CN103319497B - 天然产物Hirtellanine B及其衍生物的制备方法与在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了天然产物Hirtellanine？B的制备方法，以2，4，6-三羟基苯乙酮为原料，通过制备化合物a、b、c、d、e、f、g等步骤，制得天然产物Hirtellanine？B。本发明人对Hirtellanine？B及其14个Hirtellanine？B衍生物进行了生物活性筛选，结果显示天然产物Hirtellanine？B能够抑制Jurkat细胞，Raji细胞以及K562细胞增殖。它们对肿瘤细胞均具有一定的抑制活性。本发明方法原料易得，反应收率高，操作合理，宜于工业化生产。本发明Hirtellanine？B及其衍生物可用于制备治疗肿瘤药物，有较大的临床应用价值。本发明天然产物Hirtellanine？B的制备方法反应式如下：
Description
技术领域
本发明涉及天然药物，具体涉及天然产物HirtellanineB及其衍生物的制备方法与在制备治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术
天然产物HirtellanineB的化学结构式如下：
该化合物由寿清耀等人从植物Campylotropishirtella(Franch.)Schindl.的根中提取分离得到的一个异黄酮类化合物(Shou，Q.Y.；etal.，Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，13，3389)。生物活性测试其表现出中等B淋巴细胞抑制活性(IC50＝3.00μM)和T淋巴细胞抑制活性(IC50＝9.55μM)。本发明人经研究，通过化学合成方法制备得到天然产物HirtellanineB，并制备了该化合物的系列衍生物。经药效实验发现了化合物HirtellanineB对人白血病淋巴细胞(Jurkat)和恶性B淋巴瘤细胞株(Raji)的生长具有显著的抑制作用，(IC50分别为92.6ug/ml和63.0ug/ml)。因此，有进一步开发的前景。其主要作用机制是通过抑制恶性淋巴细胞的G2/M期，进而抑制其细胞增殖与生长，最终将引起恶性淋巴细胞凋亡。
本发明在完成HirtellanineB全合成的基础上合成了14个HirtellanineB衍生物，生物活性筛选结果显示这些衍生物对肿瘤细胞均具有一定的抑制活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计天然产物HirtellanineB的化学制备方法及其在制药中的应用。
本发明提供了一种天然产物HirtellanineB的制备方法，反应式如下：
包括下列步骤：
(1)制备化合物a(5，7-二羟基色酮)；
2，4，6-三羟基苯乙酮在三氟化硼乙醚和甲磺酰氯存在下与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)进行Vilsmeyer-Haack(维尔斯迈尔-哈克)甲酰化反应；2，4，6-三羟基苯乙酮与三氟化硼乙醚和甲磺酰氯摩尔比为1.0：2.0～5.0：1.5～4.5，反应溶剂为DMF，温度为0～50℃，时间为0.5～2.0小时；随后反应物发生闭环反应，得到化合物a(5，7-二羟基色酮)；溶剂为DMF，反应时间为1～6小时，反应温度为0～100℃；
(2)制备化合物b(7-(1，1-二甲基-2-丙炔氧基)-5-羟基色酮)；
化合物a溶解于丙酮中，在碳酸钾和碘化钾存在下，碘化亚铜催化,与3-氯-3-甲基-1-丁炔进行选择性单醚化反应,得到化合物b(7-(1，1-二甲基-2-丙炔氧基)-5-羟基色酮)；相对于化合物a，碳酸钾用量为2.0～5.0，碘化钾用量为2.0-4.5，催化剂用量为0.02～0.1当量(优选为0.05当量)，3-氯-3-甲基-1-丁炔用量为1.0～1.5当量(优选1.05当量)；温度为40～70℃，反应时间为1.0～5.0小时；
(3)制备化合物c(5-羟基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)；
化合物b在NaH和高沸点溶剂中,进行选择性的热环合反应，得到化合物c(5-羟基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)；溶剂为甲苯、二甲苯、硝基苯或N，N`-二甲基甲酰胺，温度为100～160℃，NaH用量为1.0～10.0当量，优选为4.0～6.0当量，反应时间为8.0～24.0小时；
(4)制备化合物d(5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)；
化合物c在碳酸钾存在下与甲基化试剂进行酚甲基化反应，得到化合物d(5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)；甲基化试剂为硫酸二甲酯或碘甲烷；化合物c与甲基化试剂的摩尔比为1：1.0～3.0，反应时间为2.0～8.0小时，反应溶剂为丙酮，反应在回流下进行；
(5)制备化合物e(3-碘-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)；
化合物d在醇溶剂中，用哌啶开环，然后在吡啶存在下与碘进行碘化、闭环反应，得到化合物e(3-碘-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)；相对化合物d，哌啶加入量为5.0～20.0当量，吡啶加入量为1.0～5.0当量(优选为2.0当量)，碘为1.0～10.0当量；开环反应所用溶剂为甲醇或乙醇，在回流条件下进行，反应时间为1.0～3.0小时；碘化、闭环所用溶剂为二氯甲烷，在室温(20℃)下进行，反应时间为10.0～20.0小时；
(6)制备化合物f(2-咪唑-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]色酮)；
化合物e与咪唑在碱性碳酸钾条件下，进行Michael(迈克)加成并失去一分子HI，得到化合物f(2-咪唑-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]色酮)；相对于化合物e，咪唑的加入量为1.0～3.0当量，碳酸钾的加入量为5.0～15.0当量，溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，反应温度为80℃，反应时间为2小时；
(7)制备化合物g(5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]-4-羟基-香豆素)；
化合物f在酸性条件下(PH＝1～2)水解得到化合物g(5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]-4-羟基-香豆素)，溶剂为冰醋酸，用量为5.0～10.0ml，反应温度为95℃，反应时间为20.0～40.0小时；
(8)制备化合物HirtellanineB；
化合物g和邻苯二酚溶于丙酮中，加入醋酸钠水溶液，铁氰化钾作氧化剂，室温下进行氧化偶联反应，生成化合物HirtellanineB，(此步骤的方法定义为“方法A”)；相对于化合物g的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应时间为2～3小时；
