CN103293306A - 一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的一种非洲猪瘟病毒（ASFV）抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法属于生物工程和动物疫病诊断领域，包括ASFV重组抗原p54表达、纯化、抗体制备、胶体金免疫层试纸条制备及其检测ASFV抗体的灵敏性和特异性。与现有的其他血清学方法相比，用本发明建立的胶体金免疫层析试纸条具有方便、快速、灵敏和特异等优点，能在5分钟内获得明确的诊断结果，并能直接检测可疑猪血清（或抗凝血）的病毒抗体，特别适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

Description

一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术和动物检疫检测领域。

背景技术

非洲猪瘟（ASF）是猪的一种高度致死性传染病，该病一直在许多非洲国家流行，目前已传播到格鲁齐亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯等邻国，对我国养猪业的威胁越来越大。目前ASF无疫苗用于防疫，因此快速、准确诊断对防止该病传入及其控制十分重要。世界动物卫生组织（OIE）最近推荐的ASF诊断技术包括病原鉴定和血清学试验。

在病原鉴定技术中，血吸附试验是经典的ASF鉴定方法之一，敏感性较高，但需要临时制备和培养猪骨髓细胞，不仅费时、操作繁琐，而且不能用于非血吸附性毒株的诊断；检测ASFV抗原的荧光抗体试验可用于可疑病猪组织和白细胞样品的检测，不仅适用于非血吸附性毒株的鉴定，而且能与其他病毒感染进行鉴别诊断，但需要制备冰冻切片、技术难度较大，而且仅能在专门的ASF诊断实验室进行；聚合酶链式反应（PCR）和实时定量PCR具有快速、灵敏等优点，还适合腐败样品的病毒检测，已成为ASF诊断技术的发展方向，但需要较昂贵的仪器设备和防污染措施，有时检测结果需用序列测定等方法验证；敏感猪接种试验也是经典的ASF诊断技术之一，但需时较长、成本较高，而且仅能在专门的动物设施内进行，现已不再推荐使用。

在血清学检测技术中，ASFV感染猪在感染后7-10天即可产生特异抗体，并能维持很长时间，所以可用间接免疫荧光和酶联免疫吸附法（ELISA）等方法检测。其中，ELISA是OIE规定的国际贸易检验方法，但检测抗原需从病毒感染细胞制备，病毒培养有导致病毒扩散风险，诊断可靠性也有待提高，结果需用免疫印迹（Western-blotting）等方法验证；为了解决这些问题，国内外都在进行重组抗原ELISA的尝试，法国和西班牙已有商品化试剂盒供应，但因重组抗原制备难度较大，不仅试剂盒供应有限、价格昂贵，而且不同地区病毒株的检测结果有待进一步验证。

胶体金免疫层析技术是近年来快速发展的一项诊断技术，有逐渐取代ELISA等血清学检测方法的趋势，其优点具体表现在：①操作简单，能在几分钟内得出诊断结果，特别适合野外、现场诊断；②受外界因素影响较小，检测灵敏度和准确性高；③能稳定保存，携带方便；④不需仪器设备，综合成本较低，非常适合临床和基层单位使用。尽管国内外已有较多的胶体金免疫层析试纸条问世，但到目前为止尚无将胶体金免疫层析技术用于ASFV快速诊断的尝试。鉴于我国面临ASFV巨大威胁的现实，本发明用ASFV强免疫原性主要结构蛋白p54的重组抗原标记胶体金，以与猪IgG、IgM亲和结合的金黄色葡萄球菌A蛋白捕捉标记抗原与抗体的复合物，通过反应条件的系统优化，建立了一种ASFV抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法，该试纸条在5分钟内获得明确的诊断结果，并能直接检测可疑猪血浆中的病毒抗体，特别适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

发明内容

本发明的目的在于：建立特异性强、敏感性高、操作简单、适合非疫区国家（地区）使用的ASFV抗体检测胶体金免疫层析试纸条，用于ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

本发明的技术方案包括：ASFV p54重组抗原表达与纯化、p54免疫血清制备、胶体金免疫层析试纸条制备及其检测人工感染和田间血清样品的灵敏性、特异性测定。

1.p54重组抗原表达与纯化：用聚合酶链式反应扩增不包括前50个疏水性氨基酸的ASFVp54基因片段，克隆入原核表达载体pET-30(a)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用亲和层析法纯化重组抗原，用ASFV感染康复猪血清进行免疫学鉴定；

