JP2021073465A - 被分析物の抽出、濃縮及び検出を一体化するためのデバイス - Google Patents

被分析物の抽出、濃縮及び検出を一体化するためのデバイス Download PDF

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Abstract

【課題】被分析物の抽出、濃縮及び検出を一体化するためのデバイスを提供する。【解決手段】水性二相系及びラテラルフローアッセイを用いて、試料中の目的とする被分析物を検出するデバイス並びに方法が開示される。これらのデバイス及び方法は、血液若しくは血清などの生物学的試料中の疾患または疾病を診断するために用いることができる。また、これらのデバイス及び方法は、食品試料中のアレルゲンまたは環境中の毒素などの、水中の汚染物質を検出するために用いることができる。デバイス及びキットの構成要素を利便性よく携帯型の容器中で組み立てることができ、これらは殆どの環境における作動に適する。本デバイスは使用が簡単であり、訓練を受けていない操作者が単にデバイスに試料を添加することを必要とする。利便性がよいことには、目的とする被分析物を検出するための時間は非常に短い。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月７日出願の米国仮出願第６１／９４９，８８７号及び２０１４年３月１６日出願の米国仮出願第６１／９５３，８７０日号の優先権を主張し、該出願は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
一方では物質及び材料、他方では疾患及び疾病を始めとして、未知なるものの同定は種々の多くの工業にとって最優先の重要性をもつ。酵素及び抗体が、医療診断、食品試験、及び環境汚染（例えば、毒素、病原体）を始めとする、但しそれらに限定されない、多種多様な状況において使用される。
本明細書においては、医療用、民生用、及びその他の用途向けの有用なツールとしての、方法、デバイス、キット、及びポイントオブケア（ＰＯＣ）または使用現場で行われる試験を含むシステムが記載される。ある特定の用途におけるポイントオブケアまたは使用現場の場所としては、医療施設、移動診療所、職場、工場、農場及び家庭を挙げることができる。本明細書に記載の主題は、限定されない例として、大気汚染物質、毒素、食品及び医薬中の成分の同定並びに工業、軍事、及び宇宙関連用途を始めとする、種々の他の用途にも有用である。多くの他の態様がある中でも、本明細書においては、使用が迅速、簡単且つ容易である試験が提供される。上記試験は、受けていたとしても多少の臨床診断の訓練を受けた個人によって実施され得る。本明細書においては、コスト効率及び時間効率の高い形態で試験結果を得る方法も記載される。これらの試験は、特に少量の生体分子に対して信頼性があり且つ高感度である必要がある。更に、本明細書に記載の試験は、多くの異なる環境、例えば、温度及び／または湿度が大きく変動する環境に対応可能である。このように、本明細書に記載のポイントオブケアまたは使用現場向けのデバイスは、最小量の機器だけを必要とすることができ、且つ多種多様な環境条件で安定している。
本明細書においては、目的とする被分析物の検出のためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）技術及び水性多相系を含むデバイス及び方法も開示される。ある特定の実施形態において、これらのデバイス及び方法は、水性多相系の濃縮性能をＬＦＡとの併用で利用して、以前のＬＦＡアッセイの検出限界に対して、少なくとも約１００倍〜約１０００倍の向上を与え、これは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの実験室におけるアッセイの感度に近づくまたは匹敵する、またある場合にはこれを凌駕する。
概括的には、ある特定の用途において、目的とする被分析物を含有する対象の試料を水性二相系（ＡＴＰＳ）に印加する。本明細書に記載のように、ＡＴＰＳの単一相または界面から目的とする被分析物を濃縮及び抽出し、その後目的とする被分析物をＬＦＡ上で検出するための方法及びデバイスが開発され、ここでは該被分析物の存在を検出及び／または定量することができる。あるいはまたはそれに加えて、上記目的とする被分析物を、一体化したＡＴＰＳ−ＬＦＡシステム上で濃縮並びに検出及び／または定量することができる。従って、ＡＴＰＳを下流のＬＦＡ検出と継ぎ目なく一体化することによって、抽出を迂回することができる。本明細書に記載のある特定の用途においては、これらのデバイスでは、ユーザーは対象とする試料を添加するだけでよい。種々の実施形態において、これらのデバイスを用いて、血清、唾液、尿、血液または綿棒試料などの生物学的試料中の目的とする被分析物を検出することができる。
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるデバイスは、利便性よく組み立てられて携帯型診断デバイスを形成する。本明細書に記載の様々なデバイス及び方法は、堅牢であり、汎用性が高く、拡張可能であり、安価であり、高感度であり、簡単且つ正確であり、最小限の訓練、動力、及び機器しか必要としないことが判る。なお、以下の説明は概括的には水性二相系（ＡＴＰＳ）に関するものであるが、三相または四相系、及び更により多相の系も同様に実施することができることに留意されたい。
これらの概念が如何にして機能するかを例示するために、これらの技術の実施例が本明細書に記載される。これらの実施例は例示のためのものであり、非限定的であることが意図される。本明細書において提供される教示を用いて、ＡＴＰＳ及びラテラルフロー検知を一体化した多数の他のシステムを容易に実現することができる。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示することのみを目的とすること、並びにこれらの実施例及び実施形態を考慮した種々の修正及び変更が当業者に対して示唆されることとなり、該修正及び変更は本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に包含されるべきものであることが理解される。本明細書において引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本明細書によって、全ての目的のために、参照によりそれらの全体が援用される。
本明細書に記載の方法、デバイス、キット、及びシステムを含む本明細書に記載の主題の一つの態様は、試料中の目的とする被分析物の検出及び／または定量のためのデバイスであって、該デバイスは、（ａ）ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）と、（ｂ）水性二相系（ＡＴＰＳ）とを備える。ある特定の用途において、上記ＡＴＰＳは、第１の相溶液及び第２の相溶液中に分配される混合相溶液を含む。いくつかの実施形態において、上記混合相の第１の相溶液及び第２の相溶液中への上記分配は、上記ＬＦＡ内で起こる。ある特定の実施形態において、混合相の第１の相溶液及び第２の相溶液中への分配は、ＬＦＡ内で起こらない。ある特定の用途において、目的とする被分析物は混合相溶液と接触し、第１の相溶液または第２の相溶液が分離するとき／その後に、目的とする被分析物は第１の相溶液または第２の相溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は混合相溶液と接触し、第１の相溶液または第２の相溶液が分離するとき／その後に、目的とする被分析物が第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は分配時に濃縮される。
ある特定の実施形態において、第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液はポリマーを含む。ある特定の実施形態において、第１の相溶液はポリマーを含み、第２の相溶液はミセル溶液を含む。ある特定の用途において、第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液は塩を含む。ある特定の用途において、第１の相溶液は塩を含み、第２の相溶液はミセル溶液を含む。いくつかの実施形態において、上記ミセル溶液は非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、上記非イオン性界面活性剤は、セトマクロゴール、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミド、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ、イソセテス、ラウリルグルコシド、モノラウリン、ノニデット、ノノキシノール、ＮＰ−４０、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ポロキサマー、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリソルベート、ポリグリセロール、ソルビタン、ステアリルアルコール、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、及びＴｗｅｅｎからなる群より選択される。ある特定の用途において、ミセル溶液はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液である。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００溶液及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１１４溶液から選択される。
いくつかの実施形態において、第１の相溶液は第１のポリマーを含み、第２の相溶液は第２のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、第１／第２のポリマーは、ポリエチレングリコール及びデキストランから選択される。いくつかの実施形態において、第１の相溶液はポリマーを含み、第２の相溶液は塩を含む。いくつかの実施形態において、第１の相溶液は塩を含み、第２の相溶液はポリマーを含む。いくつかの実施形態において、第１の相溶液はポリエチレングリコールを含み、第２の相溶液はリン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態において第１の相溶液はリン酸カリウムを含み、第２の相溶液はポリエチレングリコールを含む。ある特定の実施形態において、本明細書に記載のように、第１の相溶液は表１の構成成分１から選択され、第２の相溶液は表１の構成成分２から選択される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載のように、第２の相溶液は表１の構成成分１から選択され、第１の相溶液は表１の構成成分２から選択される。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は、タンパク質、抗原、生体分子、糖部分、脂質、核酸、ステロール、及びそれらの組み合わせから選択される。ある特定の用途において、目的とする被分析物は、植物、動物、ウィルス、真菌、原生動物、及び細菌からなる群より選択される生物に由来する。一実施形態において、本デバイスは、目的とする被分析物と相互作用するプローブを更に備える。
本明細書に記載の方法、デバイス、キット、及びシステムの別の態様は、少なくとも１種の目的とする被分析物、若しくは少なくとも２種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも３種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも４種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも５種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも７種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも１０種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも１５種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも２０種の異なる目的とする被分析物、またはそれを超える数の目的とする被分析物と相互作用する１種または複数種のプローブを備えるＬＦＡデバイスである。いくつかの実施形態において、少なくとも２種の異なるプローブ、または少なくとも３種の異なるプローブ、または少なくとも４種の異なるプローブ、または少なくとも５種の異なるプローブ、または少なくとも７種の異なるプローブ、または少なくとも１０種の異なるプローブ、または少なくとも１５種の異なるプローブ、または少なくとも２０種の異なるプローブが本明細書に記載される。ある特定の実施形態において、本明細書においては、合成ポリマー、金属、鉱物、ガラス、石英、セラミック、生物学的ポリマー、プラスチック、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含むプローブが提供される。ある特定の実施形態において、本明細書においては、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン（デルリン（登録商標））、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、ポリ塩化ビニル、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーを含むプローブが提供される。いくつかの実施形態において、上記ポリプロピレンはポリプロピレングリコールである。いくつかの実施形態において、上記ポリエチレンはポリエチレングリコールである。ある特定の実施形態において、デキストラン及びポリエチレングリコール、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される生物学的ポリマーを含むプローブが提供される。ある特定の実施形態において、金属（例えば、金、銀、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、白金、及び／またはそれらの合金からなる群より選択される金属）を含むプローブが提供される。
本明細書に記載の方法、デバイス、キット、及びシステムの特定の態様において、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）を含むプローブが提供される。ある特定の実施形態において、上記プローブはコーティングを含む。種々の実施形態において、上記コーティングは、ポリエチレングリコール若しくは他のポリマー（例えば、ポリプロピレングリコール）、またはグラフトコポリマー、例えば、ポリ（Ｌ−リジン）−グラフト−デキストラン（ＰＬＬ−ｇ−ｄｅｘ、ポリ（Ｌ−リジン）骨格上にデキストラン側鎖を有するグラフトコポリマー等）を含むことができる。一つの例示的な、但し非限定的な実施形態において、コーティングはデキストランを含む。別の実施形態において、コーティングは親水性タンパク質を含む。ある特定の用途において、コーティングは血清アルブミンを含む。ある特定の実施形態において、コーティングは第１の相溶液または第２の相溶液に対する親和性を有する。ある特定の実施形態において、上記プローブは、目的とする被分析物に結合する結合部分を含む。ある特定の実施形態において、上記結合部分は、抗体、レクチン、タンパク質、糖タンパク質、核酸、低分子、ポリマー、及び脂質、並びに／またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。一実施形態において、結合部分は抗体または抗体フラグメントである。ある特定の実施形態において、上記プローブは磁性粒子を含む。ある特定の実施形態において、本方法、デバイス、キット、及びシステムは磁石を備える。ある特定の実施形態において、上記磁石は、第１の相溶液または第２の相溶液中への目的とする被分析物の分配を促進する及び／または増加させるように構成される。一実施形態において、磁石は、ＬＦＡを通る目的とする被分析物の流動を促進する及び／または増加させるように構成される。ある特定の実施形態において、磁石は、本デバイスへの取り付け及び／または該デバイスからの取り外しが可能である。本明細書において提供される方法、デバイス、キット、及びシステムのある特定の用途において、ＡＴＰＳと接触して配置されるように構成される捕集器が提供され、ここで、該捕集器と第１の相溶液及び／または第２の相溶液との界面において、目的とする被分析物が分配される。いくつかの実施形態において、上記捕集器は、プラスチック、メソポーラス材料、シリカ、ポリマー（例えば、ポリプロピレン、ポリオキシメチレン（デルリン（登録商標））、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））等）、磁石、細孔を有する材料、溝を有する材料、及びそれらの任意の組み合わせから選択される材料を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法、デバイス、キット、及びシステムは、検出可能な標識を含むプローブを備える。いくつかの実施形態において、上記検出可能な標識は、発色標識、蛍光標識、酵素標識、発熱標識、放射性標識、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは多孔質マトリクスを備える。ある特定の用途において、上記多孔質マトリクスは、上記混合相溶液、第１の相溶液、第２の相溶液、及び／または目的とする被分析物がＬＦＡを通って流れることが可能なように十分に多孔質である。ある特定の実施形態において、本明細書においては、混合相溶液、第１の相溶液、第２の相溶液、及び／または目的とする被分析物が、ＬＦＡを通って垂直方向及び／または水平方向、並びにそれらの任意の組み合わせで流れるために、十分に長い及び／または深い多孔質マトリクスが提供される。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、キット、またはシステムであって、第１の相溶液が第１の速度で多孔質マトリクスを通って流れ、第２の相溶液が第２の速度で多孔質マトリクスを通って流れ、第１の速度と第２の速度が異なる、上記方法、デバイス、キット、またはシステムが提供される。ある特定の実施形態において、多孔質マトリクスは、セルロース、繊維ガラス、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷変性ナイロン、ポリエーテルスルホン、及びそれらの組み合わせから選択される材料を含む。いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物と相互作用する、目的とする被分析物の捕捉部分を含むＬＦＡが提供される。ある特定の実施形態において、競合アッセイを含むＬＦＡが提供される。ある特定の実施形態において、目的とする被分析物を含むＬＦＡが提供される。ある特定の実施形態において、サンドイッチアッセイを含むＬＦＡを利用する、方法、デバイス、キット及び／またはシステムが提供される。ある特定の実施形態において、ＬＦＡはプローブまたはその構成成分と相互作用するプローブ捕捉部分を含む。ある特定の実施形態において、混合相溶液が上記ＬＦＡストリップ上及び／または該ストリップ中で脱水され、試料を添加すると、該混合相溶液が第１の相溶液及び第２の相溶液中に分配される。
