PT106942A - Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica - Google Patents

Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica Download PDF

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Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE COM UM ENSAIO IMUNO-DETETÁVEL, SEMELHANTE A UM ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA), PARA A DETEÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA BORRELIA BURGDORFERI F.L. (BACTÉRIA RESPONSÁVEL PELOS SINTOMAS DA DOENÇA DE LYME), NUMA AMOSTRA RECOLHIDA DE UM PACIENTE. O ENSAIO DESTA INVENÇÃO É MAIS ESPECÍFICO, MAIS SENSÍVEL E MAIS PRECISO QUE AS TÉCNICAS ELISA CONHECIDAS, PERMITINDO UMA MELHOR IDENTIFICAÇÃO DOS REFERIDOS ANTICORPOS ORIGINADOS NA REAÇÃO IMUNOLÓGICA DO ORGANISMO INFETADO, DEVIDO AOS 16 ANTIGÉNIOS SELECIONADOS E QUE PODEM TAMBÉM SER FIXADOS NUM BIOCHIP.A PRESENÇA DE ANTICORPOS CONTRA BORRELIA BURGDORFERI F.L. CAPTURADOS NO BIOCHIP, TAMBÉM PODE SER DETETADA COM QUANTUM DOTS, QUE RECONHECERÃO O COMPLEXO ANTIGÉNIO-ANTICORPO E PERMITIRÃO A OBSERVAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA NO BIOCHIP.A PRESENTE INVENÇÃO É ÚTIL NO DIAGNÓSTICO DA DOENÇA DE LYME AGUDA E CRÓNICA, COM A VANTAGEM DE SE REVELAR UM MÉTODO RÁPIDO, SIMPLES, ESPECÍFICO, PRECISO E DE BAIXO CUSTO, PODENDO SER APLICADA NA ÁREA CLÍNICA.

Description

1
Descrição "Biochip e bouqaet de 16 antigénios para a deteção da doença de Lyme aguda e crónica" 1 - Doença de Lyme, uma doença endémica A doença de Lyme é uma doença endémica, provocada pela bactéria Borrelia burgdorferi f.l., que afeta 63 países à volta do mundo, incluindo os 27 estados membros da União Europeia. 0 Escritório Regional para a Europa da Organização Mundial de Saúde (WHO) estima que atualmente surgem 85,000 novos casos de doença de Lyme na Europa (avaliando dados nacionais), porém teme-se que este número seja largamente maior, uma vez que na Europa os casos reportados são altamente inconsistentes e muitas infeções por parte desta doença não são diagnosticadas corretamente. 0 número de casos reportados de doença de Lyme aumentou desde os inícios dos anos 90, e a distribuição geográfica expandiu-se devido às alterações do clima (Lindgren, E. and Jaenson, Thomas G.T., 2006). No ano de 1993, estimou-se que esta doença tinha um custo de 660 milhões de euros para a sociedade, sendo o custo por paciente de cerca de 40,750€ (Irwin T. Vanderhoof, PhD, CLU et al., 1993). Desde então o número de casos mais do que duplicou, o que fez com que o custo para a sociedade aumenta-se para mais de mil milhões euros.
Os primeiros sintomas da doença de Lyme incluem febre, dor de cabeça, fadiga, depressão e por uma erupção cutânea característica denominada por "erythema migrans". Quando detetada a tempo, a infeção e os sintomas podem ser eliminados recorrendo-se a antibióticos. Porém, se esta doença não for tratada, os sintomas podem afetar o sistema nervoso central, o coração e as articulações, o que se torna muito difícil de tratar. 2
Ocasionalmente, os sintomas como a artrite persistem após a infeção ter sido eliminada, o que sugere que a Borrelia burgdorferi f.l. pode promover infeções crónicas e infeção-induzida autoimune (Steer et. al,2004). 2 - Borrelia burgdorferi f.l., bactéria causadora da doença de Lyme A Borrelia burgdorferi f.l. é uma bactéria pleomórfica com um ciclo de vida complexo que engloba uma multitude de formas, incluindo a forma de saca-rolhas (denominada parental, pois é a forma que esta bactéria possui quando infeta o hospedeiro), a forma de cistos (sem parede celular), entre outas formas.
Embora conhecidas há mais de um século, as bactérias com parede celular deficiente (CWDB), onde se inclui a Borrelia, só foram ligadas clinicamente a doenças relevantes durante as últimas décadas. A falta de parede neste tipo de bactérias faz com que estas sejam muito difíceis de detetar segundo os métodos usuais de deteção, tais como o microscópio de luz e teste serológicos padrão, isto porque este tipo de bactérias desencadeia uma resposta imunológica diferente do normal. Como resultado, as CWDB provocam infeções difíceis de diagnosticar e tratar, permanecendo no corpo durante um longo período de tempo e causando doenças crónicas. A existência de variantes pleomórficas da espiroqueta de Borrelia explica potencialmente, a habilidade que esta bactéria possui para permanecer no hospedeiro como adormecida, durante prolongados períodos de latência clínica assintomática. De acordo com os sintomas e duração da doença, existem 3 fases da doença de Lyme: 1 - Infeção localizada da pele ("erythema migrans"); 3 2 - Infeção caracterizada pela inflamação de diferentes órgãos, semanas ou até meses após a transmissão da Borrei ia; 3 - Infeção persistente, com inflamação crónica de diferentes órgãos e sistemas por mais de 1 ano. A bactéria Borrelia burgdorferi f.l. foi implicada em manifestações clínicas mais severas, tais como a borreliosis neocortical (neuroborreliosis), a qual tem sido associada à doença de Alzheimer. 3 - Métodos de diagnóstico da doença de Lyme
Os sintomas comuns provocados pela doença de Lyme são sintomas semelhantes a uma gripe, dores de cabeça, dores nas articulações, problemas gastrointestinais, sensibilidade à luz/som e um mal-estar geral, porém a variedade de sintomas difere de paciente para paciente: alguns pacientes apenas apresentam infeções na pele enquanto outros apenas desenvolvem sintomas tardios, como a artrite.
