CN103305579B

CN103305579B - 一种玉米源辅助增强记忆肽及其制备方法

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Publication number: CN103305579B
Application number: CN201310272702.0A
Authority: CN
Inventors: 林松毅; 王可; 刘旭野; 杨帅伶; 张秦溥; 肖轲; 刘静波
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin Shengheng e-commerce Co.,Ltd.
Priority date: 2013-06-29
Filing date: 2013-06-29
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2033-06-29
Also published as: CN103305579A

Abstract

本发明属于玉米精深加工及其副产物综合利用的技术领域，公开了一种玉米源辅助增强记忆肽及其制备方法，重点解决了以玉米蛋白粉为原料，设计出酶解、超滤、稳态化处理、增效处理、真空旋转浓缩和真空冷冻干燥等工艺路线，制备玉米源辅助增强记忆肽；以动物行为学实验水迷宫、穿梭箱、爬杆、探洞和跳台实验的结果为衡量指标，优选出酶解技术、稳态化技术和增效技术的最佳工艺参数，实现了受试小鼠实验组相比对照组，其实验结果优势显著性提高（P<0.01）。本发明旨在深入研发玉米加工副产物的生物学功能，提升玉米资源综合利用水平，及加快玉米精深加工系列产品的开发进程。

Description

一种玉米源辅助增强记忆肽及其制备方法

技术领域

本发明属于玉米精深加工及其副产物综合利用的技术领域，涉及一种利用碱性蛋白酶酶解技术、超滤技术、稳态化技术和增效技术制备玉米源辅助增强记忆肽的方法，能够实现在最优酶解技术、稳态化技术和增效技术的支持下，制备出一种玉米源辅助增强记忆肽产品，经动物实验检验获知，与对照组相比，受试实验组小鼠水迷宫游程时间缩短24%，穿梭箱电击次数降低18%，爬杆时间缩短26%，探洞次数提高19%，跳台反应期缩短29%（P<0.01）。

背景技术

玉米蛋白粉是玉米籽粒经生产淀粉或提醇后的副产品，但因其具有特殊的味道和色泽，一般只作饲料使用。玉米蛋白粉也叫玉米麸质粉，是由玉米籽粒经湿磨法工艺制得的粗淀粉乳，再经淀粉分离机分离出的蛋白质水即麸质水，然后用浓缩离心机或沉淀池浓缩，再经脱水干燥制得的。其蛋白质含量一般在60%以上，有的高达70%，其余是20%的淀粉和约13%的纤维素、维生素A等多种营养物质，还有15种无机盐以及玉米独有的黄色素。因其具有特殊的味道和色泽，一般只作饲料使用，或者直接处理排放，极大地浪费了资源。但因玉米蛋白粉具有较高的蛋白质含量，将其开发成营养保健品的研究趋势正在逐渐升温。

玉米源肽是经玉米蛋白粉酶解制得的生物活性肽，可开发应用于营养保健品领域，大大提高了玉米蛋白粉的利用价值。玉米源肽是低分子肽，具有良好的可溶性，酶解制得的玉米源肽与玉米蛋白粉相比，色泽较浅、味道较淡，接受性较强。玉米源肽由部分人体必需氨基酸构成，具有多种生理活性。目前研究表明，玉米源肽能够减少或消除体内自由基、增强抗氧化性；能够抑制血管紧张素转换酶，降低血压；能够抑制酒精中毒，可用来醒酒；具有抗疲劳作用，可作为高强度工作者及运动员的食品营养强化剂。另外，通过我们通过研究发现，玉米源肽在增强小鼠记忆力和学习能力方面效果显著。因此，本发明旨在利用动物实验为依据，研发一种玉米源辅助增强记忆肽制备方法。

