CN103304622A - 海芦笋降三萜皂苷新化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及降三萜皂苷新化合物及其制备方法和用途，属于海洋生物技术领域。一类具有抗肿瘤活性的降三萜皂苷新化合物，以新鲜采摘的海芦笋地上部分为原料，原料捣碎后，用70～90%丙酮水溶液浸提2~3次，提取液减压浓缩至不含丙酮；用等体积的乙酸乙酯萃取除去大部分脂溶性成分，萃余液用等体积甲醇萃取2~3次，过滤，取上层液，减压浓缩得到甲醇萃取物；甲醇萃取物经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析，分离纯化得到式Ⅰ所示降三萜皂苷新化合物。经实验证实，本发明降三萜皂苷化合物对肿瘤细胞有增殖抑制作用，提供了在制备抗肿瘤药物中的用途，也可作为食品原料制备保健食品。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，涉及海芦笋降三萜皂苷新化合物及其制备方法和用途。
背景技术
盐生海芦笋俗称海蓬子或海豆，学名盐角草(Salicornia bigelovii)，是一种鲜美多汁、口感咸脆的绿色海水蔬菜。研究证实海芦笋降低血压、血脂，促进脂肪向肌肉细胞转化，促进肝脏的新陈代谢，提高人体免疫力及预防帕金森病。体外活性研究表明，海芦笋提取物具有显著的抗氧化活性和抗肿瘤活性。
国内外研究学者先后对海芦笋化学成分进行了相关研究，发现了多种化合物，如：槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李亭3-O-β-D-葡萄糖苷、绿原酸衍生物3-咖啡酰-4-二氢咖啡酰奎尼酸(CDCQ)、异栎素6″-O-草酸甲酯、甲基4-咖啡酰-3-二氢咖啡酰奎尼酸、3, 5-二咖啡酰奎尼酸、甲基3, 5-二咖啡酰奎尼酸和3, 4-二咖啡酰奎尼酸等等；迄今，文献报道在自然界发现的降三萜皂苷化合物的还不到20种，有关海芦笋降三萜皂苷的研究报道只有1篇（Qi-zhi Wang; Xiao-feng Liu;Yu Shan;et al.Two new nortriterpenoid saponinsfrom Salicornia bigelovii Torr. and their cytotoxic activity.Fitoterapia.2012,83:742-749）。
发明内容
本发明利用现代分离技术和现代波谱学技术对海芦笋进行化学成分研究，从中得到两个新的降三萜皂苷类化合物，鉴定了结构，初步测定了抗肿瘤活性，扩展了盐生海芦笋的药用和食用价值。
本发明的目的旨在提供一类具有抗肿瘤活性的降三萜皂苷新化合物，其结构式如式Ⅰ所示：
其中R代表(CH2)nCH3、(CH2)nCHO或(CH2)nCH2OH，所述n为0～4。
优选的化合物是：
化合物1：R代表CHO，化学名为：3-O-β-D- 吡喃葡萄糖基-30-去甲-12,20(29)-二烯齐墩果酸-23-醛基-6′-丁酯，命名为Salbige A。
化合物2：R代表CH3，化学名为：3-O-β-D- 吡喃葡萄糖基-30-去甲-12,20(29)-二烯齐墩果酸-6′-丁酯，命名为Salbige B。
目前尚未见对这2个化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道。
式Ⅰ；
本发明的另一目的是提供所述降三萜皂苷新化合物的制备方法，具体步骤如下：
以新鲜采摘的海芦笋地上部分为原料，原料捣碎后，按重量体积比加入2/5～1原料重的70～90%丙酮水溶液，浸提2~3次，提取液减压浓缩至不含丙酮；用等体积的乙酸乙酯萃取除去大部分脂溶性成分，萃余液用等体积甲醇萃取2~3次，过滤，取上层液，减压浓缩得到甲醇萃取物；甲醇萃取物经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析，分离纯化得到化合物1和2。
本发明采用MTT法测试了式Ⅰ所示降三萜皂苷新化合物对A549与hepG2细胞株的抗肿瘤活性，实验证实，式Ⅰ所示降三萜皂苷化合物对这两种肿瘤细胞均有增殖抑制作用，可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。本发明式Ⅰ所示降三萜皂苷新化合物与可接受的各种药物载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物或作为食品原料用于制备保健食品。