Como apenas 60% dos pacientes desenvolvem características de "erythema migrans" e cerca de 25-30% dos pacientes se lembra de ter sido picado, os restantes 10-15% dos pacientes só são confirmados por testes laboratoriais. Os sintomas da fase tardia desta doença são consequência, em parte, da falta de sensibilidade e eficiência das ferramentas de diagnóstico que são capazes de detetar a doença nas suas primeiras fases, quando esta é facilmente tratada. 0 Centro de Controlo de Doenças (CDC) dos Estados Unidos da América propõe um critério de diagnóstico em dois níveis, para o diagnóstico serológico da doença de Lyme:
Um primeiro nível onde se realiza um ensaio imunológico positivo (ELISA), seguido de um segundo nível onde se realiza um Western Blot (WB) para confirmar os 4 resultados do ensaio imunológico (ELISA) . Ambos os ensaios possuem falta de sensibilidade e a interpretação do WB varia de laboratório para laboratório.
Esta estratégia falha o diagnóstico da primeira fase da doença em 80% dos casos (Wilske, Bettina (2005) ) , e não distingue entre infeção aguda ou crónica.
Os mesmos problemas de sensibilidade são encontrados na avaliação do fluido cerebroespinal (CSF), onde os teste serológicos apenas detetam 10-30% dos pacientes com neuroborreliosis.
Até à data, não existe nenhuma ferramenta de diagnóstico capaz de detetar com sensibilidade e especificidade a resposta imunológica desencadeada pelas formas Borrelia burgdorferí f.l. de parede celular deficiente, as quais são responsáveis pelos sintomas crónicos severos de borreliosis. Estas formas apresentam um padrão de expressão proteico alterado, assim como diferenças nos antigénios comparados com a forma "parental". Como resultado, estas formas não são detetadas com os correntes métodos comerciais baseados nos antigénios contidos nos lisados celulares totais da forma "parental" da Borrelia burgdorferí f.l.. 4 - Métodos de diagnóstico da doença de Lyme desenhado pela STAB VIDA.
Nos últimos anos foram descritos, em artigos científicos e médicos, novos péptidos e proteínas antigénicas para a deteção de infeções por Borrelia burgdorferí f.l., que na primeira fase da doença quer em fases mais avançadas. Além disso, o uso de proteínas recombinantes e antigénios sintéticos (tais como o antigénio Arp e o antigénio DbpA) mostrou resultados melhores e mais precisos em teste serológicos do que em extratos bacterianos inteiros. A última pesquisa nesta área 5 aponta para uma combinação de antigénios num único ensaio, como sendo a melhor maneira de combater os problemas dos testes atuais. Porém, um ensaio que integre esta combinação ainda não se encontra no mercado.
Baseando-nos nas necessidades do mercado, dois principais requisitos são claramente identificáveis: 1- Melhoramento da técnica de WB, a qual exige um trabalho laboratorial intensivo, consome muito tempo e é dificil de padronizar. Sendo assim, a nova ferramenta deveria ser robusta, fácil de usar e permitir interpretações inequívocas dos resultados dos testes. 2- Evitar a necessidade de dois testes, para tornar o diagnóstico seguro, e permitir que as infeções crónicas sejam detetadas, incluindo os novos antigénios que foram reportados na literatura nos últimos anos, mas que ainda não alcançaram o uso clínico.
Com estas premissas em mente, um consórcio das PME APPLIED RESEARCH USING OMIC SCIENCES SL (AROMICS), B-C-A BORRELIOSE CENTRUM AUGSBURG BETRIEBS GMBH & CO KG (BCA) , microLIQUID sl (MLD) , STAB VIDA,
INVESTIGAÇÃO E SERVIÇOS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS LDA. (STAB VIDA), MICRO BIO DEVICES S.R.L (MICRO BIO), JYVASKYLAN YLIOPISTO (JYU), SERVILOG SA (WOW), desenvolveu uma ferramenta robusta, especifica e de alta sensibilidade. Esta ferramenta consiste num Biochip, onde estão incorporados 16 antigénios específicos (IgG, IgM, E. coli lysate, OspC, C2, C6, OspEl/2, OspA, DbpA, LFAl, Arp, Babesia microti, péptidos Ehrlichia, espiroqueta Borrelia burgdorferi B31, cisto Borrelia burgdorferi B31, Borrelia garinii, Borrelia azfelii) para os anticorpos da doença
Lyme. Este Biochip depois de carregado com amostras de soro do paciente, e após alguns procedimentos é colocado num Leitor de quimío-luminescêncía, que irá dar o diagnóstico do paciente. 0 mesmo grupo de antigénios pode ser utilizado 6 como um teste de ELISA, inovador pela composição e carácter inventivo de pelo menos 2 dos 16 antigénios. 5 - Como interpretar os resultados fornecidos pelo Leitor de quimio-luminescência 0 Biochip, como já foi referido, está carregado com 16 antigénios específicos para os anticorpos da doença de Lyme. A amostra de soro do organismo supostamente infetado é recolhida e carregada numa das câmaras do Biochip, aguarda-se alguns minutos para que a amostra entre no Biochip. De seguida, remove-se o excesso de amostra e carrega-se a câmara com uma mistura de reagentes e tampões químicos, processo que se repete duas vezes. Após este procedimento, o Biochip é inserido no Leitor de quimio-luminescência (inventado pelos autores desta patente), que possui um software fácil de utilizar.
