖的酪氨酸酶抑制活性，阐明了其在医药、食品、日用化工领域的新用途。通过酶促反应检测白首乌总多糖对酪氨酸酶二酚酶活力的影响，实验结果证明白首乌总多糖对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力抑制作用很强，IC50为31.8μg/mL，其抑制机制属于可逆的竞争性抑制。白首乌总多糖可用于制备治疗色素沉着性疾病的药物，也可用于制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的保健食品及化妆品，还可用于制备果蔬护色剂以防止食品褐变。白首乌总多糖基于酪氨酸酶抑制活性的上述应用具有天然、高效、安全、无毒的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种白首乌多糖的酪氨酸酶抑制活性及其用途。本发明涉及从中药白首乌中提取、分离得到的总多糖具有抑制酪氨酸酶的活性，阐明了其制备方法及其在医药、食品、日用化工领域的新用途。
背景技术
酪氨酸酶是一种含铜的多酚氧化酶，它是生物体黑素合成过程中的限速酶，催化酪氨酸羟化为多巴、多巴氧化为多巴醌以及5，6-二羟基吲哚(DHI)氧化为5，6-吲哚醌三个步骤。其表达和活性决定着黑色素生成的量和速度。反应过强可引起黑素过多症，如雀斑、黄褐斑等，黑色素生成过多是黄褐斑形成的根本原因；反应过弱或缺乏反应，则可引发白发、白癜风等。它的活性决定着黑色素的合成及合成量的多少，控制其活力即可控制黑色素的生成量，从而治疗色素沉着性疾病或在化妆品领域用于皮肤防晒、增白、祛斑。另外，食品加工与储藏过程中经常会发生酶促褐变等变色现象，引起褐变的酶主要就是酪氨酸酶，绝大多数褐变影响食品加工与储藏的效果和质量的稳定，尽可能降低酪氨酸酶的活性有助于改善食品褐变现象。
白首乌来源于萝摩科鹅绒藤属3种植物【分别为耳叶牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)、戟叶牛皮消(Cynanchum bungei Decne)和隔山消(Cynanchum wifordii Hemsl)】的块根，是临床常用的补益和抗衰老中药，自古以来就被视为摄生防老、益精养颜的珍品。现代研究发现白首乌中含有多种活性成分，如C21甾苷、多糖、磷脂等。如公开号为CN1583799A的专利申请“白首乌多糖的提取及其口含片制备”公开了白首乌多糖的提取及其口含片的制备技术并指出白首乌多糖具有免疫调节作用，公开号为CN1876003A的专利申请“白首乌有效部位的制备方法及其在治疗失眠药物中的用途”公开了白首乌磷脂和白首乌多糖的提取工艺及其在治疗失眠药物和治疗或改善失眠的食品中的用途，公开号为CN102649822A的专利申请“一种从新鲜白首乌中提取多糖的方法”公开了一种从新鲜的白首乌中提取多糖的工艺优化了的方法。但目前尚无白首乌药材中提取的多糖具有抑制酪氨酸酶的活性及其相关用途的报道。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种白首乌总多糖的新用途。本发明白首乌总多糖有显著的酪氨酸酶抑制活性，可用于制备治疗色素沉着性疾病的药物，也可用于制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的保健食品及化妆品，还可用于制备果蔬护色剂以防止食品褐变。
本发明通过以下技术方案实现：
所述白首乌总多糖是这样制备的：白首乌粉经多次乙醇提取后，取残渣风干，然后沸水浸提，提取液用α-淀粉酶、糖化酶去淀粉，用木瓜蛋白酶及Sevag试剂除蛋白，上清液浓缩，加入乙醇沉淀，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得白首乌总多糖。
白首乌总多糖影响酪氨酸酶活力检测方法：取适量白首乌总多糖，用磷酸盐缓冲液溶解配制成浓度为1mg/mL(在反应体系的终浓度为0.2mg/mL)的溶液，通过酶促反应检测其对酪氨酸酶二酚酶活力的影响。取适量氢醌溶于磷酸盐缓冲液中制得浓度1mg/mL溶液，作为阳性对照溶液。取待测物溶液50μL，并用pH6.8磷酸盐缓冲液适量稀释至140μL，与酪氨酸酶液(25U/mL)50μL混合，于37℃孵育5min，加入15mmol/L的左旋多巴溶液60μL，继续孵育2min，立即于酶标仪492nm处测光吸收值并计算酪氨酸酶抑制率。白首乌总多糖对酪氨酸酶活力的抑制率为73.1％，而作为阳性对照物氢醌在同样浓度时的抑制率为69.2％。说明在终浓度为0.2mg/mL时，白首乌总多糖与氢醌对酪氨酸酶的抑制率相当。
本发明提供的白首乌总多糖可以作为活性成分，可以加入一种或多种药剂学上可接受的载体，载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、润滑剂、渗透压调节剂，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂，用于治疗色素沉着性疾病如黄褐斑以及其它需要抑制酪氨酸酶活性的疾病。所述的制剂包括注射液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸、外用溶液剂等。