本明細書に記載の方法、デバイス、キット、及び／またはシステムのある特定の実施形態において、溶液を収容するために十分な体積を有するウェルを備えるＬＦＡが提供される。ある特定の用途において、上記溶液は、上記ＡＴＰＳの少なくとも一部、第１の相溶液の少なくとも一部、第２の相溶液の少なくとも一部、目的とする被分析物の再懸濁溶液、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。更なる、すなわち追加の実施形態において、角部、端部、中央部、接続部、中心を外れた部位、及び屈曲部から選択されるＬＦＡの位置に配置されたウェルを備えるＬＦＡが提供される。いくつかの実施形態において、上記ウェルは、フィルターパッド、緩衝剤パッド、界面活性剤パッド、塩パッド、プローブパッド、ポリマーパッド、及びそれらの組み合わせから選択される１種または複数種のパッドを備える。ある特定の実施形態において、ストリップを備えるＬＦＡが提供される。更なる、すなわち追加の実施形態において、図１６、２０及び６２〜７０に示す構造から選択される構造に従って構成されるストリップが提供される。更なる、すなわち追加の実施形態において、上記ストリップが複数の経路を備えるＬＦＡが提供される。ある特定の用途において、上記ＬＦＡは乾燥した受入れ紙を更に備える。いくつかの実施形態において、本デバイスは、ラニングバッファ（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を備える。いくつかの実施形態において、デバイスであって、本デバイスへの試料（例えば、生物学的試料）の投入のためのポートを備える上記デバイスが提供される。ある特定の用途において、ＡＴＰＳに接続されたポートが提供される。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳ及びＬＦＡが一体化され、ポートが該ＬＦＡに接続されたＬＦＡが提供される。ある特定の実施形態において、上記ポートは、管、ロート、弁、シリンジ、ストロー、流路、プランジャ、ピストン、重力供給、ポンプ、及びそれらの組み合わせから選択される構造体を備える。いくつかの実施形態において、本デバイスは動力源を必要としない。ある特定の実施形態において、ＡＴＰＳ及びＬＦＡは、当該デバイスの使用前に一体化される。一層更なる、すなわち追加の実施形態において、ＡＴＰＳ及びＬＦＡは、当該デバイスの使用前には分離されている。いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳにＬＦＡを挿入するように構成される。
特定の態様において、本明細書に記載の方法、デバイス、システム、及び／またはキットは、（ａ）ＡＴＰＳを収容するためのチャンバを備える第１の構成要素と、（ｂ）ＬＦＡを備える第２の構成要素とを備えるデバイスを備えるまたは利用する。この態様の一実施形態において、ＡＴＰＳ中に上記試料及び／若しくは目的とする被分析物、またはその両方を送達するアクチュエータを備えるデバイスが提供される。ある特定の実施形態において、ＬＦＡに溶液を送達するアクチュエータを更に備えるデバイスが提供される。ある特定の用途において、混合相溶液、第１の相溶液、及び第２の相溶液、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される溶液を含むＬＦＡが提供される。ある特定の実施形態において、ＡＴＰＳ及びＬＦＡは単一の筐体内に収容される。ある特定の用途において、携帯型ＬＦＡデバイスが提供される。
特定の態様において、試料中の目的とする被分析物を検出及び／または定量するための方法、デバイス、システム、及び／またはキットが提供され、該検出及び／または定量は、（ａ）本明細書に記載のデバイスに試料を印加すること、及び（ｂ）ＬＦＡ上で目的とする被分析物の有無を検出することを含む。ある特定の実施形態において、本方法は、ＡＴＰＳに試料を印加することを含む。ある特定の用途において、本方法は、ＬＦＡとＡＴＰＳとが一体化されているＬＦＡに試料を印加することを含む。ある特定の実施形態において、本方法は、ＡＴＰＳ中の目的とする被分析物を濃縮することを含む。一実施形態において、本方法は、ＬＦＡ中で目的とする被分析物を濃縮することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、生物学的有機体（例えば、植物、動物、藻類、真菌類等）由来の組織／流体、食品試料、化学試料、薬物試料、環境上の試料（例えば、水試料、土壌試料等）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１種または複数種の試料を利用する。いくつかの実施形態において、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、唾液試料、気管支肺胞洗浄液、鼻試料、糞便試料、創傷または手術部位由来の試料、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される試料が提供される。ある特定の実施形態において、目的とする被分析物は、生物学的分子を含む。ある特定の実施形態において、上記生物学的分子は、核酸、タンパク質、脂質、低分子、糖、抗体、抗原、酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。ある特定の実施形態において、試料は、脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類等）、細菌、ウィルス、原生動物、藻類、真菌類、原生動物、薬物、病原体、毒素、環境汚染物質、及びそれらの構成成分、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される供給源に由来する。
特定の態様において、試料中の目的とする被分析物の検出のためのペーパー流体デバイスを利用する、方法、デバイス、キット、及び／またはシステムが提供され、上記ペーパー流体デバイスは、水性二相系（ＡＴＰＳ）と組み合わせて用いられる。ある特定の実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳまたはその構成成分が中に配置された多孔質マトリクスを備え、該多孔質マトリクスは、ＡＴＰＳまたはその構成成分が流体相中にある場合に、該ＡＴＰＳまたはその構成成分が該多孔質マトリクスを通って流れることが可能なように構成され、且つそのように流れることが可能であるために十分な多孔性を有する。
ある特定の実施形態において、上記ペーパー流体デバイスは、上記ＡＴＰＳまたはその構成成分を含む。ある特定の実施形態において、ＡＴＰＳまたはその成分は、第１の相溶液、第２の相溶液、及び第１の相溶液と第２の相溶液との混合物を含む混合相溶液、及び／またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。ある特定の実施形態において、ＡＴＰＳ及び／またはその構成成分は、多孔質マトリクスの少なくとも第１の部分上及び／またはその中で脱水される。ある特定の用途において、多孔質マトリクスの第１の部分が、該多孔質マトリクスの第２の部分の幅と異なる幅を有する、ペーパー流体デバイス、方法、システム、及び／またはキットが提供される。更なる、すなわち追加の実施形態において、試料を利用してＡＴＰＳに加水し、それによって流体相中にあるＡＴＰＳまたはその構成成分を与えるペーパー流体デバイス、方法、システム及び／またはキットが提供される。いくつかの実施形態において、ペーパー流体デバイスは、混合相溶液、第１の相溶液、第２の相溶液、試料、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される内容物を収容するためのウェルを更に備える。ある特定の用途において、ペーパー流体デバイスは、ウェルの内容物を多孔質マトリクス中及び／または該マトリクス上に放出するためのアクチュエータを備える。ある特定の実施形態において、上記ウェルは、フィルターパッド、緩衝液パッド、界面活性剤パッド、塩パッド、プローブパッド、ポリマーパッド、及びそれらの組み合わせから選択される１種または複数種のパッドを備える。いくつかの実施形態において、第１の相溶液及び第２の相溶液は、異なる速度で多孔質マトリクスを通って流れる。一実施形態において、第１の相溶液及び第２の相溶液は、異なる方向に多孔質マトリクスを通って流れる。ある特定の実施形態において、第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液はポリマーを含む。更にある特定の実施形態において、第第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液は塩を含む。ある特定の用途において、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（または他の界面活性剤）ミセル溶液を含むペーパー流体デバイスが提供される。いくつかの実施形態において、第１の相溶液はポリマーを含み、第２の相溶液はポリマーを含む。ある特定の実施形態において、第１の相溶液はポリマーを含み、第２の相溶液は塩を含む。ある特定の実施形態において、第１の相溶液がポリエチレングリコールを含み、第２の相溶液がリン酸カリウムを含む、ペーパー流体組成物が提供される。
一態様において、第１の相溶液が表１の構成成分１から選択され、第２の相溶液が表１の構成成分２から選択されるペーパー流体デバイスを備える、デバイス、方法、システム及び／またはキットが提供される。ある特定の用途において、図１６、２０及び６２〜７０に示す構造に従って構成されるデバイス、方法、システム、及び／またはキットが提供される。ある特定の用途において、第１の経路及び第２の経路を備える多孔質マトリクスが提供される。
別の態様において、第１の相溶液が第１の経路を優先的に通って流れ、第２の相溶液が第２の経路を優先的に通って流れるペーパー流体デバイスを備えるまたは利用する、方法、デバイス、システム、及び／またはキットが提供される。いくつかの実施形態において、上記組成物／デバイスが、目的とする被分析物に結合して、プローブ−被分析物複合体を生成するプローブを含むペーパー流体デバイスが提供される。ある特定の実施形態において、使用中に、目的とする被分析物がプローブ−被分析物複合体中のプローブに結合している、ペーパー流体組成物が提供される。いくつかの実施形態において、磁性粒子を含むプローブが提供される。ある特定の実施形態において、本デバイスは、磁性粒子を多孔質マトリクスの一部に引き付けるように配向した磁場であって、該磁性粒子にかかる該磁場の力が、プローブ−被分析物複合体の多孔質マトリクスの一部に向かう流動を高める上記磁場を備え、及び／または本本法は該磁場を利用する。ある特定の実施形態において、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリオキシメチレン（デルリン（登録商標））、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、デキストラン、及びポリ塩化ビニル、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーを含むプローブが提供される。いくつかの実施形態において、上記ポリエチレンはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、上記ポリプロピレンはポリプロピレングリコールである。一実施形態において、コラーゲン、セルロース、及びキチンからなる群より選択される生物学的ポリマーを含むプローブが提供される。ある特定の用途において、上記プローブが、金、銀、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、白金、これらの合金、及び／またはそれらの組み合わせからなる群より選択される金属を含む、ペーパー流体デバイスが提供される。一実施形態において、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）を含むプローブが提供される。ある特定の用途において、プローブはコーティングを含む。ある特定の実施形態において、上記コーティングはポリエチレングリコールを含む。一実施形態において、コーティングはデキストランを含む。一実施形態において、コーティングはポリプロピレンを含む。一実施形態において、コーティングはポリプロピレングリコールを含む。ある特定の実施形態において、コーティングは親水性タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、コーティングは血清アルブミンを含む。ある特定の用途において、プローブが第１の相溶液または第２の相溶液に対する親和性をもつコーティングを有する、ペーパー流体組成物／デバイスが提供される。
本明細書に記載の方法、デバイス、システム、及び／またはキットの特定の態様において、上記目的とする被分析物に結合する結合部分を更に含むプローブを含むペーパー流体組成物／デバイスが提供される。いくつかの実施形態において、抗体、レクチン、タンパク質、糖タンパク質、核酸、低分子、ポリマー、脂質、及び／またはそれらの組み合わせからなる群より選択される結合部分を含むペーパー流体デバイスが提供される。ある特定の実施形態において、抗体または抗体フラグメントを含む結合部分を含むプローブが提供される。ある特定の実施形態において、検出可能な標識を含むプローブを備えるペーパー流体デバイスが提供される。一実施形態において、上記検出可能な標識は、発色標識、蛍光標識、酵素標識、発熱標識、放射性標識、及びそれらの組み合わせからからなる群より選択される。ある特定の用途において、乾燥した受入れ紙を更に備え、第１の相溶液または第２の相溶液が、優先的に、多孔質マトリクスを通って該乾燥した受入れ紙に向かって流れる、ペーパー流体組成物が提供される。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法、デバイス、システム、及び／またはキットは、使用中にラニングバッファを備え、第１の相溶液及び／または第２の相溶液が、該ラニングバッファと接触すると、多孔質マトリクスを通ってより速く流れる、ペーパー流体デバイス／組成物を備える。本明細書に記載の主題のある特定の用途において、セルロース、繊維ガラス、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷変性ナイロン、ポリエーテルスルホン、及び／またはそれらの組み合わせから選択される材料を含む多孔質マトリクスを備えるペーパー流体デバイスが提供される。一実施形態において、目的とする被分析物またはその構成成分と相互作用する、目的とする被分析物の捕捉部分を含む多孔質マトリクスを備える、ペーパー流体デバイスが提供される。一実施形態において、上記ペーパー流体デバイスは目的とする被分析物を更に含む。一実施形態において、多孔質マトリクスは、プローブまたはその構成成分と相互作用するプローブ捕捉部分を含む。ある特定の実施形態において、競合アッセイを含むか、またはこれを容易にするＬＦＡが提供される。ある特定の実施形態において、ＬＦＡはサンドイッチアッセイを含む。ある特定の実施形態において、多孔質マトリクスが、目的とする被分析物が当該多孔質マトリクス通って流れる際に、該目的とする被分析物を濃縮するように構成される、ペーパー流体組成物が提供される。ある特定の用途において、ペーパー流体デバイスは対照被分析物を含み、多孔質マトリクス上での該対照被分析物と目的とする被分析物との比較によって、目的とする被分析物の定量が行われる。
ある特定の態様において、試料中の目的とする被分析物の検出方法が提供され、該方法は、（ａ）上記試料を本明細書に記載及び／または権利請求されるデバイスに印加することと、（ｂ）上記目的とする被分析物の有無を検出することとを含む。
上述の発明の概要、並びに後述の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解することができる。該図面は例示であって限定的なものではないことが意図される。本開示は、図面に示す詳細な配置、例及び手段に限定されないことが理解されよう。
(上の図)一般的なラテラルフローイムノアッセイ試験ストリップの概略図である。ＬＦＡが利用する２つの機構の例、すなわちサンドイッチアッセイ（左下の図）及び競合アッセイ（右下の図）を示す。 ＡＴＰＳと共に捕捉プローブを用いた、被分析物濃縮に関する概略図である。プローブは目的とする被分析物を捕捉し、極度に一方の相に分配される。次いで濃縮されたプローブを含有する相が回収され、その後ＬＦＡによる分析を行うことができる。 ＡＴＰＳと共に磁性捕捉プローブを用いた被分析物濃縮に関する概略図である。プローブは目的とする被分析物を捕捉し、一方の相に分配される。磁石が印加され、これが磁気プローブをより小さな体積に更に濃縮する。 ピストン及びプランジャを利用して、濃縮された被分析物をＡＴＰＳからＬＦＡ試験ストリップに移送する、携帯型デバイスの例示的な、但し非限定的な一設計を示す図である。このデバイスは濃縮チャンバ及び検出チャンバで構成される。この例においては、被分析物はＡＴＰＳの下部バルク相に濃縮される。試料を採取するには、（１）プランジャを押し下げる。試料がＡＴＰＳ溶液と混合される。続いて（２）溶液を吸い込むために、デバイスの先端を試料中に挿入し、続いて（３）プランジャを放し、（４）キャップでＰＥＮデバイスを密封する。（５）被分析物が下部バルク相に濃縮された後、（６）プランジャを「試験」位置に回転させ、これによりピストンを下げ、（７）濃縮された被分析物を、逆止弁を介して検出チャンバに導入することによって検出ステップが開始される。（８）留め具が溝に嵌り込み、ピストンの動きが確実に制御され、制御された体積のみが検出チャンバ内に導入される。 濃縮された被分析物を含有する上部相中にＬＦＡ試験ストリップを機械的に挿入する、携帯型デバイスの設計の例示的な、但し非限定的な一設計を示す図である。ＡＴＰＳ溶液と予め混合されている試料を吸い込むために、（１）デバイスの側方のボタンを押す。相分離が完了し、被分析物が上部バルク相中に濃縮された後、（２）検出ボタンを押し、これによってＬＦＡ試験ストリップが降下し、該ストリップの試料パッドを濃縮された被分析物と接触させることによって検出ステップが開始される。最後に、（３）結果表示窓によって結果を把握することができる。 図６Ａ〜Ｄは、密封されたウェルを組み入れた携帯型デバイスの、例示的な、但し非限定的な設計を示す図である（Ａ）。ＡＴＰＳ溶液をウェルに混ぜ入れる。相分離が完了した後、ウェルの下部のシールを穿刺することによってウェルの流動を始動させることができ、濃縮された被分析物を含有する下部相が検出に向けて流れる。この手法は、被分析物を上部相または下部相のいずれかに濃縮するデバイスに組み込むことができる。被分析物が下部相に濃縮される場合は、ウェルをデバイスチャンバ中に押し下げ、これにより検出に向けた下部相の流動を始動させる。あるいは、ウェルを下から装着し、デバイス上に組み込まれたウェルにボタンを付けることができる。このボタンを押すと、それによって試験ストリップをウェルと接触させることができる。図６Ｂ及び図６Ｃは、試験ストリップ上の１：１体積のＰＥＧ：塩ＡＴＰＳ及び９：１体積のＰＥＧ：塩ＡＴＰＳの結果を示す。図６Ｄは、ウェルの穿刺及びＡＴＰＳ溶液（複数可）のＬＦＡを通る流動の始動の例示的な機構、すなわち、ウェルに接触しているボタンを押す（下の図）、またはウェル自体を押す（上の図）を図解する。 図６Ａ参照。 図６Ａ参照。 図６Ａ参照。 携帯型デバイスの、例示的な、但し非限定的な一設計を示す図である。このデバイスは図４に示すデバイスと類似するが、磁気プローブを利用している。下部相の形成の間、ペンのキャップに近い磁石が磁気プローブをより小さな体積に更に濃縮する。ペンのボタンが押されると、磁性粒子が逆止弁を通って一気に流れて検出を開始する。 界面における濃縮の現象を示す概略図である。プローブ及びＡＴＰＳの特定の特性に起因して、プローブが界面に分配されて高濃縮の状態になる。次いで該界面を捕集し、次のＬＦＡによる分析を行うことができる。 固液界面での濃縮の観察を示す図である。プローブは、ＰＥＧ−塩ＡＴＰＳを収容する管のポリプロピレン壁に存在することが判った。 図１０Ａ〜Ｂ：（Ａ）はＰＥＧ−塩ＡＴＰＳ中でのポリプロピレンスティックを用いた被分析物−プローブ複合体の実験的な捕集を示す図である。（Ｂ）は固液界面での濃縮の概略図である。プローブは、均一溶液中の目的とする被分析物に結合する。管壁がガラスであるため、プローブはＡＴＰＳ中に挿入されたポリプロピレン捕集器に優先的に付着する。濃縮されたプローブを含む捕集器を取り出し、プローブを再懸濁して、その後ＬＦＡによる検出を行うことができる。これらの粒子は、当該の二相系が存在する場合にのみ、固体プロピレンに付着することに留意されたい。 図１０Ａ参照。 固液界面の濃縮を利用する携帯型デバイスの概略図である。ＡＴＰＳ試料を濃縮ウェルに添加し、捕集スティックを挿入してプローブを捕集する。プローブが捕集棒に付着した後にこれを検出ウェルに移動させ、ここでプローブを再懸濁させ、ＬＦＡに向けた流動を始動させて検出を行う。 図１２Ａ〜Ｃは以下を示す。（ａ）当該のペーパーによって、ＡＴＰＳが流れる際にＡＴＰＳの相分離を起こすことができる。この例ではポリマー−塩ＡＴＰＳが用いられる。疎水性且つより粘性の相の嵩高い構成成分は遅延する一方、濃縮された目的とする被分析物を含有する親水性且つより低粘性の相は、ペーパーを通って早く流れる。（ｂ）１：１のポリマー−塩ＡＴＰＳ相がペーパー中で分離し、５分以内にペーパーを通って流れる。