CN102236018A - 荧光标记免疫抗体测定非洲猪瘟病毒试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于测定非洲猪瘟病毒的试剂盒，是由分离包装荧光标记抗体和0.01MPH7.2的PBS缓冲洗脱液组成，抗体均采用单克隆抗体。本发明采用荧光标记的方法，荧光抗体由四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rodamine isothiocyanate，TMRITC)或异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)进行标记。荧光标记抗体和相应的抗原结合后，通过荧光显微镜，在特定激光的激发下，发出稳定的荧光。本发明可快速、准确测定非洲猪瘟病毒。
Description
免疫荧光技术是近年来发展起来的一门广泛应用于现代生物学和医学中的新兴技术，免疫荧光技术具有灵敏度高、特异型好、显色特别、检测速度快和在细胞水平定位准确等优点，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等许多方面得到广泛应用。
免疫荧光技术根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光标记抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合体上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，已辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。(William，Hess Adv.African swine fever：a reassessment[J].Vet Sci Comp Med，1981，25：39～69)世界动物组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2)：117～119)。
本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。
非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。
非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb～190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafacl，Yancz，Javier M，et al.Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus[J].Virology，1995，208：249～279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个ORF，可以编码150～200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998，28(11)：42～43)。
非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性。实验证明，P30蛋白为具有较好抗原性的蛋白之一，蛋白分子量约为36KD。
发明内容
本发明涉及一种用于测定法医物证血型的荧光标记抗体试剂盒，是由分离包装的抗A和抗B荧光标记抗体和0.01MPH7.2的PBS缓冲洗脱液组成，抗A和抗B的抗体均采用单克隆抗体。本发明采用荧光标记的方法，抗A荧光抗体由四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rodamine isothiocyanate，TMRITC，最大吸 收光谱为550nm，最大发射光谱620nm呈橙红色荧光)进行标记，抗B荧光抗体用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC，最大吸收光谱为490-495nm，最大发射光谱为520-530nm，呈现黄绿色荧光)进行标记。
需要说明的是两种荧光标记物可以互换。
具体实施方式
一、荧光抗体的标记：
1、单克隆抗体荧光标记
(1)单克隆抗体血清在0.01mol/l PH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。
(2)将四甲基异硫氰酸罗达明溶于二甲亚砜(1mg/ml)，取此溶液300μl，逐滴加入单克隆抗A抗血清溶液中(每毫克IgG加入5μl)同时磁力搅拌。
(3)在室温中搅拌12h，避光。
(4)把结合物移入直径3cm，高30cm大小的Bio-gelP-6层析柱(用0.01mol/l PH8.0的PBS平衡过)，流速为1.5ml/min。
(5)收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，稀释到0.0mg/ml，分装，4℃保存。
2、单克隆抗体荧光标记
(1)抗体的准备：取适量单克隆抗血清(5mg/ml)溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
(2)荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
(3)边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入单克隆抗血清溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上(大约5～10min内加完)，加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右。
(4)透析：集合完毕后，将溶液离心(2500r/min)20min，除去其中少量之沉淀物，装于透析袋中后再置于烧杯中，用PH8.0缓冲盐水透析(0～4℃)过夜。
(5)过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体，稀释到0.1mg/ml，分装，4℃保存。
二、试剂盒的制作：
荧光标记单克隆抗体1-2ml，包装；0.01M PH7.2的PBS缓冲洗脱液20-50ml单独包装。
三、试剂盒的使用
欲检验的检材制备冰冻切片，经过常规方法固定后，每份检材加荧光标记的抗体一滴，37℃吸收30分钟；用0.01M PH7.2的PBS缓冲液洗脱没有结合的抗血清；荧光显微镜镜检。呈现红色或绿色荧光反应的为阳性。
本发明可快速、准确测定非洲猪瘟病毒，可广泛用于相关领域。
Claims (3)
1.荧光标记免疫抗体测定非洲猪瘟病毒试剂盒，试剂盒包括a)荧光标记免疫抗体，b)0.01M PH7.2的PBS缓冲洗脱液，其特征是：荧光标记免疫抗体由分别包装的非洲猪瘟P54或P30单克隆抗体组成。
2.根据权利要求1所述荧光标记免疫抗体测定非洲猪瘟病毒试剂盒，其特征为：荧光抗体由四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rodamine isothiocyanate，TMRITC)或由异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)进行标记，两种荧光标记物可替换使用。
3.权利要求1所述的荧光标记免疫抗体测定非洲猪瘟病毒试剂盒，在测定非洲猪瘟病毒中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN2010101537097A CN102236018A (zh) | 2010-04-23 | 2010-04-23 | 荧光标记免疫抗体测定非洲猪瘟病毒试剂盒 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102236018A true CN102236018A (zh) | 2011-11-09 |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102236018A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103293306A (zh) * | 2013-05-22 | 2013-09-11 | 扬州大学 | 一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法 |
| CN111304371A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-06-19 | 广东省农业科学院动物卫生研究所 | 非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒 |
-
2010
- 2010-04-23 CN CN2010101537097A patent/CN102236018A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN103293306A (zh) * | 2013-05-22 | 2013-09-11 | 扬州大学 | 一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法 |
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