PT106942B - Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica - Google Patents

Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica Download PDF

Info

Publication number
PT106942B
PT106942B PT106942A PT10694213A PT106942B PT 106942 B PT106942 B PT 106942B PT 106942 A PT106942 A PT 106942A PT 10694213 A PT10694213 A PT 10694213A PT 106942 B PT106942 B PT 106942B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
biochip
image
axis
drawer
minutes
Prior art date
Application number
PT106942A
Other languages
English (en)
Other versions
PT106942A (pt
Inventor
Meurice De Dormale Guerric
J Whitlow Harry
Demarteau Jean
Gilbert Leona
Puttaraksa Nitipon
Garcia-Nogales Paula
Sajavaara Timo
Napari Mari
Original Assignee
STAB VIDA, Investigação e Serviços em Ciências Biológicas, Lda
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by STAB VIDA, Investigação e Serviços em Ciências Biológicas, Lda filed Critical STAB VIDA, Investigação e Serviços em Ciências Biológicas, Lda
Priority to PT106942A priority Critical patent/PT106942B/pt
Priority to US14/891,616 priority patent/US20160123978A1/en
Priority to PCT/PT2014/000030 priority patent/WO2014185803A2/en
Priority to DK14736473.1T priority patent/DK2997372T5/da
Priority to EP14736473.1A priority patent/EP2997372B1/en
Publication of PT106942A publication Critical patent/PT106942A/pt
Publication of PT106942B publication Critical patent/PT106942B/pt

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502738—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by integrated valves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
    • B01L9/527—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips for microfluidic devices, e.g. used for lab-on-a-chip
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
    • B01L2200/027—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details for microfluidic devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO RELACIONA-SE COM UM ENSAIO IMUNO-DETETÁVEL, SEMELHANTE A UM ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA), PARA A DETEÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA BORRELIA BURGDORFERI F.L. (BACTÉRIA RESPONSÁVEL PELOS SINTOMAS DA DOENÇA DE LYME), NUMA AMOSTRA RECOLHIDA DE UM PACIENTE. O ENSAIO DESTA INVENÇÃO É MAIS ESPECÍFICO, MAIS SENSÍVEL E MAIS PRECISO QUE AS TÉCNICAS ELISA CONHECIDAS, PERMITINDO UMA MELHOR IDENTIFICAÇÃO DOS REFERIDOS ANTICORPOS ORIGINADOS NA REAÇÃO IMUNOLÓGICA DO ORGANISMO INFETADO, DEVIDO AOS 16 ANTIGÉNIOS SELECIONADOS E QUE PODEM TAMBÉM SER FIXADOS NUM BIOCHIP.A PRESENÇA DE ANTICORPOS CONTRA BORRELIA BURGDORFERI F.L. CAPTURADOS NO BIOCHIP, TAMBÉM PODE SER DETETADA COM QUANTUM DOTS, QUE RECONHECERÃO O COMPLEXO ANTIGÉNIO-ANTICORPO E PERMITIRÃO A OBSERVAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA NO BIOCHIP.A PRESENTE INVENÇÃO É ÚTIL NO DIAGNÓSTICO DA DOENÇA DE LYME AGUDA E CRÓNICA, COM A VANTAGEM DE SE REVELAR UM MÉTODO RÁPIDO, SIMPLES, ESPECÍFICO, PRECISO E DE BAIXO CUSTO, PODENDO SER APLICADA NA ÁREA CLÍNICA.

