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一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法，将珍珠贝的外套膜切成小片，通过酶学解聚分散成单细胞，原代培养后再进行传代培养，离心，把所得细胞配成溶液，定量注射到育珠贝外套膜的结缔组织中，放置到养殖区通过一个周期的培养可生产珍珠。

Description

一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法
技术领域
本发明属于一种养殖珍珠的方法，尤其是通过珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法。
背景技术
珍珠的培育方法一般可用植入细胞小片技术进行，首先选取供片贝用撕膜法把制好的外套膜组织带切片，再把小片植入所选育珠贝一定部位的结缔组织中，插片后处理，然后送到养殖区。目前运用此方法养殖需要消耗大量珍珠贝以提供外套膜小片，同时对育珠贝伤害较大，恢复困难，导致死亡率较高，产珠率偏低，并且培育的珍珠大小、色泽不均匀，优质珍珠生产率低。
发明内容
本发明避免了上述现有育珠技术的不足之处，提供一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）珍珠贝和育珠贝的选择：选择贝体完整无损，年龄在0.5～1岁的珍珠贝，可以为三角帆蚌、褶纹冠蚌、池蝶蚌、马氏珠母贝、白蝶贝、黑蝶贝或企鹅贝。选择贝体完整无损的育珠贝，无核育珠贝年龄在0.5～1岁，可以为三角帆蚌、褶纹冠蚌、池蝶蚌。有核育珠贝年龄在1～2岁，可以为马氏珠母贝、白蝶贝、黑蝶贝或企鹅贝。
（2）切片：从珍珠贝上撕下外套膜，置于含有青链霉素的混合液中30～60分钟，其中混合液中青霉素浓度为1500～2000U/mL，链霉素浓度为2000～2500U/mL，然后用Hanks液漂洗2～4次，去除血污，然后切成2～4mm×2～4mm大小的片。
（3）细胞培养：将步骤（2）所得小片置于浓度为0.5～100单位/mL的酶液中酶解消化，所用酶是胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶（Dispase）中的一种，在20～37℃孵育1～18h，然后将消化液500～1000rpm低速离心3～6分钟，弃去上清，得珍珠贝外套膜细胞，加入含有血清的培养液原代培养后再进行传代，培养到40～50代，其中所用含有血清的培养液以体积计由75～85%RPMI1640和15～25%胎牛血清配制而成，其中再加入1.25～1.75mmol/L Ca2+、110～130μg/mL维生素D、125～140μg/mL牛磺酸、70～80μg/mL酵素和35～40μg/mL溶菌酶。
（4）细胞悬液配制及注射：传代培养后的细胞1000～1500rpm离心3～6分钟后去上清收集细胞，用含有血清的新鲜培养液洗2～4次，细胞1000～1500rpm再次离心3～6分钟后去上清后加入适量甘油，使细胞浓度为4～6x106cells/mL，混合均匀，用开壳器把育珠贝开口，加附口器，用液体注射器将如上配制的细胞悬液以每只贝4～6mL的接种量定量注射到育珠贝外套膜的结缔组织中，所述注射为常规注射，不伤及贝体以及育珠贝外套膜和结缔组织。
（5）育珠贝养殖：将步骤（4）接种了珍珠贝细胞的育珠贝送往养殖区培养，无核育珠贝养殖2～3年，有核育珠贝养殖1～2年可生产出优质珍珠。
本发明的优点：
珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法减少了消耗珍珠贝的数量，降低了对育珠贝的伤害度，从而提高了育珠贝的存活率和得珠率，且定量注射均一的活性细胞悬液，使所得优质珍珠的比率也明显提高。
具体实施方式
实施例1