国内外学者对生物活性肽的制备工艺上进行了大量实验研究，但对其活性保护方法上探讨的较少。肽类物质往往由于在生产、应用和存储过程中存在着因氧化、脱酰胺、水解或环化等作用而发生降解的可能，甚至有可能导致活性下降甚至完全丧失，严重影响到深入开发系列化产品的研究进程。因此，研究玉米源肽活性的稳定性显得非常必要。有研究表明，向生物活性肽中加入食品添加剂可以增强其活性。以前研究对生物活性肽的增效作用的多集中在单一物质的效果研究上，如单独添加酒石酸、柠檬酸和抗坏血酸后等，但对各种增效剂之间两两配合或三者同时添加方式是否存在协同增效作用未见相关报道。因此，本发明以玉米源肽为研究对象，考察了NaCl和金属离子对其稳定性的影响，继而考察了添加糖类和柠檬酸两两合用时对玉米源肽活性的影响，并优化出最佳组合。本发明研究为深入研究玉米源肽活性保护技术提供技术支持，并对其在工业化生产中的加工、运输、保藏技术提供依据。

高等动物脑内天然存在着某些记忆增强肽，而从玉米蛋白粉中提取辅助增强记忆肽的研究较少。记忆增强肽一方面能调节神经突触的可塑性，使神经突触传递的长时程增强，另一方面能使一些维持神经细胞正常活动的关键蛋白质的活化及某些基因的表达增强，从而对促进学习增强记忆的途径作出分子水平上的合理说明。记忆增强肽能有效提高大脑记忆力和学习能力，促进大脑功能发育，加快记忆能力损伤的恢复，缓解大脑疲劳，对提高学生学习效率和改善老年人记忆能力方面具有极其重大的意义。本发明是以实验小鼠作为研究对象，用动物行为学实验作为理论依据，从而设计并研发出一种玉米源辅助增强记忆肽的产品及其制备方法。

本发明以动物行为学实验结果为衡量指标，开展了玉米源辅助增强记忆肽生理效果的实验研究。根据《保健食品功能学评价程序和检测方法》中所规定的增强记忆效果评价方法，选择小鼠为实验对象，以Morris水迷宫游程、穿梭箱回避、爬杆、探洞和跳台为实验项目，设计为期90天的玉米源辅助增强记忆肽生理效果的动物实验，为深入研究玉米源肽的稳定性和开发玉米源辅助增强记忆肽产品奠定理论基础。

因此，本发明专利要求保护的是一种玉米源辅助增强记忆肽产品及其制备方法，即利用碱性蛋白酶酶解技术，通过控制适宜的物料浓度、温度、pH值、加酶量和酶解时间，将一定水分含量的玉米蛋白粉进行酶解处理。经超滤技术分离出分子量小于1kDa的酶解液。添加适量浓度的NaCl，以及Fe²⁺或K⁺等金属离子对酶解液进行的稳态化处理，并添加麦芽糖和柠檬酸作为酶解液的增效剂，即得到玉米源辅助增强记忆肽产品。

本专利申请实现了在最优酶解技术、稳态化技术和增效技术的支持下，制备出玉米源辅助增强记忆肽产品。其优势主要体现在以下三个方面：

第一，本专利技术是以碱性蛋白酶酶解技术为核心。多数研究表明碱性蛋白酶制备玉米源肽是可行而有效的，其水解能力较强，肽的得率和水解度均较高。本专利旨在提高肽得率的同时，改善玉米源肽的品质，使其苦涩味降低，色泽易被接受。通过单因素和响应面实验设计方法，优选出最佳酶解条件，攻克了以往玉米蛋白粉酶解效果不佳的技术难题。

第二，本专利技术是以稳态化技术和增效技术为辅助技术。肽类物质由于在生产、应用和储存过程中存在着因氧化、脱酰胺、水解或环化等作用而发生降解的可能，也可能导致活性下降甚至完全丧失，严重影响到深入开发系列化产品的研究进程。因此，本专利旨在研究玉米源肽的稳态增效技术，以保证玉米蛋白酶解物有良好的稳定性和显著的增效性。对其在工业化生产的加工、运输和保藏技术提供依据。