本发明的目的还在于提供在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的有益效果：
本发明式Ⅰ所示降三萜皂苷新化合物可通过有机溶剂萃取海芦笋或含有该化学成分的植物的地上部分，然后从粗提物中分离纯化而得到；也可经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得；本发明非三萜皂苷新化合物对多种不同肿瘤细胞株的显著抑制作用也表明其可以进一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。
附图说明
图1 本发明化合物的化学结构式。
具体实施方式
实施例1 化合物的制备
新鲜采摘的海芦笋地上部分22.6 kg，用匀浆搅拌机搅碎，置于20L的容量瓶中，用10 L 80%丙酮水溶液浸泡，静置提取24 h；浸提液用布氏漏斗抽滤，过滤后的海芦笋残渣再用10 L 80%丙酮水溶液重复提取两次，提取液减压浓缩至不含丙酮；用等体积的乙酸乙酯萃取3次除去大部分脂溶性成分，萃余液用等体积甲醇萃取3次，过滤，取上层液，浓缩至干，得到甲醇萃取物。
甲醇萃取物(85 g)用60 g硅胶干法拌样后上装有200 g硅胶(300-400目)的常压柱，依次用石油醚-丙酮(50:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:10、1:50、1:100、0:1)、丙酮-甲醇(50:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:10、1:50、0:1)梯度洗脱分离。根据TLC检测，合并得到5个组分，分别用Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D和Fr.E 表示。TLC条件为：显色剂为5%硫酸乙醇溶液；展开剂为石油醚：丙酮(10：1)。
取组分Fr.B (2.5 g)经正相硅胶柱分离，石油醚-丙酮 (v/v 200:1)洗脱，得到Fr.B1和Fr.B2两个组分；其中组分Fr.B2经过正相硅胶柱分离，以石油醚-丙酮 (v/v 20:1)洗脱，得到组分Fr.B2-1和Fr.B2-2；组分Fr.B2-2继续经过正相硅胶柱分离，以环己烷-乙酸乙酯(v/v 10:3)进行洗脱，得化合物1 (6.3 mg)，TLC检测，展开剂为环己烷：乙酸乙酯(4:6)，Rf=0.3，5%硫酸乙醇溶液显粉紫色。
取组分Fr.C (2.0 g)经过正相硅胶柱分离，以石油醚-丙酮 (v/v20:1)洗脱，得到Fr.C1和Fr.C2两个组分；组分Fr.C1通过正相硅胶柱分离，以石油醚-丙酮 (v/v 8:1)洗脱，得到组分Fr.C1-1；组分Fr.C1-1经过Sephadex LH-20进一步分离纯化，以氯仿-甲醇 (v/v 1:1)洗脱，得化合物2 (8.9 mg)，TLC检测，展开剂为石油醚：丙酮(2:1)，Rf=0.4，5%硫酸乙醇溶液显紫红色。
化合物1：白色无定型粉末，HRESI-MS在m/z 685.3942处给出[M -H]-峰，提示该化合物的分子量为686，分子式为C39H58O10，不饱和度为11。红外光谱νmax 3416, 1731与1699处的吸收峰分别提示分子中含有羟基、羰基和双键。1H-NMR谱中有5个甲基信号δ 1.08 (s, 3H, H-24)，0.99 (s, 3H, H-25)，0.81(s,3H, H-26)，1.23(s,3H, H-27)，0.93 (t, J=7.70 Hz, 3H,H-4′′ )，一个连氧次甲基信号δ 3.89 (1H, m, H-3)，一个环外双键δ 4.61 (2H,s, H-29)，一个环内双键δ 5.31 (1H, s, H-12)，一个醛基δ 9.43 (s, 1H, H-23)，一个端基碳氢信号δ 4.33(d, J=7.72, 1H)，提示该化合物是一个Δ12-齐墩果烯型皂苷。