Os anticorpos de segunda ligação, que reconhecem os anticorpos IgG e IgM aprisionados pelos antigénios estão ligados a Quantum Dots e quando um anticorpo da amostra se liga a um antigénio fica-se, com uma ligação anticorpo-antigénio-anticorpo secundário-Quantum Dots. Assim, se esta ligação se verificar no Biochip, o Leitor de quimio-luminescência irá excitar estes Quantum Dots que por sua vez transmitirão fluorescência, lendo-se este sinal como um resultado positivo da presença de infeção na amostra.
Ou seja, se for transmitida fluorescência significa que houve a ligação anticorpo-antigénio, logo chega-se à conclusão que o paciente está infetado com a bactéria Borrelia burgdorferi f.l. e desenvolveu sintomas de doença de Lyme. Se não for transmitida fluorescência significa que a ligação anticorpo-antigénio não ocorreu, logo o paciente não desenvolveu a doença de Lyme. 7
Descrição detalhada da invenção 1. Bouquet de 16 antigénios
Foi concebido um conjunto inovador de antigénios, a que chamamos um novo bouquet de 16 antigénios, específicos no todo ou em parte para a deteção da doença de Lyme, sendo eles os seguintes:
IgG e IgM, ambos utilizados como controlo positivo da reação imunológica; - Lisados celulares de E. Coli, utilizados como controlo negativo para infeção de Borrelia burgdorferi f.l.i
OspC (Outer Surface Protein C) , C2 19-mer (DAASVNGIAKGIKGIVDAA) e C6 25-mer (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) todos juntos, são antigénios de infeção aguda provocada por Borrelia burgdorferi f.l.} - OspEl/2 (Outer Surface Protein El/2) juntos, OspA (Outer Surface Protein A) e DbpA (Decorin binding protein A), são antigénios de infeção crónica provocada por Borrelia burgdorferi f.l.; LFA1 (Lymphocyte Function Antigen-1) e Arp (Arthritis-related proteins GST-like self-antigen), são antigénios de infeção autoimune provocada por Borrelia burgdoferi; - Péptidos de Babesia microti (com a sequência IVE FNAIFSNIDLNNS S TVKNE11K) e Ehrlichia (com a sequência SAVSNRKLPLGGVLMALVAAVAPIHSALLA), provenientes de coinfecções;
Borrelia burgdorferi B31 spirochete, B.burgdorferi B31 cysts, Borrelia garinii and Borrelia azfelii, utilizados como lisados celulares de controlo positivo para a infeção por Borrelia e para as suas espécies mais próximas. δ
Neste bouquet, 14 dos antigénios já tinham sido descobertos e 2 antigénios foram descobertos e produzidos especificamente para este bouquet de deteção da doença de Lyme, sendo eles os antigénios DbpA e Arp. 1.1. Clonagem do antigénio Decorin binding protein A (DbpA)
Para expressar o antigénio DbpA (rDbpA), selecionámos o plasmideo pBAD/His A para expressão induzivel em E.Coli. A proteína será expressa como uma proteina de fusão com uma 6-His-tag na posição N-terminal. A 6-His-tag é pequena, não imunogénica e permitirá a purificação através de ligação a matrizes de metais iónicos.
Inicialmente o plasmideo de expressão foi amplificado e purificado (Midiprep QIAfilter Plasmid Purification Kit #12243) . Seguidamente, 2 pg do plasmideo e todo o amplicon de DbpA purificado foram digeridos com os enzimas de restrição Xhol e HindIII durante a noite a 37° C, seguindo as condições da tabela abaixo descrita:
Digestão com Xhol e Plasmideo DbpA (μΐ) HindIII (μΐ) Água desionizada e 25, 5 35 livre de nucleases ADN template 15 50 NEB 2 buffer (lOx) 5 10 BSA (lOOx) 0,5 1 Xhol (20 u/ul) 2 2 HindIII (20 u/ul) 2 2 Volume Final 50 100 plasmideo e a proteina são corridos num gel de agarose a 0,8% (a 100 V durante 70 minutos) e purificados com 9
QiAQuick Gel Extraction. 0 DbpA clivado é depois ligado ao plasmideo de digestão, num rácio de 1:3, durante 3 horas à temperatura ambiente, e 5 μΐ transformados em células E. coli NEB 5-alpha (25 μΐ) . A mistura de transformação (200 μΐ) é colocada em placas Luria-Bertani (LB), contendo estas placas 50 pg de ampicilina por ml, e crescem durante a noite a 37°C.