Description

Descrição
Biochip e bouquet de 16 antigénios para a deteção da doença de Lyme aguda e crónica
- Doença de Lyme, uma doença endémica
A doença de Lyme é uma doença endémica, provocada pela bactéria Borrelia burgdorferi f.l., que afeta 63 países à volta do mundo, incluindo os 27 estados membros da União Europeia. 0 Escritório Regional para a Europa da Organização Mundial de Saúde (WHO) estima que atualmente surgem 85,000 novos casos de doença de Lyme na Europa (avaliando dados nacionais), porém teme-se que este número seja largamente maior, uma vez que na Europa os casos reportados são altamente inconsistentes e muitas infeções por parte desta doença não são diagnosticadas corretamente.
número de casos reportados de doença de Lyme aumentou desde os inícios dos anos 90, e a distribuição geográfica expandiu-se devido às alterações do clima (Lindgren, E. and Jaenson, Thomas G.T., 2006). No ano de 1993, estimou-se que esta doença tinha um custo de 660 milhões de euros para a sociedade, sendo o custo por paciente de cerca de 40,750€ (Irwin T. Vanderhoof, PhD, CLU et al., 1993) . Desde então o número de casos mais do que duplicou, o que fez com que o custo para a sociedade aumenta-se para mais de mil milhões euros.
Os primeiros sintomas da doença de Lyme incluem febre, dor de cabeça, fadiga, depressão e por uma erupção cutânea caracteristica denominada por erythema migrans. Quando detetada a tempo, a infeção e os sintomas podem ser eliminados recorrendo-se a antibióticos. Porém, se esta doença não for tratada, os sintomas podem afetar o sistema nervoso central, o coração e as articulações, o que se torna muito difícil de tratar.
Ocasionalmente, os sintomas como a artrite persistem após a infeção ter sido eliminada, o que sugere que a Borrelia burgdorferi f.l. pode promover infeções crónicas e infeção-induzida autoimune (Steer et. al,2004).
- Borrelia burgdorferi f.l., bactéria causadora da doença de Lyme
A Borrelia burgdorferi f.l. é uma bactéria pleomórfica com um ciclo de vida complexo que engloba uma multitude de formas, incluindo a forma de saca-rolhas (denominada parental, pois é a forma que esta bactéria possui quando infeta o hospedeiro), a forma de cistos (sem parede celular), entre outas formas.
Embora conhecidas há mais de um século, as bactérias com parede celular deficiente (CWDB), onde se inclui a Borrelia, só foram ligadas clinicamente a doenças relevantes durante as últimas décadas. A falta de parede neste tipo de bactérias faz com que estas sejam muito difíceis de detetar segundo os métodos usuais de deteção, tais como o microscópio de luz e teste serológicos padrão, isto porque este tipo de bactérias desencadeia uma resposta imunológica diferente do normal. Como resultado, as CWDB provocam infeções difíceis de diagnosticar e tratar, permanecendo no corpo durante um longo período de tempo e causando doenças crónicas.
A existência de variantes pleomórficas da espiroqueta de Borrelia explica potencialmente, a habilidade que esta bactéria possui para permanecer no hospedeiro como adormecida, durante prolongados períodos de latência clínica assintomática. De acordo com os sintomas e duração da doença, existem 3 fases da doença de Lyme:
- Infeção localizada da pele (erythema migrans);
- Infeção caracterizada pela inflamação de diferentes órgãos, semanas ou até meses após a transmissão da Borrelia;
- Infeção persistente, com inflamação crónica de diferentes órgãos e sistemas por mais de 1 ano.
A bactéria Borrelia burgdorferi f.l. foi implicada em manifestações clinicas mais severas, tais como a borreliosis neocortical (neuroborreliosis), a qual tem sido associada à doença de Alzheimer.
- Métodos de diagnóstico da doença de Lyme
Os sintomas comuns provocados pela doença de Lyme são sintomas semelhantes a uma gripe, dores de cabeça, dores nas articulações, problemas gastrointestinais, sensibilidade à luz/som e um mal-estar geral, porém a variedade de sintomas difere de paciente para paciente: alguns pacientes apenas apresentam infeções na pele enquanto outros apenas desenvolvem sintomas tardios, como a artrite.
Como apenas 60% dos pacientes desenvolvem caracteristicas de erythema migrans e cerca de 25-30% dos pacientes se lembra de ter sido picado, os restantes 10-15% dos pacientes só são confirmados por testes laboratoriais. Os sintomas da fase tardia desta doença são consequência, em parte, da falta de sensibilidade e eficiência das ferramentas de diagnóstico que são capazes de detetar a doença nas suas primeiras fases, quando esta é facilmente tratada.
Centro de Controlo de Doenças (CDC) dos Estados Unidos da América propõe um critério de diagnóstico em dois níveis, para o diagnóstico serológico da doença de Lyme:
Um primeiro nível onde se realiza um ensaio imunológico positivo (ELISA) , seguido de um segundo nível onde se realiza um Western Blot (WB) para confirmar os resultados do ensaio imunológico (ELISA). Ambos os ensaios possuem falta de sensibilidade e a interpretação do WB varia de laboratório para laboratório.
Esta estratégia falha o diagnóstico da primeira fase da doença em 80% dos casos (Wilske, Bettina (2005) ) , e não distingue entre infeção aguda ou crónica.
Os mesmos problemas de sensibilidade são encontrados na avaliação do fluido cerebroespinal (CSF), onde os teste serológicos apenas detetam 10-30% dos pacientes com neuroborreliosis.
Até à data, não existe nenhuma ferramenta de diagnóstico capaz de detetar com sensibilidade e especificidade a resposta imunológica desencadeada pelas formas Borrelia burgdorferi f.l. de parede celular deficiente, as quais são responsáveis pelos sintomas crónicos severos de borreliosis. Estas formas apresentam um padrão de expressão proteico alterado, assim como diferenças nos antigénios comparados com a forma parental. Como resultado, estas formas não são detetadas com os correntes métodos comerciais baseados nos antigénios contidos nos lisados celulares totais da forma parental da Borrelia burgdorferi f.l..
- Métodos de diagnóstico da doença de Lyme desenhado pela STAB VIDA.