（ｃ）９：１のＰＥＧ−塩ＡＴＰＳも５分以内にペーパーを通って流れるが、ポリマーの乏しい相中の捕捉プローブは、体積がより少ないことに起因して容易に見ることができない。 図１２Ａ参照。 図１２Ａ参照。 図１３Ａ〜Ｃは以下を示す。（Ａ）ペーパーウェルはより効率的なＡＴＰＳ相分離を可能にする。疎水性且つより粘性の相の嵩高い構成成分は、ペーパーによって保持されて当該ウェルの上部層に残存する一方、目的とする被分析物を含有する親水性且つより低粘性の相は、下部層へと早く流れる。被分析物の捕集を改善するために、ラニングバッファの添加を利用して、相の完全性を維持しながら、試料をペーパーウェルの外、且つ上記膜上に一気に流すことができる。図１３Ｂは、１：１のＰＥＧ−塩ＡＴＰＳ相は上記ペーパーの層中で分離し、膜を通って流れて検出されることを示す。図１３Ｃは、９：１のＰＥＧ−塩ＡＴＰＳは、大きなＰＥＧ分子を高い濃度で含有するＰＥＧに富む相に起因して、上記膜をよりゆっくりと流れることを示す。次いで、濃縮された塩相は前縁となる。 図１３Ａ参照。 図１３Ａ参照。 図１４Ａ〜Ｄは以下を例示する。（Ａ）本発明者らが濃縮ウェル及び混合ウェルの両方を用いる、三次元ペーパーウェルの変化形。アッセイを開始するために、ＡＴＰＳ溶液と混合した試料を上記濃縮ウェルに印加する。（Ｂ）次いで緩衝剤を該濃縮ウェルに添加して、相分離を促進する。（Ｃ）濃縮された被分析物が混合ウェルに到達すると、（Ｄ）別な緩衝剤を該混合ウェルに添加して流動を容易にし、濃縮された被分析物を下流のＬＦＡ試験ストリップに到達させる。 図１４Ｂ〜Ｄを示す。 図１５Ａ〜Ｂは、ＡＴＰＳにとって必要な構成成分をペーパーストリップ内で脱水することが、該構成成分が試料溶液によって再加水された後の相分離に繋がる機構を示す図である（Ａ）。この実験において、試料溶液は、ポリマーに富む相を好む青色色素及び、ポリマーに乏しい相を好むＬＦＡ用の赤色発色ナノ粒子指示薬から構成される。ＦＧは繊維ガラス紙を指す。（Ｂ）脱水されたＡＴＰＳの構成成分を用いない対照条件。 図１５Ａ参照。 図１６Ａ〜Ｅは、脱水されたＰＥＧ−塩ＡＴＰＳの構成成分を用いた種々のペーパーデバイスの構造を例示する。（ａ）別個のＰＥＧ及び塩セグメントを用いた簡単な構造。（ｂ）組み合わせたＰＥＧ及び塩セグメントを用いた簡単な構造。（ｃ）濃縮効率を高めるために複数の繰返しセグメントを組み入れた例。（ｄ）当該ＰＥＧセグメントがデバイスの直接の流路内にない、例ｃの繰返し。（ｅ）上記流路の終端に相分離部位を配置した構造の例。この概略図には示されていないＬＦＡ試験ストリップは、このデバイスの下流の領域に配置される。 図１６Ａ参照。 図１６Ａ参照。 図１６Ａ参照。 図１６Ａ参照。 図１７Ａ〜Ｂは以下を示す。（Ａ）脱水されたＰＥＧセグメント中へ溶液を吸い込んでＰＥＧに富む相を形成し、これがサイズ排除に基づいて対象とする被分析物を排除することによって、ＰＥＧ−塩ペーパーのみの診断装置内の脱水されたＰＥＧセグメントを埋め合わせることを用いて、先行流体を更に濃縮する方法、及び（Ｂ）濃縮効果を検証する実験。 図１７Ａ参照。 図１８Ａ〜Ｂは以下を示す。（Ａ）濃縮された被分析物を含有する遅延相を、ＬＦＡ試験ストリップに向けて駆動するためのラニングバッファの導入の概略図、及び（Ｂ）濃縮された被分析物を含有する先行相を、ＬＦＡ試験ストリップに向けて駆動するためのラニングバッファの導入に関する、例示的な別な設計。 図１８Ａ参照。 種々の紙材による三次元ペーパーウェルを用いた、流動の経路再設定の設計の概略図である。ポリマーに富む相はより疎水性であり、優先的により疎水性の紙へ流れる一方、ポリマーに乏しい相はより優先的に親水性の紙を通って流れる。ＬＦＡ試験ストリップは、検出のために、このデバイスの下流領域に取り付けることができる。 濃縮性能を高めるために磁気プローブの使用を組み込んだ、ペーパーデバイスの設計の別な例を説明する図である。ここでは、磁石の位置が、目的とする被分析物に結合している粒子に作用する力を与える。これが効果的に、ＬＦＡの検出区域を有するペーパーの側方に粒子を濃縮する。 図２１Ａ〜Ｃは以下を示す。ＧＭＰは、下部のＰＥＧに乏しい相中に極度に分配されることが判明した（Ａ）。このことから、小さな磁石を用いて（Ｂ）、ＡＴＰＳ溶液から殆どのＰＧＭを迅速に回収することが可能となった（Ｃ）。 図２１Ａ参照。 図２１Ａ参照。 事前のＡＴＰＳ濃縮ステップを（上の図）伴わない場合及び（下の図）伴う場合の、Ｔｆを検出するために用いられたＬＦＡストリップを示す画像である。 図２３Ａ〜Ｄは、（Ａ）ＰＥＧのみ、（Ｂ）塩のみ、または（Ｃ）１：1 ＡＴＰＳを含有する溶液中のＰＧＮＰ及びＰＰストローを示す画像である。ＡＴＰＳの存在下でのみＰＧＮＰが極度にＰＰストローに分配された。（Ｄ）ＰＰストローを（Ｃ）から引抜き、この図は、ストローを引抜いて濃縮されたＰＧＮＰを容易に捕集し、その後検出アッセイを行うことができることを示す。 図２３Ａ参照。 図２３Ａ参照。 図２３Ａ参照。 事前のＡＴＰＳ濃縮ステップを（上の図）伴わない場合及び（下の図）伴う場合の、トランスフェリン（Ｔｆ）を検出するために用いられたＬＦＡストリップを示す画像である。 提案された携帯型デバイスを示す概略図である。 ＡＴＰＳを用いたＬＦＡの検出限界を向上させるための手法における、ＤＧＮＰ及びそれらの役割を示す概略図である。 ＬＦＡの競合試験に関する陽性及び陰性の結果を示す概略図である。 図２８Ａ〜Ｃは、種々の％（ｗ／ｗ）のリン酸カリウム溶液における、（ａ）クエン酸塩でキャップしたまたはそのままの金ナノ粒子、（ｂ）ＰＥＧ化金ナノ粒子、及び（ｃ）デキストラン被覆金ナノ粒子の、正規化した可視光領域の吸収スペクトル（４００〜７００ｎｍ）を示す。 図２８Ａ参照。 図２８Ａ参照。 図２９Ａ〜Ｃは、（Ａ）０分時、（Ｂ）３０分時、及び（Ｃ）１２時間時における、本発明者らのＰＥＧ／塩ＡＴＰＳ中のＤＧＮＰの分配挙動を示す。 図２９Ａ参照。 図２９Ａ参照。 ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳにおいて、１２時間の期間内の様々な時点で実験的に測定されたＴｆの濃度係数を示す。エラーバーは、３回の測定値からの標準偏差を表す。 図３１Ａ〜Ｂは、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳを用いた事前のＡＴＰＳ濃縮ステップを（Ａ）伴わない場合及び（Ｂ）伴う場合の、Ｔｆを検出するために用いられたＬＦＡストリップを示す画像である。 図３１Ａ参照。 ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を用いたＬＦＡ定量の結果を示す。エラーバーは３つのＬＦＡ試験ストリップによる測定値からの標準偏差を表わす。 図３３Ａ〜Ｄは、ブリリアントブルーＦＣＦ色素及びデキストラン被覆金ナノ粒子がそれぞれ、上部のＰＥＧに富む相及び下部のＰＥＧに乏しい相に極度に分配されることを示す。（Ａ）２５℃において、混合された１：１体積比のＡＴＰＳ相は分離して（Ｂ）２つの等体積の相を形成した。（Ｃ）２５℃において、混合された９：１体積比のＡＴＰＳ相は分離して（Ｄ）より多いＰＥＧに富む相及びより少ないＰＥＧに乏しい相に分離した。双方のＡＴＰＳに等量のブリリアントブルーＦＣＦ及びデキストラン被覆金ナノ粒子を添加した。９：１体積比のＡＴＰＳのより濃い紫色は、下部のＰＥＧに乏しい相中の金ナノ粒子の濃度が顕著に増加したことを示す。 図３４Ａ〜Ｂは、ペーパー膜によって、ＡＴＰＳが流れる際にＡＴＰＳの相分離を起こすことができることを示す。ＰＥＧに富むドメインはペーパー膜の開始点近傍に保持された一方、ＰＥＧに乏しいドメインは迅速に先頭部に移動した。（ａ）１：１体積比のＡＴＰＳ相は分離し、５分以内にペーパー膜を通って流れた。（ｂ）９：１体積比のＡＴＰＳ相もまた分離し、５分以内に膜を通って流れたが、３００秒時に先頭部がより明確でなかったことから、相分離はより効率的でなかった。 図３４Ａ参照。 図３５Ａ〜Ｂは、三次元ペーパーウェルがＡＴＰＳ相分離を更に向上させることができることを示す。色素を含む混合ＡＴＰＳの添加後、ＰＥＧに富むドメインはウェルの上部の層に保持された一方、濃縮された金ナノ粒子を含有するＰＥＧに乏しいドメインは迅速に底部の層に流れた。（ａ）１：１体積比のＡＴＰＳは、三次元ペーパーウェル中で相分離の向上を示し、ＰＥＧに乏しい相は５分以内に膜を通って流れた。（ｂ）９：１体積比のＡＴＰＳも相分離が向上し、ＰＥＧに乏しい相は明確に視認可能であった。図３４とは対照的に、先頭部は明確であって濃紫色を呈し、デキストラン被覆金ナノ粒子の濃縮を表わしている。 図３５Ａ参照。 図３６Ａ〜Ｃは、Ｔｆ検出のために、三次元ペーパーウェルがＰＥＧ／塩ＡＴＰＳ及びＬＦＡと組み合わされたことを示す。（ａ）ペーパーウェルデバイスが、ニトロセルロース紙上でのＴｆ競合アッセイと組み合わされた。（ｂ）１：１または（ｃ）９：１体積比のＡＴＰＳ溶液を用いた場合に、目視による試験線及び対照線によって、Ｔｆを含有しない試料が正しく診断された。 図３６Ａ参照。 図３６Ａ参照。 図３７Ａ〜Ｂは、三次元ペーパーウェルで、１：１体積比のＰＥＧ／塩ＡＴＰＳを用いると、Ｔｆの検出限界を２倍向上させることができる一方、９：１体積比のＡＴＰＳは１０倍向上させることができること示す。（ａ）従来のＬＦＡはＴｆを１ｎｇ／μＬで検出したが、０．５ｎｇ／μＬではＴｆを検出できず、偽陰性に繋がった。三次元ペーパーウェルで、１：１体積比のＡＴＰＳを用いると、Ｔｆを０．５ｎｇ／μＬで検出することに成功した。（ｂ）従来のＬＦＡはＴｆを１ｎｇ／μＬで検出したが、０．１ｎｇ／μＬではＴｆを検出できず、偽陰性に繋がった。三次元ペーパーウェルで、９：１体積比のＡＴＰＳを用いると、Ｔｆを０．１ｎｇ／μＬで検出することに成功した。 図３７Ａ参照。 例示的なＡＴＰＳ−ＬＦＡシステムを示す。 ＬＦＡサンドイッチアッセイを示す概略図である。陽性の結果（上の図）は試験線及び対照線における２のバンドによって示される一方、陰性の結果（下の図）は対照線における単一のバンドによって示される。 図４０Ａ〜Ｃは、３７℃の水浴中での（Ａ）１０分間、（Ｂ）３０分間、及び（Ｃ）２４時間のインキュベーション後の、水性二相ＰＥＧ−塩系を示す。白色の紙を文字「Ｘ」で埋めて、各相の濁度を視覚化するために役立てた。矢印は巨視的な界面の位置を示す。 様々な時点で、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳにおいて実験的に求めたＭ１３の濃度係数を示す。エラーバーは３回の測定値からの標準偏差を表す。 様々な体積比でのＰＥＧ／塩ＡＴＰＳにおいて実験的に求めたＭ１３の濃度係数を示す。記号は測定データに対応し、エラーバーは３回の測定値からの標準偏差を表す。実線は式（６）からの予測に対応する。 図４３Ａ〜Ｆは、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳを用いた事前の濃縮ステップを伴わない、Ｍ１３を検出するためのＬＦＡを示す。図（Ａ）はＭ１３を添加しなかった陰性対照を示す。残りの溶液はＭ１３を、（Ｂ）１×１０１０、（Ｃ）３．２×ｌ０９、（Ｄ）１×１０９、（Ｅ）３．２×ｌ０８、及び（Ｆ）１×１０８ｐｆｕ／ｍＬの濃度で含んでいた。 図４４Ａ〜Ｆは、事前の濃縮ステップを伴う、Ｍ１３を検出するためのＬＦＡを示す。図（Ａ）はＭ１３を添加しなかった陰性対照を示す。残りの溶液は当初、Ｍ１３を、（Ｂ）１×１０９、（Ｃ）３．２×ｌ０８、（Ｄ）１×１０８、（Ｅ）３．２×ｌ０７、及び（Ｆ）１×１０７ｐｆｕ／ｍＬの濃度で含んでいた。 事前の濃縮ステップを伴う（
Figure 2021073465
 ）及び伴わない（
Figure 2021073465
 ）、Ｍ１３に対する信号強度を示す。エラーバーは少なくとも３回からの測定値の標準偏差を表す。
ＰＢＳ中のＡＴＰＳ−ＬＦＡシステムの概略図を示す。 競合に基づくＬＦＡ並びに陽性及び陰性の結果の解釈を示す概略図である。 図４８Ａ〜Ｄは、ＡＴＰＳ中での分配挙動に影響を与えるためのＧＮＰの表面修飾を示す。（Ａ）ＧＮＰの概略図及び各構成成分の機能である。本発明者らのＰＥＧ−塩ＡＴＰＳ中でのＧＮＰの分配挙動をカスタマイズ可能であることを実証するために、種々の量のＰＥＧをＧＮＰに結合させて、該ＧＮＰの分配挙動を操作した。（Ｂ）結合の際に５０００：１のモル比のＰＥＧ：ＧＮＰを用いると、得られたＧＮＰはＰＥＧに富む上部相中に優先的に分配された。（Ｃ）結合の際に１０００：１のモル比のＰＥＧ：ＧＮＰを用いると、当該のＧＮＰはＰＥＧに乏しい下部相中に分配されたが、該相が高い塩濃度を有していたために凝集した。これらの凝集したＧＮＰを続く検出アッセイに用いることはできなかった。（Ｄ）結合の際に３０００：１のモル比のＰＥＧ：ＧＮＰを用いると、得られたＧＮＰは極度に界面に分配された。（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に関して、液−空気界面の最上部で観察された赤色は、反射に起因するものでナノプローブの存在によるものではなかった。 図４８Ａ参照。 図４８Ａ参照。 図４８Ａ参照。 ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳ界面抽出ステップを用いた事前の濃縮ステップを伴わない場合（上の図）及び伴う場合（下の図）の、ＰＢＳ中でのＴｆの検出のためのＬＦＡの結果を示す。 ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳ界面抽出ステップを用いた事前の濃縮ステップを伴わない場合（上の図）及び伴う場合（下の図）の、ＦＢＳ中でのＴｆの検出のためのＬＦＡの結果を示す。 ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳ界面抽出ステップを用いた事前の濃縮ステップを伴わない場合（上の図）及び伴う場合（下の図）の、合成尿中でのＴｆの検出のためのＬＦＡの結果を示す。 ミセルＡＴＰＳを用いた、同時に行われる目的とする被分析物の濃縮と検出を示す図である。 図５３Ａ〜Ｂは、ＰＢＳ中での体積比１：９のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４システムに関する、相分離に達するのに要する時間の比較を示す。ブリリアントブルーＦＣＦ色素及びサクランボ色のＢＳＡ−ＧＮは、それぞれ、下部のミセルに富む相用及び上部のミセルに乏しい相用の発色指示薬であった。（ａ）２５℃において、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳは、試験管中、８時間で巨視的な相分離平衡に達した。（ｂ）三次元紙芯を混合ＡＴＰＳに適用した場合には、ミセルに富むドメインは芯の底部近傍に保持され、ミセルに乏しいドメインはより自由に芯を上に向かって流れることができたことから、３０秒時で既に、該芯内で相分離が観察された。芯から外に出ると、別個な相が互いに分離した状態を維持し、ミセルに乏しい相は先頭部における小さな体積内に濃縮された状態を維持し、１８０秒（３分）時にはより完全な分離を示した。 図５３Ａ参照。 図５４Ａ〜Ｂは、紙芯及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ミセルＡＴＰＳのＬＦＡとの一体化を例示する。（ａ）一体化された診断ストリップは、相分離が起こる濃縮区域、及びそれに続く固定化された試験線及び対照線成分を含有する検出区域から構成される。（ｂ）ｐＬＤＨを含有しない溶液を分析する場合において、真の陰性試験を２０分以内で確認した。 図５４Ａ参照。 ペーパーに基づく１：９体積比のミセルＡＴＰＳが、２５℃、ＰＢＳ中で、ｐＬＤＨの検出限界の１０倍の向上を達成したことを示す。標準的なＬＦＡはｐＬＤＨを１０ｎｇμＬ−１で検出したが、１ｎｇμＬ−１ではｐＬＤＨを正確に検出することはできなかった。上記一体化された診断ストリップは、ｐＬＤＨを１ｎｇμＬ−１で検出することに成功した。 ペーパーに基づく９：１体積比のミセルＡＴＰＳが、２５℃、無希釈ＦＢＳ中で、ｐＬＤＨの検出限界の１０倍の向上を達成したことを示す。標準的なＬＦＡはｐＬＤＨを１０ｎｇμＬ−１で検出したが、１ｎｇμＬ−１ではｐＬＤＨを正確に検出することはできなかった。上記一体化された診断ストリップは、ｐＬＤＨを１ｎｇμＬ−１で検出することに成功した。 図５７Ａ〜Ｄは、（Ａ）繊維ガラス上のＰＥＧ４６００及びリン酸カリウム、（Ｂ）繊維ガラス上のＰＰＧ４２５及びリン酸カリウム、（Ｃ）セルロース上のＰＥＧ８０００及びデキストラン９０００、並びに（Ｄ）繊維ガラス上のＰＥＧ４６００及びデキストラン３５０００を用いた相分離の結果を示す。 図５７Ａ参照。 図５７Ａ参照。 図５７Ａ参照。 図５８Ａ〜Ｂは、（Ａ）塩相を先行流体とする、または（Ｂ）ＰＥＧ相を先行流体とする、異なる紙の種類上での相分離を示す。 図５８Ａ参照。 図５９Ａ〜Ｄは、疎水性ポリマー（例えばＰＥＧ）相を、（Ａ）ＬＦＡの狭い領域、（Ｂ）ＬＦＡの広い領域の中心、（Ｃ）ＬＦＡの狭い領域からＬＦＡの広い領域へと展開するＬＦＡの領域、及び（Ｄ）主としてＬＦＡの広い領域、に載置することを含む、ポリマーＡＴＰＳの構成成分の脱水のための種々の設計を示す。 図５９Ａ参照。 図５９Ａ参照。 図５９Ａ参照。 脱水されたポリマーＡＴＰＳ−ＬＦＡシステム上での相分離のこま撮り撮影画像を示す。 脱水されたポリマーＡＴＰＳ−ＬＦＡシステム上での相分離のこま撮り撮影画像を示す。 脱水されたナノプローブペーパーセグメントが検出膜の幅よりも広い（幅は、流れの方向に垂直な、但し流れの面内である寸法として定義される）設計を示す。 図６３Ａ〜Ｂは、（Ａ）ＡＴＰＳなしまたは（Ｂ）ＡＴＰＳありでの、幅広の設計における成功した相分離を示す。 図６３Ａ参照。 検出膜内での流動を大幅に緩慢にする、ポリマーＡＴＰＳのＰＥＧに富む相の粘度に起因して、継続して流れることができなかった実験の画像である。 検出膜内での流動を大幅に緩慢にするＰＥＧに富む相に対して、ＰＥＧを含有しない空白のスペーサを残すことによって対処することができることを示す。 後に残るナノプローブの量を低減するための、流体の供給源からＬＦＡ膜にかけて一定の勾配を有する脱水されたＬＦＡの設計を示す。 ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳを用いた、脱水されたＡＴＰＳ−ＬＦＡシステムを例示する。 脱水されたポリマーＡＴＰＳの構成成分を含有する紙パッドを有する三次元ペーパーウェルの設計を例示する。 図６９Ａ〜Ｂは、（Ａ）ＬＦＡの開始端及び（Ｂ）ＬＦＡの開始端ではない箇所に位置する、脱水されたポリマーＡＴＰＳの構成成分を含有する紙パッドを有する三次元ペーパーウェル上での分離を示す。 図６９Ａ参照。 ある長さの水平方向のペーパーによって分離された２の別個の三次元ウェルが存在する、例示的な２ウェル構成の設計を示す。第１のウェルは脱水されたＡＴＰＳの構成成分を含有する。第２のウェルは相分離のためのより多くの時間及び空間を可能にする。 ＭＦ１紙がＰＥＧ−塩溶液中の血液試料に適合することを示す。 ＭＦ１紙上での血液試料のろ過が遅くなることがあることを示す。 図７３Ａ、Ｂは、ろ紙上の（Ａ）３層三次元ウェルまたは（Ｂ）５層三次元ウェルを用いた、血液試料及びＰＥＧ−塩溶液の相分離の結果を示す。 図７３Ａ参照。 ペーパー上の三次元ウェルを用いた、血液試料及びＰＥＧ−塩溶液の相分離の結果を示す。 ろ過及び濃縮用の紙の層を備える三次元ウェルを用いた、血液試料及びＰＥＧ−塩溶液の相分離の結果を示す。 サンドイッチ形式ＬＦＡを用いた、ウィルス輸送培地（ＶＴＭ）中のＣ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出を示す。 サンドイッチ形式ＬＦＡ及びミセルＡＴＰＳを用いた、Ｓ． ｍｕｔａｎｓの検出を示す。 サンドイッチ形式ＬＦＡ及びＰＥＧ／塩ＡＴＰＳを用いた、Ｓ． ｍｕｔａｎｓの検出を示す。 競合形式ＬＦＡ及びＰＥＧ／塩ＡＴＰＳを用いたトロポニンの検出を示す。 図８０Ａ〜Ｃは、混合ＡＴＰＳのペーパー膜上への添加の概略図（Ａ）及び結果を示し、ここで、ＡＴＰＳの両方の相がガラスウェル内で完全に分離することができ、その後ペーパーを通って流れた。紫色のデキストラン被覆金ナノ粒子を含有したＰＥＧに乏しい相（中抜きの矢印）はペーパーを通って迅速に流れたことが観測された一方、青色色素を含有したＰＥＧに富む相（塗り潰しの矢印）はペーパー膜の起点に保持された。（Ｂ）１：１体積比のＡＴＰＳまたは（Ｃ）９：１体積比のＡＴＰＳを用いた場合に、ペーパー膜内で起こる相分離の向上が明確であった。 図８０Ａ参照。 図８０Ａ参照。 ９：１体積比のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−ＰＢＳ ＡＴＰＳ及び三次元ＬＦＡを用いた、０．１ｎｇ／ｍＬのＦＢＳ試料中のｐＬＤＨの検出を示す。 同時に行われる濃縮及び検出用の混合ＡＴＰＳ溶液中、または相分離及び一方の相中のプローブ−被分析物複合体の濃縮後のＡＴＰＳの一方の相中の、ＬＦＡに添加されるプローブ−被分析物複合体の概略図を示す。
