CN103314771B - 一种松杉灵芝新菌种及其栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种松杉灵芝新菌种及其栽培方法。所述松杉灵芝新菌种为松杉灵芝（Ganoderma tsugae Murr.）G122，保藏编号为CGMCC 7220。松杉灵芝CGMCC 7220的栽培方法包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作生产种，栽培培养及出芝管理。本发明的有益效果是：本发明提供一种松杉灵芝新菌种，该菌种来自于西藏林芝地区波密县扎西岗乡的阔叶林中的青冈树根部，并且还提供了相应的人工栽培方法。该松杉灵芝新菌种活性成分高，抗肿瘤功能好，丰富了抗肿瘤的菌种品种，具有很好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种松杉灵芝新菌种及其栽培方法。
背景技术
松杉灵芝（Ganoderma tsugae Murr.）收录在我国中药药典中，与赤芝（Ganoderma lucidum），紫芝（Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang）一起被广泛应用于抗肿瘤药品及保健食品当中。目前，关于松杉灵芝的专利申请主要是关于松杉灵芝的提取、多糖制备、子实体分子标记或已有菌种的栽培方法。本申请是在西藏林芝地区波密县扎西岗乡的阔叶林中的青冈树根部中发现并分离的新菌种，经研究，未见关于该菌种的研究报道。
发明内容
针对以上不足，本发明提供一种松杉灵芝新菌种及其人工栽培方法。
本发明通过以下方案达到上述目的：
本发明的松杉灵芝新菌种采自西藏林芝地区波密县扎西岗乡的阔叶林中的青冈树根部，经鉴定为松杉灵芝变种，并组织分离获得原始菌株，命名为松杉灵芝（Ganoderma tsugae Murr.）G122，已于2013年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC7220。
上述的松杉灵芝CGMCC7220的栽培方法，包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作生产种，栽培培养及出芝管理。
优选的，上述栽培方法具体包括以下步骤：
（1）制作母种：采集组织分离的菌种松杉灵芝G122，将菌种无菌接至综合PDA斜面，置于25℃培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面即得生产母种，其中所述综合PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1微量，其余为水；
（2）制作原种：将生产母种无菌接入原种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱75-79%、小米16-20%、CaCO31-2%、含水量55-60%，将所述原种料装入菌种袋中，制得原种袋；
（3）制作生产种：将原种无菌接入生产种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得生产种，其中生产种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89%、麸皮10-12%、CaCO31-2%或棉籽壳48-52%、木屑25-30%、麸皮18-20%、碳酸钙1-2%、硫酸钙1-2%，含水量55-60%，将所述将生产种料装入菌种袋中，制得生产种袋；
（4）接种栽培：将生产种无菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃培养室中避光培养，待栽培袋中的菌丝长满栽培料后，继续遮光后熟培养至菌丝完成后熟期，其中栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑75-78%、麸皮20-22%、CaCO3 1-2%，含水量60-65%，将所述栽培料装入菌种袋中，制得栽培袋；
（5）出芝管理：调节温度为26-28℃、湿度85-90%、光照100-200lux，不通气，保持CO2含量在2000ppm以上至长出原基，调整温度为26-28℃、空气相对湿度85-90%、光照约200-300lux，不通气，继续保持CO2含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长期时，通气，调整温度为26-28℃，湿度85-95%，光照300-500lux，通气，保持CO2含量小于1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘。
进一步优选的栽培方法，在上述步骤（4）中的培养室的空气相对湿度为60-70%。
该松杉灵芝CGMCC7220的子实体具有以下的形态特征：
菌盖15-20cm×7-10cm，近柄处厚2-3cm，肾形或扇形，基部常连结在一起；盖表面近红色至红褐色，边缘新生部分呈白色至淡黄色，成熟个体菌盖近柄处颜色由黄渐变成红褐、深红褐至略紫或暗红褐色，漆样光泽由微至强，光滑，成熟个体的边缘通常有同心环带的褶皱，软肉质但表面覆盖一层薄硬皮，边缘钝。