Reagentes utilizados na reação de ligação Rácio 1:3 <μ1) Sem o plasmideo inserção (μΐ) Sem plasmideo de inserção e ADN ligase (μΐ) Água desionizada e livre de nucleases 5 7 8 Tampão T4 Ligase (10x) 2 2 2 Plasmideo de ADN (~10 ng/μΐ) 10 10 10 Plasmideo de inserção (~25 ng/μΐ) 2 T4 ADN ligase (3U/pl, Promega, #M1801) 1 1 Volume Final 20 20 20 Várias colónias positivas são amplificadas em 2 ml de LB (50 pg de ampicilina/ml), purificadas (Miniprep QIAfilter Plasmid Purification Kit #37104), digeridas com Xhol/HindIII a 37°C durante 2 horas, e corridas em gel de agarose (1%), para confirmar a presença do gene DbpA. 10 São obtidas 5 minipreps positivas digeridas, das quais 2 se seleciona para sequenciação. Após confirmado que a sequência corresponde exatamente ao gene DbpA (incluído o His-tag) , 200 μΐ de uma das culturas positivas das minipreps transformadas com TOPIO, crescem em 200 ml de LB (100 pg de ampicilina/ml) a 37 °C durante a noite. Seleciona-se TOPIO porque é uma estirpe de recA/endA, capaz de transporter L-arabinose, mas não a metaboliza. Estes 200 ml de cultura, o ADN de DbpA construído são purificados com Qiafilter Plasmid Midi kit (Qiagen #12243, transformado (2.8 μΐ, ~100 ng) em células TOPIO (15 μΐ), e cresce-se em placas de LB (100 pg/ml ampicillin) a 37°C durante a noite.
No fim, uma das colónias é novamente repicada para gerar stocks em glicerina e para expressar rDbpA. 1.2. Clonagem do antigénio Arthritis-related proteins GST-like self-antigen (Arp)
Para a expressão da proteína recombinante Arp (rArp), é utilizada a proteína 6-His-tag com o mesmo plasmídeo utilizado na expressão do DbpA, plasmídeo pBAD/His A (Invitrogen). 0 plasmídeo recombinante é amplificado e purificado como descrito na secção anterior para o DbpA, mas em vez de HindIII usa-se EcoRI. 1 pg de plasmídeo e todo o gene Arp amplificado e purificado são digeridos com Xhol e EcoRI durante 3 horas a 37°C, seguindo as condições da seguinte tabela: 11
Reagentes para a digestão com Xhol and EcoRI Plasmídeo (μΐ) Arp (μΐ) Água desionizada e livre de nucleases 40 11.5 ADN template 1.5 30 NEB 4 buffer (lOx) 5 5 BSA (lOOx) 0.5 0.5 Xhol (20 u/ul) 1.5 1.5 EcoRI (20 u/ul) 1.5 1.5 Volume Final 50 50 0 plasmídeo e a proteína são corridos num gel de agarose a 0,8% (a 100 V durante 70 minutos) e purificados com QiAQuick Gel Extraction. 0 Arp clivado é depois ligado ao plasmídeo de digestão, num rácio de 1:3, durante 75 minutos à temperatura ambiente, e 5 μΐ transformados em células E. coli NEB 5-alpha (25 μΐ) . A mistura de transformação (200 μΐ) é colocada em placas Luria-Bertani (LB) , contendo estas placas 50 pg de ampicilina por ml, e crescem durante a noite a 37°C. 12
Reagentes para a reação de ligação Rácio 1:3 (μΐ) Sem o plasmideo inserção (μΐ) Sem plasmideo de inserção e ADN ligase (μΐ) Água desionizada e livre de nucleases 12.7 14.5 15.5 Tampão T4 Ligase (lOx) 2 2 2 Plasmideo de ADN (~10 ng/μΐ) 2.5 2.5 2.5 Plasmideo de inserção (~25 ng/μΐ) 1.8 T4 ADN ligase (3υ/μ1, Promega, #M1801) 1 1 Volume Final 20 20 20 Várias colónias positivas são amplificadas em 2 ml de LB (50 μg de ampicilina/ml), purificadas (Miniprep QIAfilter Plasmid Purification Kit #37104), digeridas com Xhol/EcoRI a 37°C durante a noite, e corridas em gel de agarose (1%), para confirmar a presença do gene Arp.
Duas colónias positivas das minipreps são selecionadas para sequenciação. Após confirmado que a sequência corresponde exatamente ao gene Arp (incluído o His-tag), 200 μΐ de uma das culturas positivas das minipreps transformadas com TOPIO, crescem em 200 ml de LB (100 pg de ampicilina/ml) a 37°C durante a noite. A partir deste 200 13 ml de cultura, o ADN de Arp construído é purificado com Qiafilter Plasmid Midi kit (Qiagen #12243, transformado (1 μΐ, ~100 ng) em células TOP10 (15 μΐ) , e cresce em placas de LB (100 pg/ml ampicillin) a 37°C durante a noite.
No fim, uma das colónias é novamente repicada para gerar stocks em glicerina e para expressar rArpn.