本明細書においては、ポイントオブケア（ＰＯＣ）または使用現場で実施することができ、また医療用、民生用、及びその他の用途向けの有用なツールを提供する、方法、デバイス、キット、及びシステムが提供される。本明細書において提供される試験（アッセイデバイス及び／またはシステム）は、使用が迅速、簡単且つ容易であり、受けていたとしても多少の臨床診断の訓練を受けた個人によって容易に実施することができる。上記試験は非常に高感度且つ信頼性がある。ある特定の実施形態において、本デバイス及び方法は、水性多相系の濃縮性能をＬＦＡとの併用で利用して、思いがけなくも驚くべき感度、例えば、以前のＬＦＡアッセイの検出限界に対して、少なくとも約１０倍〜約１００倍の向上を与え、これは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの実験室におけるアッセイの感度に近づくまたは匹敵する、またある場合にはこれを凌駕する。
Ｉ．デバイス
本明細書においては、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）及び水性二相系（ＡＴＰＳ）を利用する（例えば、提供するように構成されている）、試料中の目的とする被分析物の検出及び／または定量のためのデバイスが開示され、上記ＡＴＰＳは第１の相溶液及び第２の相溶液に分離する混合相溶液を含み、上記ＬＦＡは上記目的とする被分析物を検出するための試験線及び対照線を備える。いくつかの実施形態において、上記混合相の第１の相溶液及び第２の相溶液への上記分離はＬＤＡ内で起こる。いくつかの実施形態において、混合相の第１の相溶液及び第２の相溶液への分離はＬＤＡ内で起こらない。いくつかの実施形態において、第１の相溶液は第２の相溶液よりもより速くＬＦＡを通って流れ、先行流体と呼ばれる一方、第２の相溶液は遅延流体と呼ばれる。いくつかの実施形態において、第２の相溶液は第１の相溶液よりもより速くＬＦＡを通って流れ、先行流体と呼ばれる一方、第１の相溶液は遅延流体と呼ばれる。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、上記先行流体中に分配され／集中する。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、上記遅延流体中に分配され／集中する。
構成及び操作
いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳ及び／または試料の該デバイスへの投入のためのポートを備える。いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳを備える第１の構成要素、及びＬＦＡを備える第２の構成要素を備える。いくつかの実施形態において、第１の構成要素及び第２の構成要素は、別個の構成要素として設けられる。いくつかの実施形態において、第１の構成要素及び第２の構成要素は、ユーザーによって互いに繋ぎ合わされる。いくつかの実施形態において、第１の構成要素は、ＡＴＰＳに接続された第１のポートを有する。いくつかの実施形態において、第１の構成要素はＡＴＰＳ用のチャンバを備える。いくつかの実施形態において、第１のポートは上記チャンバに接続されている。いくつかの実施形態において、第１のポートは、試料及び／または目的とする被分析物の第１の構成要素への投入のために構成されている。いくつかの実施形態において、第１のポートは、ＡＴＰＳまたはその構成成分の第１の構成要素への投入のために構成されている。いくつかの実施形態において、第２のポートは、試料及び／または目的とする被分析物の第２の構成要素への投入のために構成されている。いくつかの実施形態において、第２のポートは、ＡＴＰＳまたはその構成成分の第２の構成要素への投入のために構成されている。
いくつかの実施形態において、本デバイスは複数のチャンバを備える。いくつかの実施形態において、第１の構成要素は、試料及び／またはＡＴＰＳ溶液を保持する第１のチャンバを備え、相分離を起こさせる。いくつかの実施形態において、第２の構成要素はＬＦＡを収容し、相分離が起きた後の目的とする被分析物のＬＦＡへの印加を容易にする第２のチャンバ（例えば検出チャンバ）を備える。いくつかの実施形態において、追加のチャンバを加えて、圧力差を利用するまたは減圧を生み出すなど、流動を促進してもよい。いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳから目的とする被分析物を捕集し、機械的な構成要素を用いて該被分析物をＬＦＡに移送する。
いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳとＬＦＡとが一体化される（ＡＴＰＳ−ＬＦＡ）、すなわち、ＡＴＰＳの構成要素が直接または接続子を介してＬＦＡの構成要素に接続される。ある特定の実施形態において、ＡＴＰＳ及びＬＦＡは別個の構成要素として提供され、例えば、ユーザーによって一つに組み付けられるか、またはＡＴＰＳ及びＬＦＡは単一の一体化されたユニットとして提供される。いくつかの実施形態において、本デバイスはＡＴＰＳとＬＦＡとの間に接続（例えばＡＴＰＳ−ＬＦＡ接続子）を備える。ＡＴＰＳ−ＬＦＴ接続子の例証としての、但し非限定的な例としては、管、ポート、弁、ロート、ゲート、ポンプ、穴、流路、フィルタ、それらの組み合わせなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記一体化されたデバイスは、ＬＦＡ上に脱水されたＡＴＰＳの構成成分を備える。いくつかの実施形態において、本デバイスは、上記ＡＴＰＳ−ＬＦＡに接続されている単一のポートを備える。いくつかの実施形態において、上記単一のポートは、試料及び／または目的とする被分析物のＡＴＰＳ−ＬＦＡへの投入のために構成されている。いくつかの実施形態において、単一のポートは、ＡＴＰＳまたはその構成成分のＡＴＰＳ−ＬＦＡへの投入のために構成されている。いくつかの実施形態において、ポートは、管、ロート、弁、シリンジ、ストロー、流路、プランジャ、ピストン、ポンプ、それらの組み合わせなどから選択される、但しこれらに限定はされない、構造体を備える。
いくつかの実施形態において、本デバイスはＬＦＡストリップを備える。いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳに上記ＬＦＡストリップを挿入するように構成される。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳ及びＬＦＡは単一の筐体内に収容される。
いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳ中に試料及び／または目的とする被分析物を送達するアクチュエータを備える。いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＬＦＡに溶液を送達するアクチュエータを更に備える。
携帯性
いくつかの実施形態において、本デバイスは携帯型デバイスである。いくつかの実施形態において、本デバイスは、約１００オンス未満、約９０オンス未満、約８０オンス未満、約７０オンス未満、約６０オンス未満、約５０オンス未満、約４０オンス未満、約３２オンス未満、約２４オンス未満、約１６オンス未満、約８オンス未満、約４オンス未満、約２オンス未満、約１オンス未満の重量である。いくつかの実施形態において、複数のデバイスが携帯型容器内に詰められている。いくつかの実施形態において、本デバイスの最大長は約１インチ、約２インチ、約３インチ、約４インチ、約６インチ、約７インチから約８インチ、約９インチ、約１０インチ、約１２インチ、約１４インチ、約１６インチ、約１８インチ、約１９インチ、約２０インチ、約２４インチ、約２６インチ、約２８インチまたは約３０インチである。いくつかの実施形態において、本デバイスは、利便性よく搬送及び／または保管することができるように、該デバイスが拡げられた場合のその大きさよりも小さい大きさに折り畳まれる。
図４は、ピストン及びプランジャシステムを用いて、ＡＴＰＳをＬＦＡと組み合わせることができる携帯型デバイスを例示する。例証としての一実施形態において、濃縮チャンバ及び検出チャンバは、確実に、ＬＦＡストリップが濃縮されていない試料と時期尚早に接触することがないようにする、逆止弁または同様の機構によって接続される。上記ピストン及びプランジャシステムを用いて、試料を濃縮チャンバ内に吸い込むことができる。濃縮は、被分析物の抽出の前に試料をＡＴＰＳ溶液と事前に混合することによって、本デバイスによる試料採取の前に行われてもよく、または濃縮は、ＡＴＰＳ溶液を液体若しくは脱水された形態のいずれかとして濃縮チャンバ内部に事前に充填することによって、本デバイス内部で行われてもよい。相分離が起きた後、ユーザーは、ピストン／プランジャを用いて、所定の体積の濃縮された被分析物を、濃縮チャンバから逆止弁を介して検出チャンバへと方向を変更して、検出過程を開始することができる。被分析物が存在する所望のバルク相（上部相または下部相）をＬＦＡストリップに移送するために、逆止弁の位置を変更することができる。
図５は、ＬＦＡストリップに印加するための上部バルク相の捕集を実証するデバイス設計を図解する。図示する実施形態において、ＡＴＰＳ溶液と事前に混合された試料がデバイス内に吸い込まれる。相分離の後、ユーザーはボタンを押して、ＬＦＡ試験ストリップ（複数可）をＡＴＰＳの上部相中の濃縮された被分析物と接触させることによって、検出ステップを開始することができる。種々の実施形態において、ＡＴＰＳ溶液の構成成分を、液体または脱水された形態のいずれかとして、本デバイスに事前に充填することができる。
図６は、携帯型カセット式デバイスの、例証のための、但し非限定的な例を提示する。最初に試料及びＡＴＰＳ溶液を、カセットデバイス上の試料ウェルに充填することができる。該ウェルは、試料を充填した後にカセットに取り付けることができる、着脱式の構成要素として設計されてもよい。相分離が起きた後、ＬＦＡ試験ストリップまたは試料ウェルのいずれかの機械的な移動によって、検出ステップを開始することができる。
図７は、磁気捕捉プローブが、携帯型デバイスにおけるＡＴＰＳとＬＦＡとの一体化に対して適用可能な一構成を例示する。図示のデバイスは、４図に示すデバイスと同様に、プランジャ及びピストンシステムを利用して、外部磁石によって捕集された濃縮された被分析物を検出チャンバに移送することができる。いくつかの実施形態において、本デバイスは、動力源（例えば電力）を必要としない。
検出時間
いくつかの実施形態において、本デバイスは検出時間を有する。いくつかの実施形態において、上記検出時間は相分離時間を含む。いくつかの実施形態において、検出時間は流動時間を含む。
いくつかの実施形態において、検出時間（例えば、デバイスへの試料の印加と、対照／試験における目的とする被分析物の検出との間の時間等）は、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満または約０．５時間未満である。いくつかの実施形態において、検出時間は、約３０分未満、約２５分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、または約５分未満である。いくつかの実施形態において、検出時間は約５分未満、または約４分未満、約３分未満、約２分未満、または約１分未満である。いくつかの実施形態において、検出時間は、約３０秒未満、約２０秒未満または約１０秒未満である。
いくつかの実施形態において、相分離時間（例えば、第１／第２の相溶液がＡＴＰＳの混合相溶液から分離するために要する時間）は、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満時間または約０．５時間未満である。いくつかの実施形態において、上記検出時間は約３０分、または約２５分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、または約５分未満である。いくつかの実施形態において、相分離時間は約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満、または約１分未満である。いくつかの実施形態において、相分離時間は、約３０秒未満、約２０秒未満、または約１０秒未満である。
いくつかの実施形態において、流動時間（例えば、目的とする被分析物を含有する溶液が、ＬＦＡの試料パッドから試験線及び対照線まで進むために要する時間）は、約２時間未満、約１．５時間未満、約１時間未満または約０．５時間未満である。いくつかの実施形態において、流動時間は、約３０分未満、または約２５分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、または約５分未満である。いくつかの実施形態において、上記検出時間は約５分未満、または約４分未満、約３分未満、約２分未満、または約１分未満である。いくつかの実施形態において、流動時間は、約３０秒未満、約２０秒未満または約１０秒未満である。
検出限界
いくつかの実施形態において、本デバイスは、検出されるために試料中に存在する必要がある、目的とする被分析物の最小量である検出限界を有している。
いくつかの実施形態において、上記試料中の目的とする被分析物の最小量は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、約０．０５ｎｇ／ｍｌ、約０．１ｎｇ／ｍｌ、約０．１５ｎｇ／ｍｌ、約０．２０ｎｇ／ｍｌ、約０．２５ｎｇ／ｍｌ、約０．３ｎｇ／ｍｌ、約０．３５ｎｇ／ｍｌ、約０．４０ｎｇ／ｍｌ、約０．４５ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌ、約０．５５ｎｇ／ｍｌ、約０．６０ｎｇ／ｍｌ、約０．６５ｎｇ／ｍｌ、約０．７ｎｇ／ｍｌ、約０．７５ｎｇ／ｍｌ、約０．８０ｎｇ／ｍｌ、約０．８５ｎｇ／ｍｌ、約０．９ｎｇ／ｍｌ、約０．９５ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、試料中の目的とする被分析物の最小量は、約１ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１１０ｎｇ／ｍｌ、約１２０ｎｇ／ｍｌ、約１３０ｎｇ／ｍｌ、約１４０ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１６０／ｍｌ、約１７０ｎｇ／ｍｌ、約１８０ｎｇ／ｍｌ、約１９０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９８０ｎｇ／ｍｌ、または約１０００のｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物の最小量は、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌである。いくつか実施形態において、目的とする被分析物最小量は、約１０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物の最小量は約１０μｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物の最小量は、１兆部当たり約１部、１兆部当たり約１０部または１兆部当たり約１００部である。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物の最小量は、１０億部当たり約１部、１０億部当たり約１０部、１０億部当たり約１００部、１０億部当たり約１０００部、１０億部当たり約１０，０００部または１０億部当たり約１００，０００部である。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物の最小量は、１０００部当たり約１部、１０００部当たり約１０部または１０００部当たり約１００部である。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は、細胞上に存在するかまたは細胞に由来する。いくつかの実施形態において、上記試料は、細胞上に存在するかまたは細胞に由来する目的とする被分析物が検出されるための、最小限の濃度の細胞を有する。いくつかの実施形態において、上記細胞の最小濃度は、試料ｍｌ当たり約１細胞、試料ｍｌ当たり約１０個の細胞、試料ｍｌ当たり約２０細胞、試料ｍｌ当たり約３０個の細胞、試料ｍｌ当たり約４０細胞、試料ｍｌ当たり約５０細胞、試料ｍｌ当たり約６０細胞、試料ｍｌ当たり約７０細胞、試料ｍｌ当たり約８０細胞、試料ｍｌ当たり約９０細胞または試料ｍｌ当たり約１００細胞である。
いくつかの実施形態において、上記細胞の最小濃度は、約１×１００細胞／ｍＬ、約１×１０１細胞／ｍＬ、約１×１０２細胞／ｍＬ、約１×１０３細胞／ｍＬ、約１×１０４細胞／ｍＬ、約１×１０５細胞／ｍＬ、約１×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０８細胞／ｍＬまたは約１×１０９細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態において、細胞の最小濃度は約１×１０６細胞／ｍＬである。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物はウィルス粒子であり、ウィルス上に存在するかまたはウィルスに由来する。いくつかの実施形態において、上記試料は、ウィルス上に存在するかまたはウィルスに由来する目的とする被分析物が検出されるための、最小限の濃度のウィルス粒子を有する。いくつかの実施形態において、試料中のウィルス粒子の最小濃度は、約１×１００ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０１ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０２ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０３ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０４ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０５ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０１１ｐｆｕ／ｍＬ、または約１×１０１２ｐｆｕ／ｍＬである。