菌孔面白色至奶白色，伤变淡褐色；5-6个孔/mm，菌孔近圆形；菌管长4-6mm，不分层，赭黄色至浅灰褐色。近柄处或基部菌肉厚约2.2cm，干时呈白色至近奶白色，软纤维质或软木质。菌柄长5-8cm，粗3.5-5.5cm，圆柱形或略扁，呈微红至紫褐色的革质，菌柄的菌肉组织白色，纤维质至木质。
菌丝系统三型：生殖菌丝直径4.0-5.0μm，无色，薄壁，有锁状联合结构；骨架菌丝粗2.5-5.5μm，无色，厚壁，不分枝或末端有少量分枝；联络菌丝无色，厚壁，多分枝，约1.0-2.0μm宽。
担孢子大小10-13×7-9μm，卵形或宽椭圆形，通常有一端较尖细，顶端平截，内壁有明显小刺，褐色。
皮壳构造呈直立的栅栏状，褐色，组成菌丝棍棒状，厚壁，由骨架菌丝形成的，皮层末端细胞40-70×8-15.0μm。
经分子生物学鉴定，其ITS分子序列分析结果接近松杉灵芝G.tsugae。松杉灵芝生境应为松树基部，而该灵芝生于阔叶树青冈基部，由此得出其应该为松杉灵芝的变种。
本发明的有益效果是：本发明提供一种松杉灵芝新菌种，该菌种来自于西藏林芝地区波密县扎西岗乡的阔叶林中的青冈树根部，并且还提供了相应的人工栽培方法。该松杉灵芝新菌种活性成分高，抗肿瘤功能好，丰富了抗肿瘤的菌种品种，具有很好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：
松杉灵芝新菌种（CGMCC7220）的人工栽培方法，包括以下步骤：
1）按质量百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%及微量维生素B1、其余为水的原料组成常规制作综合PDA斜面，0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min；
2）按质量百分比计为高粱78%、小米20%、CaCO32%的原料组成，含水量60%，制作原种料，将原种料装入13cm×25cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得原种袋，折合每原种袋装干料300g；
3）按质量百分比计为棉籽壳89%、麸皮10%、CaCO3 1%的原料组成，含水量55%，制作生产种料，将生产种料装入15cm×30cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得生产种袋，折合每生产种袋装干料350g；
4）按质量百分比计为木屑78%、麸皮20%、CaCO3 2%的原料组成，含水量60%，制作栽培料，将栽培料装入17cm×35cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得栽培袋，折合每袋装干料500g；
5）制作母种：采集组织分离的菌种松杉灵芝CGMCC7220，将菌种无菌接至综合PDA斜面，置于25℃培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面（约7天左右）即得生产母种；
6）制作原种：将生产母种无菌接入原种袋中，接种时确保母种料块埋入原种料中，然后置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后（约25天左右）即得原种；
7）制作生产种：将原种无菌接入生产种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得生产种；
8）接种栽培：将生产种无菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃、空气相对湿度60-70%的培养室中避光培养，待栽培袋中的菌丝长满栽培料后（大约30-35d），继续遮光后熟培养15d至菌丝完成后熟期，切下套环及老种块；
9）出芝管理：调节温度为26-28℃、湿度85-90%、光照100-200lux，不通气，保持CO2含量在2000ppm以上至长出原基，调节温度为26-28℃、空气相对湿度85-90%、光照约200-300lux，不通气，继续保持CO2含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长期时，通气，调整温度为26-28℃，湿度85-95%，光照300-500lux，通气，保持CO2含量小于1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘，子实体约40.6g/个（鲜重），10.6g/个（干重），直径平均为9.9cm。
实施例2：松杉灵芝新菌种（CGMCC7220）的有效成分分析（灵芝多糖及总三萜）
本实施例中分别采用三个样品进行灵芝多糖及总三萜含量测定，三个样品分别为：国内常用赤芝子实体（市售）、松杉灵芝CGMCC7220（广州人工栽培）的子实体、松杉灵芝CGMCC7220（西藏栽培）的子实体。
1、灵芝多糖含量的测定
1）葡萄糖标准曲线的制作
精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖50mg，置500ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度。吸取葡萄糖标准溶液0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml，分置于比色管中，各加蒸馏水至体积为1.0ml，再加5%苯酚试液1.5ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸7.0ml，摇匀后放置30min，然后用去离子水定容至10ml，冷却后再488nm波长条件下，以空白试剂调零，分别测定A488nm值。按浓度与吸光值得比绘制葡萄糖标准曲线。