本发明提供的白首乌总多糖可以作为活性成分，加入食品工业允许添加的成分制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的保健食品，如冲调粉、口服液、胶囊、口服片等。
本发明提供的白首乌总多糖用于制备防晒、增白、祛斑化妆品在配方上没有特别的限制，可制成防晒乳、防晒霜、按摩霜、面膜、凝胶、身体护理乳液、身体护理油和身体护理精华等。
本发明提供的白首乌总多糖还可用于制备果蔬护色剂以防止食品褐变，护色剂可以是白首乌多糖的水溶液，也可以白首乌多糖为主，添加一些有助于护色的安全无毒害的物质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供的具有酪氨酸酶抑制活性的白首乌总多糖具有许多新的用途：可用于制备治疗色素沉着性疾病的药物，也可用于制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的保健食品及化妆品，还可用于制备果蔬护色剂以防止食品褐变。由于其酪氨酸酶抑制活性较强和具有可食性，用于制备药物高效、安全；用于制备保健食品安全无毒；作为果蔬护色剂安全性好，不影响果蔬的营养价值，不改变果蔬的性状，对环境友好，预防果蔬加工过程中的褐变，有利于鲜切果蔬的上市，既适合企业生产加工，也适合普通人群使用；并且由于其源于天然，用于制备化妆品迎合受众崇尚自然的心理，用量较少而效果明显，生产成本较低，安全无害。
附图说明
图1白首乌总多糖对酪氨酸酶抑制作用的进程曲线(图中直线1-6多糖的浓度分别为：0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12mg/mL)
图2白首乌总多糖抑制酪氨酸酶活力量效关系曲线
图3白首乌总多糖对酪氨酸酶抑制机理曲线(图中直线1-6多糖的浓度分别为：0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12mg/mL)
图4白首乌总多糖对酪氨酸酶抑制类型的测定(图中直线1-6多糖的浓度分别为：0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12mg/mL)
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，对本领域技术人员来说，所有类似的取代和修饰显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求书所限定的范围之内。
实施例1
白首乌总多糖的制备：白首乌块根用粉碎机粉碎，白首乌粉20g经多次乙醇提取后，取残渣风干，按照料液比1∶20进行沸水浸提，提取液用α-淀粉酶、糖化酶去淀粉，用木瓜蛋白酶及Sevag试剂(氯仿∶正丁醇为5∶1)去除蛋白质，上清液浓缩至一定体积，加入乙醇沉淀，经离心分离沉淀后，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得白首乌多糖1.39g。
实施例2
白首乌总多糖的制备：白首乌块根用粉碎机粉碎，过20目筛，白首乌粉末经过数次乙醇提取，取残渣风干至无醇味，按照料液比1∶20比例进行沸水提取，水浴2h，4000r/min离心5min，取上清液抽滤。加淀粉酶至抽滤过的上清液中，调至PH＝6，85℃水浴1.5h，用I2/KI检测至I2不变色。加糖化酶(提前45℃)，PH调至6，水浴60℃条件下1h，抽滤去掉残渣，收集提取液，浓缩至小体积。上述小体积浓缩液，按1∶3比例加入三氯甲烷和甲醇(5∶1)的混合液，3500r/min离心3min，混合液与上清液之间的沉淀即为蛋白质，收集上清液，按照上述方法重复数次至中间没有明显沉淀，所得上清液即为多糖溶液。多糖溶液进一步浓缩，加3倍体积无水乙醇沉淀，然后用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀，真空干燥既得白首乌总多糖。
实施例3
白首乌总多糖抑制酪氨酸酶活力实验方法：
试剂：蘑菇酪氨酸酶(EC.1.14.18.1，比活力为5370U/mg)及左旋多巴(1-dopa)均为Sigma公司产品，氢醌(AR级)为北京紫竹药业有限公司产品，其他试剂(AR级)均为国药集团上海化学试剂公司产品。
仪器：AL104型电子分析天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司制造；Muitiskan MK3多功能酶标仪，上海雷勃分析仪器有限公司产品。