2.p54免疫血清制备：用纯化p54重组抗原与弗氏佐剂混合物反复免疫ASFV抗体阴性猪，用间接ELISA测定免疫血清抗体效价，采集合格免疫猪血清，-20℃保存；

3.试纸条制备：用胶体金颗粒标记纯化p54重组抗原，以，两者线间距为5mm捕捉标记抗原与病毒抗体复合物作为检测线，以p54免疫血清捕捉未结合至检测线上的胶体金标记的p54抗原作为质量控制线，制备胶体金免疫层析试纸条。

检测方法及结果判定：将稀释可疑猪血清（或抗凝血）点于试纸条的样品孔，5分钟内观察结果，将同时出现检测线和质控线血清（或抗凝血）样品判为ASFV抗体阳性，仅出现质控线的判为ASFV抗体阴性。

步骤（3）具体操作是：用0.2mol/L K₂CO₃溶液将10mL25nm直径胶体金溶液pH调至8.0，在磁力搅拌下缓慢滴加纯化的p54重组抗原500μL，继续搅拌10min，室温避光放置30min；缓慢加入10%牛血清白蛋白，使其终浓度为1%，混匀后室温放置15min；4℃、1000rpm离心15min，吸取上清液，4℃、12000rpm离心30h，沉淀用1mL含5%蔗糖、1%BSA、0.5%Tween-20、0.2%PEG20000以及0.02%叠氮钠的0.01mol/L pH9.2硼酸盐缓冲液悬浮；用Biodot XYZ3060胶体金点样系统以2μL/cm的喷量在玻璃纤维膜的金标垫上均匀喷涂浓度为0.3mg/mL金标抗原，37℃烘箱干燥1h后即为金标结合垫；以1μL/cm喷量在硝酸纤维素膜喷涂浓度为1mg/mL SPA、0.5mg/mL的p54抗血清，分别作为检测线和质控线，两者线间距为5mm。

步骤（3）中，用对猪IgG和部分IgM具有亲和性的金黄色葡萄球菌A蛋白捕捉标记抗原-抗体复合物，可以提前病毒抗体的检出时间。

以可疑猪血清（或抗凝血）作为检测对象，不仅可以简化样品制备，而且可以缩短检测时间。

本发明与现有的其他血清学方法相比，用本发明建立的胶体金免疫层析试纸条具有方便、快速、灵敏和特异等优点，能在5分钟内获得明确的诊断结果，并能直接检测可疑猪血清（或抗凝血）中的病毒抗体，特别适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

附图说明

图1为纯化的重组蛋白p54聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

1.蛋白分子质量标准SM0661（Fermentas），2.纯化的重组蛋白p54。

图2为Westernblotting结果

1.蛋白分子质量标准SM0441（Fermentas），2.重组蛋白p54。

图3胶体金试纸组装示意图

A.胶体金试纸内部右侧示意图；B.胶体金试纸内部正面示意图；C.包装塑料外壳的胶体金试纸。

1.硬质塑料底板，2.吸水滤纸，3.固相硝酸纤维素膜，4.吸附有胶体金标记的P54重组蛋白金标垫，5.玻璃纤维素膜，6.塑料外壳，7.喷有抗P54抗体的质控线，8.喷有SPA的检测线。

图4ASFV阴性血清、阳性抗凝血、阳性血清以及阴性抗凝血检测结果。

具体实施方式

生物材料来源：

pET30a（+）：大肠杆菌表达载体，从美国Novogen公司引进（Cat No.69909.3）；

大肠杆菌（E.coli）BL21(DE3)：从海基生（HaiGene）物科技有限公司引进（Cat No，K10127）；

pGEX-4T-1-E183L：含E70株ASFV E183L（p54）基因，由葡萄牙Gulbenkian de Cie^ncia研究所RM Parkhouse博士惠赠（Reis,A.L.,R.M.Parkhouse,A.R.Penedos,C.Martins,and A.Leitao.2007.Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infectedexperimentally with African swine fever virus.J.Gen.Virol.88:2426-2434.）；

ASFV抗体阳性和阴性猪血清：由英国Pirbright研究所ASF参考实验室（OIE ASFV参考实验室）LK Linda博士提供。

具体操作步骤如下：

1.p54重组抗原制备

用DNASTAR软件包（DNASTAR,Inc.）中Protean软件分析E70株ASFV pE183L（p54）氨基酸序列二级结构，前50个氨基酸为疏水性氨基酸集中区，不仅无潜在的B细胞表位，而且可能影响该基因在原核细胞中的可溶性表达。根据第50个氨基酸以后的p54编码序列设计一对引物：