通过测试本发明方法制得的化合物HirtellanineB的熔点、1HNMR、13CNMR、IR、MS数据，证实其结构与天然产物HirtellanineB完全一致。
本发明的另一目的是提供了天然产物HirtellanineB的衍生物的制备方法。
本发明天然产物HirtellanineB的衍生物包括下列化合物：
化合物1(8,9-二羟基-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物2(N-(8,9-二羟基-6-氧代-6H-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]色烯-2-基)乙酰胺)；
化合物3(2-氯-8,9-羟基-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物4(2-溴-8,9-羟基-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物5(8,9-二羟基-1,3-二甲氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物6(8,9-二羟基-1,3-二乙氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物7(8,9-二羟基-1,3-二乙氧基-2-硝基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)
化合物8(8,9-二羟基-3-甲氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物9(8,9-二羟基-3-乙氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物10(8,9-二羟基-2,2-二甲基-2H-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]吡喃并[2,3-h]色烯-6-色酮)；
化合物11(8,9-二羟基-2H-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]吡喃[2,3-h]色烯-6-色酮)；
化合物12(8,9-二羟基-5-甲基-5H-11-氧杂-5-氮杂苯并[a]芴-6-色酮)；
化合物13(3-烯丙氧基-8,9-羟基-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
化合物14(8,9-二羟基-1,3-二甲氧基-5H-11-氧杂-5-氮杂苯并[A]芴-6-色酮)；
具体的，HirtellanineB的衍生物制备如下：
(一)制备化合物1，2：反应式如下：
(1)制备化合物1(8,9-二羟基-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]色烯-6-色酮)；
4-羟基香豆素和邻苯二酚溶于丙酮中，加入醋酸钠水溶液后，铁氰化钾作氧化剂，室温条件下，进行氧化偶联反应，得到化合物1(8,9-二羟基-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]色烯-6-色酮)；相对于4-羟基香豆素的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应时间为2～3小时；
(2)制备化合物2(N-(8,9-二羟基-6-氧代-6H-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]色烯-2-基)乙酰胺)；
4-羟基香豆素与硝酸钠在浓硫酸中，0℃进行硝化反应，反应1～2小时，生成4-羟基-6-硝基香豆素，该化合物在Zn作催化剂、酸性条件下，发生水解反应生成中间体4-羟基-6-乙酰胺基香豆素，该中间体4-羟基-6-乙酰胺基香豆素，再通过方法A生成化合物2(N-(8,9-二羟基-6-氧代-6H-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]色烯-2-基)乙酰胺)；相对于4-羟基香豆素的量，硝酸钠的用量为1.0～2.0当量；相对于4-羟基-6-硝基香豆素的量，锌粉的用量为2.0～5.0当量；相对于中间体4-羟基-6-乙酰胺基香豆素的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(二)制备化合物3，4：
(1)制备化合物3(2-氯-8,9-羟基-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
氢化钠分散在甲苯中，加入2-羟基-5-氯苯乙酮和碳酸二乙酯，室温进行环合反应2～3小时，生成中间体3a(4-羟基-6-氯香豆素)(此步骤的方法定义为“方法B”)，相对于2-羟基-5-氯苯乙酮的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；然后，中间体4-羟基-6-氯香豆素通过“方法A”生成化合物3，相对于中间体4-羟基-6-氯香豆素的量邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量；
(2)制备化合物4(2-溴-8,9-羟基-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
氢化钠分散在甲苯中，加入2-羟基-5-溴苯乙酮和碳酸二乙酯，室温进行环合反应2～3小时，生成中间体4a(4-羟基-6-溴香豆素),(“方法B”)，相对于2-羟基-5-溴苯乙酮的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；然后中间体4-羟基-6-溴香豆素通过“方法A”生成化合物4，相对于中间体4-羟基-6-溴香豆素的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量；
(三)制备化合物5，6，7
(1)制备化合物5(8,9-二羟基-1,3-二甲氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
2，4，6-三羟基苯乙酮溶于丙酮中，加入碳酸钾后，与硫酸二甲酯进行甲基醚化反应，生成中间体5a(2-羟基-4，6-二甲氧基苯乙酮)；相对于2，4，6-三羟基苯乙酮的量，碳酸钾的用量为5.0～10.0当量，硫酸二甲酯的用量为3.0～6.0当量，温度为回流温度，反应时间为5～8小时；然后中间体5a通过“方法B”与碳酸二乙酯发生环合反应，生成中间体5b(4-羟基-5，7-二甲氧基香豆素)；相对于中间体5a的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；最后中间体5b通过“方法A”生成化合物5，相对于中间体5b的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(2)制备化合物6(8,9-二羟基-1,3-二乙氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