Nos últimos anos foram descritos, em artigos científicos e médicos, novos péptidos e proteínas antigénicas para a deteção de infeções por Borrelia burgdorferi f.l., que na primeira fase da doença quer em fases mais avançadas. Além disso, o uso de proteínas recombinantes e antigénios sintéticos (tais como o antigénio Arp e o antigénio DbpA) mostrou resultados melhores e mais precisos em teste serológicos do que em extratos bacterianos inteiros. A última pesquisa nesta área aponta para uma combinação de antigénios num único ensaio, como sendo a melhor maneira de combater os problemas dos testes atuais. Porém, um ensaio que integre esta combinação ainda não se encontra no mercado.
Baseando-nos nas necessidades do mercado, dois principais requisitos são claramente identificáveis:
1- Melhoramento da técnica de WB, a qual exige um trabalho laboratorial intensivo, consome muito tempo e é difícil de padronizar. Sendo assim, a nova ferramenta deveria ser robusta, fácil de usar e permitir interpretações inequívocas dos resultados dos testes.
2- Evitar a necessidade de dois testes, para tornar o diagnóstico seguro, e permitir que as infeções crónicas sejam detetadas, incluindo os novos antigénios que foram reportados na literatura nos últimos anos, mas que ainda não alcançaram o uso clínico.
Com estas premissas em mente, um consórcio das PME APPLIED RESEARCH USING OMIC SCIENCES SL (AROMICS), B-C-A BORRELIOSE CENTRUM AUGSBURG BETRIEBS GMBH & CO KG (BCA) , microLIQUID sl (MLD) , STAB VIDA, INVESTIGAÇÃO E SERVIÇOS EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS LDA. (STAB VIDA), MICRO BIO DEVICES S.R.L (MICRO BIO) , JYVASKYLAN YLIOPISTO (JYU), SERVILOG SA (WOW), desenvolveu uma ferramenta robusta, específica e de alta sensibilidade. Esta ferramenta consiste num Biochip, onde estão incorporados 16 antigénios específicos (IgG, IgM, E. coli lysate, OspC, C2, C6, OspEl/2, OspA, DbpA, LFA1, Arp, Babesia microti, péptidos Ehrlichia, espiroqueta Borrelia burgdorferi B31, cisto Borrelia burgdorferi B31, Borrelia garinii, Borrelia azfelii) para os anticorpos da doença Lyme. Este Biochip depois de carregado com amostras de soro do paciente, e após alguns procedimentos é colocado num Leitor de quimio-luminescência, que irá dar o diagnóstico do paciente. 0 mesmo grupo de antigénios pode ser utilizado como um teste de ELISA, inovador pela composição e carácter inventivo de pelo menos 2 dos 16 antigénios.
- Como interpretar os resultados fornecidos pelo Leitor de quimio-luminescência
Biochip, como já foi referido, está carregado com 16 antigénios específicos para os anticorpos da doença de Lyme. A amostra de soro do organismo supostamente infetado é recolhida e carregada numa das câmaras do Biochip, aguarda-se alguns minutos para que a amostra entre no Biochip. De seguida, remove-se o excesso de amostra e carrega-se a câmara com uma mistura de reagentes e tampões químicos, processo que se repete duas vezes. Após este procedimento, o Biochip é inserido no Leitor de quimioluminescência (inventado pelos autores desta patente), que possui um software fácil de utilizar.
Os anticorpos de segunda ligação, que reconhecem os anticorpos IgG e IgM aprisionados pelos antigénios estão ligados a Quantum Dots e quando um anticorpo da amostra se liga a um antigénio fica-se, com uma ligação anticorpoantigénio-anticorpo secundário-Quantum Dots. Assim, se esta ligação se verificar no Biochip, o Leitor de quimioluminescência irá excitar estes Quantum Dots que por sua vez transmitirão fluorescência, lendo-se este sinal como um resultado positivo da presença de infeção na amostra.
Ou seja, se for transmitida fluorescência significa que houve a ligação anticorpo-antigénio, logo chega-se à conclusão que o paciente está infetado com a bactéria Borrelia burgdorferi f.l. e desenvolveu sintomas de doença de Lyme. Se não for transmitida fluorescência significa que a ligação anticorpo-antigénio não ocorreu, logo o paciente não desenvolveu a doença de Lyme.
Descrição detalhada da invenção
1. Bouquet de 16 antigénios
Foi concebido um conjunto inovador de antigénios, a que chamamos um novo bouquet de 16 antigénios, específicos no todo ou em parte para a deteção da doença de Lyme, sendo eles os seguintes:
IgG e IgM, ambos utilizados como controlo positivo da reação imunológica;
- Lisados celulares de E. Coli, utilizados como controlo negativo para infeção de Borrelia burgdorferi f.l.;
OspC (Outer Surface Protein C) , C2 19-mer (DAASVNGIAKGIKGIVDAA) e C6 25-mer (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) todos juntos, são antigénios de infeção aguda provocada por Borrelia burgdorferi f.l.;
- OspEl/2 (Outer Surface Protein El/2) juntos, OspA (Outer Surface Protein A) e DbpA (Decorin binding protein A), são antigénios de infeção crónica provocada por Borrelia burgdorferi f.l.;
LFA1 (Lymphocyte Function Antigen-l) e Arp (Arthritis-related proteins GST-like self-antigen), são antigénios de infeção autoimune provocada por Borrelia burgdoferi;
Péptidos de Babesia microti (com a sequência IVEFNAIFSNIDLNNSSTVKNEIIK) e Ehrlichia (com a sequência SAVSNRKLPLGGVLMALVAAVAPIHSALLA), provenientes de coinfecções;
Borrelia burgdorferi B31 spirochete, B.burgdorferi B31 cysts, Borrelia garinii and Borrelia azfelii, utilizados como lisados celulares de controlo positivo para a infeção por Borrelia e para as suas espécies mais próximas.
Neste bouquet, 14 dos antigénios já tinham sido descobertos e 2 antigénios foram descobertos e produzidos especificamente para este bouquet de deteção da doença de Lyme, sendo eles os antigénios DbpA e Arp.
1. 1. Clonagem do antigénio Decorin binding protein A (DbpA)
Para expressar o antigénio DbpA (rDbpA), selecionámos o plasmídeo pBAD/His A para expressão induzível em E.Coli. A proteína será expressa como uma proteína de fusão com uma 6-His-tag na posição N-terminal. A β-His-tag é pequena, não imunogénica e permitirá a purificação através de ligação a matrizes de metais iónicos.
Inicialmente o plasmídeo de expressão foi amplificado e purificado (Midiprep QIAfilter Plasmid Purification Kit #12243) . Seguidamente, 2 pg do plasmídeo e todo o amplicon de DbpA purificado foram digeridos com os enzimas de restrição Xhol e HindIII durante a noite a 37° C, seguindo as condições da tabela abaixo descrita:
Digestão com Xhol e HindIII Plasmídeo (μΐ) DbpA (μΐ)
Água desionizada e livre de nucleases 25, 5 35
ADN template 15 50
NEB 2 buffer (lOx) 5 10
BSA (lOOx) 0, 5 1