2）样品中多糖的提取
分别精确称取0.25g样品，加入10ml蒸馏水（加水量根据样品量来定、料水重量体积比1：40），摇匀后沸水浴2小时，冷却后加水至10ml，4000r/min离心15min后去上清液，沉淀物加水溶解，在沸水中水浴1小时，4000r/min离心15min同样取上清液，沉淀物再加水5ml洗涤，4000r/min离心15min，三次上清液混合定容至25ml，准确量取1.0ml加无水乙醇5ml，振荡均匀后沉淀过夜，4000r/min离心15min，弃去上清液，取沉淀物再加无水乙醇5ml，反复操作二次，沉淀物用去离子水溶解定容至10ml（也可视沉淀物的量而定）。
3）样品测定
吸取1ml溶解液于10ml比色管中，加苯酚1.5ml、浓硫酸7.0ml摇匀后反应半小时，然后定容至10ml，冷却后在488nm波长条件下，以空白试剂调零，分别测定A488nm值。与葡萄糖标样作对照，计算总多糖含量。
4）计算
C从标准曲线上查得的样品比色液中葡萄糖的质量，mg
n为稀释倍数
W为样品重量
2、总三萜含量测定（以齐墩果酸计）：
参考：DB44/T496-2008灵芝中三萜物质的测定
1）供试品溶液
分别精密称定样品0.5g，加入30ml乙酸乙酯，摇均后超声波处理1小时，过滤；滤纸连同残渣再加入20ml乙酸乙酯，超声处理1小时，过滤，合并滤液，定容至50ml。取0.2ml提取液于沸水浴蒸干，加入0.20ml5%香草醛—冰乙酸溶液和0.80ml高氯酸，在70℃水浴中加热15分钟并移入冰水浴中冷却5分钟，用自来水浴调至室温，再加入5.00ml冰乙酸，摇匀。以空白试剂做参比，在30分钟内用分光光度计于545nm波长下测定对照品溶液的吸光度。
2）标准品溶液
精密称取齐墩果酸标准品（购自SIGMA-ALDRICH公司，纯度≥97%）10mg，置100ml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.1mg/ml的标准品溶液。
3）标准曲线制备
分别吸取0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml和1.20ml标准品溶液，于沸水浴蒸干后，加入0.20ml5%香草醛—冰乙酸溶液和0.80ml高氯酸，在70℃水浴中加热15分钟，并移入冰水浴中冷却5分钟，用自来水浴调至室温，再加入5.00ml冰乙酸，摇匀。以空白试剂做参比，在30分钟内用分光光度计于545nm波长下测定对照品溶液的吸光度。分别以浓度和吸光度绘制标准曲线。
4）计算和结果表示
根据标准曲线，于545nm处测吸光度后按下式计算。
以上样品的灵芝多糖及总三萜含量测定结果如表1所示。
表1各样品的灵芝多糖及总三萜含量测定
以上结果说明，经人工栽培的松杉灵芝CGMCC7220子实体有效成分（灵芝多糖、总三萜）含量远高于目前国内常用的赤芝品种。
实施例3：松杉灵芝新菌种（CGMCC7220）的抗肿瘤特性分析（体外肿瘤乳腺癌细胞MT-1生长抑制实验）
1、水提物制备
将赤芝子实体、松杉灵芝CGMCC7220子实体分别粉碎后，分别按料液比1:10加入蒸馏水，于9O℃水浴中恒温3h，过滤，滤渣重复提取2h，过滤，合并滤液浓缩至料液为1:5后，加5倍体积的无水乙醇静置1h，然后过滤，将醇沉后的沉淀冻干（冻干仪器为德国产CHRIST ALPHA1-4LD）后备用。
2、肿瘤细胞培养
用含青霉素、链霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液进行细胞培养。将含有10%FBS的DMEM细胞悬液接种于96孔组织培养板上，细胞浓度为1×105cells/ml，100μl/孔。培养物置于37℃、5%CO2的组织培养箱中培养4小时待用。
将水提物用PBS溶解，配制成浓度为20mg/ml的母液，过滤后用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液将母液分别稀释为2mg/ml和2.5mg/ml的样品溶液。小心吸去96孔培养板里的细胞培养液，分别加入终浓度分别为2mg/ml和2.5mg/ml的样品溶液，然后置于37℃、5%CO2组织培养箱中培养48小时。对照组只含PBS和培养基。
3、台酚蓝染色
培养结束后，收集细胞，与台酚蓝1：1混合进行拒染法染色。死细胞被染成蓝色，活细胞因有完整的细胞膜而未着色。用细胞计数器测定活细胞数。每个实验重复三次。
4、MTT法检测抑制效果
（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1×105cells/ml，细胞单层铺满孔底（96孔平底板）（边缘孔用无菌PBS填充）。
（2）5%CO2，37℃孵育4个小时后加不同浓度样品。
（3）5%CO2，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。