具体为2，4，6-三羟基苯乙酮溶于丙酮中，加入碳酸钾后与硫酸二乙酯进行乙基醚化反应，生成中间体6a(2-羟基-4，6-二乙氧基苯乙酮)；相对于2，4，6-三羟基苯乙酮的量，碳酸钾的用量为5.0～10.0当量，硫酸二乙酯的用量为3.0～6.0当量，溶剂为丙酮，温度为回流温度，反应时间为5～8小时；然后中间体6a通过“方法B”与碳酸二乙酯发生环合反应生成中间体6b(4-羟基-5，7-二乙氧基香豆素)；相对于中间体6a的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；最后中间体6b通过“方法A”生成化合物6，相对于中间体6b的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(3)制备化合物7(8,9-二羟基-1,3-二乙氧基-2-硝基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
中间体6b在浓硫酸中与硝酸钠发生硝化反应生成中间体6c(4-羟基-5，7-二乙氧基-6-硝基香豆素)；相对于中间体6b的量，硝酸钠的用量为1.0～2.0当量，反应温度为0℃，反应时间为1小时；随后中间体6c通过“方法A”生成化合物7，相对于中间体6c的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(四)制备化合物8，9：
(1)制备化合物8(8,9-二羟基-3-甲氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
2，4-二羟基苯乙酮溶于丙酮中，加入碳酸钾，与硫酸二甲酯发生甲基醚化反应，生成中间体8a(2-羟基-4-甲氧基苯乙酮)，相对于2，4，-二羟基苯乙酮的量，碳酸钾的用量为5.0～10.0当量，硫酸二甲酯的用量为3.0～6.0当量，温度为回流温度，反应时间为5～8小时；然后中间体8a通过“方法B”与碳酸二乙酯发生环合反应,生成中间体8b(4-羟基-7-甲氧基香豆素)，相对于中间体8a的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；最后中间体8b通过“方法A”生成化合物8，相对于中间体8b的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(2)制备化合物9(8,9-二羟基-3-乙氧基苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
2，4-二羟基苯乙酮溶于丙酮中，加入碳酸钾后，与硫酸二乙酯发生乙基醚化反应生成中间体9a(2-羟基-4-乙氧基苯乙酮)，相对于2，4，-二羟基苯乙酮的量，碳酸钾的用量为5.0～10.0当量，硫酸二乙酯的用量为3.0～6.0当量，温度为回流温度，反应时间为5～8小时；然后中间体9a通过“方法B”与碳酸二乙酯发生环合反应，生成中间体9b(4-羟基-7-乙氧基香豆素)；相对于中间体9a的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；最后中间体9b通过“方法A”生成化合物9，相对于中间体9b的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(四)制备化合物10：
(1)制备化合物10(8,9-二羟基-2,2-二甲基-2H-苯并[4,5]呋喃[3,2-c]吡喃并[2,3-h]色烯-6-色酮)；
2，4-二羟基苯乙酮溶解于丙酮中，在碳酸钾和碘化钾存在下，经碘化亚铜催化与3-氯-3-甲基-1-丁炔发生酚醚化反应，生成中间体10a(2-羟基-4-(1，1-二甲基-2-丙炔氧基)苯乙酮)；相对于2，4-二羟基苯乙酮，碳酸钾用量为2.0～5.0，碘化钾用量为2.0～4.5，催化剂用量为0.02～0.1当量(优选为0.05当量)，3-氯-3-甲基-1-丁炔用量为1.0～1.5当量(优选1.05当量)，温度为40～70℃，反应时间为1.0～5.0小时；然后中间体10a在强碱条件和高沸点溶剂中发生选择性的Clainsen(克莱森)热重排环合反应，生成中间体10b(1-(5-羟基-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)-乙酮)；强碱为NaH、Na、NaOH或KOH，溶剂为甲苯、二甲苯、硝基苯或N，N`-二甲基甲酰胺，温度为100～160℃，强碱用量为1.0～10.0当量，优选为4.0～6.0当量，反应时间为8.0～24.0小时；中间体10b经“方法B”生成中间体10c(4-羟基-8,8-二甲基-8H-吡喃并[2,3-f]色烯-2-色酮)，相对于10b的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；最后中间体10c通过“方法A”生成化合物10，相对于中间体10c的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(五)制备化合物11：
(1)制备化合物11(8,9-二羟基-2H-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]吡喃[2,3-h]色烯-6-色酮)；
2，4-二羟基苯乙酮在碳酸钾存在下与炔丙基溴发生选择性单醚化反应得到中间体11a(2-羟基-4-(1-丙炔氧基)苯乙酮)，相对于2，4-二羟基苯乙酮的量，炔丙基溴的用量为1.0～2.0当量，碳酸钾用量为2.0～5.0当量，溶剂为丙酮，温度为回流温度，反应时间为3～5小时；中间体11a在四氯化铂催化作用下发生选择性的Clainsen(克莱森)热重排和环合反应，生成中间体11b(1-(5-羟基-2H-色烯-6-基)-乙酮)，相对于中间体11a的量，四氯化铂的用量为0.005～0.02当量，溶剂为二氧六环，反应温度为50℃，反应时间为1小时；中间体11b经“方法B”生成中间体11c(4-羟基-8H-吡喃并[2,3-f]色烯-2-色酮)；相对于11b的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；最后中间体11c通过“方法A”生成化合物11；相对于中间体11c的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(六)制备化合物12：
(1)制备化合物12(8,9-二羟基-5-甲基-5H-11-氧杂-5-氮杂苯并[a]芴-6-色酮)；
N-甲基邻胺苯甲酸在醋酸酐和醋酸1：1的混合溶液中发生环合反应，生成中间体12a(4-乙酰基-1-甲基-1H-喹啉-2-色酮)，反应温度为回流温度，反应时间为3～5小时；中间体12a在碱性条件下水解得到中间体12b(4-羟基-1-甲基-1H-喹啉-2-色酮)；相对于中间体12a的量，碱为氢氧化钠，用量为0.1～0.5当量，溶剂为乙醇，反应温度为室温，反应时间为10分钟；中间体12b通过“方法A”生成化合物12，相对于中间体12b的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时；
(七)制备化合物13：
(1)制备化合物13(3-烯丙氧基-8,9-羟基-苯并[4,5]呋喃并[3,2-c]色烯-6-色酮)；
2，4-二羟基苯乙酮在碱性条件下与烯丙基溴进行选择性单醚化得到中间体13a(2-羟基-4-(1-丙烯氧基)苯乙酮)；相对于2，4-二羟基苯乙酮的量，稀丙基溴的用量为1.0～3.0当量，碱为碳酸钾，用量为2.0～6.0当量，溶剂为丙酮，温度为回流温度，反应时间为2.0～5.0小时；中间体13a经“方法B”生成中间体13b(4-羟基-7-(1-丙烯氧基)香豆素)，相对于13a的量，氢化钠的用量为3.0～8.0当量，碳酸二乙酯的用量为1.0～3.0当量，溶剂为甲苯，反应温度为回流温度，反应时间为1小时；最后中间体13b通过“方法A”生成化合物13，相对于中间体13b的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反映温度为室温，反应时间为2～3小时；