第三，本专利技术是以动物行为学实验结果为衡量指标。根据《保健食品功能学评价程序和检测方法》中所规定的增强记忆效果评价方法，研究受试小鼠的主动和被动跳避反应，可检验受试小鼠的学习记忆功能，为深入研究玉米源肽的稳定性和改善记忆效果的生理功能奠定了理论基础。

发明内容

本发明需要解决的技术问题：

以玉米蛋白粉为原料，设计出酶解、超滤、稳态化处理、增效处理、真空旋转浓缩和真空冷冻干燥等工艺路线，制备玉米源辅助增强记忆肽。以动物行为学实验水迷宫、穿梭箱、爬杆、探洞和跳台实验的结果为衡量指标，优选出酶解技术、稳态化技术和增效技术的最佳工艺参数，实现了受试小鼠的实验组相比对照组，其实验结果优势显著性提高（P<0.01）。

本发明的技术方案：

1.一种玉米源辅助增强记忆肽的制备方法，其特征在于，以蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉为原料，包括干燥、超微粉碎、酶解、离心、超滤、稳态化处理、增效处理、真空旋转浓缩、真空冷冻干燥过程制备获得玉米源辅助增强记忆肽，其蛋白质含量为86.5%、含水量为2.1%、分子量小于1kDa，其NaCl的含量为0.1%，Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺中的任意一种金属离子含量为0.003%、麦芽糖含量为0.07%、柠檬酸含量为0.04%；经动物实验检验发现，与对照组相比，受试实验组小鼠水迷宫游程时间缩短24%，穿梭箱电击次数降低18%，爬杆时间缩短26%，探洞次数提高19%，跳台反应期缩短29%，实验结果优势显著性提高（P<0.01）；

1）所述的干燥过程，是将蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉置于干燥箱内进行除水干燥，干燥温度控制在35～50℃，干燥时间控制在6～12h，直至玉米蛋白粉的水分含量为1.0～2.0%时，终止干燥过程；

2）所述的超微粉碎过程，是利用超微粉碎机将干燥后的玉米蛋白粉进行粉碎，粉碎筛网规格要求为100～200目，收集玉米蛋白超微粉，迅速密封备用；

3）所述的酶解过程，是选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种，将100～200目的玉米蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为1～6%（W/W）；用高速分散均质机进行均一化处理，调控转速为2000～4000r/min，处理时间为0～20min；再置于80～97℃的水浴锅中加热变性5～30min，冷却后控制酶解温度为40～65℃，调节pH值为6.5～10.5，按[E]/[S]为2～12%（W/W）加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为100万～140万u/g，用1M的NaOH控制料液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为2～5h，将酶解液在80～97℃的水浴锅中加热灭酶5～15min；

4）所述的离心过程，是将酶解液进行离心处理，离心温度为2～10℃、转速为6000～12000×g、离心时间为5～30min，收集酶解上清液备用；

5）所述的超滤过程，是将酶解上清液进行超滤处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01～0.15M、NaOH温度为10～45℃、NaOH清洗时间为1～2h，控制蒸馏水的温度为10～45℃、清洗时间为1～3h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2.0～4.5mL/min，压力均为5～30pis；再依次选用截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，料液温度为5～20℃、膜面流速为2.0～4.5mL/min、压力为5～30pis，最后收集分子量小于1kDa的酶解上清液备用；

6）所述的稳态化处理过程，是在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加浓度为0.2～0.8g/mL、体积为5～10mL的NaCl溶液，再添加浓度为5～30mg/mL、体积为0.5～2mL的Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺中的任意一种金属离子溶液；

7）所述的增效处理过程，是在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加浓度为0.1～0.5g/mL、体积为5～10mL的麦芽糖溶液，再添加浓度为0.01～0.1g/mL、体积为1～5mL的柠檬酸溶液；