いくつかの実施形態において、上記試料中のウィルス粒子の最小濃度は、約１×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、２×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、３×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、４×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、５×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、６×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、７×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、８×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、９×１０６ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約２×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約３×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約４×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約５×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約６×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約７×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約８×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約９×１０７ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約２×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約３×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約４×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約５×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約６×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約７×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約８×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約９×１０８ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約２×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約３×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約４×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約５×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約６×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約７×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約８×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約９×１０９ｐｆｕ／ｍＬ、約１×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約２×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約３×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約４×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約５×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約６×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約７×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約８×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、約９×１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、または約１×１０１１ｐｆｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、試料中のウィルス粒子の最小濃度は、約１×１０７ｐｆｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、試料中のウィルス粒子の最小濃度は、約１×１０８ｐｆｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、試料中のウィルス粒子の最小濃度は、約１×１０９ｐｆｕ／ｍＬである。
温度
いくつかの実施形態において、本デバイスは、デバイス周囲の温度に拘わらず作動する。但し当然、温度は、当該デバイスの材料の発火点／融点／引火点を下回り、当該デバイスの構成成分が揮発する、昇華する、または破壊する温度を下回り、且つアッセイの動作時には、当該デバイスの構成成分の凝固点を上回る温度である必要がある。いくつかの実施形態において、本デバイスは室温で動作する。いくつかの実施形態において、本デバイスは、約摂氏−５０度〜約摂氏６０度の温度で動作する。いくつかの実施形態において、本デバイスは、約摂氏−１０度〜約摂氏４５度の温度で動作する。いくつかの実施形態において、本デバイスは、約摂氏１０度〜約摂氏３０度の温度で動作する。
水性二相系（ＡＴＰＳ）
ある特定の実施形態において、本デバイスは、水性二相系（ＡＴＰＳ）法をサポートするように構成され、本明細書において、かかるデバイスを用いるアッセイが提供される。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳは相溶液を含む。「相溶液」という用語は、概括的には、ＡＴＰＳの第１の相溶液または第２の相溶液を指す。いくつかの実施形態において、上記相溶液は、（例えば第１／第２の相溶液との）混合溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、相溶液は、ＡＴＰＳの混合溶液から分配された後の第１／第２の相溶液である。いくつかの実施形態において、相溶液は、ＬＦＡ中の混合溶液から分配された後の第１／第２の相溶液である。相溶液は、それが（例えば第１の相溶液との）混合状態にある間は、第２の相溶液を指すことができる。いくつかの実施形態において、相溶液はＬＦＡ中における先行流体である。いくつかの実施形態において、相溶液はＬＦＡ中における遅延流体である。
いくつかの実施形態において、上記ＡＴＰＳは、当初に混合された２種の水溶液、第１の相溶液及び第２の相溶液（例えば混合相溶液）を含む。いくつかの実施形態において、上記混合相溶液は均一な溶液である。いくつかの実施形態において、第１の相溶液と第２の相溶液とは非混和性である。いくつかの実施形態において、該非混和性は、温度の変化、及び／または塩などの異なる構成成分の濃度の変化によって駆動される。いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液は、ミセル、塩、及び／またはポリマーなどの構成成分を含む。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳと接触する目的とする被分析物は、その大きさ、形状、疎水性、及び電荷などの物理的並びに化学的特性に基づいて、第２の相溶液に対して第１の相溶液に優先的に分布し、分配され、並びに／若しくは集中する、あるいはその逆である。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物（例えば、哺乳動物細胞、細菌またはウィルスの成分）は、圧倒的に（若しくは極度に）ＡＴＰＳの第１の相溶液または第２の相溶液中に分配され、それ故にＡＴＳＰ中に集中する。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、第１の相溶液と第２の相溶液との間の体積比を調整することによって濃縮される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、当該被分析物が分配される相の体積を低減することによって濃縮される。実例として、いくつかの実施形態において、例えば、１：９の第２の相溶液に対する第１の相溶液の体積比を用いることによって、当該被分析物が極度に分配される相の体積は全体積の１／１０であるため、目的とする被分析物は第１の相溶液中に１０倍濃縮される。
いくつかの実施形態において、他の比率を用いることによって他の濃縮が得られる。このように、いくつかの実施形態において、第１の相溶液の第２の相溶液に対する比率は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、及び約１：１０の比率から選択される。いくつかの実施形態において、第１の相溶液の第２の相溶液に対する比率は、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００の比率から選択される。いくつかの実施形態において、第１の相溶液の第２の相溶液に対する比率は、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：５００、約１：６００、約１：７００、約１：８００、約１：９００、及び約１：１０００の比率から選択される。
いくつかの実施形態において、第２の相溶液の第１の相溶液に対する比率は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、及び約１：１０の比率から選択される。いくつかの実施形態において、第２の相溶液の第１の相溶液に対する比率は、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、及び約１：１００の比率から選択される。いくつかの実施形態において、第２の相溶液の第１の相溶液に対する比率は、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：５００、約１：６００、約１：７００、約１：８００、約１：９００、及び約１：１０００の比率から選択される。
いくつかの実施形態において、第１の相溶液と第２の相溶液との間で実質的に等分に被分析物が分配され、被分析物の濃縮を妨げる。かかる系においては、当該目的とする被分析物を捕捉するプローブであって、一方の相中に圧倒的に分配され、それによって目的とする被分析物の分配挙動を向上させて濃縮を可能にする、上記プローブなどの追加成分を導入することによって、目的とする被分析物の濃縮が達せられる。いくつかの実施形態において、濃縮された被分析物を含む第１／第２の相溶液が捕集され、ＬＦＡに印加される。かかる追加成分の使用は、実質的に等分の分配系に限定されるものではない。被分析物が圧倒的に一方の相中に分配される場合であっても、いくつかの実施形態において、上述の追加成分（例えば、プローブ）の利用によって、かかる分配が向上することが認識されよう。
いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液はミセル溶液を含む。いくつかの実施形態において、上記ミセル溶液は非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、ミセル溶液は洗剤を含む。いくつかの実施形態において、ミセル溶液はＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含む。いくつかの実施形態において、ミセル溶液は、非限定的な例として、Iｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０及びＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０などのＴｒｉｔｏｎ−Ｘと類似のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、ミセル溶液は本質的にＴｒｉｔｏｎ−Ｘからなる。
いくつかの実施形態において、上記ミセル溶液は、約０．０１センチポアズ〜約５０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約４５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約４０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約３５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約３０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約２５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約２０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約１５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約１０００センチポアズ、または、約０．０１センチポアズ〜約５００センチポアズの粘度（室温、約摂氏２５度）を有する。いくつかの実施形態において、ミセル溶液は、約０．０１センチポアズ〜約４５０センチポアズ、約０．０１センチポアズ〜約４００センチポイズ、約０．０１センチポアズ〜約３５０センチポアズ、約０．０１センチポイズ〜約３００センチポアズ、約０．０１センチポイズ〜約２５０センチポイズ、約０．０１センチポイズ〜約２００センチポアズ、約０．０１センチポイズ〜約１５０センチポイズ、または約０．０１センチポイズ〜約１００センチポイズの粘度（室温、約摂氏２５度）を有する。
いくつかの実施形態において、上記第１／第２の相溶液はポリマーを含む（例えば、ポリマー溶液）。ある特定の実施形態において、上記ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。種々の実施形態において、上記ＰＥＧは１０００〜１００，０００の分子量を有していてもよい。ある特定の実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ−４６００、ＰＥＧ−８０００、及びＰＥＧ−２０，０００、ＰＥＧから選択される。ある特定の実施形態において、上記ポリマーは、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）である。種々の実施形態において、上記ＰＰＧは、１００〜１０，０００の分子量を有していてもよい。ある特定の実施形態において、ＰＰＧはＰＰＧ４２５から選択される。ある特定の実施形態において、上記ポリマーはデキストランである。種々の実施形態において、上記デキストランは１０００〜１，０００，０００の分子量を有していてもよい。ある特定の実施形態において、デキストランは、デキストラン６０００、デキストラン９０００、デキストラン３５，０００、及びデキストラン２００，０００から選択される。
いくつかの実施形態において、上記ポリマー溶液は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ、または約１％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。いくつかの実施形態において、ポリマー溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ、及び約５０％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。いくつか実施形態において、ポリマー溶液は、約１０％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗ、約６０％ｗ／ｗ、約７０％ｗ／ｗ、約８０％ｗ／ｗ、または約９０％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。いくつかの実施形態において、ポリマー溶液は、約１０％ｗ／ｗ〜約８０％ｗ／ｗのポリマー溶液から選択される。いくつかの実施形態において、ポリマー溶液は、約１０％ｗ／ｗ〜約２５％ｗ／ｗであるポリマー溶液から選択される。
いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液は塩を含む（例えば、第１／第２の相溶液は塩溶液である）。いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物及び／またはプローブ−被分析物複合体は、上記塩溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物及び／またはプローブ−被分析物複合体は、コスモトロピック塩を含む塩溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物及び／またはプローブ−被分析物複合体は、カオトロピック塩を含む塩溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、上記塩は、マグネシウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、亜鉛塩及びアルミニウム塩から選択される。いくつかの実施形態において、塩は、臭化塩、ヨウ化塩、フッ化塩、炭酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、カルボン酸塩、ホウ酸塩、及びリン酸塩から選択される。いくつかの実施形態において、塩はリン酸カリウムである。いくつかの実施形態において、塩は硫酸アンモニウムである。
いくつかの実施形態において、上記塩溶液は、約０．０１％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．１５％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、約０．２５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．３５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．４５％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．７５％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．８５％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．９５％ｗ／ｗ、または約１％ｗ／ｗである塩溶液から選択される。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１１％ｗ／ｗ、約１２％ｗ／ｗ、約１３％ｗ／ｗ、約１４％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約１６％ｗ／ｗ、約１７％ｗ／ｗ、約１８％ｗ／ｗ、約１９％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２１％ｗ／ｗ、約２２％ｗ／ｗ、約２３％ｗ／ｗ、約２４％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約２６％ｗ／ｗ、約２７％ｗ／ｗ、約２８％ｗ／ｗ、約２９％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３１％ｗ／ｗ、約３２％ｗ／ｗ、約３３％ｗ／ｗ、約３４％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約３６％ｗ／ｗ、約３７％ｗ／ｗ、約３８％ｗ／ｗ、約３９％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４１％ｗ／ｗ、約４２％ｗ／ｗ、約４３％ｗ／ｗ、約４４％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約４６％ｗ／ｗ、約４７％ｗ／ｗ、約４８％ｗ／ｗ、約４９％ｗ／ｗ、及び約５０％ｗ／ｗである塩溶液から選択される。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約０．１％ｗ／ｗ〜約１０％である塩溶液から選択される。いくつかの実施形態において、塩溶液は、約１％ｗ／ｗ〜約１０％の塩溶液から選択される。
いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液は水と混和しない溶媒を含む。いくつかの実施形態において、上記溶媒は非極性有機溶媒を含む。いくつかの実施形態において、溶媒は油を含む。いくつかの実施形態において、溶媒は、ペンタン、シクロペンタン、ベンゼン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン及びヘキサンから選択される。