(八)制备化合物14：
(1)制备化合物14(8,9-二羟基-1,3-二甲氧基-5H-11-氧杂-5-氮杂苯并[A]芴-6-色酮)；
3，5-二甲氧基苯胺、丙二酸和氯化锌溶于三氯氧磷中，发生环合反应，生成中间体14a(4-羟基-5,7-二甲氧基-1H-喹啉-2-色酮)；相对于3，5-二甲氧基苯胺的量，丙二酸的用量为1.0～2.0当量，氯化锌的用量为2.0～5.0当量，溶剂为三氯氧磷，反应温度为65℃，反应时间为24小时；中间体14a通过“方法A”生成化合物14；相对于中间体14a的量，邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应温度为室温，反应时间为2～3小时。
本发明的又一目的是提供天然产物HirtellanineB在治疗肿瘤药物中的应用。
医学上已知，无节制的细胞增殖是癌症的基本特征，天然产物HirtellanineB能够抑制Jurkat细胞(人白血病淋巴细胞)，Raji细胞(恶性B淋巴瘤细胞株)以及K562细胞(人红白血病细胞)增殖。本发明人对14个HirtellanineB衍生物进行了生物活性筛选，结果显示这些衍生物对肿瘤细胞均具有一定的抑制活性。本发明人又通过流式细胞仪检测细胞周期的变化，研究了HirtellanineB抑制细胞增殖的机制。实验结果显示2.5ug/ml浓度的HirtellanineB对Jurkat细胞周期G2/M期抑制率为69.05％，比其空白对照组提高了5倍；对Raji细胞周期G2/M期抑制率为31.93％，比其空白对照组提高了3倍；对K562细胞周期G2/M期抑制率为34.26％，比其空白对照组提高了近3倍。其主要作用机制是通过抑制恶性淋巴细胞的G2/M期，进而抑制其细胞增殖与生长，最终将引起恶性淋巴细胞凋亡。
因此，天然产物HirtellanineB及其衍生物可用于制备治疗肿瘤药物。
本发明所述药物是由天然产物HirtellanineB作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
本发明所述药物是由天然产物HirtellanineB的衍生物作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
所述作为药物组合物活性成分的衍生物选自化合物1～14中的任一个化合物。
本发明提供的天然产物HirtellanineB的制备方法原料易得，反应收率高，操作合理，宜于工业化生产。本发明HirtellanineB及其衍生物可用于制备治疗肿瘤药物，有较大的临床应用价值。
附图说明
图1:Jukata细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析(空白组)
图2:2.5ug/mlHirtellanineB处理后Jukata细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图3:1.25ug/mlHirtellanineB处理后Jukata细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图4:0.63ug/mlHirtellanineB处理后Jukata细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图5:Raji细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析(空白组)
图6:2.5ug/mlHirtellanineB处理后Raji细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图7:1.25ug/mlHirtellanineB处理后Raji细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图8:0.63ug/mlHirtellanineB处理后Raji细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图9:K562细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析(空白组)
图10:2.5ug/mlHirtellanineB处理后K562细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图11:1.25ug/mlHirtellanineB处理后K562细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
图12:0.63ug/mlHirtellanineB处理后K562细胞的细胞周期分布的流式细胞仪分析
注：图谱中横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞数
图例：图谱中染色部分依次为：
DNA合成前期(G0/G1期)
DNA合成后期/细胞分裂期(G2/M期)
DNA合成期(S期)
具体实施方式
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
说明：以下实施例中，所述室温为20℃，浓缩是在32℃减压条件下进行的，干燥是用无水硫酸钠室温进行的，柱层析使用的硅胶为200-300目，洗脱液为乙酸乙酯和石油醚的混合液，二者体积比例为1.0～3.0：1.0～10.0。
实施例1化合物a(5，7-二羟基色酮)的制备
5.58克2，4，6-三羟基苯乙酮溶于50毫升DMF(N，N`-二甲基甲酰胺)中，然后在室温，搅拌下50分钟内慢慢加入15.2毫升三氟化硼乙醚复合物(从国药集团购买，使用前重蒸过)，随后加入含有6.95毫升的甲磺酰氯的15毫升DMF溶液。反应混合物在90℃搅拌3小时，然后冷却至室温，在强烈搅拌下慢慢倒入120毫升冰水中，过滤，水洗得到6.8克深黄色固体粗产物。滤液通过乙酸乙酯萃取三次，每次100毫升，合并萃取物经柱层析纯化得到4.82克(90.3％)黄色固体化合物a。熔点：255℃(降解)；1HNMR(400MHz，Acetone-d6)δppm:12.76(s，1H)，8.07(d，J＝6.0Hz，1H)，6.39(s，1H)，6.26(s，1H)，6.23(d，J＝6.0Hz，1H)；IR(film)νmax:3084，3005，2930，2878，2741，2629，1647，1616，1612，1553，1499，1466，1425，1369，1313，1234，1188，1167，1117，1032，978；ESI-MSm/z179.1([M+1]+，100％)。
实施例2化合物b(7-(1，1-二甲基-2-丙炔氧基)-5-羟基色酮)的制备
1.08克中间体a溶于50毫升丙酮中，然后加入2.51克碳酸钾，2.52克碘化钾，12毫克催化剂碘化亚铜，通入氩气后，加入0.71毫升3-氯-3-甲基-1-丁炔。随后反应混合物回流3小时，冷却后减压去除丙酮溶剂，加40毫升水溶解固体，乙酸乙酯萃取三次，每次50毫升，合并萃取物浓缩后干燥后经柱层析得到1.41克(95.2％)黄色固体产物化合物b。熔点：112～113℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm:12.47(s，1H)，7.75(d，J＝6.0Hz，1H)，6.77(d，J＝2.0Hz，1H)，6.69(d，J＝2.0Hz，1H)，6.22(d，J＝5.6Hz，1H)，2.68(s，1H)，1.72(s，6H)；ESI-MSm/z245.2([M+1]+，100％)。