Xhol (20 u/ul) 2 2
HindIII (20 u/ul) 2 2
Volume Final 50 100
plasmídeo e a proteína são corridos num gel de agarose a 0,8% (a 100 V durante 70 minutos) e purificados com
QiAQuick Gel Extraction. 0 DbpA clivado é depois ligado ao plasmideo de digestão, num rácio de 1:3, durante 3 horas à temperatura ambiente, e 5 pl transformados em células E. coli NEB 5-alpha (25 pl) . A mistura de transformação (200 pl) é colocada em placas Luria-Bertani (LB), contendo estas placas 50 pg de ampicilina por ml, e crescem durante a noite a 37°C.
Reagentes utilizados na reação de ligação Rácio 1:3 (pl) Sem o plasmideo inserção (pl) Sem plasmideo de inserção e ADN ligase (pl)
Água desionizada e livre de nucleases 5 7 8
Tampão T4 Ligase (10x) 2 2 2
Plasmideo de ADN (~10 ng/pl) 10 10 10
Plasmideo de inserção (~25 ng/pl) 2
T4 ADN ligase (3U/pl, Promega, #M1801) 1 1
Volume Final 20 20 20
Várias colónias positivas são amplificadas em 2 ml de LB (50 pg de ampicilina/ml), purificadas (Miniprep QIAfilter Plasmid Purification Kit #37104), digeridas com Xhol/HindIII a 37°C durante 2 horas, e corridas em gel de agarose (1%), para confirmar a presença do gene DbpA.
São obtidas 5 minipreps positivas digeridas, das quais 2 se seleciona para sequenciação. Após confirmado que a sequência corresponde exatamente ao gene DbpA (incluído o His-tag), 200 μΐ de uma das culturas positivas das minipreps transformadas com TOPIO, crescem em 200 ml de LB (100 pg de ampicilina/ml) a 37°C durante a noite. Seleciona-se TOPIO porque é uma estirpe de recA/endA, capaz de transporter L-arabinose, mas não a metaboliza. Estes 200 ml de cultura, o ADN de DbpA construído são purificados com Qiafilter Plasmid Midi kit (Qiagen #12243, transformado (2.8 μΐ, ~100 ng) em células TOPIO (15 μΐ), e cresce-se em placas de LB (100 pg/ml ampicillin) a 37°C durante a noite.
No fim, uma das colónias é novamente repicada para gerar stocks em glicerina e para expressar rDbpA.
1. 2. Clonagem do antigénio Arthritis-related. proteins GST-like self-antigen (Arp)
Para a expressão da proteína recombinante Arp (rArp), é utilizada a proteína 6-His-tag com o mesmo plasmídeo utilizado na expressão do DbpA, plasmídeo pBAD/His A (Invitrogen).
O plasmídeo recombinante é amplificado e purificado como descrito na secção anterior para o DbpA, mas em vez de HindIII usa-se EcoRI.
pg de plasmídeo e todo o gene Arp amplificado e purificado são digeridos com Xhol e EcoRI durante 3 horas a 37°C, seguindo as condições da seguinte tabela:
Reagentes para a digestão com Xhol and EcoRI Plasmideo (μΐ) Arp (μΐ)
Água desionizada e livre de nucleases 40 11.5
ADN template 1.5 30
NEB 4 buffer (lOx) 5 5
BSA (lOOx) 0.5 0.5
Xhol (20 u/ul) 1.5 1.5
EcoRI (20 u/ul) 1.5 1.5
Volume Final 50 50
plasmideo e a proteína são corridos num gel de agarose a 0,8% (a 100 V durante 70 minutos) e purificados com QiAQuick Gel Extraction. 0 Arp clivado é depois ligado ao plasmideo de digestão, num rácio de 1:3, durante 75 minutos à temperatura ambiente, e 5 μΐ transformados em células E. coli NEB 5-alpha (25 μΐ) . A mistura de transformação (200 μΐ) é colocada em placas Luria-Bertani (LB) , contendo estas placas 50 pg de ampicilina por ml, e crescem durante a noite a 37°C.
Reagentes para a reação de ligação Rácio 1:3 (pl) Sem o plasmídeo inserção (pl) Sem plasmídeo de inserção e ADN ligase (pl)
Água desionizada e livre de nucleases 12.7 14.5 15.5
Tampão T4 Ligase (lOx) 2 2 2
Plasmídeo de ADN (~10 ng/pl) 2.5 2.5 2.5
Plasmídeo de inserção (~25 ng/pl) 1.8
T4 ADN ligase (3U/pl, Promega, #M1801) 1 1
Volume Final 20 20 20
Várias colónias positivas são amplificadas em 2 ml de LB (50 pg de ampicilina/ml), purificadas (Miniprep QIAfilter Plasmid Purification Kit #37104), digeridas com Xhol/EcoRI a 37°C durante a noite, e corridas em gel de agarose (1%), para confirmar a presença do gene Arp.
Duas colónias positivas das minipreps são selecionadas para sequenciação. Após confirmado que a sequência corresponde exatamente ao gene Arp (incluído o His-tag), 200 pl de uma das culturas positivas das minipreps transformadas com TOP10, crescem em 200 ml de LB (100 pg de ampicilina/ml) a 37°C durante a noite. A partir deste 200 ml de cultura, o ADN de Arp construído é purificado com Qiafilter Plasmid Midi kit (Qiagen #12243, transformado (1 μΐ, ~100 ng) em células TOP10 (15 μΐ) , e cresce em placas de LB (100 pg/ml ampicillin) a 37°C durante a noite.
No fim, uma das colónias é novamente repicada para gerar stocks em glicerina e para expressar rArpn.
2. A utilização do conjunto inovador de antigénios num novo teste de ELISA
Um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima competitivo (ELISA) para a deteção de anticorpos já é conhecido. A nossa técnica assemelha-se a um teste de ELISA porém é mais inovador, mais sensível, mais específico e mais preciso do que as técnicas conhecidas de ELISA. 0 teste inovador semelhante a um teste de ELISA da presente invenção é particularmente adequado para a detecção de anticorpos contra Borrelia burgdorferi f.l. presentes numa amostra de um organismo possivelmente infetado. O aperfeiçoamento da técnica de ELISA da presente invenção reside na utilização de um bouquet especificamente desenhado para a deteção de anticorpos contra Borrelia burgdorferi f.l., que suprime as reações de ligação não-específicas entre o analito e o primeiro agente de ligação da reação. Além disso, o teste ELISA foi melhorado utilizando-se a técnica de remoção de possíveis contaminantes, uma vez que são utilizados antigénios alvo altamente específicos.
3. Biochip
Biochip contém o bouquet de antigénios (descritos no ponto 1, e representado pela figura 1 do caderno de desenhos) em câmaras microfluídicas, e foi construído da seguinte forma:
a) no Biochip todas as funções são integradas sem conexões externas (reservatórios de entrada, válvulas misturadoras, área de deteção e bombas de fluidos);
b) o Biochip (representado na figura 2 do caderno de desenhos) possui as propriedades desejadas de suavidade da parede e humidade da estrutura de canais de microfluidos e uma elevada relação de aspeto para permitir forças capilares fortes.