いくつかの実施形態において、第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液はポリマーを含む。いくつかの実施形態において、第２の相溶液はミセル溶液を含み、第１の相溶液はポリマーを含む。いくつかの実施形態において、第１の相溶液はミセル溶液を含み、第２の相溶液は塩を含む。いくつかの実施形態において、第２の相溶液はミセル溶液を含み、第１の相溶液は塩を含む。いくつかの実施形態において、上記ミセル溶液はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液である。いくつかの実施形態において、第１の相溶液は第１のポリマーを含み、第２の相溶液は第２のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、第１／第２のポリマーは、ポリエチレングリコール及びデキストランから選択される。いくつかの実施形態において、第１の相溶液はポリマーを含み、第２の相溶液は塩を含む。いくつかの実施形態において、第２の相溶液はポリマーを含み、第１の相溶液は塩を含む。いくつかの実施形態において、第１の相溶液はポリエチレングリコールを含み、第２の相溶液はリン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態において、第２の相溶液はポリエチレングリコールを含み、第１の相溶液はリン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態において、第１の相溶液は塩を含み、第２の相溶液は塩を含む。いくつかの実施形態において、第１の相溶液はコスモトロピック塩を含み、第２の相溶液はカオトロピック塩を含む。いくつかの実施形態において、第２の相溶液はコスモトロピック塩を含み、第１の相溶液はカオトロピック塩を含む。
いくつかの実施形態において、第１の相溶液は表１の構成成分１から選択され、第２の相溶液は表１の構成成分２から選択される。いくつかの実施形態において、第２の相溶液は表１の構成成分１から選択され、第２の相溶液は表１の構成成分２から選択される。
いくつかの実施形態において、表１の構成成分は緩衝液中に懸濁または溶解される。いくつかの実施形態において、表１の構成成分は、試料が由来する生物系に適合する緩衝液中に溶解／懸濁される。いくつかの実施形態において、表１の構成成分は生理食塩水に溶解／懸濁される。いくつかの実施形態において、表１の構成成分はＰＢＳ中に溶解／懸濁される。いくつかの実施形態において、表１の構成成分は水中に溶解／懸濁される。
Figure 2021073465
いくつかの実施形態において、本デバイスは、ＡＴＰＳと接触して配置されるように構成される捕集器を更に備え、目的とする被分析物が該捕集器と第１の相溶液及び／または第２の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態において、上記捕集器は、プラスチック、メソポーラス材料、シリカ、ポリプロピレン、磁石、磁性粒子、常磁性粒子、細孔を有する材料、溝を有する材料、及びそれらの任意の組み合わせから選択される材料を含む。いくつかの実施形態において、捕集器はポリプロピレンを含む。いくつかの実施形態において、捕集器は、目的とする被分析物の捕集を増大させるために最適化される。いくつかの実施形態において、捕集器は、表面積を最大にする細孔を備える。いくつかの実施形態において、上記細孔の幅は、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、または約１００μｍである。いくつかの実施形態において、細孔の幅は、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、または約１ｍｍである。いくつかの実施形態において、細孔の深さは、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、または約１００μｍである。いくつかの実施形態において、細孔の深さは、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、または約１ｍｍである。
ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）
ある特定の実施形態において、本明細書に記載のデバイス及びシステムは、試料中の目的とする被分析物の検出のためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）を提供するように構成されており、該ＬＦＡは水性二相系（ＡＴＰＳ）と組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、ＡＴＰＳまたはその構成成分が中に配置された多孔質マトリクスを備え、該多孔質マトリクスは、ＡＴＰＳまたはその構成成分が流体相の状態にある場合に、該ＡＴＰＳまたはその構成成分が当該多孔質マトリクスを通って流れることが可能なように構成され、且つそのように流れることが可能であるために十分な多孔性を有する。かかる多孔質ＬＦＡデバイスは、本明細書において、ペーパーデバイスまたはペーパー流体デバイスと呼び、これらの用語は同義で用いられる。上記のように、本明細書で用いられるペーパーは、木材のパルプまたは他の繊維質植物物質由来の薄いシートに限定されない。但し、ある特定の実施形態において、本明細書に記載のＬＦＡデバイス中でのかかるペーパーの使用が企図される。
いくつかの実施形態において、上記多孔質マトリクスは、混合相溶液、ＡＴＰＳの第１の相溶液及び／または第２の相溶液、及び／または目的とする被分析物が、ＬＦＡを通って流れることを可能にするために十分に多孔質である。いくつかの実施形態において、多孔質マトリクスは、混合相溶液、第１の相溶液並びに／または第２の相溶液、並びに／または目的とする被分析物が、ＬＦＡを通って垂直及び／若しくは水平に流れるために十分に長い並びに／または深い。いくつかの実施形態において、第１の相溶液は第１の速度で多孔質マトリクスを通って流れ、第２の相溶液は第２の速度で多孔質マトリクスを通って流れ、第１の速度と第２の速度は異なる。いくつかの実施形態において、多孔質マトリクスは、焼結ガラスセラミックス、鉱物、セルロース、繊維ガラス、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷変性ナイロン、ポリエーテルスルホン、及びそれらの組み合わせから選択される材料を含む。
流動時に集中する
以前は、ＡＴＰＳにおける相分離は流動のない条件下で行われてきた。しかしながら、本発明者らは最近、ＡＴＰＳが紙を通って流れる際に相分離することを見出し、本発明者らはこれを「流動時に集中する」と命名した。上記の紙は濃縮過程を大幅に時間短縮することが判ったことから、この知見は刺激的且つ興味深いものとなっている。この基本となる現象に基づいて、本発明者らはペーパー流体デバイスを設計し、ＡＴＰＳとＬＦＡとを組み合わせた診断のために必要な構成要素を完全に一体化した。異なる条件で異なる種類の紙を通って流れる際のＡＴＰＳを検討したことが、本発明者らがより複雑なペーパー流動検出デバイスを開発することができたことに関して重要であった。本発明者らは、ポリマー−塩ＡＴＰＳ及びミセルＡＴＰＳなどの異なるＡＴＰＳを用いた本発明者らの実験データから、均一なＡＴＰＳ溶液を特定の紙材に印加した場合に、該溶液が流れる際に相分離及び被分析物の濃縮が起こることとなることに気が付いた。本発明者らはまた、変化する体積比、例えば、上部相の体積を下部相の体積で除した値、を有したＡＴＰＳを作製した場合であっても、この現象が維持されることも実証した（例えば、図１２を参照）。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡはペーパーを備える。いくつかの実施形態において、上記ペーパーは、流体がそれを通って流れることができる複数の多孔質材料のシートを備える。いくつかの実施形態において、ペーパーは、セルロース、繊維ガラス、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、電荷変性ナイロン、ポリエーテルスルホン等から選択される材料を含む。いくつかの実施形態において、ペーパーはＨＩ−ＦＬＯＷ ＰＬＵＳ（登録商標）膜である。
いくつかの実施形態において、上記ペーパーはウーブ紙である。いくつかの実施形態において、ペーパーはワットマン紙である。いくつかの実施形態において、上記ワットマン紙は、ワットマンＳ１７、ワットマンＭＦ１、ワットマンＶＦ１、ワットマン フュージョン５、ワットマンＧＦ／ＤＶＡ、ワットマンＬＦ１、ワットマンＣＦ１、及びワットマンＣＦ４から選択される。
いくつかの実施形態において、上記ペーパーは、目的とする被分析物がＬＦＡ（例えば「流動時に集中する」に基づくデバイス）を通って流れる際に、該目的とする被分析物を濃縮する。いくつかの実施形態において、ペーパーは、目的とする被分析物がＬＦＡを通って水平に流れる際に、該目的とする被分析物を濃縮する。いくつかの実施形態において、ペーパーは、目的とする被分析物がＬＦＡを通って垂直に流れる際に、該目的とする被分析物を濃縮する。いくつかの実施形態において、ペーパーは、目的とする被分析物が重力によってＬＦＡを通って垂直に流れる際に、該目的とする被分析物を濃縮する。いくつかの実施形態において、ペーパーは、目的とする被分析物が毛管作用によってＬＦＡを通って垂直に流れる際に、該目的とする被分析物を濃縮する。いくつかの実施形態において、ペーパーは、いずれの相溶液が先行流体になるかに影響を与える特性を有する。非限定的な例として、ＰＥＧ−塩ＡＴＰＳを用いる場合には、該溶液を繊維ガラスペーパーに添加することにより、塩相が先行溶液になることとなる一方、セルロースペーパーを用いることにより、ＰＥＧ相が先行溶液になることとなる。いくつかの実施形態において、ペーパー内の相分離は相分離を促進する。これも非限定的な例として、ミセルＡＴＰＳは、流動のないＡＴＰＳ中では一般的に、相分離するためには数時間を要するが、ペーパーストリップに印加すると、この相分離は数分で起こる。これは、従来診断過程における律速段階であるＡＴＰＳを、本発明者らの迅速なペーパー診断アッセイにとって実行可能な選択とすることによって、上記診断過程を時間短縮する。いくつかの実施形態において、「流動時に集中する」デバイスはＰＥＧ−塩ＡＴＰＳを含む。いくつかの実施形態において、「流動時に集中する」デバイスはミセルＡＴＰＳを含む。いくつかの実施形態において、「流動時に集中する」デバイスのＬＦＡは繊維ガラスペーパーを備える。いくつかの実施形態において、「流動時に集中する」デバイスのＬＦＡはニトロセルロースペーパーを備える。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、血液細胞または他の粒子を除去するフィルタ、そこで目的とする被分析物を含む試料が当該ＬＦＡに印加される試料パッド、そこで目的とする被分析物が結合し且つ検出される検出ゾーン（例えば、試験線及び対照線）、及びＬＦＡに印加される過剰な試料及び／または溶液を吸収する吸収パッド（例えば乾燥した受入れ紙）を備える（例えば、図１上の図を参照）。いくつかの実施形態において、対照線及び／または試験線は、正確な意味では線ではなく領域またはスポットである。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡはＬＦＡストリップを含む。「ＬＦＡ」及び「ＬＦＡストリップ」という用語は本明細書において同義で用いられる。いくつかの実施形態において、ＬＦＡストリップは、その幅及び深さよりも大きな長さを有する。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは長方形である。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは、円形、卵形、正方形、多角形、及び不規則な形状からなる群より選択される形状を有する。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは複数の経路及び／または接続部を備える。いくつかの実施形態において、ＬＦＡストリップは試料パッド、検出区域及び吸収パッドを備える。いくつかの実施形態において、上記検出区域は上記試料パッドと吸収パッドとの間に位置し、該吸収パッドは目的とする被分析物を含む試料を、試料パッドから検出ゾーンに向けて吸収し排出する。
サンドイッチアッセイ
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、サンドイッチアッセイを提供する、すなわち実行するように構成される（例えば、図１左下の図を参照）。いくつかの実施形態において、上記サンドイッチアッセイは、目的とする被分析物に結合する捕捉部分を含む。いくつかの実施形態において、本デバイスはプローブを備える。いくつかの実施形態において、上記プローブは検出可能な特性（発色性、蛍光性、放射性等）を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、目的とする被分析物と相互作用する結合部分（例えば、抗体）を含む。いくつかの実施形態において、プローブが試料に添加され、プローブが目的とする被分析物に結合してプローブ−被分析物複合体を形成する。いくつかの実施形態において、上記プローブ−被分析物複合体が試料パッドに印加され、吸収パッドに向かってＬＦＡを通って流れる。いくつかの実施形態において、プローブ−被分析物複合体の目的とする被分析物が上記捕捉部分に結合する。いくつかの実施形態において、捕捉部分が試験線上に固定化され、プローブ−被分析物複合体が試験線上に固定化された状態となる。いくつかの実施形態において、プローブは発色性であり、プローブ−被分析物複合体が試験線に蓄積すると、試験線が強い色（例えば、検出可能な信号）を示すこととなり、これが陽性の結果を示す。いくつかの実施形態において、試料中に目的とする被分析物が存在せず、プローブ−被分析物複合体のプローブが捕捉部分と相互作用せず、試験線が存在しないことが陰性の結果を示す。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは、プローブ及び／または上記結合部分と直接相互作用するプローブ捕捉部分を対照線上に含み、従って、試料中の目的とする被分析物の存在に拘わらず、プローブ／結合部分は上記プローブ捕捉部分と結合し、対照線上に蓄積する。いくつかの実施形態において、プローブ捕捉部分は結合部分と結合する二次抗体であり、該結合部分は当該の目的とする被分析物に結合する一次抗体である。いくつかの実施形態において、プローブは対照線上で固定化及び検出された状態となり、これが、試験が有効であることを示す。いくつかの実施形態において、試験線及び対照線における検出可能な信号によって陽性の結果（例えば、目的とする被分析物が試料中に存在する）が示される。いくつかの実施形態において、対照線における検出可能な信号によって陰性の結果が示される。
競合アッセイ
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは競合アッセイを提供するように構成される（例えば、図１右下の図を参照）。いくつかの実施形態において、プローブが試料に添加され、該プローブが目的とする被分析物に結合してプローブ−被分析物複合体を形成する。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは、試験線に固定化された目的とする被分析物を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、試料中の目的とする被分析物によって飽和され、該プローブは、試験線に固定化された目的とする被分析物に結合しないこととなる。いくつかの実施形態において、試験線上に検出可能な信号が存在しないことは、陽性の結果を示す。いくつかの実施形態において、試料中に目的とする被分析物が存在せず、プローブは試験線上の目的とする被分析物に結合し、これは陰性の結果を示す。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは、プローブと直接相互作用する対照線上のプローブ捕捉部分を含み、試料中の目的とする被分析物の存在に拘わらず、当該プローブは当該プローブ捕捉部分に結合し、対照線上に蓄積する。いくつかの実施形態において、プローブは対照線上で固定化及び検出された状態となり、これが、試験が有効であることを示す。いくつかの実施形態において、試験線において検出可能な信号が存在しないが、対照線において検出可能な信号が存在することによって、陽性の結果（例えば、目的とする被分析物が試料中に存在する）が示される。いくつかの実施形態において、試験線及び対照線の両方における検出可能な信号によって、陰性の結果が示される。
ウェル
いくつかの実施形態において、試料パッドはウェルを備える。いくつかの実施形態において、上記ウェルは、ＡＴＰＳの少なくとも一部、第１の相溶液の少なくとも一部、第２の相溶液の少なくとも一部、目的とする被分析物の再懸濁溶液、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される溶液を収容するために十分な容積を有する。
ある特定の実施形態において、上記ウェルの容積は約１μＬ〜約１０μＬの範囲である。ある特定の実施形態において、ウェルの容積は約１μＬ〜約１００μＬの範囲である。ある特定の実施形態において、ウェルの容積は約１μＬ〜約１０００μＬの範囲である。ある特定の実施形態において、ウェルの容積は約１μＬ〜約５０００μＬの範囲である。ある特定の実施形態において、ウェルの容積は約１ｍＬ〜約１０ｍＬの範囲である。ある特定の実施形態において、ウェルの容積は約１ｍＬ〜約１００ｍＬの範囲である。ある特定の実施形態において、ウェルの容積は約１ｍＬ〜約１０００ｍＬの範囲である。
いくつかの実施形態において、上記再懸濁溶液は、ＡＴＰＳからの濃縮／抽出された目的とする被分析物を再懸濁するための緩衝液を含む。
いくつかの実施形態において、上記ウェルは、ＬＦＡの角部、端部、中央部、接続部、中心を外れた部位、及び屈曲部から選択されるＬＦＡの位置に配置される。いくつかの実施形態において、ウェルは、塩パッド、プローブパッド、ポリマーパッド、及びそれらの組み合わせから選択される１種または複数種のパッドを備える。いくつかの実施形態において、ウェルは複数のパッドを備える。いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液が、上記複数のパッドを通って流れる際に分離し、且つ／または目的とする被分析物が集中する。いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液が、複数のパッドを通って垂直に流れる際に分離し、且つ／または目的とする被分析物が集中する。いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液が、重力によって複数のパッドを通って垂直に流れる際に分離し、且つ／または目的とする被分析物が集中する。いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液が、毛管作用によって複数のパッドを通って垂直に流れる際に分離し、且つ／または目的とする被分析物が集中する。いくつかの実施形態において、ウェルはペーパーウェルである。いくつかの実施形態において、上記ペーパーウェルは三次元の紙構造体であり、ＬＦＡで用いられる一般的なペーパーストリップに比較してより大容量の試料を保持する。いくつかの実施形態において、ペーパーウェルは、相分離を起こすことができ、その後の先行流体中での被分析物の濃縮を可能にする紙材からなる。いくつかの実施形態において、上記先行流体の流動は、被分析物の検出を可能にする吸収パッドに誘導される（例えば、図１３を参照）。
いくつかの実施形態において、上記デバイスは、上記ウェル中で重力を利用して流動及び巨視的な相分離を更に促進しながら、「流動時の濃縮」機構を利用する。いくつかの実施形態において、第１の相溶液と第２の相溶液とは、当該相溶液の粘度の差並びに当該紙材に対する親和性の差に起因して、異なる速度で流れ得ることから、ウェルは、相分離を促進するために十分な断面積を与える。いくつかの実施形態において、相溶液（複数可）がウェルを通って移動して先行流体中に現れる際に、ウェルは相分離及び／または目的とする被分析物の濃縮を向上すなわち促進する。いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡ試験ストリップはウェルに下流位置で直接接続されているので、先行流体中の濃縮された被分析物が最初にＬＦＡストリップに接触することになり、検出ステップが濃縮過程と同時に起こり、全体としてのアッセイ時間を更に短縮する。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは複数のウェルを備える。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは混合ウェルを備える。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは濃縮ウェルを備える。いくつかの実施形態において、上記ＡＴＰＳは、相分離及び／または目的とする被分析物の濃縮が起こる濃縮ウェルに印加される。いくつかの実施形態において、濃縮された被分析物は相分離後に混合ウェルから取り出され、濃縮ウェルに印加される。いくつかの実施形態において、濃縮ウェルは、濃縮ウェル及び／またはＬＦＡ中で相分離を向上／促進するラニングバッファを含む（例えば、図１４参照）。