实施例3化合物c(5-羟基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)的制备
508毫克中间体b溶于40毫升邻二甲苯后加入480毫克氢化钠(60％分散于固体油中)，然后此悬浊液于130℃反应20小时，冷却至室温，加入30毫升冰水溶解，分离有机层，水层用1N稀盐酸中和至pH＝5，随后乙酸乙酯萃取三次，每次30毫升，合并萃取物，食盐水洗涤。在干燥浓缩后，粗产物经柱层析纯化得到498毫克(98.0％)黄色固体产物c。熔点:139～141℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm:12.86(s，1H)，7.70(d，J＝6.0Hz，1H)，6.71(d，J＝10.0Hz，1H)，6.31(s，1H)，6.19(d，J＝5.6Hz，1H)，5.62(d，J＝10.0Hz，1H)，1.46(s，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δppm:155.62，128.49，115.58，111.45，59.33，28.55；IR(film)νmax:3441，3070，2976，2926，1655，1628，1574，1481，1423，1396，1313，1290，1254，1165，1115，1074，839，833，777，702，633，530，505；ESI-MSm/z245.2([M+1]+，100％)。
实施例4化合物d(5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)的制备
488毫克化合物c溶于50毫升丙酮中，加入3.79克碳酸钾。在冰水浴中搅拌10分钟后，在5分钟内滴加1.33毫升硫酸二甲酯。随后通入氩气，加热回流3小时，冷却至室温，加入30毫升水后，继续搅拌20分钟，减压消除丙酮溶剂，乙酸乙酯萃取三次，每次30毫升，合并萃取物浓缩干燥后经柱层析纯化得到492毫克(95.2％)淡黄色固体产物化合物d。熔点:96～98℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm:7.55(d，J＝6.0Hz，1H)，6.62(d，J＝10.0Hz，1H)，6.47(s，1H)，6.05(d，J＝6.0Hz，1H)，5.63(d，J＝10.0Hz，1H)，3.78(s，3H)；1.35(s，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δppm:176.33，158.97，158.26，155.37，153.27，153.08，131.02，116.06，113.98，113.62，113.34，100.98，95.70，62.89，28.46；IR(film)νmax:3447，3074，2978，2941，2845，1661，1639，1603，1558，1466，1433，1400，1354，1283，1252，1157，1119，1097，1067，1024，947，897，845，831，798，714，526，484；HRMS(ESI+):Calcd.ForC15H15O4([M+1]+)，259.0965，Found:259.0970。
实施例5化合物e(3-碘-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮)的制备
320毫克化合物d溶于30毫升甲醇中，然后加入2毫升哌啶，随后反应液回流2小时。冷却后减压蒸馏除去甲醇溶剂及多余的哌啶给出黄色油状物。加入40毫升二氯甲烷溶解，然后分别加入196毫克吡啶和含788毫克碘的二氯甲烷(10毫升)溶液。室温搅拌过夜后加入30毫升饱和亚硫酸钠水溶液，搅拌10分钟，分离有机层，水层用二氯甲烷萃取三次，每次30毫升，合并萃取物，水洗，干燥，浓缩。粗产物经柱层析纯化得到无色油状物产品，随后经放置过夜固化为白色固体产物化合物e424毫克(89.1％)。熔点:121～123℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm:8.03(s，1H)，6.65(d，J＝10.0Hz，1H)，6.51(s，1H)，5.68(d，J＝6.0Hz，1H)，3.83(s，3H)，1.40(s，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δppm:171.15，158.61，156.08，155.35，131.70，115.93，113.93，111.02，100.73，89.04，78.21，63.13，28.68；IR(film)νmax:3421，2943，2849，1643，1603，1466，1427，1350，1275，1217，1123，1051，947，879，839，769，681，552；HRMS(ESI+):Calcd.ForC15H14IO4([M+1]+)，384.9931，Found:384.9938。
实施例6化合物f(2-咪唑-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]色酮)的制备
285毫克化合物e，249毫克咪唑，1.02克碳酸钾溶于12毫升DMF中，反应液于80℃下反应2小时，反应液冷却后倒入冰水中，搅拌5分钟，静置0.5小时，有银灰色固体析出，过滤后，滤液经乙酸乙酯萃取三次，每次25毫升，干燥、浓缩后得粗产物，粗产物经柱层析纯化得230毫克化合物f(95.8％)。熔点:191～192℃；1HNMR(400MHz，Acetone-d6)δppm:8.42(s，1H)，7.82(s，1H)，7.19(s，1H)，6.83(s，1H)，6.74(d，J＝10.0Hz，1H)，6.41(s，1H)，5.92(d，J＝10.4Hz，1H)，3.86(s，3H)，1.47(s，6H)；13CNMR(100MHz，Acetone-d6)δppm:176.11，171.94，158.76，157.37，155.93，152.62，135.90，131.96，131.68，116.93，116.12，114.28，101.36，97.78，78.52，62.77，28.41；IR(film)νmax:3454，3119，3065，2980，1655，1597，1464，1412，1288，1120，864，646；HRMS(ESI+):Calcd.ForC18H17N2O4([M+1]+)，325.1183，Found:325.1187。
实施例7化合物g(5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]-4-羟基-香豆素)的制备