2. A utilização do conjunto inovador de antigénios num novo teste de ELISA
Um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima competitivo (ELISA) para a deteção de anticorpos já é conhecido. A nossa técnica assemelha-se a um teste de ELISA porém é mais inovador, mais sensível, mais específico e mais preciso do que as técnicas conhecidas de ELISA. O teste inovador semelhante a um teste de ELISA da presente invenção é particularmente adequado para a detecção de anticorpos contra Borrelia burgdorferi f.l. presentes numa amostra de um organismo possivelmente infetado. O aperfeiçoamento da técnica de ELISA da presente invenção reside na utilização de um bouquet especificamente desenhado para a deteção de anticorpos contra Borrelia burgdorferi f.l., que suprime as reações de ligação não-específicas entre o analito e o primeiro agente de ligação da reação. Além disso, o teste ELISA foi melhorado utilizando-se a técnica de remoção de possíveis contaminantes, uma vez que são utilizados antigénios alvo altamente específicos. 3. Biochip 0 Biochip contém o bouquet de antigénios (descritos no ponto 1, e representado pela figura 1 do caderno de desenhos) em câmaras microfluídicas, e foi construído da seguinte forma: 14 a) no Biochip todas as funções são integradas sem conexões externas (reservatórios de entrada, válvulas misturadoras, área de deteção e bombas de fluídos); b) o Biochip (representado na figura 2 do caderno de desenhos) possui as propriedades desejadas de suavidade da parede e humidade da estrutura de canais de microfluídos e uma elevada relação de aspeto para permitir forças capilares fortes. c) possui estruturas denominadas bombas capilares que permitem o transporte da amostra e dos reagentes até à câmara de deteção. Esta estrutura tem uma taxa de fluxo na ordem dos 0,4 pL/min, permitindo um tempo de teste inferior a 20 minutos, e é capaz de bombear todo o volume de teste da amostra através da câmara de deteção. d) possui uma câmara de deteção, na qual as imunoglobulinas, do soro humano, contra os antigénios de Borrelia são capturadas pelos antigénios imobilizados, com uma capacidade de imobilização superior a 1000 moléculas de proteína. As câmaras são desenhadas para serem compatíveis com um Leitor de quimio-luminescência específico e incluem as estruturas requeridas de direcionamento de ondas. e) a abordagem da produção de um novo Biochip de baixo custo, altamente reprodutível e confiável. f) Procedimentos para a imobilização dos antigénios na câmara de deteção e o revestimento de qDots com anticorpos contra soros humanos, para serem incorporados como reagentes para dentro do chip. A qualidade do revestimento da superfície da câmara, e os qDots foram avaliados utilizando técnicas do estado-da-arte. 15 g) integração de bombas e de válvulas no Biochip com baixo custo, uma vez que não são necessários atuadores externos. Este é um projeto muito simples, que compreende o bombeamento, válvulas, canais microfluidicos (cuja altura está demonstrada na figura 3 presente no caderno de desenhos), e reservatórios. h) uma arquitetura aberta do design do Biochip, que pode ser adaptado para outras aplicações e doenças. 4 . Interpretação dos resultados do Biochip
Inicialmente recolhe-se uma amostra do paciente, que está possivelmente infetado com a doença de Lyme. Esta amostra pode ser fluídica (urina, sangue total, soro, plasma, fluido cérebroespinal, suor, saliva) ou tecidular (lisados de tecidos). Adiciona-se 3 pL da solução filtrada e diluída (1/200) da amostra em 0,1% de Tween 20/PBS e deixa-se na entrada apropriada do Biochip durante 9 minutos. Seguidamente remove-se o excesso de amostra e lava-se a respetiva entrada com 3 pL de uma solução filtrada de 0,1% de Tween 20/PBS. Volta-se a remover o excesso da solução anterior e adiciona-se 3 pL de uma solução de 1/10 de fqDot525, e de 1/100 fqDot625 e deixa-se na referida entrada durante 9 minutos. Novamente, remove-se o excesso da solução anterior e volta-se a fazer uma lavagem com 3 pL de uma solução de 0,1% de Tween 20/PBS. Após realizado este procedimento o Biochip está pronto para ser lido num Leitor de quimio-luminescência apropriado.
Os qDots referidos acima são fundamentais, pois são agentes reveladores que permitirão a identificação da ligação entre o primeiro agente de ligação da reação (um dos 16 antigénios fixados no Biochip) com o analito (amostra) e por sua vez com o segundo agente de ligação da 16 reação (anticorpo IgG ou IgM). Se houver a ligação entre o primeiro agente de ligação de reação, o analito e o segundo agente de ligação da reação quando o Bichip for lido no Leitor de quimio-luminescência apropriado irá ser emitida fluorescência, indicando que os teste foi positivo para a doença de Lyme e o paciente está infetado com a bactéria Borrelia. Se não houver esta ligação, significa que a amostra do paciente não possui anticorpos contra a bactéria Borrelia burgdorferi f.l. e o paciente não se encontra infetado com a doença de Lyme. 5. Quantum Dots, agentes reveladores
QuantumDots (qDots) ou nanocristais são um grupo distinto de compostos fluorescentes que diferem dos fluoróforos convencionais na medida em que têm características espectrais únicas. Os seus núcleos de metais pesados são responsáveis por essas características espectrais originais e são compostos por material semicondutor, seleneto de cádmio (CdSe) ou fosfeto de índio e gálio (InGaP). Os núcleos possuem normalmente propriedades tecnológicas de revestimento que permite a sua conjugação com várias biomoléculas, incluindo anticorpos, proteínas e péptidos. Este revestimento é também um polímero anfifílico, que proporciona uma superfície solúvel em água que pode modificar a conjugação com outras biomoléculas, tais como anticorpos e proteínas. Estes nanocristais são ajustáveis em tamanho (2-50 nm) , normalmente de 10-20 nm, possuem forma esférica, é esta forma esférica que permite que os qDots sejam ajustados para um comprimento de onda de emissão específico. Os qDots são intrinsecamente brilhantes, têm espectros de emissão muito estreitos, têm foto-estabilidade excecional, são fáceis de usar, e podem ser usados numa infinidade de aplicações. 0 uso destes nanocristais em aplicações 17 biomédicas está apenas a emergir e a ganhar popularidade. Devido às suas características espectrais fundamentais os qDots têm alto desempenho numa variedade de aplicações, tais como citometria de fluxo, imuno-histoquímica ou no nosso caso, como moléculas de detecção para os soros humanos.