8）所述的真空旋转浓缩过程，是用真空旋转浓缩仪处理经稳态增效后的酶解上清液，控制转速为1000～1500rpm，浓缩温度为50～70℃，最终浓缩至初始体积的1/5～1/10；

9）所述的真空冷冻干燥过程，是将真空旋转浓缩后的酶解上清液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在3～5mm，温度为-30～-20℃，预冻时间为2～5h，然后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度在10Pa以下，冷冻干燥时间为9～13h，即可获得含水量为2.1%的玉米源辅助增强记忆肽。

2.一种玉米源辅助增强记忆肽，其特征在于，其蛋白质含量为86.5%、含水量为2.1%、分子量小于1kDa，其NaCl的含量为0.1%，Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺中的任意一种金属离子含量为0.003%、麦芽糖含量为0.07%、柠檬酸含量为0.04%；经动物实验检验发现，与对照组相比，受试实验组小鼠水迷宫游程时间缩短24%，穿梭箱电击次数降低18%，爬杆时间缩短26%，探洞次数提高19%，跳台反应期缩短29%，实验结果优势显著性提高（P<0.01）。

3.根据权利要求1所述的酶解过程，其特征在于，选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的碱性蛋白酶，其特征在于，选用碱性蛋白液体酶或固体酶，要求酶活范围为100万～130万u/g。

5.根据权利要求1所述的超滤过程，其特征在于，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01～0.15M、NaOH温度为10～45℃、NaOH清洗时间为1～2h，控制蒸馏水温度为10～45℃、清洗时间为1～3h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为2.0～4.5mL/min，压力均为5～30pis；再依次选用截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，料液温度为5～10℃、膜面流速为2.5～4.0mL/min，压力为6～28pis，最后收集分子量小于1kDa的酶解上清液备用。

6.根据权利要求1所述的稳态化处理过程，其特征在于，是在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加浓度为0.2～0.6g/mL、体积为5～10mL的NaCl溶液，再添加浓度为10～20mg/mL、体积为0.5～2mL的Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺中的任意一种金属离子溶液。

7.根据权利要求1所述的增效处理过程，其特征在于，是在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加浓度为0.2～0.5g/mL、体积为5～10mL的麦芽糖溶液，再添加浓度为0.05～0.1g/mL、体积为1～5mL的柠檬酸溶液。

8.根据权利要求1和2所述的真空冷冻干燥过程，其特征在于，是将真空旋转浓缩后的酶解上清液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在3～5mm，温度为-30～-20℃，冷冻时间为2～5h；然后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度在10Pa以下，冷冻干燥时间为10～12h，即可获得含水量为2.1%的玉米源辅助增强记忆肽。

9.根据权利要求1和6所述的Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺中的任意一种金属离子溶液，其特征在于，是在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加浓度为10～20mg/mL、体积为0.5～2mL的Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺中的任意一种金属离子溶液。

本发明的技术效果：

（1）本发明实现了最优酶解技术、稳态化技术和增效技术的支持下，制备出玉米源辅助增强记忆肽产品,经动物实验检验发现，与对照组相比，受试实验组小鼠水迷宫游程时间缩短24%，穿梭箱电击次数降低18%，爬杆时间缩短26%，探洞次数提高19%，跳台反应期缩短29%，实验结果优势显著性提高（P<0.01）。