c) possui estruturas denominadas bombas capilares que permitem o transporte da amostra e dos reagentes até à câmara de deteção. Esta estrutura tem uma taxa de fluxo na ordem dos 0,4 pL/min, permitindo um tempo de teste inferior a 20 minutos, e é capaz de bombear todo o volume de teste da amostra através da câmara de deteção.
d) possui uma câmara de deteção, na qual as imunoglobulinas, do soro humano, contra os antigénios de Borrelia são capturadas pelos antigénios imobilizados, com uma capacidade de imobilização superior a 1000 moléculas de proteína. As câmaras são desenhadas para serem compatíveis com um Leitor de quimio-luminescência específico e incluem as estruturas requeridas de direcionamento de ondas.
e) a abordagem da produção de um novo Biochip de baixo custo, altamente reprodutível e confiável.
f) Procedimentos para a imobilização dos antigénios na câmara de deteção e o revestimento de qDots com anticorpos contra soros humanos, para serem incorporados como reagentes para dentro do chip. A qualidade do revestimento da superfície da câmara, e os qDots foram avaliados utilizando técnicas do estado-da-arte.
g) integração de bombas e de válvulas no Biochip com baixo custo, uma vez que não são necessários atuadores externos. Este é um projeto muito simples, que compreende o bombeamento, válvulas, canais microfluidicos (cuja altura está demonstrada na figura 3 presente no caderno de desenhos), e reservatórios.
h) uma arquitetura aberta do design do Biochip, que pode ser adaptado para outras aplicações e doenças.
4. Interpretação dos resultados do Bioahip
Inicialmente recolhe-se uma amostra do paciente, que está possivelmente infetado com a doença de Lyme. Esta amostra pode ser fluidica (urina, sangue total, soro, plasma, fluido cérebroespinal, suor, saliva) ou tecidular (Usados de tecidos) . Adiciona-se 3 pL da solução filtrada e diluída (1/200) da amostra em 0,1% de Tween 20/PBS e deixa-se na entrada apropriada do Biochip durante 9 minutos. Seguidamente remove-se o excesso de amostra e lava-se a respetiva entrada com 3 pL de uma solução filtrada de 0,1% de Tween 20/PBS. Volta-se a remover o excesso da solução anterior e adiciona-se 3 pL de uma solução de 1/10 de fqDot525, e de 1/100 fqDot625 e deixa-se na referida entrada durante 9 minutos. Novamente, remove-se o excesso da solução anterior e volta-se a fazer uma lavagem com 3 pL de uma solução de 0,1% de Tween 20/PBS. Após realizado este procedimento o Biochip está pronto para ser lido num Leitor de quimio-luminescência apropriado.
Os qDots referidos acima são fundamentais, pois são agentes reveladores que permitirão a identificação da ligação entre o primeiro agente de ligação da reação (um dos 16 antigénios fixados no Biochip) com o analito (amostra) e por sua vez com o segundo agente de ligação da reação (anticorpo IgG ou IgM). Se houver a ligação entre o primeiro agente de ligação de reação, o analito e o segundo agente de ligação da reação quando o Bichip for lido no Leitor de quimio-luminescência apropriado irá ser emitida fluorescência, indicando que os teste foi positivo para a doença de Lyme e o paciente está infetado com a bactéria Borrelia. Se não houver esta ligação, significa que a amostra do paciente não possui anticorpos contra a bactéria Borrelia burgdorferi f.l. e o paciente não se encontra infetado com a doença de Lyme.
5. Quantum Dots, agentes reveladores
QuantumDots (qDots) ou nanocristais são um grupo distinto de compostos fluorescentes que diferem dos fluoróforos convencionais na medida em que têm caracteristicas espectrais únicas. Os seus núcleos de metais pesados são responsáveis por essas caracteristicas espectrais originais e são compostos por material semicondutor, seleneto de cádmio (CdSe) ou fosfeto de índio e gálio (InGaP). Os núcleos possuem normalmente propriedades tecnológicas de revestimento que permite a sua conjugação com várias biomoléculas, incluindo anticorpos, proteínas e péptidos. Este revestimento é também um polímero anfifílico, que proporciona uma superfície solúvel em água que pode modificar a conjugação com outras biomoléculas, tais como anticorpos e proteínas. Estes nanocristais são ajustáveis em tamanho (2-50 nm) , normalmente de 10-20 nm, possuem forma esférica, é esta forma esférica que permite que os qDots sejam ajustados para um comprimento de onda de emissão específico. Os qDots são intrinsecamente brilhantes, têm espectros de emissão muito estreitos, têm foto-estabilidade excecional, são fáceis de usar, e podem ser usados numa infinidade de aplicações. O uso destes nanocristais em aplicações biomédicas está apenas a emergir e a ganhar popularidade. Devido às suas caracteristicas espectrais fundamentais os qDots têm alto desempenho numa variedade de aplicações, tais como citometria de fluxo, imuno-histoquimica ou no nosso caso, como moléculas de detecção para os soros humanos.
No caso desta invenção, foram escolhidos os qDots 525 e os qDots 625. O número à frente de qDots corresponde ao pico de emissão do referido qDot, no nosso casso os qDots escolhidos para esta invenção irão ter picos de emissão a 525 nm (qDots 525) e 625 nm (qDots 625) . Ambos os qDots serão conjugados com os nossos segundos agentes de ligação (IgG ou IgM) formando o complexo segundo agente de ligaçãoqDot. Este complexo por sua vez ir-se-á ligar ao complexo primeiro agente de ligação-analito (soro humano), no caso do soro possuir anticorpos contra Borrelia burgdorferi f.l.. Se o complexo primeiro agente de ligação-analitosegundo agente de ligação-qDot quando o Biochip for colocado no Leitor de quimio-luminescência os qDots serão excitados ao comprimento de onda referido acima, e transmitirão fluorescência, acusando um diagnóstico positivo para a doença de Lyme.
Bibliografia
1. Lyme borreliosis in Europe: influences of climate and climate change, epidemiology, ecology and adaptation measures. Elisabet Lindgren and Thomas G.T. Jaenson. World Health Organization Regional Office for Europe 2006
2. Irwin T. Vanderhoof, PhD, CLU et al. (1993) Lyme Disease: The cost to society. Contingencies, Jan./Feb., p. 42-48
3. The emergence of Lyme Disease. Steere et al., The Journal of Clinicai Investigation, 2004.
4. Wilske, Bettina(2005)'Epidemiology and diagnosis of Lyme borreliosis', Annals of Medicine.
5. http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/lyme/ld_humandisease_d iagnosis.html

Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Sistema para detetar e monitorizar a presença de anticorpos associados a diferentes estágios da doença de Lyme, presentes em amostras biológicas, compreendendo
    - um bouquet de antigénios;
    - um biochip;
    - um leitor ótico de biochip; e caracterizado pelo facto de os anticorpos presentes nas amostras biológicas serem detetados especificamente para autoimunidade e coinfecção aguda, crónica, relacionada com a doença de Lyme, o bouquet de antigénios compreendendo dezasseis antigénios, em particular IgG e IgM, lisados celulares de E. coli, OspC, OspA, DbpA e Arp, OspEl/2, LFA1, Arp, péptidos de Babesia microti e Ehrlichia, espiroquetas de Borrelia burgdorferi B31, cistos de Borrelia burgdorferi B31, Borrelia gariníi e Borrelia azfelii;
    e em que o referido biochip compreende um primeiro reservatório (1) adequado para conter amostras biológicas, um segundo reservatório (2) para o tampão de lavagem, um terceiro reservatório (3) para os quantum dots, uma área de deteção e campo de visão (4) compreendendo válvulas, câmaras de reação e câmaras de análise em que as câmaras de reação e análise apresentam revestimentos de antigénios, com pelo menos uma primeira bomba (5), uma segunda bomba (6) e nove canais microfluidicos (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14 e 15).
  2. 2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as amostras biológicas serem soro ou fluído cerebrospinal.
  3. 3. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tampão de lavagem ser solução 0,1% Tween 20/PBS.
  4. 4. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os quantum dots fluorescerem entre 400 e 900 nm, preferencialmente entre 500 e 700 nm, e mais preferencialmente a 525 nm e 625 nm, e serem conjugados com anticorpos anti-IgG ou anti-IgM humanos.
  5. 5. Sistema de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a área de trabalho e campo de visão (42) do biochip medir até 1 mm de comprimento e até 1 mm de largura, preferencialmente 350 pm de largura, e compreender pelo menos dezasseis câmaras de reação e análise.
  6. 6. Sistema de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por cada câmara de reação e análise compreendida na área de deteção e campo de visão (42) ter até 50 pm de comprimento, até 50 pm de largura e até 15 pm de profundidade.
  7. 7. Sistema de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o biochip compreender bombas fluidicas capilares (43) e (44) com uma taxa de fluxo de pelo menos 0,2 pL/minuto, preferencialmente com uma taxa de fluxo de 0,4 pL/minuto.
  8. 8. Sistema de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o leitor ótico do biochip compreender um detetor de fluorescência contendo uma estrutura interna que compreende uma fonte de luz, de preferência LED, uma câmara, um tubo de lente, sistema de iluminação Kõhler, um sistema de foco automático, uma estrutura mecânica e um posicionador de objetivo fixo.
  9. 9. Sistema de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o leitor ótico do biochip conter ainda uma estrutura intermediária que compreende proteções leves, uma estrutura de alojamento, um painel de encaixe, um reforçador, um compartimento de computador e uma estrutura externa que compreende o invólucro principal, um ecrã tátil, orifícios de ventilação e uma porta de acesso, onde o detetor de fluorescência é desenhado especificamente para usar marcadores fluorescentes de quantum dot e é especificamente adaptado para ser acoplado opticamente e alinhado com um sistema de inserção e remoção de biochip através de um sistema de fixação e o sistema de foco automático possui um campo de visão de deteção de até 1 mm de comprimento, preferencialmente 480 pm, e até 1 mm de largura, de preferência 480 pm, e que o campo de visão de deteção compreende o campo de deteção do biochip (4) com tolerância de cerca de 65 pm no eixo X e Y para precisão de posicionamento.
  10. 10. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o sistema de fixação do leitor ótico do biochip compreender três pontos de contacto de referência com travões mecânicos (16) com posição ajustável e dois impulsores (34) que empurram o biochip contra esses travões, em que, além dos grampos X, Y, dois grampos elásticos mantêm o biochip em posição ao longo do eixo Z e as molas de retorno (17) puxam os impulsores para trás para permitir a inserção e remoção do biochip.
  11. 11. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto o sistema de inserção e remoção do leitor ótico do biochip compreender uma peça de material de aço inoxidável magnético e um mecanismo de direcionamento com dois carrinhos de direcionamento (18) por carril, onde na posição fechada a gaveta é bloqueada por um eletroíman (19) em que o contacto entre a gaveta e o eletroíman garante um alinhamento perfeito do eixo X entre o detetor e o biochip, mantendo o detetor isolado da luz e, na posição aberta, a gaveta é bloqueada com dois imanes permanentes (20) para mantê-lo em posição durante o carregamento do biochip.
  12. 12. Método de utilização do sistema para detetar e monitorizar a presença de anticorpos associados a doença de Lyme, em amostras biológicas, definido nas reivindicações 1 a 11, caracterizado pelos seguintes passos:
    a) execução de um algoritmo no leitor ótico;
    b) adição de 3 μΐ de uma solução filtrada e diluída (1:200) da amostra biológica em 0,1% Tween 20/PBS durante até 9 minutos à câmara respetiva;
    c) lavagem com 3 μΐ da solução filtrada de 0,1% de Tween 20/PBS;
    d) adição de 3 μΐ de uma solução diluída (1:10) de quantum dot 525 e uma solução diluída (1:100) de quantum dot 625 por até 9 minutos;
    e) uma segunda lavagem com 3 μΐ da solução filtrada de 0,1% de Tween 20/PBS;
    f) inserção do biochip na gaveta do leitor ótico;
    g) inserção de informação disponível da interface web; e
    h) pressionar o botão de início;
    i) em que o dispositivo coloca o biochip num sistema de foco automático durante até 2 minutos, opcionalmente aguarda pelo fim da migração, realiza a análise de imagem durante até 2 minutos, armazena e exibe os resultados na página web em até 5 segundos.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por as amostras biológicas serem preferencialmente soro ou fluído cerebrospinal.