13C-NMR谱显示齐墩果烯12、13位和20、29位的特征碳信号δ 122.3 (C-12)，143.5(C-13)和δ 148.5 (C-20)，106.2 (C-29)，一个吡喃糖端基碳信号δ 104.2，1个羧基碳δ 177.4，1个酯基碳δ 168.7，1个醛基碳δ 206.3；1H-1HCOSY谱显示吡喃糖上氢的连接顺序为δ 4.33(d, J=7.72, 1H, H-1′), 3.17(t, J=8.48, 1H,H-2′), 3.38(dq, J=9.00,18.08, 1H, H-3′), 3.57(t, J=9.24, 1H, H-4′)，3.79(m, 1H, H-5′)，也显示与吡喃糖侧链酯基相连的丁酯连接顺序为δ 4.15(m, 2H, H-1′′)，1.64(m, 2H, H-2′′)，1.42 (m,2H,H-3′′)，0.93(t, J=7.70 Hz, 3H, H-4′′)；HMBC显示δ 4.33(d, J=7.72, 1H, H-1′)与δ81.8 (C-3)耦合，提示吡喃糖连接在齐墩果烯的3位上；δ 4.15(m, 2H, H-1′′)与δ 168.7(C-6′)耦合，提示丁酯侧链连接在吡喃糖的6位碳上；δ 1.93 (m, 1H, H-16a), 2.15(m, 1H, H-16b)与δ 177.4 (C-28) 耦合，以及17位季碳的特征化学位移δ46.3，提示羧基连接在17位上；NOESY谱显示H-5与 δ 9.43 (1H,s, CHO)耦合，H-24与H-25耦合，提示醛基连接在C-23上。该化合物吡喃糖的相对构型从1′与2′位氢的耦合常数δ 4.33 (d, J=7.72, 1H)可知为β型，绝对构型通过盐酸水解并衍生化反应后进行GC-MS分析，比较与标准葡萄糖酸的保留时间(均为9.527 min)，确定为D-型。因此该化合物的结构鉴定为：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-30-去甲-12,20(29)-二烯齐墩果酸-23-醛基-6′-丁酯，通过ACS数据库SCIFinder软件对化合物1的结构进行检索，确定该化合物为新化合物，将其命名为Salbige A。
化合物2：白色无定型粉末，HRESI-MS在m/z 671.4163处给出[M -H]-峰，提示该化合物的分子量为672，分子式为C39H60O9，不饱和度为10。红外图谱3425cm-1提示分子中含有羟基，1719 cm-1提示分子中含有羰基，1698 cm-1提示分子中含有双键。化合物2与化合物1相比，氢谱与碳谱非常相似，提示二者具有相同的骨架。化合物2的氢谱在低场区缺少化合物1中的醛基信号δ 9.43 (s, 1H, H-23)，在高场区多了一个甲基氢信号δ 1.01(s, 3H，H-23)，碳谱在高场区缺少化合物1中的醛基碳信号δ 206.3，而在高场区多了一个甲基碳信号δ28.2，提示化合物1中23位的醛基在化合物2中被甲基所取代，HMBC谱显示H-23与C-3, 4, 5, 24耦合，进一步证实23位为甲基。该化合物吡喃糖的相对构型从1′与2′位氢的耦合常数δ 4.40 (d, J=7.72 Hz, 1H)，可知为β型，绝对构型通过通过盐酸水解并衍生化反应后进行GC-MS分析，比较与标准葡萄糖酸的保留时间(均为9.527min)，确定为D-型。因此，该化合物鉴定为3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-30-去甲-12,20(29)-二烯齐墩果酸-6′-丁酯。通过ACS数据库SCIFinder软件对化合物2的结构进行检索，可知该化合物为新化合物，将其命名为Salbige B。
衍生化分析方法：化合物1mg 溶于2M HCl/H2O(2mL)，在85°C下搅拌15h。反应混合物冷却后，然后用乙酸乙酯(10mL)和水H2O(10mL)萃取，水相部分用水反复浓缩蒸干后得到单糖剩余物。剩余物溶于1mL吡啶，再加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐2.0mg。混合物在60°C保温2h，之后加入0.2mL三甲基硅唑在60 ℃再保温2h。混合物在正己烷和水(各2mL)之间萃取，然后正己烷相用GC-MS分析（Thermo Quest Trace 2000 GC； PhenomenexDB-5柱（30m x 0.25mm x 0.25 μm)；载气：N2；进样温度：250℃；检测温度：280℃；柱温：最初160℃(3min)，然后以20℃/min加热到300℃(30min)。
表1 化合物1的核磁数据（1H 400MHz，13C 100MHz，Acetone-d6）
表2 化合物2的核磁数据（1H 400MHz，13C 100MHz，Acetone-d6）
实施例2 抗肿瘤活性的测试
1、实验方法及试剂配制