（2）本发明所设计玉米源辅助增强记忆肽生产技术路线简单，所需设备投资少，产品价值高，有利于促进玉米副产物的综合利用和产业开发。

具体实施方式

实施例1：将蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉置于干燥箱内进行除水干燥，干燥温度控制在35℃，干燥10h，直至玉米蛋白粉的水分含量为1.5%。利用超微粉碎机将物料进行粉碎，粉碎筛网规格为200目，收集玉米蛋白超微粉，迅速密封备用。以玉米蛋白膨化粉为底物，用纯净水调适至底物浓度为5%（W/W），用高速分散均质机进行均一化处理，调控转速为3000r/min，处理时间10min；再置于90℃的水浴锅中加热变性10min，冷却控制酶解温度为50℃，调节pH值至9.1，按[E]/[S]为3%（W/W）加入酶活为120万u/g的液体碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制料液pH值的变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，将酶解液在90℃的水浴锅中加热灭酶10min。将酶解后的料液进行离心处理，温度为4℃、转速为10000×g，离心时间为15min，收集酶解上清液。将料液进行超滤处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、温度为10℃、清洗时间为1h，控制蒸馏水温度为10℃、清洗时间为1h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为4.5mL/min、压力均为25pis。然后依次选用截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，料液温度为10℃、膜面流速为4.0mL/min、压力为25pis，最后收集分子量小于1kDa的料液。在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加10mL浓度为0.5g/mL的NaCl溶液，添加1mL浓度为10mg/mL的Fe²⁺溶液，添加10mL浓度为0.5g/mL的麦芽糖溶液，再添加1mL浓度为0.05g/mL的柠檬酸溶液。用真空旋转浓缩仪处理料液，控制转速为1000rpm，浓缩温度设定为60℃，浓缩至初始体积的1/8。将浓缩后的料液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为5mm，温度为-30℃，预冻时间为4h，然后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为8Pa，冻干时间为10h，即获得含水量为2.1%的玉米源辅助增强记忆肽。经动物行为学实验证实，所得产品能使受试小鼠的实验组相比对照组，水迷宫游程时间显著缩短20%，穿梭箱电击次数显著降低18%，爬杆时间显著缩短24%，其他实验结果变化不显著（P<0.05）。

实施例2：将蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉置于干燥箱内进行除水干燥，干燥温度控制在40℃，干燥10h，直至玉米蛋白粉膨化物的水分含量为1.5%。利用超微粉碎机将物料进行粉碎，粉碎筛网规格为200目，收集玉米蛋白超微粉，迅速密封备用。以玉米蛋白膨化粉为底物，用去离子水调适至底物浓度为5%（W/W），用高速分散均质机进行均一化处理，调控转速为3000r/min，处理时间10min；再置于90℃的水浴锅中加热变性10min，冷却控制酶解温度为45℃，调节pH值至10.2，按[E]/[S]为5%（W/W）加入酶活为120万u/g的液体碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制料液pH值的变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，将酶解液在90℃的水浴锅中加热灭酶10min。将酶解后的料液进行离心处理，温度为6℃、转速为10000×g，离心时间为15min，收集酶解上清液。将料液进行超滤处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、温度为10℃、清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为10℃、清洗时间为1h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为4.5mL/min、压力均为25pis。然后依次选用截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，料液温度为10℃、膜面流速为4.0mL/min、压力为25pis，最后收集分子量小于1kDa的料液。在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加10mL浓度为0.2g/mL的NaCl溶液，添加1mL浓度为10mg/mL的K⁺溶液，添加10mL浓度为0.2g/mL的麦芽糖溶液，再添加1mL浓度为0.05g/mL的柠檬酸溶液。用真空旋转浓缩仪处理料液，控制转速为1000rpm，浓缩温度设定为60℃，浓缩至初始体积的1/7。将浓缩后的料液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为5mm，温度为-20℃，预冻时间为4h，然后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为9Pa，冻干时间为10h，即获得含水量为2.1%的玉米源辅助增强记忆肽。经动物行为学实验证实，所得产品能使受试小鼠的实验组相比对照组，爬杆时间显著缩短24%，探洞次数显著提高15%，跳台反应期显著缩短25%，其他实验结果变化不显著（P<0.05）。