80毫克化合物f溶于5毫升冰醋酸中，90℃反应30小时。反应结束后冷却至室温，缓慢加入冰水，析出大量固体，混悬液搅拌20分钟，静置，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取三次，每次15毫升，干燥，浓缩即得粗产物，粗产物经柱层析纯化得化合物g63毫克(93.1％)。熔点:124～125℃；1HNMR(400MHz，Acetone-d6)δppm:6.66(d，J＝10.0Hz，1H)，6.51(s，1H)，5.92(d，J＝10.0Hz，1H)，5.41(s，1H)，3.98(s，3H)，1.47(s，6H)；13CNMR(100MHz，Acetone-d6)δppm:166.13，161.51，157.77，155.94，153.51，131.21，115.52，111.49，102.44，100.87，90.11，77.74，63.94，27.35；IR(film)νmax:3524，3346，2978，2854，2613，1678，1616，1319，1165，1083，939，825；ESI-MS:m/z275.3([M+1]+，100％)。
实施例8化合物HirtellanineB的制备
55毫克化合物g和邻苯二酚(33毫克，1.5eq)溶于7毫升丙酮中，加入3毫升含醋酸钠197毫克(12eq)的水溶液。室温搅拌底物溶解后于1小时内滴加3毫升含铁氰化钾264毫克(4eq)的水溶液。滴加结束后，室温搅拌3小时。反应液过滤，丙酮洗，减压蒸干丙酮，乙酸乙酯萃取三次，每次15毫升，有机相合并后用20毫升饱和食盐水洗涤一次，减压蒸干。过柱纯化得HirtellanineB52毫克。(产率：69％)
HirtellanineB：熔点:283～285℃；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.24(s，1H)，7.17(s，1H)，6.77(s，1H)，6.67(d，J＝10.4Hz，1H)，5.94(d，J＝10.0Hz，1H)，3.92(s，1H)，1.43(s，6H)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)δppm：158.03，157.84，156.50，154.44，151.29，149.89，146.64，145.23，132.23，115.65，114.23，112.76，105.29，103.97，102.29，101.51，99.52，78.39，63.80，28.45；IR(film)νmax：3502，3414，3126，177，1624，1371，1280，1122，862；HRMS(ESI+):Calcd.ForC21H17O7([M+1]+)，381.0969，Found:381.0976。
以上HirtellanineB的各项图谱数据与天然产物HirtellanineB完全一致，证明本发明方法制得的HirtellanineB证实与天然产物HirtellanineB结构完全相同
实施例9采用反应式中所述方法A的操作步骤，制备化合物1-14
采用方法A，相应的4-羟基香豆素或4-羟基(氨基)奎诺酮(0.2mmol)衍生物和邻苯二酚(33毫克，1.5eq)溶于7毫升丙酮中，加入3毫升含醋酸钠197mg(12eq)的水溶液。室温搅拌底物溶解后于1小时内滴加3毫升含铁氰化钾264mg(4eq)的水溶液。滴加结束后，室温搅拌3小时。反应液过滤，丙酮洗，减压蒸干丙酮，乙酸乙酯萃取三次，每次15毫升，有机相合并后用20毫升饱和食盐水洗涤一次，减压蒸干。过柱纯化。(化合物1，43mg，80％；化合物2，56mg，86％；化合物3，50mg，83％；化合物4，61mg，88％；化合物5，60mg，91％；化合物6，63mg，89％；化合物7，68mg，85％；化合物8，52mg，87％；化合物9，52mg，83％；化合物10，62mg，89％；化合物11，53mg，83％；化合物12，52mg，93％；化合物13，54mg，83％；化合物14，51mg，78％)
实施例10采用反应式中所述方法B的操作步骤，制备中间体3a，4a，5b，6b，8b，9b，10c，11c，13b，
采用方法B，200毫克NaH(5eq，60％分散于固体油中)加入到30毫升无水甲苯中，相应的苯乙酮类似物(8mmol，1eq)随后加入，之后缓慢滴加0.18毫升碳酸二乙酯(1.5eq)，滴毕后回流1小时。冷却至室温，冰浴下，缓慢加入冷水淬灭反应，1N的盐酸调节至酸性。乙酸乙酯萃取三次，每次20毫升，合并有机相，20毫升饱和食盐水洗涤一次，减压蒸干，过柱纯化。(中间体3a，1.18g，75％；中间体4a，1.45g，75％；中间体5b，1.65g，93％；中间体6b，1.82g，91％；中间体8b，1.40g，91％；中间体9b，1.55g，94％；中间体10c，1.70g，87％；中间体11c，1.54g，89％；中间体13b，1.55g，89％)
实施例11HirtellanineB的衍生物1的制备
0.2mmol4-羟基香豆素通过实施例8的方法A直接制备衍生物1(43mg，产率80％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.99(d，J＝7.6Hz，1H)，7.66(m，1H)，7.57(d，J＝8.4Hz，1H)，7.48(m，1H)，7.30(s，1H)，7.24(s，1H)。
实施例12HirtellanineB的衍生物2的制备
0℃下，硝酸钠(1.02克，1.5eq)溶于20ml浓硫酸中，4-羟基香豆素(1.30克，8mmol，1eq)随后加入，反应液在0℃下反应2小时。反应结束后，缓慢加入50毫升冷水，固体析出，过滤后所得固体为中间体4－羟基－6－硝基香豆素，中间体溶于10毫升醋酸中，加入锌粉(1.56g，3eq)，该反应液回流1小时，反应结束后趁热过滤，热的醋酸洗涤，滤液冷却至室温，固体析出，过滤后所得固体为中间体4-羟基-6-乙酰胺基香豆素。中间体再经实施例8的方法A得目标化合物衍生物2(56毫克，产率65％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：8.47(s，1H)，7.58(d，J＝8.8Hz，1H)，7.50(d，J＝8.8Hz，1H)，7.27(s，1H)，7.25(s，1H)，2.12(s，3H)。
实施例13HirtellanineB的衍生物3，4的制备
衍生物3和4分别由2-羟基-5-氯(溴)苯乙酮依次通过实施例10的方法B和实施例9的方法A反应而得(衍生物3，50毫克，产率75％；衍生物4，61毫克，79％)。衍生物3：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.98(s，1H)，7.65(d，J＝8.8Hz，1H)，7.58(d，J＝8.8Hz，1H)，7.27(s，1H)，7.20(s，1H)。衍生物4：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：8.09(s，1H)，7.76(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(d，J＝8.8Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.20(s，1H)。
实施例14HirtellanineB的衍生物5，6，7的制备