No caso desta invenção, foram escolhidos os qDots 525 e os qDots 625. 0 número à frente de qDots corresponde ao pico de emissão do referido qDot, no nosso casso os qDots escolhidos para esta invenção irão ter picos de emissão a 525 nm (qDots 525) e 625 nm (qDots 625) . Ambos os qDots serão conjugados com os nossos segundos agentes de ligação (IgG ou IgM) formando o complexo segundo agente de ligação-qDot. Este complexo por sua vez ir-se-á ligar ao complexo primeiro agente de ligação-analito (soro humano), no caso do soro possuir anticorpos contra Borrelia burgdorferi f.l.. Se o complexo primeiro agente de ligação-analito-segundo agente de ligação-qDot quando o Biochip for colocado no Leitor de quimio-luminescência os qDots serão excitados ao comprimento de onda referido acima, e transmitirão fluorescência, acusando um diagnóstico positivo para a doença de Lyme. 18
Bibli ografia 1. Lyme borreliosis in Europe: influences of climate and climate change, epidemiology, ecology and adaptation measures. Elisabet Lindgren and Thomas G.T. Jaenson. World Health Organization Regional Office for Europe 2006 2. Irwin T. Vanderhoof, PhD, CLU et al. (1993) Lyme Disease: The cost to society. Contingencies,
Jan./Feb., p. 42-48 3. The emergence of Lyme Disease. Steere et al., The Journal of Clinicai Investigation, 2004. 4. Wilske, Bettina(2005)'Epidemiology and diagnosis of Lyme borreliosis', Annals of Medicine. 5. http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/lyme/ld_humandisease_d iagnosis.html 2013-07-24

Claims (4)

  1. R® i v :c. n d i o a. çd n s X , Ensaio cio ligação cio ama arco a ora cio aabssâacia a analisar, compreendendo os passos da; 1 ~ mis tu xa o a fase nomogénea, nume sério de recipientes cio reação, do uma amostra para análise, com nm cotjento Inovador do antigénios que foncionam coso p circo ir o agente cio ligação, aguardando o an.al.lto do interesse presente na amostra formar um primoIro produto de mistura/ 2- e empoado o primeiro produto do mistura a um. segando agente de ligação, a fim de formar um segunde produto cie mistura;. ·./< />' , 0 ensaie de iigagáo de eoordo cem a reiulndlcagao n!3., oaracterirado por o uso de 16 anui génios come primeiros agentes de ligação, eo todo ou em. parte, em igual recipiente de reação ou em recipientes separados para cada um dos agentes do ligação, 0 ensaio de ligaçao de acordo som a rolvindioaçao n*l, oaraoierirado pelo facto do anui génio OspC (outer surface proteio Cu, de Borre, ti a tutetíorfori /, 1 < , ser ou poder ser utlilsado eemo primeiro agente de r rg a çé o, 0 ensaio de ligaçao de acorde com a rereirdrcaçáo η°1, caractor.irado pele facto do antigénio peptidico Cr 19-mer, com a: seguênoia BEQ, XO n ° 3., de Borréiia bux-gaox-feri fui,,· ser ou poder sor utilirado como primeiro aponte de ligação. v 0 ensaio de ligação de acorde oom a reis indicação tdl, csracteri zado pelo itero do enri.gènio peptidico C6 25-mor, com a seguênoia SEg, 15 ndr, de Borrei im dtrpmorrerl li ,1., ser ou poder sor utiiirado como primeiro agente de ligação, 6, 0 ensaio de ligação do acordo com a reirindioação n * 1, osoraotor 3 suco polo facto do ant -.génio OapEl ;outer surface pxotein 31) , do Bc/rredim iiurgdorreri fui,,-: ser ou poder sor utilirado como primeiro agente de ligação 1., 0 ensaio de 1 igaçfo de acordo com a reivindicação nd, oaraoterieado: pele facto do antigéuio Ospes (cuter aardaoe protei.a Idf , de .Borrei is barçsmnneri ff i , ser ou poder ser utilisado como primeiro agente de ligação, 8, 0 de a a Io de ligação de acerco coo a rol vindicacao caraoterlsado pelo facto do antigénio Os ca. ( o ater aurfsce proteit â) f dc .Borrélis dargdo.rrerl f» 1. ser oo poder ser otilirado coce pr imoi.ro agente de aigagao, 0, O ensaio de ligação de acordo com a rei'ti.ndicação n°lf csractcriando polo facto dc antigénio LFK1 flvrpfooyte faaction antlgen-l) de forrei ia butgdorÍeri ff 1, ... ser ou poder der utilidade coso granei ro agente de s gaçao.. iDv 0 ensaio de i r. gaga o de acordo oom a. rei vradicação nffu oareoterirsde peio facto dos péptidos obtidos a partir de Bafes ia microtí.? coe a sequência 8£ζη XO n<:3?