正向引物：5-TAGAATTCGACCCGTCTTCAAGAAAG-3（SEQ ID NO.1）

反向引物：5-TACTCGAGTTACAAGGAGTTTTCTAGG-3（SEQ ID NO.2）

以pGEX-4T-1-E183L为模板进行PCR扩增，50μL反应体系为：

质粒pGEX-4T-1-E183L（50ng/μL）1μL、上下游引物（25μM）各1μL、dNTP（10mM/each，大连宝生物公司）2μL、10×buffer5μL、LA Taq DNA聚合酶（大连宝生物公司）0.5μL，去离子水补至50μL。

30次循环PCR程序为：

94℃预变性5min后，94℃变性30sec、54℃退火45sec、72℃延伸1min，共进行30循环，72℃再充分延伸5min，温度降至16℃

扩增产物用限制酶EcoRI、XhoI消化后，与同酶线性化pET-30a（+）连接，获得重组载体pET-E183L；用重组载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含50μg/mL卡那霉素琼脂平板上37℃培养过夜，获得pET-E183L重组菌；挑取单菌落接种含同样抗生素的LB培养基，37℃培养过夜作为种子液；按1∶100比例接种1000mL含50μg/mL卡那霉素2×YT培养基（参考文献1），37℃摇床（150rpm）培养至OD₆₀₀=0.8，加入终浓度1mmol/L IPTG，37℃诱导4h；4℃、8000rpm离心2min，沉淀菌体用0.01moL/L PBS（pH7.6）离心洗涤2次；用HD3100型超声波细胞破碎仪（Bandelin公司）裂解细菌（功率50W，10s/次，共10min），4℃、10000g离心20min，按照Ni-NTA亲和层析柱（Qiagen公司）说明书，在非变性条件下纯化His-p54融合蛋白；取0.5μL纯化产物与蛋白质分子量标准进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（5%的浓缩胶，12%的分离胶），经考马斯蓝染色后，用Gel Doc XR+凝胶成像系统（BioRad公司）观察重组蛋白纯化效果，结果显示最终得到单一重组蛋白（图1）；按照蛋白转印仪（BioRad公司）说明书，将凝胶分离蛋白转印硝酸纤纤维膜（Whatman公司），以ASFV感染康复猪血清为第一抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG（Earthox公司）为第二抗体，按照常规方法进行Western-blot分析，结果显示p54重组抗原能与ASFV感染康复猪血清反应（图2）。

2.p54抗血清制备

用PBS（pH7.6）将纯化的重组蛋白p54浓度调整为1mg/mL，与等体积弗氏完全佐剂（Sigma公司）混合，超声波细胞破碎仪（Bandelin公司）充分乳化（功率30W，5min），肌肉注射2月龄姜曲海猪（江苏省畜牧兽医技术学院种猪场提供）2头，2mL（1mg蛋白）/头；第一次免疫后10天，用加弗氏不完全佐剂的同样剂量抗原加强免疫1次；10天后再用同样剂量的重组抗原加强免疫1次；在第三次免疫后第7天，无菌采集猪血分离血清，以5μg/mL重组蛋白p54包被酶标板，与连续10倍稀释免疫猪血清进行间接ELISA方法，测得重组p54免疫猪血清的ELISA抗体效价为10^-7。

3.试纸条制备

用0.2mol/L K₂CO₃溶液将10mL25nm直径胶体金溶液（Sigma公司）pH调至8.0，在磁力搅拌下缓慢滴加纯化的p54重组抗原500μL（0.2mg/mL），继续搅拌10min，室温避光放置30min；缓慢加入10%牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司），使其终浓度为1%，混匀后室温放置15min；4℃、1000rpm离心15min，吸取上清液，4℃、12000rpm离心30h，沉淀用1mL含5%蔗糖、1%BSA、0.5%Tween-20、0.2%PEG20000以及0.02%叠氮钠的0.01mol/LpH9.2硼酸盐缓冲液（3.81g Na2B4O7·10H2O溶于无二氧化碳的水，定容至1000mL）悬浮。

用Biodot XYZ3060胶体金点样系统以2μL/cm的喷量在玻璃纤维膜的金标垫（Ahlstrom8964）上均匀喷涂浓度为0.3mg/mL金标抗原，37℃烘箱干燥1h后即为金标结合垫。以1μL/cm喷量在硝酸纤维素膜（Sartorius CN140）喷涂浓度为1mg/mL SPA（Sigma公司）、0.5mg/mL的p54抗血清，分别作为检测线8（T线）和质控线7（C线），两者线间距为5mm。