（1）珍珠贝和育珠贝的选择：选择珍珠贝为三角帆蚌，完整无损，年龄1岁，育珠贝为三角帆蚌，同样完整无损，年龄是1岁。
（2）切片：从珍珠贝上撕下外套膜，将其先置于含有青链霉素的混合液中40分钟，其中混合液中青霉素浓度为2000U/mL，链霉素浓度为2500U/mL，再用Hanks液漂洗3次，去除血污，然后切成2mm×3mm大小的片。
（3）细胞培养：将步骤（2）所得小片加入到浓度为60单位/mL的酶液中酶解消化，所用酶是胶原酶，在37℃孵育12h，800rpm离心消化液6分钟，弃去上清，得珍珠贝外套膜细胞，然后向所得细胞中加入含有血清的培养液原代培养后再进行传代，培养45代，其中所用含有血清的新鲜培养液以体积计由80%RPMI1640和20%胎牛血清配制而成，其中再加入1.25mmol/L Ca2+、110μg/mL维生素D、125μg/mL牛磺酸、70μg/mL酵素和35μg/mL溶菌酶。（4）细胞悬液的配制及注射：传代培养后的细胞1500rpm离心5分钟后弃去上清收集细胞，用含有血清的新鲜培养液洗3次，细胞1500rpm再次离心5分钟后去上清后加入适量甘油，使细胞悬液浓度为6×106cells/mL，混合均匀，用开壳器把育珠贝开口，加附口器，用液体注射器将如上配制的细胞悬液以每只贝5mL的接种量定量注射到育珠贝外套膜的结缔组织中，所述注射为常规注射，不伤及贝体以及育珠贝外套膜和结缔组织。
（5）育珠贝养殖：将步骤（4）接种了珍珠贝细胞的育珠贝送往养殖区培养3年获得珍珠，并测得育珠贝的存活率为96.4%、得珠率为89.6%，优质珠率为56.3%。
实施例2
（1）珍珠贝和育珠贝的选择：选择珍珠贝为白蝶贝，完整无损，年龄1岁，育珠贝为白蝶贝，同样完整无损，年龄是2岁。
（2）切片：从珍珠贝上撕下外套膜，将其先置于含有青链霉素的混合液中60分钟，其中混合液中青霉素浓度为2000U/mL，链霉素浓度为2500U/mL，再用Hanks液漂洗4次，去除血污，然后切成2mm×3mm大小的片。
（3）细胞培养：将步骤（2）所得小片加入到浓度为80单位/mL的酶液中酶解消化，所用酶是胰蛋白酶，在37℃孵育15h，800rpm离心消化液6分钟，弃去上清，得珍珠贝外套膜细胞，然后向所得细胞中加入含有血清的培养液原代培养后再进行传代，培养45代，其中所用含有血清的新鲜培养液以体积计由80%RPMI1640和20%胎牛血清配制而成，其中再加入1.75mmol/L Ca2+、130μg/mL维生素D、140μg/mL牛磺酸、80μg/mL酵素和40μg/mL溶菌酶。
（4）细胞悬液的配制及注射：传代培养后的细胞1500rpm离心5分钟后弃去上清收集细胞，用含有血清的新鲜培养液洗4次，细胞1500rpm再次离心5分钟后去上清后加入适量甘油，使细胞悬液浓度为6×106cells/mL，混合均匀，用开壳器把育珠贝开口，加附口器，用液体注射器将如上配制的细胞悬液以每只贝6mL的接种量定量注射到育珠贝外套膜的结缔组织中，所述注射为常规注射，不伤及贝体以及育珠贝外套膜和结缔组织。
（5）育珠贝养殖：将步骤（4）接种了珍珠贝细胞的育珠贝送往养殖区培养2年获得珍珠，并测得育珠贝的存活率为94.8%、得珠率为87.3%，优质珠率为57.1%。
实施例3
（1)珍珠贝和育珠贝的选择：选择珍珠贝为企鹅贝，完整无损，年龄0.5岁，育珠贝为白蝶贝，同样完整无损，年龄是1岁。
（2）切片：从珍珠贝上撕下外套膜，将其先置于含有青链霉素的混合液中60分钟，其中混合液中青霉素浓度为1800U/mL，链霉素浓度为2000U/mL，再用Hanks液漂洗4次，去除血污，然后切成2mm×3mm大小的片。
（3）细胞培养：将步骤（2）所得小片加入到浓度为60单位/mL的酶液中酶解消化，所用酶是中性蛋白酶（Dispase），在37℃孵育15h，800rpm离心消化液6分钟，弃去上清，得珍珠贝外套膜细胞，然后向所得细胞中加入含有血清的培养液原代培养后再进行传代，培养45代，其中所用含有血清的新鲜培养液以体积计由85%RPMI1640和15%胎牛血清配制而成，其中再加入1.75mmol/L Ca2+、130μg/mL维生素D、140μg/mL牛磺酸、80μg/mL酵素和40μg/mL溶菌酶。