  14. 14. Método de utilização do sistema definido nas reivindicações 1 a 11, de acordo com as reivindicações 12 a 13, caracterizado pelo facto de o biochip ser inserido e removido através de um sistema de fixação que compreende três pontos de contacto de referência com travões mecânicos (16) de posição ajustável e dois impulsores (34), que empurram o biochip contra os travões em que, adicionalmente aos grampos X e Y, dois grampos elásticos sustentam o biochip em posição ao longo do eixo Z e as molas de retorno (35) puxam os impulsores para trás para permitir a inserção e remoção do biochip.
  15. 15. Método de utilização do sistema definido nas reivindicações 1 a 11, de acordo com as reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo facto de o sistema de fixação ser parte de um sistema de gaveta compreendendo uma peça de material de aço inoxidável magnético e um mecanismo de guia com dois carrinhos de direcionamento (18) por carril, onde a posição fechada da gaveta é bloqueada por um eletroíman (19), e o contacto entre a gaveta e o eletroíman garante um alinhamento perfeito do eixo X entre o detetor de fluorescência e o biochip, mantendo o detetor de fluorescência isolado da luz e, na posição aberta, a gaveta é bloqueada com dois imanes permanentes (20) para mantê-lo em posição durante o carregamento do biochip.
  16. 16. Método de utilização do sistema definido nas reivindicações 1 a 11, de acordo com as reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo facto de o sistema de foco automático compreender um suporte de translação do eixo Z com uma mesa guiada por rolamento de esferas motorizada por um servo motor DC escovado e opera através três etapas:
    a) varre uma grande gama de distâncias entre o biochip e a objetiva, na ordem de lmm, com grandes etapas de movimento na ordem de 50pm, entre cada captura de imagem, em que o movimento do eixo Z é contínuo e as imagens são tiradas em tempo real e a distância em que a imagem é a mais nítida é registada;
    b) digitaliza com precisão, com pequenos movimentos da ordem de alguns micrómetros, preferencialmente entre 5 e 50pm, o intervalo de distância determinado pelo primeiro passo para encontrar a distância de foco, o eixo Z se move e, em seguida, uma imagem é adquirida quando o eixo Z é parado e, assim que toda a segunda etapa do varrimento é varrida, o eixo Z volta à posição correspondente à imagem mais nítida; e
    c) desce o eixo Z por uma distância correspondente à profundidade dos canais microfluídicos do biochip, preferencialmente entre 15 e 20 pm e desce o eixo Z em até 10 pm para compensar a diferença ótica entre o filtro de campo brilhante e os filtros de fluorescência.
  17. 17. Método de utilização do sistema definido nas reivindicações 1 a 11, de acordo com as reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo facto de o algoritmo extrair a localização exata das diferentes câmaras de reação na imagem nítida recolhida e produzir um relatório, compreendendo:
    a) reduzir para uma imagem de menor resolução;
    b) transformação da imagem do domínio temporal para domínio de frequência, usando a transformada de Fourier;
    c) correlação da imagem de frequência com a mesma através da auto-correlação;
    d) inversão da transformada de Fourier da imagem autocor relacionada;
    e) mapeamento da imagem de Fourier inversa no domínio de pixel;
    f) cálculo da média e desvio padrão das intensidades de pixel da imagem original de menor resolução;
    g) cálculo do fator de correlação entre a imagem original, como média e desvio padrão, e pixels da imagem de Fourier inversa;
    h) cálculo da pontuação com base no fator de correlação mínimo da etapa anterior;
    i) procura do campo de visão, sua posição e orientação através da correspondência de padrões, em que os padrões são criados desenhando cerca de 16 regiões de interesse alinhadas com o padrão, sendo essas cerca de 16 regiões correspondentes às áreas em que os dados são usados para fornecer resultados dos testes de diagnóstico; e
    j) o algoritmo de correspondência de padrões ser usado com o padrão armazenado na etapa anterior;
    em que o novo algoritmo de análise de imagem funciona em 4 etapas consecutivas, ou seja, determinação do melhor tempo de exposição da câmara, determinação de resíduos e sua remoção, determinação da fluorescência de fundo e análise de câmaras de reação sem resíduos e fluorescência de fundo.
  18. 18. Método de utilização do sistema definido nas reivindicações 1 a 11, de acordo com as reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo facto de compreender a execução de um algoritmo customizado no leitor ótico e:
    a) adição de 3 μΐ de uma solução filtrada e diluída (1:200) da amostra biológica em 0,1% Tween 20/PBS durante até 9 minutos à câmara respetiva;
    b) lavagem com 3 μΐ da solução filtrada de 0,1% de Tween 20/PBS;
    c) adição de 3 μΐ de uma solução diluída (1:10) de quantum dot 525 e uma solução diluída (1:100) de quantum dot 625 durante até 9 minutos;
    d) uma segunda lavagem com 3 μΐ da solução filtrada de 0,1% de Tween 20/PBS;
    e) inserção do biochip na gaveta do leitor ótico;
    f) inserção de informação disponível da interface web; e
    g) pressionar o botão de início;
    h) em que o dispositivo coloca o biochip num sistema de foco automático durante até 2 minutos, opcionalmente aguarda pelo fim da migração, realiza a análise de imagem durante até 2 minutos, armazena e exibe os resultados na página web em até 5 segundos.
PT106942A 2013-05-15 2013-05-15 Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica PT106942B (pt)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PT106942A PT106942B (pt) 2013-05-15 2013-05-15 Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica
US14/891,616 US20160123978A1 (en) 2013-05-15 2014-05-13 Biochip, antigen bouquet, optical reader and method for detecting and monitoring diseases
PCT/PT2014/000030 WO2014185803A2 (en) 2013-05-15 2014-05-13 Biochip, antigen bouquet, optical reader and method for detecting and monitoring diseases
DK14736473.1T DK2997372T5 (da) 2013-05-15 2014-05-13 Biochip, antigenbuket, optisk læser og fremgangsmåde til detektering og overvågning af sygdomme
EP14736473.1A EP2997372B1 (en) 2013-05-15 2014-05-13 Biochip, antigen bouquet, optical reader and method for detecting and monitoring diseases