· ser ou poderem set utilisadoe corso primeiro agente de ligação* 11 v 0 ensaio de Is.gaçao de acordo com: o reivindicação nslí caraotatirado paio facto dos péptidos obtidos a partir do Ehalictxiaoom a sequência SEQ. ID rdi, serem o o pode roas ser utilisadoe como primeiro agente de ligação» lb., 0 ensaio de i.igaçao do acordo com a reivindicação nl1!, caraoterlsado pelo facto da aeni rogue ta de dorroiia burgdorferi 8-31 ser ou poder sor utiiisedo somo primeiro agente de ligação» 13. ô enséio de IIgaçao do acordo com a r ervi.ndioação πX .< caraoterlsado polo facto do cisto de Borreiia .burgdorferi E31 ser ou poder ser ut Uivado como primeiro agente do ligação. 14» O ensaio de ia gaçao do acordo com a. reivindicação ídb caaracierirado paio facto dos Usados celularae de ibllsll serem ou poderem ser utiiirados como primeiro agente de ligação. 15,. 0 ensaio de ligação de acordo com a reivindicação n*l*. oaraotarirado pelo facto dos Usados celulares de 1.7 18 16 20' 21 24 ãorraiiu garini .i serem ou poderem ser et 11 irados como primeiro agerme de ligação* O ensaio de ligação de acordo com a raivindicação •do cara oro rir sdo polo facto dos lisados ceie lares de morrei is ãzfelii aerom oo poderem, ser utilidades como ρτ 1 me i ro a ser; t e de .1 i oc.cs o. O ensaio de ligação do acordo com a reivindicação ní:lí ca racter irado pelo tacto do antigênio Gbpit ; oocorir ci ntíang prateia A) .,· de Boi relia hurgdorf&ri 21.1 < ... ser oc poder sor utilidade como primeiro agente de ligação* 0 ensaio de ligação de acordo com a reivindicação 0*1^ caraoterirado pelo lacro do antigênio crp (arrdri rrc-related proteins GST-li.ke self-antigea} , de ocrre.lia io;recorrer.; 11 i. , ser ou poder ser utilizado como primeiro agente de ligação, 0 ensaio de ligação de acordo com a reivindicação n1 ... ca rac ter irado pelo facto do segundo agente de ligação ser um anticorpo. O ensaio de .1 inação de acordo com a reivindicação η° 1 , carac r:erszaoo pelo facto doe anticorpos anti-IgG e anti ·· Tgd serem, utilizados como segundos agentes de Iigação* . O ensaio de ligação da acorde com a reivindicação .0*2, ca r ao i. cr irado paio facto do segundo agente da ligação estar conjugado a um marcador químico* * O ermalo de ligação de acordo com a reivindicação nç2, caraoterirado pelo facto do segando agente de ligação estar conjugado a um enzima* Q ensaio de ligação de acordo com a reivindicação n22; caractetirado peio facto do anticorpo ser cm anticorpo XgG ou IgH* . G ensaio de ligação de acordo com as rolvindicações n° 22 e η®23* crmactorizado pelo facto do anticorpo ser utilizado em diluições de lo 100* 1; 1000 e 1:100.00., 0 ensaio de ligação de acordo ocra a reivindicação η :'Ί * caraoteriaado pelo facto dos recipientes de reação: puderam fazer parte da um rdochip onde vai 28 ocorrer a reação de reconhec.i.eento do antiuénio e do anelito, 26, o biocblp de acordo coar a reivindicação s c 2 5 s carectexarado pelo facto de ser forrando por câmaras, mierocsnsis e raiva 1 ao sobre po 1 ime t i 1 -me i a o r 11 ato, material fcermopleotico rígido e transparents, também conde cl do tomo PbMli, 21.. 0 biocnip de acordo com :a meiviudioaçâo rdls, caraoterirado peio facto ser formado por câmaras, miorccanaia e vá i vaias sobre o atro material pcl.imér.ico coohac::. do core rmialmc nr e come da ias 3 .
  2. 28. Oe microcsnais de acordo com as reiv1calcacôas n* 2 a e n ° 2 7, caracterirados pelo facto de possuírem uma largura de 2s a 50 um, 2a. lis climaras de acordo com as reivmadicagOes .a° 26 e T·c 2 7, caracter iradas polo facto de: serem 16 mlcrocâmaras de amáliae de reações im.uao lógicas o deteção de 11 uoroscericra, com ume alto ta, I arpara e diâsTo tr o de Spm a Bõgm.. 30, lia câmaras de acorde com as reivindicações n* 26 e ns21, earacteriradas pelo facto de conterem oe 16 antigéoios deecritos da rol vi ecii caçOo n°3 à reiulodicagão n c t 6, um por cada câmara. 31, lis válvulas oe acordo com as reivindicações n° 26 o rd 27, esraoteriaadss pelo facto de fa serem variar a largara do caos 1 de 5 um para 36 pm, 32 v d biocbip de acordo com a reivindicação n ° 2 3, caracter1 sedo peio facto de conter Prés entradas para as câmaras e canais, sts sistema de entrada miorofiuidlpa,: nma entrada para o analrto, amostra do paciente, uma entrada nata reagentes e uma entrada para as lavagens, 33c Os microcaneis,· váI.vaias e câmaras de acordo com as reivindicações n* 26 e rd 2 7, oaracterisados pelo facto de possuírem uma profundidade de 10 nm e 25 pm.