实施例3：将蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉置于干燥箱内进行除水干燥，干燥温度控制在40℃，干燥10h，直至玉米蛋白粉膨化物的水分含量为1.5%。利用超微粉碎机将物料进行粉碎，粉碎筛网规格为180目，收集玉米蛋白超微粉，迅速密封备用。以玉米蛋白膨化粉为底物，用纯净水调适至底物浓度为4%（W/W），用高速分散均质机进行均一化处理，调控转速为3000r/min，处理时间10min；再置于90℃的水浴锅中加热变性10min，冷却控制酶解温度为45℃，调节pH值至8.4，按[E]/[S]为10%（W/W）加入酶活为120万u/g的液体碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制料液pH值的变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，将酶解液在90℃的水浴锅中加热灭酶10min。将酶解后的料液进行离心处理，温度为4℃、转速为10000×g，离心时间为15min，收集酶解上清液。将料液进行超滤处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、温度为10℃、清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为10℃、清洗时间为1h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为4.5mL/min、压力均为25pis。然后依次选用截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，料液温度为10℃、膜面流速为4.0mL/min、压力为20pis，最后收集分子量小于1kDa的料液。在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加10mL浓度为0.6g/mL的NaCl溶液，添加1mL浓度为20mg/mL的Zn²⁺溶液，添加10mL浓度为0.5g/mL的麦芽糖溶液，再添加1mL浓度为0.1g/mL的柠檬酸溶液。用真空旋转浓缩仪处理料液，控制转速为1200rpm，浓缩温度设定为60℃，浓缩至初始体积的1/8。将浓缩后的料液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为4mm，温度为-25℃，预冻时间为4h，然后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为9.5Pa，冻干时间为10h，即获得含水量为2.1%的玉米源辅助增强记忆肽。经动物行为学实验证实，所得产品能使受试小鼠的实验组相比对照组，水迷宫游程时间显著缩短23%，穿梭箱电击次数显著降低16%，探洞次数显著提高15%，跳台反应期显著缩短28%，爬杆实验结果变化不显著（P<0.05）。

实施例4：将蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉置于干燥箱内进行除水干燥，干燥温度控制在45℃，干燥10h，直至玉米蛋白粉膨化物的水分含量为1.5%。利用超微粉碎机将物料进行粉碎，粉碎筛网规格为180目，收集玉米蛋白超微粉，迅速密封备用。以玉米蛋白膨化粉为底物，用纯净水调适至底物浓度为5%（W/W），用高速分散均质机进行均一化处理，调控转速为3000r/min，处理时间10min；再置于85℃的水浴锅中加热变性10min，冷却控制酶解温度为50℃，调节pH值至8.4，按[E]/[S]为10%（W/W）加入酶活为120万u/g的液体碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制料液pH值的变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，将酶解液在90℃的水浴锅中加热灭酶10min。将酶解后的料液进行离心处理，温度为4℃、转速为10000×g，离心时间为15min，收集酶解上清液。将料液进行超滤处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、温度为10℃、清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为10℃、清洗时间为1h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为4.5mL/min、压力均为25pis。然后依次选用截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，料液温度为10℃、膜面流速为4.0mL/min、压力为25pis，最后收集分子量小于1kDa的料液。在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加5mL浓度为0.6g/mL的NaCl溶液，添加0.5mL浓度为20mg/mL的Fe²⁺溶液，添加5mL浓度为0.5g/mL的麦芽糖溶液，再添加1mL浓度为0.1g/mL的柠檬酸溶液。用真空旋转浓缩仪处理料液，控制转速为1200rpm，浓缩温度设定为60℃，浓缩至初始体积的1/9。将浓缩后的料液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为5mm，温度为-30℃，预冻时间为4h，然后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为9.5Pa，冻干时间为12h，即获得含水量为2.1%的玉米源辅助增强记忆肽。经动物行为学实验证实，所得产品能使受试小鼠的实验组相比对照组，水迷宫游程时间显著缩短24%，穿梭箱电击次数显著降低17%，跳台反应期显著缩短20%，爬杆和探洞的实验结果变化不显著（P<0.05）。