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PT106942A PT106942B (pt) 2013-05-15 2013-05-15 Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT106942A PT106942A (pt) 2014-11-17
PT106942B true PT106942B (pt) 2020-09-10

Family

ID=51136743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT106942A PT106942B (pt) 2013-05-15 2013-05-15 Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20160123978A1 (pt)
EP (1) EP2997372B1 (pt)
DK (1) DK2997372T5 (pt)
PT (1) PT106942B (pt)
WO (1) WO2014185803A2 (pt)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108474028A (zh) * 2015-11-16 2018-08-31 雷瑞生物传感器有限责任公司 鉴别并区分遗传样品的系统及方法
WO2017100598A1 (en) * 2015-12-10 2017-06-15 Immport Therapeutics, Inc. Babesia biomarkers for diagnostic and screening in vitro diagnostic test
EP3252470B1 (en) 2016-06-03 2020-07-29 Te?ted Oy A method and a solid support for detecting tick-borne microbes in a biological sample
CN105974237A (zh) * 2016-06-16 2016-09-28 昆山金箭机械设备有限公司 液晶屏幕检测设备的测试机构
US11939638B2 (en) 2017-05-09 2024-03-26 Revere Biosensors, Llc Systems and methods for identifying and distinguishing genetic samples
KR101993305B1 (ko) * 2017-06-01 2019-06-26 주식회사 스몰머신즈 유체 분석용 마이크로 칩
WO2020036869A1 (en) 2018-08-16 2020-02-20 Emd Millipore Corporation Closed bioprocessing device
GB201918912D0 (en) * 2019-12-19 2020-02-05 Vidya Holdings Ltd Improved measurement of an assay
US12364744B2 (en) 2020-11-25 2025-07-22 Lankenau Institute For Medical Research Methods and compositions for the diagnosis, prophylaxis and treatment of Lyme disease
CN116823607B (zh) * 2023-06-25 2024-10-01 青岛百创智能制造技术有限公司 扫描图像处理方法、装置及设备
US20250067736A1 (en) * 2023-08-25 2025-02-27 Focus on Lyme Foundation Multi-antigen diagnostic for detecting lyme disease
CN118735860B (zh) * 2024-06-06 2025-07-11 南宁市基诺生物技术有限公司 基于人工智能的蛋白芯片检测分析方法及系统
CN119555937B (zh) * 2025-01-26 2025-05-20 杭州奥泰生物技术股份有限公司 一种犬虫媒病五联抗体检测卡及其制备方法和试剂盒

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3783826B2 (ja) 2000-01-17 2006-06-07 横河電機株式会社 バイオチップ読み取り装置
US7390626B2 (en) * 2005-02-25 2008-06-24 Immunosciences Lab., Inc. Methods and kit for diagnosing tick borne illnesses
US20070074972A1 (en) * 2005-09-13 2007-04-05 Fluidigm Corporation Microfluidic assay devices and methods
US9056291B2 (en) * 2005-11-30 2015-06-16 Micronics, Inc. Microfluidic reactor system
WO2012047607A2 (en) 2010-09-27 2012-04-12 Cornell University Methods for diagnosing lyme disease
US20120142023A1 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Ascoli Carl A Proteins and method for detection of lyme disease

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DU W ET AL: "Antigen biochips verify and extend the scope of antibody detection in Lyme borreliosis", DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASE, 1 January 0059 (0059-01-01) *
REVEL A ET AL: "DNA microarray analysis of differential gene expression in Borrelia burgdorferi", THE LYME DISEASE SPIROCHETE, PNAS, 99, Nº3, 5 February 2002 (2002-02-05) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2997372A2 (en) 2016-03-23
US20160123978A1 (en) 2016-05-05
DK2997372T3 (da) 2019-09-23
DK2997372T5 (da) 2019-10-14
EP2997372B1 (en) 2019-06-19
WO2014185803A3 (en) 2015-02-26
WO2014185803A2 (en) 2014-11-20
PT106942A (pt) 2014-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT106942B (pt) Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica
US20130034863A1 (en) Apparatus and Methods for Detecting Inflammation Using Quantum Dots
Joshi et al. Immunofluorescence
JP2019168471A (ja) サンプルを代表する光を検出すること及び利用すること
US11796542B2 (en) Rapid test for the detecting pathogens and cells and method
JP4786656B2 (ja) シデロホアおよび関連組成物を使用する標的分子検出の方法
US9506921B2 (en) Method for determining exposure to mycobacteria
US20110008798A1 (en) Lipid insertion for antigen capture and presentation and use as a sensor platform
Walzer Diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia
WO2005116234A2 (en) Detection and quantification of intracellular pathogens
US11204351B2 (en) Compositions and methods for identifying Ehrlichia species
Perego et al. A Compact Prism‐Based Microscope for Highly Sensitive Measurements in Fluid Biopsy
US20230221319A1 (en) A Method, A System, An Article, A Kit And Use Thereof For Biomolecule, Bioorganelle, Bioparticle, Cell And Microorganism Detection
Triantafilou et al. Visualising PAMP–PRR interactions using nanoscale imaging
Asai Immunofluorescence microscopy
JP7373286B2 (ja) 被検物質の情報の取得方法及び被検物質の捕捉方法
US20120202189A1 (en) Rapid, semi-automated method to detect respiratory virus infected cells in direct specimens
RU2247383C2 (ru) Способ серологической диагностики хламидийных конъюнктивитов
CN107192823B (zh) 一种b族链球菌酶联免疫检测试剂盒
Heggestad A “Zero-Background” Multiplexed, Point-Of-Care Testing Platform for Disease Diagnosis, Management, and Surveillance
BR102020021516A2 (pt) Peptídeo sintético, método imunodiagnóstico para diferenciação de infecções por plasmodium vivax de infecções por plasmodium falciparum, e uso
WO2024102748A1 (en) Methods, diagnostic instruments, and kits for detecting diseases
Prior et al. Serological diagnosis of Leptospirosis in bovine serum samples using a microsphere immunoassay
Kim A Novel Approach for Detection of Several Tuberculosis Markers Using Diffractive Optics
UA9395U (en) Diagnostics method for detecting latent syphilis

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Laying open of patent application

Effective date: 20131011

FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 20200907