组装试纸条的结构和外观如图3所示，试纸条的组装按照下列操作进行：

（1）25mm长的固相硝酸纤维素膜3（Sartorius CN140）黏附于6mm长的硬质塑料底板1（上海杰一公司）；

（2）黏附吸水滤纸2（上海杰一公司），长约18mm，并与固相硝酸纤维素膜3重叠2mm；

（3）10mm长的金标垫4（AlhStorm8964）与固相硝酸纤维素膜3重叠2mm；

（4）玻璃纤维素膜5（上海杰一公司）长约15mm，与金标垫4重叠2mm；

（5）微电脑自动斩切机（上海金标公司ZQ2000）切割成4mm宽的条带；

（6）条带外装上保护性的塑料外壳6（上海杰一公司）。

4.检测方法及结果判定

（1）吸取1μL待检血清或2μL10%肝素溶液（100U/mL）的抗凝血，加入50μL0.01mol/LPBS（pH7.6）混匀；

（2）吸取40μL滴加于试纸条的加样孔中；

（3）室温静置5min内肉眼观察结果。如果质控线和检测线均出现红色条带，将待检血清样品判为ASFV抗体阳性；如果质控线出现棕红色条带，检测线处无棕红色条带，将待检血清样品判为ASFV抗体阴性；如果质控线无棕红色条带，则该试纸条失效（图4）。

5.特异性与灵敏性试验

以Western-blot检测结果为标准，选择ASFV抗体阴性猪血清12份，人工感染ASFV后的ASFV抗体弱阳性血清24份、ASFV抗体强阳性血清25份，按照上述程序用试纸条进行抗体检测。结果显示：基于p54重组抗原胶体金免疫层析试纸条检测ASFV抗体阴性血清的符合率为91.67%（11/12），检测弱阳性和强阳性血清的符合率均为100%。

为了简化检测样品制备程序，随机选择上述ASFV抗体阳性血清13份，各取1μL加入等体积ASFV抗体阴性猪肝素抗凝血，混匀后按照上述操作步骤用试纸条进行抗体检测，结果显示均为阳性，说明基于p54重组抗原胶体金免疫层析试纸条可直接用于可疑猪血的ASFV抗体现场检测。

6.可重复性试验

将上述12份ASFV抗体阴性猪血清，24份人工感染ASFV后的ASFV抗体弱阳性血清、25份ASFV抗体强阳性血清进行3次重复检测，结果显示检测每分血清检测结果均一致，表明该试纸条具有很好的重复性。

Claims (2)

1.一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法，其步骤如下：

（1）p54重组抗原表达与纯化：用聚合酶链式反应扩增不包括前50个氨基酸的非洲猪瘟病毒p54基因片段，克隆入原核表达载体pET-30(a)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用亲和层析法纯化重组抗原，用ASFV感染康复猪血清进行免疫学鉴定；

（2）p54免疫血清制备：用纯化p54重组抗原与弗氏佐剂混合物反复免疫ASFV抗体阴性猪，用间接ELISA测定免疫血清抗体效价，采集合格免疫猪血清，-20℃保存；

（3）试纸条制备：用胶体金颗粒标记纯化p54重组抗原，以金黄色葡萄球菌A蛋白捕捉标记抗原与病毒抗体复合物作为检测线，以p54免疫血清捕捉未结合至检测线上的胶体金标记的p54抗原作为质量控制线，制备胶体金免疫层析试纸条。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）是：用0.2mol/L K₂CO₃溶液将10mL25nm直径胶体金溶液pH调至8.0，在磁力搅拌下缓慢滴加纯化的p54重组抗原500μL，继续搅拌10min，室温避光放置30min；缓慢加入10%牛血清白蛋白，使其终浓度为1%，混匀后室温放置15min；4℃、1000rpm离心15min，吸取上清液，4℃、12000rpm离心30h，沉淀用1mL含5%蔗糖、1%BSA、0.5%Tween-20、0.2%PEG20000以及0.02%叠氮钠的0.01mol/L pH9.2硼酸盐缓冲液悬浮；用Biodot XYZ3060胶体金点样系统以2μL/cm的喷量在玻璃纤维膜的金标垫上均匀喷涂浓度为0.3mg/mL金标抗原，37℃烘箱干燥1h后即为金标结合垫；以1μL/cm喷量在硝酸纤维素膜喷涂浓度为1mg/mL SPA、0.5mg/mL的p54抗血清，分别作为检测线和质控线，两者线间距为5mm。

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