实施例5：将蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉置于干燥箱内进行除水干燥，干燥温度控制在40℃，干燥12h，直至玉米蛋白粉膨化物的水分含量为2.0%。利用超微粉碎机将物料进行粉碎，粉碎筛网规格为200目，收集玉米蛋白超微粉，迅速密封备用。以玉米蛋白膨化粉为底物，用纯净水调适至底物浓度为6%（W/W），用高速分散均质机进行均一化处理，调控转速为3000r/min，处理时间10min；再置于90℃的水浴锅中加热变性10min，冷却控制酶解温度为65℃，调节pH值至10.5，按[E]/[S]为10%（W/W）加入酶活为120万u/g的液体碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制料液pH值的变化在±0.04内，控制酶解时间为3.5h，将酶解液在90℃的水浴锅中加热灭酶10min。将酶解后的料液进行离心处理，温度为4℃、转速为10000×g，离心时间为10min，收集酶解上清液。将料液进行超滤处理，先用NaOH和蒸馏水分别对截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行清洗，控制NaOH浓度为0.01M、温度为10℃、清洗时间为1h，控制蒸馏水的温度为10℃、清洗时间为1h，控制NaOH和蒸馏水的膜面流速均为4.5mL/min、压力均为25pis。然后依次选用截流量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，料液温度为10℃、膜面流速为3.5mL/min、压力为25pis，最后收集分子量小于1kDa的料液。在每100mL分子量小于1kDa的酶解上清液中，添加10mL浓度为0.2g/mL的NaCl溶液，添加2mL浓度为10mg/mL的Fe²⁺溶液，添加10mL浓度为0.2g/mL的麦芽糖溶液，再添加5mL浓度为0.05g/mL的柠檬酸溶液。用真空旋转浓缩仪处理料液，控制转速为1500rpm，浓缩温度设定为70℃，浓缩至初始体积的1/10。将浓缩后的料液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为5mm，温度为-30℃，预冻时间为5h，然后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为8Pa，冻干时间为12h，即获得含水量为2.1%的玉米源辅助增强记忆肽。经动物行为学实验证实，所得产品能使受试小鼠的实验组相比对照组，穿梭箱电击次数显著降低18%，爬杆时间显著缩短24%，探洞次数显著提高17%，跳台反应期显著缩短26%，水迷宫实验结果变化不显著（P<0.05）。

Claims

1.一种玉米源辅助增强记忆肽的制备方法，其特征在于，以蛋白质含量为66%的玉米蛋白粉为原料，包括干燥、超微粉碎、酶解、离心、超滤、稳态化处理、增效处理、真空旋转浓缩、真空冷冻干燥过程制备获得玉米源辅助增强记忆肽；

3）所述的酶解过程，是选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种，按照重量比将100～200目的玉米蛋白超微粉调至底物蛋白浓度为1～6%；用高速分散均质机进行均一化处理，调控转速为2000～4000r/min，处理时间为0～20min；再置于80～97℃的水浴锅中加热变性5～30min，冷却后控制酶解温度为40～65℃，调节pH值为6.5～10.5，按照重量比调整[E]/[S]为2～12%加入碱性蛋白酶，要求酶活范围为100万～140万u/g，用1M的NaOH控制料液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为2～5h，将酶解液在80～97℃的水浴锅中加热灭酶5～15min；

2.根据权利要求1所述玉米源辅助增强记忆肽的制备方法，其特征在于，所述的碱性蛋白酶，选用碱性蛋白液体酶或固体酶，要求酶活范围为100万～130万u/g。

3.一种权利要求1的玉米源辅助增强记忆肽的制备方法制得的玉米源辅助增强记忆肽，其特征在于，玉米源辅助增强记忆肽的蛋白质含量为86.5%、含水量为2.1%、分子量小于1kDa，其NaCl的含量为0.1%，Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺中的任意一种金属离子含量为0.003%、麦芽糖含量为0.07%、柠檬酸含量为0.04%。