いくつかの実施形態において、本デバイスは、上記ウェルの内容物を上記多孔質マトリクス中及び／または該マトリクス上に放出するためのアクチュエータを備える。いくつかの実施形態において、上記アクチュエータはウェルを穿刺するための機構を備える。
ＬＦＡ中の脱水されたＡＴＰＳ
いくつかの実施形態において、上記ＡＴＰＳまたはその構成成分は、上記多孔質マトリクスの少なくとも第１の部分上及び／またはその中で脱水される。いくつかの実施形態において、本デバイスへの試料の印加はＡＴＰＳに加水し、それによってＡＴＰＳまたはその構成成分を流体相に転換する。脱水は本デバイスの取り扱いをより容易にすることができるが、それは、ユーザーが単に試料（例えば、唾液）を本デバイスに添加することのみを必要とすることによる。いくつかの実施形態において、ユーザーは、目的とする被分析物の存在／非存在を検出するためのストリップに試料の溶液を印加するだけでよい。いくつかの実施形態において、試料の溶液はＬＦＡを通って流れ、ＡＴＰＳが再可溶化され、ＬＦＡ内での相分離及びその後の目的とする被分析物の濃縮を始動させる（例えば、図１５を参照）。
いくつかの実施形態において、所与のＡＴＰＳに対して必要な全ての構成成分が混合されて均一な溶液を形成し、上記ペーパーに印加され、次いで脱水される。試料溶液が脱水されたペーパーストリップに添加されると、試料が流れる際にＡＴＰＳ構成成分が再加水されることとなり、結果として相分離が起こる。濃縮された被分析物を含有する相がより低粘性であり、可能性としてより少量のポリマーまたはミセルを含有する一部のＡＴＰＳにおいては、当該の相はより速く流れることとなり、濃縮された被分析物が先行流体中に現れ、ＬＦＡに到達して検出を開始する。また、脱水されたＡＴＰＳの構成成分セグメントの長さ及び濃度は、異なる用途に対して調整することができる。
いくつかの実施形態において、上記ＡＴＰＳは上記ＬＦＡ上で脱水される。いくつかの実施形態において、第１のＡＴＰＳの構成成分はＬＦＡで脱水される。いくつかの実施形態において、第２のＡＴＰＳ成分はＬＦＡ上で脱水される。いくつかの実施形態において、混合相溶液はＬＦＡ上で脱水される。いくつかの実施形態において、第１の相溶液の構成成分及び／または第１のＡＴＰＳの構成成分は、ＬＦＡの第１の部分上で脱水される。いくつかの実施形態において、第２の相溶液の構成成分及び／または第２のＡＴＰＳの構成成分は、ＬＦＡの第２の部分上で脱水される。いくつかの実施形態において、上記第１の部分と第２の部分とは同一である。いくつかの実施形態において、第１の部分と第２の部分とは異なる。非限定的な例として、ＰＥＧ−塩ＡＴＰＳにおいて、ＰＥＧ及び塩溶液は、ペーパーの異なる部分またはセグメント中で別個に脱水される（例えば、図１６参照）。いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液及び／またはＡＴＰＳの構成成分をＬＦＡの異なる部分上で脱水することにより、より均一な濃度の第１／第２の相溶液の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分が与えられる。いくつかの実施形態において、第１／第２の相溶液の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分を異なる部分上で脱水することにより、加水後に第１の相溶液またはＡＴＰＳの構成成分を第１の方向に流し、且つ加水後に第２の相溶液及び／またはＡＴＰＳの構成成分を第２の方向に流すことができ、但し、第１の方向と第２の方向とは異なる。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、第１の方向に濃縮されるが、第２の方向では濃縮されない。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、第２の方向に濃縮されるが、第１の方向では濃縮されない。いくつかの実施形態において、第１／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分を異なる部分で脱水することにより、試料が第１／第２の方向に流れることを必要とすることなく、目的とする被分析物を第１／第２の方向に流すことができる（例えば、図１６Ｄ、１６Ｅ、及び１７を参照）。いくつかの実施形態において、第１／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分を異なる部分で脱水することにより、目的とする被分析物をより速く流し、結果としてより早く検出することができる。いくつかの実施形態において、第１／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分を異なる部分で脱水することにより、結果の信頼性の向上を可能にする。いくつかの実施形態において、第１／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分を異なる部分で脱水することにより、第１／第２の相溶液の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分（例えばＰＥＧ−塩ＡＴＰＳ）の凝集が防止される。いくつかの実施形態において、塩溶液を含む第１／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分が、複数のセグメントにおいて脱水される。いくつかの実施形態において、疎水性ポリマー（例えばＰＥＧ）を含まない第１／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳの構成成分が、複数のセグメントにおいて脱水される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧに富む相は検出膜内の流れを遅延させるために、脱水されたＰＥＧは検出区域の近傍に位置しない（例えば、図６４を参照）。いくつかの実施形態において、ＬＦＡストリップは、ＰＥＧまたは塩を含有しない空白スペーサを検出ゾーン近傍に備える（例えば、図６５を参照）。
いくつかの実施形態において、上記プローブはプローブ緩衝液中で提供される。いくつかの実施形態において、上記プローブ緩衝液はＬＦＡ上で脱水される。いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡはプローブ及び脱水されたプローブ緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、プローブ緩衝液は、プローブ−被分析物複合体のＬＦＡを通る流動を向上させる。
いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳの構成成分の脱水が、ＡＴＰＳの構成成分が液体の形態で添加されたデバイスと比較して、検出限界を向上させる。いくつかの実施形態において、液状のＡＴＰＳの構成成分を添加すると、患者由来の試料溶液が希釈される。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳの構成成分の脱水により、流動の間に、識別可能な第１の相溶液及び／または識別可能な第２の相溶液を展開させ、試験線及び対照線に到達することとなる目的とする被分析物またはプローブ−被分析物複合体を、先行流体の前部の小さな体積中に濃縮することができる。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物及びまたはプローブ−被分析物複合体を先行流体の前部に濃縮することによって、検出に必要な時間が減少することとなる。
ＬＦＡの設計／構造
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡストリップは第１の端部から第２の端部まで変化しない幅を有している。いくつかの実施形態において、上記幅は、ＬＦＡ内の流れの方向に垂直であり、且つ長さの面内の寸法として定義される。いくつかの実施形態において、ＬＦＡストリップの第１の部分が第１の幅を有し、ＬＦＡストリップの第２の部分が第２の幅を有し、第１の幅と第２の幅とは異なる。いくつかの実施形態において、第１の幅は第２の幅よりも大きく、一方他の実施形態においては、第１の幅は第２の幅よりも小さい。ある特定の実施形態において、ＬＦＡストリップは、２よりも多い幅を備えることが企図され、例えば、ストリップは連続的に狭くなってもよく、または３以上の位置で累進的に狭くなってもよい。いくつかの実施形態において、第１の部分は試料パッドを備え、第２の部分は検出区域を備える。いくつかの実施形態において、第１の部分は脱水されたプローブ緩衝液を備え、第２の部分は検出区域を備える（例えば、図６２を参照）。第１の部分が脱水されたプローブ緩衝液を備え、第２の部分が検出区域を備えるいくつかの実施形態においては、試料パッドを備える部分の幅が検出区域を備える部分の幅と同一であるＬＦＡストリップと比較して検出限界が向上する。いくつかの実施形態において、より広い試料パッドセグメントによって、幅が変化しないＬＦＡストリップに比較して、より多くの試料中の目的とする被分析物がプローブに結合することが可能になる。いくつかの実施形態において、より広い試料パッドセグメントによって、幅が変化しないＬＦＡストリップに比較して、より大きな体積の試料が可能となり、従って、より多くの目的とする被分析物がプローブに結合することが可能になる（例えば、図６３を参照）。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは勾配（例えば、ＬＦＡの長さに沿ったＬＦＡの深さの変化）を備える。ＬＦＡが勾配を備えていないいくつかの実施形態において、プローブ−被分析物複合体の一部が試料パッドに残存する。ＬＦＡが勾配を備えるいくつかの実施形態において、勾配なしのＬＦＡよりも、より多くのプローブ−被分析物複合体がＬＦＡを通って流れる（例えば、図６６を参照）。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、相対的に遅い速度で再可溶化され、プローブが、プローブ／プローブ緩衝液を相対的に速い速度で再可溶化する場合に比較して、プローブ上の結合部位をより完全に飽和させる、より大きな体積を有する試料を可能にすることを可能にする、脱水されたプローブ及び／またはプローブ緩衝液を含む部分を備え、結果として、競合アッセイにおける検出限界が向上する。いくつかの実施形態において、脱水されたＡＴＰＳまたはその構成成分は、プローブ及び目的とする被分析物に、それらがＡＴＰＳまたはその構成成分に到達する前に、互いに結合する時間を与えるために、脱水されたプローブ及び／またはプローブ緩衝液を含む部分の下流に配置される。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳ（構成成分）は、より小さな体積中にプローブ−被分析物複合体を濃縮する。いくつかの実施形態において、上記より小さい体積は、より大きな体積にわたって分布することに起因して、全てのプローブ−被分析物複合体が試験線及び対照線に到達することとはならない他の実施形態よりも、試験線及び対照線を通過するより多くのプローブ−被分析物複合体を含有する。いくつかの実施形態において、より小さな先行相中にプローブ−被分析物複合体を濃縮することによって、デバイスの感度及び／または信頼性が増加する。いくつかの実施形態において、より小さな先行相中にプローブ−被分析物複合体を濃縮することによって、検出時間が減少する。例えば、図６７を参照されたく、該図はＰＥＧ／塩ＡＴＰＳを用いた１つの可能な設計の略図を示す。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは図１６に示す構造に従って構成される。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは図２０に示す構造に従って構成される。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは図６２〜７０に示す構造に従って構成される。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、磁性／常磁性粒子を含むまたは該粒子と複合体を形成するプローブと共に使用するように設計される。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは、ペーパーストリップの端部に、ＡＴＰＳの第１及び第２の相溶液の流動を分割するために用いられるフォーク状物を有するペーパーストリップを備える。いくつかの実施形態において、ＬＦＡの検出区域は、上記フォーク状物の尖った先端部上に配置され、磁石が該尖った先端部の近傍または該尖った先端部に配置される（例えば、図２０を参照）。上記磁石は、ＬＦＡ検出区域に流入する流体中にプローブ／プローブ−被分析物複合体を濃縮し、これによって診断の感度の増加がもたらされる。逆に、いくつかの実施形態において、上記プローブは磁石または磁場を含み、本デバイスは、上記尖った先端部の近傍または該尖った先端部に配置される磁性粒子または常磁性粒子を備える。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは三次元構造を備える。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは三次元構造をもたらす多孔質マトリクスの層を備える。いくつかの実施形態において、上記三次元構造がＬＦＡとＡＴＰＳとを一体化する。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳは長い相分離時間を有し（例えばミセルＡＴＰＳ）、相分離時間は三次元構造を用いる（例えばＬＦＡストリップの高さを増加させる）ことによって改善される。いくつかの実施形態において、相溶液がＬＦＡを通って（例えば、多孔質マトリクスの層を通って）垂直に流れる際に、該混合相溶液は第１の相溶液と第２の相溶液とに分離する。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは厚さ（例えば、高さ、深さまたは垂直方向の寸法）を有する。いくつかの実施形態において、上記厚さは約０．１ｍｍ〜約３０ｃｍである。いくつかの実施形態において、厚さは約０．１ｍｍ〜約１ｍｍ、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約０．１ｍｍ〜約１ｃｍである。いくつかの実施形態において、厚さは約１ｍｍ〜１０ｍｍ、約１ｍｍ〜約１ｃｍ、約１ｍｍ〜約１．５ｃｍ、約１ｍｍ〜約３ｃｍ、約１ｍｍ〜約３．５ｃｍ、約１ｍｍ〜約４ｃｍ、約１ｍｍ〜約４．５ｃｍ、約１ｍｍ〜約５ｃｍ、約１ｍｍ〜約５．５ｃｍ、約１ｍｍ〜約６ｃｍ、約１ｍｍ〜約６．５ｃｍ、約１ｍｍ〜約７ｃｍ、約１ｍｍ〜約７．５ｃｍ、約１ｍｍ〜約８ｃｍ、約１ｍｍ〜約８．５ｃｍ、約１ｍｍ〜約９ｃｍ、約１ｍｍ〜約９．５ｃｍ、または約１ｍｍ〜約１０ｃｍである。いくつかの実施形態において、厚さは約０．５ｃｍ〜約５ｃｍである。
複数の経路
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、第１の経路及び第２の経路、または少なくとも第１の経路及び第２の経路を備える。いくつかの実施形態において、第１の相溶液は第１の経路を優先的通って流れ、第２の相溶液は第２の経路を優先的通って流れる。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物が、ペーパーを通る流動中に先行流体中に濃縮されない場合もある。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは、先行流体が適時に検出ゾーンを通過する第１の流体となるように流動の方向を変更するように設計される。いくつかの実施形態において、流動の方向変更は新しい流路の導入を含む。いくつかの実施形態において、流動の方向変更は三次元ペーパー構造の組み込みを含む。いくつかの実施形態において、流動の方向変更は、当該の流動の相に依存する優先的な流動が存在する複数の経路を提供するまたは一体化することを含む。いくつかの実施形態において、流動の方向変更は、上記の流動の方向変更のための複数の方法を組み合わせることを含む。いくつかの実施形態において、流動の方向変更によって、相分離が向上し且つ／または目的とする被分析物が検出ゾーンを通って流れるように誘導される。
いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、試料がＬＦＡに印加された後に導入される、ラニングバッファを含むＬＦＡセグメント及び乾燥した受入れ紙を含むＬＦＡセグメントを備えることによって、流動の方向を変更するように構成される。いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、試料がＬＦＡを通って流れ始めた後に導入される、ラニングバッファを含むＬＦＡセグメント及び乾燥した受入れ紙を含むＬＦＡセグメントを備えることによって、流動の方向を変更するように構成される。いくつかの実施形態において、標的は遅延流体中で濃縮され、この場合には、ラニングバッファが該遅延流体を（それを先行流体として）検出区域へと経路変更することとなる（例えば図を参照。エラー！ 参照元が見つからず。Ａ）。いくつかの実施形態において、ラニングバッファ及び乾燥した受入れ紙セグメントが、濃縮された被分析物を含有する先行流体を検出区域へと押出す（図１８Ｂ）。
いくつかの実施形態において、目的とする被分析物が複数存在し、本デバイスは、第１の目的とする被分析物を第１の相溶液中に分配し、第２の目的とする被分析物を第２の相溶液中に分配するように構成され、ＬＦＡは、第１の相溶液を第１の検出区域へと導く第１の経路を備え、ＬＦＡは、第２の相溶液を第２の検出区域へと導く第２の経路を備える。いくつかの実施形態において、第１の経路は第１の種類の多孔質マトリクスからなり、第２の経路は第２の種類の多孔質マトリクスからなり、第１の種類の多孔質マトリクスと第２の種類の多孔質マトリクスとは異なる（例えば、異なる多孔性、電荷、疎水性、三次元構造等）。いくつかの実施形態において、第１の種類の多孔質マトリクスは第２の種類の多孔質マトリクスよりもより疎水性／親水性である（例えば、図１９を参照）。いくつかの実施形態において、ポリマーに富む相溶液はより疎水性のストリップを優先的に通って流れ得る一方、濃縮された被分析物を含有するポリマーに乏しい相溶液はより親水性のペーパーを通って流れ得る。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、下流のＬＦＡの性能に影響を与える可能性がある汚染物質を含有する場合があるポリマーに富む相を、「精製」することによって濃縮される。いくつかの実施形態において、複数の目的とする被分析物の１種または複数種の目的とする被分析物が、ＡＴＰＳの異なる相中へと分配される。
いくつかの実施形態において、上記プローブは磁性粒子を含み、１または複数の磁石によってプローブ−被分析物複合体の方向が変更される。いくつかの実施形態において、上記１または複数の磁石はペーパーストリップに沿って配置され、ＬＦＡの特定の位置（例えば検出区域）で／該位置に向けてプローブを濃縮する。あるいは、いくつかの実施形態において、プローブは磁石を含み、１種または複数種の磁性／常磁性粒子によってプローブ−被分析物複合体の方向が変更される。いくつかの実施形態において、上記１種または複数種の磁性／常磁性粒子はペーパーストリップに沿って配置され、ＬＦＡの特定の位置（例えば検出区域）で／該位置に向けてプローブを濃縮する。
プローブ
ある特定の実施形態において、本明細書に記載のシステム及び／またはデバイスはプローブを含み、及び／または本明細書に記載される方法はプローブを利用し、該プローブは、目的とする被分析物と結合してプローブ−被分析物複合体を形成する結合部分を含む。本明細書で用いられる「目的とする被分析物」及び「プローブ−被分析物複合体」という用語は、別段の明示がない限りにおいて同義で用いられる。