（4）培养48小时后，吸去样品，用培养基清洗细胞后吸去培养基，加入MTT：培养基=1:5的混合溶液，每孔溶液终体积为100ul，培养4小时后检测。
（5）同时设置调零孔（培养基、MTT），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT）。
5、数据分析
使用SPSS.16专用统计软件进行统计，采用配对t检验，P<0.05具有显著性差异。赤芝子实体、松杉灵芝CGMCC7220子实体对于体外肿瘤乳腺癌细胞MT-1的抑制效果如表2所示。
表2两个测试样品对于体外肿瘤乳腺癌细胞MT-1的IC50
实施例4：松杉灵芝新菌种（CGMCC7220）的抗病毒特性分析
1.生长状态良好的Vero细胞以1.5×104个/孔的密度接种96孔细胞培养板，过夜培养，长成细胞单层。
2.待筛选样品用维持培养基倍比稀释成3个浓度，起始浓度为小于20%细胞毒性的样品浓度。阳性对照ACV选取12.5ug/ml的浓度，溶剂对照则作平衡浓度，阴性对照为培养液。
3.病毒HSV/Blue用维持培养基稀释成0.5MOI/50ul溶液。吸弃Vero细胞培养液，分别加入稀释好的样品液或各种对照，每孔加入50ul。随后立即加入稀释好的病毒液，每孔50ul。轻轻振荡均匀。
4.37℃、5%CO2培养箱培养24h后进行β-Gal活性检测。
5.吸弃样品与病毒的混合液，每孔加入100ul1%NP40细胞裂解液，放置5～10min，中途十字振荡三次。
6.每孔吸取50ul裂解物加到96孔酶标板（或96孔细胞培养板）上，随后加入50ul的β-Gal活性检测底物缓冲液，轻轻振动混匀。
7.超级酶标仪上进行570nm动态光吸收的测定。测定条件为37℃，测570nm光吸收值，每2min读数一次，连续25次读数，中途振荡。测试结果单位为milli-optical density units per min（mOD/min）。
8.根据公式计算每个浓度样品对病毒抑制率：
抑制率＝（阴性对照孔测量值－样品孔测量值）/阴性对照孔测量值×100%
表3测试样品对病毒的IC50值
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种松杉灵芝菌种，其特征在于，所述松杉灵芝菌种为松杉灵芝（Ganoderma tsugae Murr.）G122，保藏编号为CGMCC7220。
2.一种如权利要求1所述的松杉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作生产种，栽培培养及出芝管理。
3.如权利要求2所述的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制作母种：采集组织分离的菌种松杉灵芝G122，将菌种无菌接至综合PDA斜面，置于25℃培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面即得生产母种，其中所述综合PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1微量，其余为水；
（2）制作原种：将生产母种无菌接入原种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱78%、小米20%、CaCO32%、含水量55-60%，将所述原种料装入菌种袋中，制得原种袋；
（3）制作生产种：将原种无菌接入生产种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得生产种，其中生产种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89%、麸皮10-12%、CaCO31-2%或棉籽壳48-52%、木屑25-30%、麸皮18-20%、碳酸钙1-2%、硫酸钙1-2%，含水量55-60%，将所述生产种料装入菌种袋中，制得生产种袋；
（4）接种栽培：将生产种无菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃培养室中避光培养，待栽培袋中的菌丝长满栽培料后，继续遮光后熟培养至菌丝完成后熟期，其中栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78%、麸皮20%、CaCO32%，含水量60-65%，将所述栽培料装入菌种袋中，制得栽培袋；
（5）出芝管理：调节温度为26-28℃、湿度85-90%、光照100-200lux，不通气，保持CO2含量在2000ppm以上至长出原基，调整温度为26-28℃、空气相对湿度85-90%、光照200-300lux，不通气，继续保持CO2含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长期时，通气，调整温度为26-28℃，湿度85-95%，光照300-500lux，通气，保持CO2含量小于1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘。
4.如权利要求3所述的栽培方法，其特征在于，所述步骤（4）中的培养室的空气相对湿度为60-70%。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20140730 |