酪氨酸酶用磷酸盐缓冲液溶解配制成500U/mL溶液，分装冻存，实验前用磷酸盐缓冲液稀释为25U/mL备用。实验前称取适量左旋多巴，用磷酸盐缓冲液溶解配制15mmol/L溶液，振摇，充分溶解后备用。取适量白首乌总多糖，用磷酸盐缓冲液溶解配制成浓度为1mg/mL(在反应体系的终浓度为0.2mg/mL)的溶液，通过酶促反应检测其对酪氨酸酶二酚酶活力的影响。取适量氢醌溶于磷酸盐缓冲液中制得浓度1mg/mL(在反应体系的终浓度为0.2mg/mL)的溶液，作为阳性对照溶液。通过酶促反应检测其对酪氨酸酶二酚酶活力的影响。取待测样品溶液50μL，并用pH6.8磷酸盐缓冲液适量稀释至140μL，与酪氨酸酶液(25U/mL)50μL混合，于37℃孵育5min，加入15mmol/L的左旋多巴溶液60μL，继续孵育2min，立即于酶标仪492nm处测光吸收值C。如果用磷酸盐缓冲液50μL代替酪氨酸酶液50μL，则测得的光吸收值为D；如果用磷酸盐缓冲液50μL代替待测样品溶液50μL，则测得的光吸收值为A；如果用磷酸盐缓冲液100μL代替待测样品溶液50μL和酪氨酸酶液50μL，则测得的光吸收值为B。白首乌总多糖或氢醌对酪氨酸酶抑制率按以下公式计算：
酶抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)*100
式中：A＝A492+药+酶；含底物和酶，不加待测样品反应后的光吸收值；
B＝A492+药+酶；含底物，不加待测样品和酶的光吸收值；
C＝A492+药+酶；含底物和酶，加入待测样品反应后的光吸收值；
D＝A492+药+酶。含底物和待测样品，不加酶的光吸收值。
实验结果白首乌总多糖在终浓度为0.2mg/mL时对酪氨酸酶活力的抑制率为73.1％，而阳性对照物氢醌在同样浓度时的抑制率为69.2％，说明白首乌总多糖与氢醌对酪氨酸酶的抑制率相当。
实施例4
白首乌总多糖抑制酪氨酸酶活力量效关系实验方法：把总多糖用磷酸盐缓冲液稀释为不同浓度(终浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.12mg/mL)，按实施例3方法测光吸收值，其光吸收值随时间变化的曲线即多糖抑制酪氨酸酶催化氧化底物的反应进程曲线。酶的终浓度为9.2μg/mL，左旋多巴溶液的终浓度为3.6mmol/L。
实验结果多糖对酶作用的进程曲线为直线，说明多糖影响酪氨酸酶催化1-dopa氧化不存在迟滞过程，在反应体系中加入多糖后，直线的斜率随着加入的多糖浓度增大而下降(图1)，说明多糖对酪氨酸酶活力有抑制作用，抑制作用随多糖浓度增加而加强。多糖对酪氨酸酶活力的浓度效应实验结果见图2。随着抑制剂浓度的增大，相对酶活力下降，导致酶活力下降一半所需的抑制剂浓度(IC50)为31.8μg/mL。
实施例5
白首乌总多糖对酪氨酸酶抑制作用机理探讨：在实施例4所述浓度的多糖抑制酪氨酸酶测活体系中，确定底物为1-dopa溶液，其用量为60μL(终浓度为3.6mmol/L)，加入不同浓度的酪氨酸酶，测定剩余酶活力与酶浓度的关系，通过作图法判断抑制剂的作用机理。
图3表示酪氨酸酶经多糖作用后的剩余酶活力与加入酶浓度间的关系，得到一组通过原点的直线，随着加入的多糖浓度增大，直线的斜率降低，说明多糖对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程，多糖是酪氨酸酶的可逆抑制剂，增加效应物含量导致酶活力的下降是通过抑制酶活力降低其催化速率，而不是通过降低其有效的酶量而使其活力下降。
在实施例4所述浓度的多糖抑制酪氨酸酶测活体系中，确定酪氨酸酶溶液的用量为50μL(终浓度为9.2μg/mL)，加入不同体积的1-dopa溶液，多糖对酪氨酸酶抑制作用类型的测定采用Lineweaver-Burk双倒数法作图判断，抑制常数通过直线的斜率和纵轴截踞对效应物含量二次作图测定。
图4为多糖对酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver-Burk双倒数作图，得到1组纵轴截距不变的直线，说明多糖作为酪氨酸酶抑制剂，它不改变酶促反应的最大反应速度(Vmax)，只影响米氏常数(Km)，且Km值随着抑制剂浓度的增大而增大，表现酶对底物的亲和力下降，底物与抑制剂同酶分子的结合是相互竞争的，其抑制剂类型为竞争性类型。图中表现出酶反应的Vmax不随抑制剂浓度增大而变化，说明多糖只能与游离酶(E)结合，而不能与酶-底物络合物(ES)结合。
实施例6
取白首乌总多糖在常温下用水溶解，配成浓度为100μg/mL的果疏护色液。取新鲜马铃薯，水洗后去皮，切成薯条，放入盛装上述护色液的容器中，一定将鲜切马铃薯条全部淹没，浸泡15min后捞出，装袋密封，4℃储藏1周或-20℃冻存，可保护薯条不发生褐变。
实施例7
取白首乌总多糖在常温下用纯净水溶解，配成浓度为80μg/mL的果疏护色液。取新鲜苹果或梨子等切开易褐变的水果，水洗后削去皮，切成所需形状的水果块，放入盛装上述护色液的清洁食器中，一定将水果块全部淹没，浸泡10min后捞出，拼装冷盘供食客享用，可保护果块新鲜而不变成褐色。