  3. 4. Os anti genica do a cri tos cia reivindicação n°3 s rei vindicação n° 18 e os anticorpos descri tos na reitindieaçao o°1 scaracteritados polo facto de serem dispostos no biochip do acordo cot; a reivindicação n° ia do acordo coó a figara 1 presente rio caderno de dose .oh os, S, d biochip do acordo com a reivindicação ns 25, caracterirado pelo facto de ser recostado com po 1 y-0,--iysi.oe, 6, 0 biochip do acordo com. a se ir indicação m' 25, earaeterisado peio facto do serem inceridos o a 30 pi de a anticéaioc descritos de seioindicação 3 à reivindicação lã e dos anticorpos da reivindicação 13. 7, 0 procedimento otiIdeado nc Biochip de acordo cem a rei vmarcação n* 25, carácter isaCo pelos seguintes passos:: adicionar 3 ui de orna solução filtrada, e dlluida na proporção oe 1/200 de soro em 0,1% de Tceen 20/BBS e deitar na entrada apropriada do biochip durante 9 ml natos; remeter e coces so da solução anterior e .lavar com 3 uL de uma solução filtrada de 0,1% de Tween 20/PBS; remeter o excesso da solução anterior e adicionar 3 uB de uma solução de 1/10 de fgDocSaS, c de 1/1 DD fcDotoiS durante 9 minutos; remeter c excesso da solução anterior e lavar com 3 gB de uma solução de 0,1% de Teeen 20/FBSí o biochip fica. desta forma, prento pera o passo de deteção, s , Oa anticorpos de acordo com a reivindicação n<:20, caraoteri.xãdos pelo facto de estarem ligados a ccots, fqOot525, como mencionado na reivindicação ni21. 0, Os anticorpos de acorde com a reitindicação n°2D, sara o te rira dos pelo facto de estarem ligados a. oDots, ini)ot62S, como mencionado na reitindicação ;/2L IIIIIjWljl)l||.IMIIjl)UWimiÍimBiBÍim!WWBWW·—W—I—1 0, Os qbota de acordo coo a.s rolviudicaçoes n°3ã o o3 á ,· caracterissdo poio facto de serem aqentes roce i adoro o que permit 1 râo a rden t r ti caçoo da ligação entre o prliteiro soante do ligaçao da reação coo o analito e por sue ror oem o segundo agente de ligaçao da reação,. por excitação da sua flucre acene ia e deteção num Lei tor do quir 1 o~ 1 umnuscência , 41, um método de diagnóst: i co, monitor! cação e avaliação da grani da de da doença de trone num mamífero,· caracterisado polo ensaio de ligaçao de acordo com reivindicação ns'l compreendendo oa passes das obtendo ama amostra do referido mamífero, sega ela um fluido biológico, ou cm tecido; f a rendo entrar em contato a amostra referida em ag com partículas molecu lares poliméricaes mui ti f an n lona iasob as condições nas nuais am ou maio antigenios de Borrei ia purgdorferi f. i, estão presos,· concentrados e fracionados a partir de outras moléculas interferentes ce maior abundância ou proteínas t ransport adora s; f atendo entrar em contato os ditos anti.génios ou am fragmento de ligação do antigènio com, peio menos um: anti corpo, sob condições nas quais complexos imunes serão formados entre os ditos anticorpos ou fragmentos o qualqaer antigènio associado com. dorreiia burgr.fcu:'fe.ri que possa estar presente na dita am.es trs; fa tendo entrar em contato o como leso imune anti corpo·" antigènio primário de Borora ix a innnpiorfari com um anti corpo secundário ligado a Um marcador gui.mi.oo,. que sobre determinadas condições formará um complexo entre o complexo imune anticorpo-antigénio primário de Borreiiâ btiradorferi e o anticorpo secundário; medição da quantidade de 11qoçoes e.ntre snt1 génlos de Sorreiia burgdorferi ri 1, e c complexo de anticorpos; deteção da presença doa antigénios come método de diagnóstico da doença de Lymc em mamíferos.
  4. 42, A amostra d® acordo reivindicação nfl e n:>4l a} , caracteritaco pelo facto da amostra a cr constituída per um: ou mais nos seguintes fluidos ou amostras tacidulares: urina^ sangue total.,. soro> plasma.., tinido oárebroespinai, suor,· sal ima. e lisados de teci doa, 43, 0 diagnostico positivo para a doença, de Lym.e, caractorisadc peie facto de no final do ensaio da ligação de; acordo com s reivindicação n<! 1,. a presença do agente revelador ou dos qDots, de acordo com as reivindicações rm 3 8 e rtiS, ser detetada na câmara onde ocorreu o ensaio da ligação. ί $ :.¾ * 1 $ 0 dia sor; co d1 ao 0 0 00 tiro para a do enga da Lytaa , oar a cteria ado peio x: ac x: Cá et o uo -final cto eu a aio de 1 ig a ça e cia a. co rd.o o :oai a raio iu dl cação π d, ^ a p; oa aeoga: do agenda 00 V·· alado:: c ou cioa qDota, de a cg a do c oo a a r a i 'v'' .1 adi s® ÇOOG n 3 S; Cr O: ° 33, u ão acu:' date fcada 0 o c doara. ond dg ocoa r 6U G enea. io de. 11UU çao» 2013-10-0/
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