（4）细胞悬液的配制及注射：传代培养后的细胞1200rpm离心5分钟后弃去上清收集细胞，用含有血清的新鲜培养液洗4次，细胞1200rpm再次离心5分钟后去上清后加入适量甘油，使细胞悬液浓度为5×106cells/mL，混合均匀，用开壳器把育珠贝开口，加附口器，用液体注射器将如上配制的细胞悬液以每只贝6mL的接种量定量注射到育珠贝外套膜的结缔组织中，所述注射为常规注射，不伤及贝体以及育珠贝外套膜和结缔组织。
（5）育珠贝养殖：将步骤（4）接种了珍珠贝细胞的育珠贝送往养殖区培养2年获得珍珠，并测得育珠贝的存活率为92.7%、得珠率为84.3%，优质珠率为51.9%。

Claims (6)

1.一种基于珍珠贝外套膜细胞培养生产珍珠的方法，包括如下步骤：
（1）珍珠贝和育珠贝的选择：选择贝体完整无损，年龄在0.5～1岁的珍珠贝，选择贝体完整无损的育珠贝，无核育珠贝年龄在0.5～1岁，有核育珠贝年龄在1～2岁；
（2）切片：从珍珠贝上撕下外套膜，置于含有青链霉素的混合液中30～60分钟，其中混合液中青霉素浓度为1500～2000U/mL，链霉素浓度为2000～2500U/mL，然后用Hanks液漂洗2～4次，去除血污，然后切成2～4mm×2～4mm大小的片；
（3）细胞培养：将步骤（2）所得小片置于浓度为0.5～100单位/mL的酶液中酶解消化，在20～37℃孵育1～18h，然后将消化液500～1000rpm低速离心3～6分钟，弃去上清，得珍珠贝外套膜细胞，加入含有血清的培养液原代培养后再进行传代；
（4）细胞悬液配制及注射：传代培养后的细胞1000～1500rpm离心3～6分钟后去上清收集细胞，用含有血清的新鲜培养液洗2～4次，细胞1000～1500rpm再次离心3～6分钟后去上清后加入适量甘油，使细胞浓度为4～6x106cells/mL，混合均匀，将如上配制的细胞悬液以每只贝4～6mL的接种量定量注射到育珠贝外套膜的结缔组织中；
（5）育珠贝养殖：将步骤（4）接种了珍珠贝细胞的育珠贝送往养殖区培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其中珍珠贝选自三角帆蚌、褶纹冠蚌、池蝶蚌、马氏珠母贝、白蝶贝、黑蝶贝或企鹅贝，无核育珠贝选自三角帆蚌、褶纹冠蚌或池蝶蚌，有核育珠贝选自马氏珠母贝、白蝶贝、黑蝶贝或企鹅贝。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤（3）中所用的酶选自胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶（Dispase）中的一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤（3）和步骤（4）所用的含有血清的新鲜培养液以体积计由75～85%RPMI1640和15～25%胎牛血清配制而成，其中再加入1.25～1.75mmol/L Ca2+、110～130μg/mL维生素D、125～140μg/mL牛磺酸、70～80μg/mL酵素和35～40μg/mL溶菌酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤（3）中所述的传代是培养到40～50代。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤（5）中无核育珠贝养殖2～3年，有核育珠贝养殖1～2年后获得珍珠。
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