Claims (7)
1.一种白首乌来源的多糖，其特征在于对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力有很强的抑制作用从而可应用于相关领域。
2.根据权利要求1所述白首乌多糖的酪氨酸酶抑制活性，其特征在于抑制机制属于可逆的竞争性抑制。
3.根据权利要求1所述白首乌多糖的相关领域的应用，其特征在于可用于制备治疗色素沉着性疾病的药物，也可用于制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的保健食品及化妆品，还可用于制备果蔬护色剂以防止食品褐变。
4.根据权利要求3所述白首乌多糖用于制备治疗色素沉着性疾病的药物，其特征在于其可以作为活性成分，可以加入一种或多种药剂学上可接受的载体，载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、润滑剂、渗透压调节剂，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂，用于治疗色素沉着性疾病如黄褐斑以及其它需要抑制酪氨酸酶活性的疾病。所述的制剂包括注射液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸、外用溶液剂等。
5.根据权利要求3所述白首乌多糖用于制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的保健食品，其特征在于白首乌总多糖可以作为活性成分，加入食品工业允许添加的成分制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的保健食品，如冲调粉、口服液、胶囊、口服片等。
6.根据权利要求3所述白首乌多糖用于制备预防皮肤晒黑、增白、祛斑的化妆品，其特征在于其在配方上没有特别的限制，可制成防晒乳、防晒霜、按摩霜、面膜、凝胶、身体护理乳液、身体护理油和身体护理精华等。
7.根据权利要求3所述白首乌多糖用于制备果蔬护色剂，其特征在于护色剂可以是白首乌多糖的水溶液，也可以白首乌多糖为主，添加一些有助于护色的安全无毒害的物质。
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Effective date of registration: 20200903 Address after: 265607 Beijing Road, Penglai Economic Development Zone, Yantai, Shandong 7 Patentee after: YANTAI BAOFULING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 710000 Shaanxi Xi'an economic and Technological Development Zone, Fengcheng four road, Ming Guang road, southeast corner of the new business building 1808 Patentee before: SHAANXI ZHUANYI INTELLECTUAL PROPERTY OPERATION Co.,Ltd. |
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Denomination of invention: Tyrosinase inhibitory activity of Polygonum multiflorum polysaccharide and its application Effective date of registration: 20211207 Granted publication date: 20160224 Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: YANTAI BAOFULING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980014256 |
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Date of cancellation: 20230612 Granted publication date: 20160224 Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: YANTAI BAOFULING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980014256 |