2，4，6-三羟基苯乙酮(1克，5.95mmol)溶于30毫升丙酮中，随后加碳酸钾(4.11克，5eq)，滴加硫酸二甲(乙)酯(4eq)，该混悬液回流5～8小时，反应结束后，冷却至室温，过滤，丙酮洗涤，滤液减压蒸干后得到中间体5a(2-羟基-4，6-二甲氧基苯乙酮)、6a(2-羟基-4，6-二乙氧基苯乙酮)(5a，1.01克，产率87％；6a，1.15克，产率79％)；中间体5a、6a再经过实施例9的方法B得到中间体5b(4-羟基-5，7-二甲氧基香豆素)、6b(4-羟基-5，7-二乙氧基香豆素)(5b，1.00克，产率93％；6b，1.07克，产率91％)；分别取0.2mmol中间体5b(44毫克)、6b(50毫克)通过实施例9的方法A得到衍生物5，6(衍生物5，60毫克，产率74％；衍生物6，63毫克，64％)；取中间体6b(500毫克，2mmol)进行硝基化反应(反应步骤参见化合物2的合成)，生成中间体6c(484毫克，产率82％)；取中间体6c(59毫克，0.2mmol)再经过实施例9的方法A得到衍生物7(68mg，产率85％)
衍生物5：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.22(s，1H)，7.12(s，1H)，6.70(s，1H)，6.56(s，1H)，3.95(s，3H)，3.83(s，3H)。
衍生物6：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.21(s，1H)，7.07(s，1H)，6.63(s，1H)，6.49(s，1H)，4.19(q，2H)，4.07(q，2H)，1.44(m，3H)，1.33(m，3H)。
衍生物7：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.21(s，1H)，7.11(s，1H)，6.84(s，1H)，4.37(q，2H)，4.32(q，2H)，1.49(m，3H)，1.32(m，3H)。
实施例15HirtellanineB的衍生物8，9的制备
2，4-二羟基苯乙酮(1克，6.58mmol)溶于30毫升丙酮中，随后加碳酸钾(4.54克，5eq)，滴加硫酸二甲(乙)酯(2eq)，该混悬液回流5～8小时，反应结束后，冷却至室温，过滤，丙酮洗涤，滤液减压蒸干，可得中间体8a(2－羟基－4－甲基苯乙酮)、9a(2－羟基－4－乙基苯乙酮)，中间体分别经过实施例10的方法B和实施例9的方法A可得目标产物衍生物8和衍生物9(衍生物8，1.25克，总产率64％，衍生物9，1.33克，总产率65％)
衍生物8：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.87(d，J＝8.8Hz，1H)，7.25(s，1H)，7.19(s，1H)，7.14(s，1H)，7.40(d，J＝8.8Hz，1H)，3.87(s，3H)。
衍生物9：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.80(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(s，1H)，7.18(s，1H)，7.05(s，1H)，6.96(d，J＝8.4Hz，1H)，4.10(q，2H)，1.36(m，3H)。
实施例16HirtellanineB的衍生物10的制备
2，4-二羟基苯乙酮(760毫克，5mmol)首先进行选择性单醚化，然后经过区域选择性的Clainsen热重排和环合反应得到中间体1-(5-Hydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-ethanone(具体步骤参见化合物b和化合物c的合成)，中间体再依次经过实施例10的方法B和实施例9的方法A得到目标化合物10(1.25克，总产率71％)。
化合物10：1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.64(d，J＝8.4Hz，1H)，7.22(s，1H)，7.15(s，1H)，6.82(d，J＝8.4Hz，1H)，6.74(d，J＝9.0Hz，1H)，5.91(d，J＝9.0Hz，1H)。
实施例17HirtellanineB的衍生物11的合成
2，4-二羟基苯乙酮(1克，6.58mmol)溶于40毫升丙酮中，加入碳酸钾(2.72克，3eq)，室温下滴加炔丙基溴(861毫克，1.1mmol)，该反应液回流3小时。冷却至室温，过滤，丙酮洗，滤液减压蒸干所得固体溶于1，4-二氧六环中，加入催化量的四溴化铂(0.01eq)，该反应液在50℃下反应1小时，可得中间体1-(5-羟基-2H-色烯-6-基)-乙酮，中间体再经实施例10的方法B和实施例9的方法A得到目标化合物衍生物11(1.35克，总产率64％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.69(d，J＝8.8Hz，1H)，7.25(s，1H)，7.18(s，1H)，6.86(dd，J＝8.4Hzand9.2Hz)，6.07(d，J＝8.8Hz，1H)，4.93(s，2H)。
实施例18HirtellanineB的衍生物12的合成
N-甲基邻胺苯甲酸(500毫克，3.31mmol)溶于8毫升醋酸酐和醋酸(体积比为1:1)的混合溶液中，该反应液回流3小时。冷却至室温，缓慢加入10毫升冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次，每次15毫升，合并有机相，20毫升饱和食盐水洗涤一次，减压旋干溶剂，所得固体溶于20毫升乙醇中，加入氢氧化钠(0.1eq)后搅拌10分钟，减压蒸干乙醇，过柱纯化，得到中间体4-Hydroxy-1-methyl-1H-quinolin-2-one，中间体再经实施例9的方法A得到目标化合物衍生物12(597毫克，产率64％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：8.02(d，J＝8.0Hz，1H)，7.65(s，2H)，7.45(s，1H)，7.37(m，1H)，7.16(s，1H)，3.71(s，3H)。
实施例19HirtellanineB的衍生物13的合成
2，4-二羟基苯乙酮(1g，6.58mmol)溶于40ml丙酮中，加入碳酸钾(2.72g，3eq)，室温下滴加烯丙基溴(875mg，1.1mmol)，该反应液回流3小时。冷却至室温，过滤，丙酮洗，滤液减压蒸干所得固体为中间体1-(4-Allyloxy-2-hydroxy-phenyl)-ethanone，中间体再经实施例9的方法B和实施例8的方法A得到目标化合物衍生物13(1.43g，总产率67％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.87(d，J＝8.8Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.20(s，1H)，7.16(s，1H)，7.57(dd，J＝8.4Hz，1H)，6.08(m，1H)，5.45(d，J＝17.2Hz，1H)，5.32(d，J＝10.4Hz，1H)，4.71(d，J＝4.8Hz，2H)。
实施例20HirtellanineB的衍生物14的合成
3，5-二甲氧基苯胺(2克，13.1mmol)、丙二酸(1.36克，13.1mmol)、氯化锌(5.34克，39.3mmol)溶于20毫升三氯氧磷中，该反应液在65℃下反应24小时，反应结束后，反应液冷却至室温，将反应液缓慢滴加至100毫升冰水中，过滤，固体为中间体4-Hydroxy-5,7-dimethoxy-1H-quinolin-2-one，中间体再经实施例9的方法A得到目标化合物衍生物14(2.9克，总产率68％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：7.36(s，1H)，7.08(s，1H)，6.61(s，1H)，6.45(s，1H)，3.96(s，1H)，3.81(s，1H)。