MTT法测定2种化合物对A549与hepG2细胞的抑制作用：取对数生长期的A549 (人肺癌细胞)与hepG2 (人肝癌细胞)，调节细胞悬液浓度，每孔100 μL加入到96孔细胞培养板中，铺板使待测细胞密度3000 /孔，并于5% CO2、37℃的培养箱中培养4 h；待测的样品分别设置0.1、1、10、25、50 μM 5个浓度梯度，每个浓度设置5个平行，同时设置调零孔和对照孔，每孔加入样品液或空白液（细胞、药物溶解介质、细胞培养液）各100 μL，分别培养72 h后每孔加入20 μLMTT液 (5mg/mL，PBS溶液配置)，继续培养4 h，于37℃下，2000转/分钟离心机离心8分钟，用移液枪吸去上清液；然后每孔中分别加入100 μL DMSO，于微量振荡器上振荡至结晶完全溶解后，570 nm下用酶联免疫检测仪测定各孔的吸光值(OD值)，取五孔平均OD值；计算方法按IR% = (OD空白对照－OD样品)/ OD空白对照×100%计算。
细胞培养液的配置：取RPMI Medium 1640，按标示量(Net wt 10.4 g pkg-1)加入1 L双蒸水，并用磁力搅拌器搅拌至全部溶解后，用已高压灭菌过的的蔡氏(Zeiss)滤器经0.22 μm滤膜过滤以除去杂质；过滤后的滤液保存于经高压灭菌的玻璃瓶中，一般在500 mL玻璃瓶中加入450 mL滤液，加盖并用锡箔纸封口，于4 ℃冰箱中保存，使用前加入50 mL胎牛血清FBS，12 mL 8% NaHCO3，摇匀即可使用。
PBS(Phosphate-Buffer Saline，pH7.2)溶液的配置：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.15 g Na2HPO4，0.02 g KH2PO4，加入1 L双蒸水溶解，过0.22 μm的滤膜，4 ℃冰箱中保存。
2、实验结果
2种化合物不同浓度下对A549与hepG2细胞的抑制作用，如表3所示。
表3 MTT法测定2种化合物对A549与hepG2细胞的抑制作用
在0.1~50 μM浓度范围内，2个化合物对人肺癌细胞A549与人肝癌细胞hepG2的抑制率基本呈上升趋势，表明抑制作用逐渐增强，当浓度为50 μM时，化合物1对人肺癌细胞A549的最大抑制率为58.49%，IC50 52.35 μM，表明其具有较强的抗肿瘤活性，且抑制率高于阳性对照药物依托泊苷（36.08%）；化合物2对人肺癌细胞A549的抑制率为32.87%，IC50 79.39 μM，表明其具有一定的抗肿瘤活性，但这2种化合物对人肝癌细胞hepG2的抑制率均较弱，表明其抑制hepG2细胞增殖作用不明显。
Claims (5)
1.降三萜皂苷新化合物，其特征在于：其结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ；
其中R代表(CH2)nCH3、(CH2)nCHO或(CH2)nCH2OH，所述n为0～4。
2.根据权利要求1所述的降三萜皂苷新化合物，其特征在于：
化合物1：R代表CHO，化学名为：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-30-去甲-12,20(29)-二烯齐墩果酸-23-醛基-6′-丁酯，命名为Salbige A。
化合物2：R代表CH3，化学名为：3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-30-去甲-12,20(29)-二烯齐墩果酸-6′-丁酯，命名为Salbige B。
3.权利要求1或2所述的降三萜皂苷新化合物的制备方法，其特征在于：以新鲜采摘的海芦笋地上部分为原料，原料捣碎后，按重量体积比加入2/5～1原料重的70～90%丙酮水溶液，浸提2~3次，提取液减压浓缩至不含丙酮；用等体积的乙酸乙酯萃取除去大部分脂溶性成分，萃余液用等体积甲醇萃取2~3次，过滤，取上层液，减压浓缩得到甲醇萃取物；甲醇萃取物经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析，分离纯化得到化合物1和2。
4.权利要求1或2所述的降三萜皂苷新化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
5.权利要求1或2所述的降三萜皂苷化合物用作食品原料在制备保健食品中的用途。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150422 |