实施例21由实施例8制备所得的HirtellanineB对细胞周期影响的流式细胞仪检测步骤：
1)分别将Jurkat细胞(人白血病淋巴细胞)、Raji细胞(恶性B淋巴瘤细胞株)、K562细胞(人红白血病细胞)(100μL)接种于60mm培养板，80％汇合后转染。
2)24小时后在新鲜培养液(1mL)中加入10μL不同浓度的HirtellanineB(二甲基亚砜配制，浓度分别为0ug/ml(空白对照组)、0.63ug/ml、1.25ug/ml、2.5ug/ml)。
3)48～72小时后用胰酶(100μg/ml)消化收集细胞，PBS(含0.05％吐温-20的pH7.2的磷酸盐缓冲液，每次800μL)洗两遍，弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。
4)PBS洗涤去乙醇，1000rpm,5min，洗两遍(每次2mL)。
5)0.5mlPBS重悬细胞，加入PI(碘化丙啶)和RNaseA(核糖核酸酶A)至终浓度50mg/ml，37℃温浴30min。
6)用流式细胞仪测定细胞周期。
注：PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4℃保存。RNaseA：10mg/ml
测试结果如下：
表1:实施例8制备的HirtellanineB对Jurkat细胞(人白血病淋巴细胞)细胞周期的影响
表2实施例8制备的HirtellanineB对Raji细胞(恶性B淋巴瘤细胞株)细胞周期的影响
表3:实施例8制备的HirtellanineB对K562细胞(人红白血病细胞)细胞周期的影响
从以上实验结果显示2.5ug/ml浓度的HirtellanineB对Jurkat细胞周期G2/M期抑制率为69.05％，比其空白对照组提高了5倍；对Raji细胞周期G2/M期抑制率为31.93％，比其空白对照组提高了3倍；对K562细胞周期G2/M期抑制率为34.26％，比其空白对照组提高了近3倍。
Claims (2)
1.一种天然产物HirtellanineB的制备方法，其特征在于，该方法反应式如下：
包括下列步骤：
(1)制备化合物a5，7-二羟基色酮；
2，4，6-三羟基苯乙酮在三氟化硼乙醚和甲磺酰氯存在下与N，N-二甲基甲酰胺进行Vilsmeyer-Haack甲酰化反应，随后反应物发生闭环反应，得到化合物a；所述2，4，6-三羟基苯乙酮与三氟化硼乙醚和甲磺酰氯摩尔比为1.0：2.0～5.0：1.5～4.5，反应温度为rt～90℃，时间为1～6小时；
(2)制备化合物b7-(1，1-二甲基-2-丙炔氧基)-5-羟基色酮；
化合物a溶解于丙酮中，在碳酸钾和碘化钾存在下碘化亚铜催化,与3-氯-3-甲基-1-丁炔进行选择性单醚化反应,得到化合物b；相对于化合物a，所述碳酸钾用量为2.0～5.0当量，碘化钾用量为2.0-4.5当量，催化剂用量为0.02～0.1当量，3-氯-3-甲基-1-丁炔用量为1.0～1.5当量；温度为40～70℃，反应时间为1.0～5.0小时；
(3)制备化合物c5-羟基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮；
化合物b在NaH和高沸点溶剂中进行选择性的热环合反应，得到化合物c；溶剂为二甲苯，温度为130℃，NaH用量为1.0～10.0当量，反应时间为8.0～24.0小时；
(4)制备化合物d5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮；
化合物c在碳酸钾存在下与硫酸二甲酯进行酚甲基化反应，得到化合物d；化合物c与硫酸二甲酯的摩尔比为1：1.0～3.0，反应时间为2.0～8.0小时，反应溶剂为丙酮，反应在回流下进行；
(5)制备化合物e3-碘-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮；
化合物d在甲醇溶剂中，用哌啶开环，然后在吡啶存在下与碘进行碘化、闭环反应，得到化合物e；相对化合物d，所述哌啶加入量为5.0～20.0当量，吡啶加入量为1.0～5.0当量，碘为1.0～10.0当量；开环反应在回流条件下进行，反应时间为1.0～3.0小时；所述碘化、闭环所用溶剂为二氯甲烷，在室温下进行，反应时间为10.0～20.0小时；
(6)制备化合物f2-咪唑-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]色酮；
化合物e与咪唑在碱性碳酸钾条件下，进行Michael加成并失去一分子HI，得到化合物f；相对于化合物e，所述咪唑的加入量为1.0～3.0当量，碳酸钾的加入量为5.0～15.0当量，溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，反应温度为80℃，反应时间为2小时；
(7)制备化合物g5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃[3，2-g]-4-羟基-香豆素；
化合物f在酸性条件下pH＝1～2水解得到化合物g，所述溶剂为冰醋酸，用量为5.0～10.0ml，反应温度为80℃，反应时间为20.0～40.0小时；
(8)制备化合物HirtellanineB；
化合物g和邻苯二酚溶于丙酮中，加入醋酸钠水溶液，铁氰化钾作氧化剂，室温下进行氧化偶联反应，生成化合物HirtellanineB；相对于化合物g的量，所述邻苯二酚的量为1.5～3.0当量，醋酸钠的量为10.0～20.0当量，铁氰化钾的量为5.0～10.0当量，反应时间为2～3小时。
2.根据权利要求1所述的一种天然产物HirtellanineB的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)制备化合物b7-(1，1-二甲基-2-丙炔氧基)-5-羟基色酮；化合物a溶解于丙酮中，在碳酸钾和碘化钾存在下碘化亚铜催化,与3-氯-3-甲基-1-丁炔进行选择性单醚化反应,得到化合物b；相对于化合物a，所述碳酸钾用量为2.0～5.0当量，碘化钾用量为2.0-4.5当量，催化剂用量为0.05当量，3-氯-3-甲基-1-丁炔用量为1.05当量；温度为40～70℃，反应时间为1.0～5.0小时；
所述步骤(3)制备化合物c5-羟基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮；化合物b在NaH和高沸点溶剂中进行选择性的热环合反应，得到化合物c；溶剂为二甲苯，温度为130℃，NaH用量为4.0～6.0当量，反应时间为8.0～24.0小时；所述步骤(5)制备化合物e3-碘-5-甲氧基-8，8-二甲基-8H-吡喃(3，2-g)色酮；化合物d在甲醇溶剂中，用哌啶开环，然后在吡啶存在下与碘进行碘化、闭环反应，得到化合物e；相对化合物d，所述哌啶加入量为5.0～20.0当量，吡啶加入量为2.0当量，碘为1.0～10.0当量；，在回流条件下进行，反应时间为1.0～3.0小时；所述碘化、闭环所用溶剂为二氯甲烷，在室温下进行，反应时间为10.0～20.0小时。
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