いくつかの実施形態において、目的とする被分析物が単独で、優先的に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物が単独で、極度に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される。
いくつかの実施形態において、目的とする被分析物が単独で、優先的に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配されない。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物が単独で、極度に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配されない。
いくつかの実施形態において、プローブ−被分析物複合体が、優先的に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配され、それによって（プローブ−被分析物複合体の）目的とする被分析物が優先的に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される。
いくつかの実施形態において、プローブ−被分析物複合体が、極度に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配され、それによって（プローブ−被分析物複合体の）目的とする被分析物が極度に第１の相溶液または第２の相溶液または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される。
いくつかの実施形態において、目的とする被分析物（またはプローブ−被分析物複合体）のＡＴＰＳの第１／第２の相溶液への分配に関して用いられる場合に、「優先的に分配される」という表現は、ＡＴＰＳの別の相溶液よりも好ましい相溶液中に、より多くの量の目的とする被分析物が配置された状態となることを指す。
いくつかの実施形態において、目的とする被分析物（またはプローブ−被分析物複合体）のＡＴＰＳの第１／第２の相溶液への分配に関して用いられる場合に、「極度に分配される」という表現は、ＡＴＰＳの別の相溶液よりも好ましい相溶液中に、約９０％以上の目的とする被分析物が配置された状態となることを指す。
いくつかの実施形態において、より多くの量の目的とする被分析物が第１の相溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、約５０％を超える、または約５５％を超える、または約６０％を超える、または約６５％を超える、または約７０％を超える、または約７５％を超える、または約８０％を超える、または約８５％を超える、または約９０％を超える、または約９５％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える目的とする被分析物が、第１の相溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、約９９％を超える、または約９９．１％を超える、または約９９．２％を超える、または約９９．３％を超える、または約９９．４％を超える、または約９９．５％を超える、または９９．６％を超える、または約９９．７％を超える、または約９９．８％を超える、または約９９．９％を超える目的とする被分析物が、第１の相溶液中に分配される。
いくつかの実施形態において、より多くの量の被分析物が第２の相溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、約５０％を超える、または約５５％を超える、または約６０％を超える、または約６５％を超える、または約７０％を超える、または約７５％を超える、または約８０％を超える、または約８５％を超える、または約９０％を超える、または約９５％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える目的とする被分析物が、第２の相溶液中に分配される。いくつかの実施形態において、約９９％を超える、または約９９．１％を超える、または約９９．２％を超える、または約９９．３％を超える、または約９９．４％を超える、または約９９．５％を超える、または９９．６％を超える、または約９９．７％を超える、または約９９．８％を超える、または約９９．９％を超える目的とする被分析物が、第２の相溶液中に分配される。
いくつかの実施形態において、より多くの量の被分析物が第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態において、約５０％を超える、または約５５％を超える、または約６０％を超える、または約６５％を超える、または約７０％を超える、または約７５％を超える、または約８０％を超える、または約８５％を超える、または約９０％を超える、または約９５％を超える、または約９８％を超える、または約９９％を超える目的とする被分析物が、上記界面中に分配される。いくつかの実施形態において、約９９％を超える、または約９９．１％を超える、または約９９．２％を超える、または約９９．３％を超える、または約９９．４％を超える、または約９９．５％を超える、または９９．６％を超える、または約９９．７％を超える、または約９９．８％を超える、または約９９．９％を超える目的とする被分析物が、上記界面中に分配される。
いくつかの実施形態において、プローブ−被分析物複合体がＬＦＡに抽出及び／または捕集される（例えば、図２を参照）。
いくつかの実施形態において、プローブ及び／またはプローブ−被分析物複合体が、溶液中に再懸濁される（例えば再懸濁溶液）。いくつかの実施形態において、上記再懸濁溶液は水を含む。いくつかの実施形態において、再懸濁溶液は生理食塩水溶液を含む。いくつかの実施形態において、再懸濁溶液は緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、再懸濁溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を含む。いくつかの実施形態において、上記緩衝液は酢酸を含む。いくつかの実施形態において、緩衝液はトリスを含む。いくつかの実施形態において、緩衝液はエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤はホウ酸を含む。いくつかの実施形態において、緩衝液はホウ酸緩衝液である。いくつかの実施形態において、緩衝液はホウ酸リチウム緩衝液である。いくつかの実施形態において、緩衝液はホウ酸ナトリウム緩衝液である。
いくつかの実施形態において、上記再懸濁溶液は、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５または約１２のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、再懸濁溶液は約９のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、本デバイスは１種のプローブを備える、若しくは利用するように構成される、及び／または該デバイス上でのアッセイの実行は１種のプローブを利用する。いくつかの実施形態において、本デバイスは少なくとも２種の異なるプローブ、若しくは少なくとも３種の異なるプローブ、若しくは少なくとも４種の異なるプローブ、若しくは少なくとも５種の異なるプローブ、若しくは少なくとも７種の異なるプローブ、若しくは少なくとも１０種の異なるプローブ、若しくは少なくとも１５種の異なるプローブ、若しくは少なくとも２０種の異なるプローブを備える、または利用するように構成される、及び／あるいは該デバイス上でのアッセイの実行は上記の複数の異なるプローブを利用する。
いくつかの実施形態において、上記プローブは、合成ポリマー、金属、鉱物、ガラス、石英、セラミック、生物学的ポリマー、プラスチック、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン（デルリン（登録商標））、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、デキストラン、及びポリ塩化ビニルからなる群より選択されるポリマーを含む。いくつかの実施形態において、上記ポリエチレンはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、上記ポリプロピレンはポリプロピレングリコールである。いくつかの実施形態において、プローブは、コラーゲン、セルロース、及びキチンからなる群より選択される生物学的ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、金、銀、白金、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、及びこれらの合金からなる群より選択される金属を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子等）を含む。
いくつかの実施形態において、上記プローブはコーティングを更に含む。いくつかの実施形態において、上記コーティングはポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む。いくつかの実施形態において、コーティングはポリプロピレンを含む。いくつかの実施形態において、コーティングはポリプロピレングリコールを含む。いくつかの実施形態において、コーティングはデキストランを含む。いくつかの実施形態において、コーティングは親水性タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、コーティングは血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態において、コーティングは、第１の相溶液または第２の相溶液に対して親和性を有する。
いくつかの実施形態において、試料中の目的とする被分析物の量は非常に低く、その結果、当該被分析物は、ＬＦＡによる検出を可能にするために実質的に濃縮される必要がある。ある特定の実施形態において、実質的な濃縮は界面で達成される。それというのも、被分析物の濃縮の程度は、当該被分析物が分配される、または集中する相の体積に依存し、上記界面における「体積」はバルク相に比較して非常に小さくいことによる。
いくつかの実施形態において、目的とする被分析物を界面に向けて駆動するために、上記プローブは該界面に優先的に（または極度に）分配される。いくつかの実施形態において、上記プローブは、その表面化学に起因して、界面に優先的に（または極度に）分配される。非限定的な例として、ポリエチレングリコール−リン酸カリウム（ＰＥＧ／塩）系などのポリマー−塩ＡＴＰＳ系の界面にプローブ−被分析物複合体を駆動するために、プローブは、ＰＥＧ（またはＰＥＧ化物）に結合されて、ＰＥＧに富む相とのＰＥＧ−ＰＥＧ相互作用を促進し、及び／または親水性タンパク質で修飾されて、ＰＥＧに乏しい相との親水性相互作用を促進する。特異的な抗体または標的に結合することができる他の分子で修飾された、かかる最適化されたプローブを用いて、目的とする被分析物が界面で捕捉及び捕集される。上記界面の体積は非常に小さいことから、被分析物は高度に濃縮され、その後のＬＦＡに印加される（図８）。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳの界面に分配され得る金ナノプローブ（ＧＮＰ）が調製され、動作条件が最適化されて、非常に高いＧＮＰ／被分析物の回収率での迅速な相分離時間が可能になる。非限定的な例として、ＬＦＡを用いてＡＴＰＳからの界面抽出との組み合わせの後で、トランスフェリン（Ｔｆ）の検出が１００倍向上することが実証された（実施例５を参照）。
いくつかの実施形態において、プローブ−被分析物複合体が、ＡＴＰＳ中で固液界面へ分配される。いくつかの実施形態において、上記固体はＡＴＰＳを収容するチャンバの壁である。いくつかの実施形態において、固体は捕集器である。いくつかの実施形態において、固体は固体ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、上記固体ポリマーは、ポリエチレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン（デルリン（登録商標））、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、ポリ塩化ビニル、及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、固体ポリマーがポリプロピレンを含む（例えば、図９を参照）。いくつかの実施形態において、プローブ−被分析物複合体は固体に付着し、高度に濃縮される。というのは、該複合体が固液界面における小さな体積中に存在し、バルク相の溶液によって希釈されないことによる。いくつかの実施形態において、濃縮された被分析物を攪乱することなく上記バルク相が除去され、洗浄によって回収され、その後ＬＦＡに印加される（図１０）。いくつかの実施形態において、この手法は被分析物を大幅に濃縮し、且つ外力（例えば磁石）を用いることなく捕集を可能にする。あるいは、プローブは磁性材料を含み、磁石を用いてこの方法が用いられる。いくつかの実施形態において、これらのプローブは、極度の被分析物濃縮に向けて、界面において濃縮されるように修飾される。上述のように、この手法は磁石を使用することにより、ＡＴＰＳにより非特異的に濃縮されるその他の汚染物質から、目的とする被分析物を更に分離することができる。いくつかの実施形態において、磁気プローブは、特定の場所（界面）において最初に非常に小さな体積中に濃縮されるので、ＡＴＰＳ濃縮によって、磁気プローブがより効率的に作用することができる。従って、濃縮された被分析物を捕集するために、より小さい磁石またはより弱い磁場しか必要とされない。いくつかの実施形態において、ＡＴＰＳ界面濃縮と磁気プローブとの組み合わせによって、現在の最先端に比較して、より効果的、迅速、かつ安価なデバイスの開発が可能になる。
結合部分
いくつかの実施形態において、上記結合部分は、目的とする被分析物に結合する分子である。いくつかの実施形態において、結合部分は目的とする被分析物に特異的に結合する分子である。いくつかの実施形態において、「特異的に結合する」とは、当該分子が、他の分子に対するよりも目的とする被分析物に対して優先的に結合する、または目的とする被分析物に対してより大きな親和性をもって結合することを指す。非限定的な例として、抗体は該抗体に対して生じた抗原に選択的に結合することとなる。また、非限定的な例として、ＤＮＡ分子は、ストリンジェントな条件下で、実質的に相補的な配列に結合し、無関係な配列には結合しない。いくつかの実施形態において、「特異的結合」とは、分子（例えば、タンパク質及び他の生物学的物質）の異種集団中の、目的とする被分析物の存在を判定する能力をもつ結合反応を指すことができる。いくつかの実施形態において、結合部分は、特定の目的とする被分析物に結合し、試料中に存在する他の分子に対しては、有意な量では結合しない。
いくつかの実施形態において、上記結合部分は、抗体、レクチン、タンパク質、糖タンパク質、核酸、単量体の核酸、多量体の核酸、アプタマー、アプタザイム、小分子、ポリマー、レクチン、炭水化物、多糖、糖、脂質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、結合部分は、対目的とする被分析物分子と結合が可能な分子である。
いくつかの実施形態において、上記結合部分は抗体または抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｖ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｈｓＦｖフラグメント、カメロイド抗体、二重特異性抗体、及び後述する他のフラグメントが挙げられるが、これらに限定はされない。
いくつかの実施形態において、「抗体」とは、実質的に免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによってコードされる、１種または複数種のポリペプチドからなるタンパク質を指す。別段の明示がない限りにおいて、本明細書で用いられる「抗体」と「免疫グロブリン」という用語は同義で用いられる。いくつかの実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子は、免疫グロブリン定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン遺伝子は、非限定的な例として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンまたはミュー定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン遺伝子は免疫グロブリン可変領域遺伝子である。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン遺伝子は軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン遺伝子は重鎖を含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは、順に免疫グロブリンの種別、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥにそれぞれ対応する。
いくつかの実施形態において、上記免疫グロブリンは四量体を含む。いくつかの実施形態において、上記四量体は同一の２対のポリペプチド鎖からなり、各対は１の「軽」（約２５ｋＤａ）鎖及び１の「重」（約５０〜７０ｋＤａ）鎖を有する。いくつかの実施形態において、各連鎖のＮ末端が、主として抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を特徴付ける。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖及び重鎖を指す。
いくつかの実施形態において、上記抗体は完全な免疫グロブリンを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、様々なペプチダーゼを用いた消化によって生成された、特徴が明確化された多くのフラグメントから選択される。いくつかの実施形態において、上記ペプチダーゼはペプシンである。いくつかの実施形態において、上記ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合する軽鎖であり、Ｆａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成する。いくつかの実施形態において、上記Ｆ（ａｂ）’２は温和な条件下で還元されて、上記ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に転化する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ’単量体は、実質的にヒンジ領域の一部を含むＦａｂからなる。いくつかの実施形態において、上記Ｆａｂ’フラグメントは、化学的にまたは組換えＤＮＡ手法を利用することによるかの何れかによって新規に合成される。いくつかの実施形態において、上記抗体フラグメントは完全な抗体の改変によって生成される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは組換えＤＮＡ手法を用いて新規に合成される。いくつかの態様において、上記抗体は単鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、可変重鎖及び可変軽鎖が（直接またはペプチド結合子を介して）互いに結合して連続したポリペプチドを形成する単鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、抗体は単鎖Ｆｖ抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、直接結合したかまたはペプチドをコードする結合子によって結合したかのいずれかの、ＶＨ−及びＶＬ−コード配列を含む核酸から発現させることができる、共有結合によって結合したＶＨ−ＶＬ−ヘテロ二量体を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬは単一のペプチド鎖として互いに接続され、ＶＨ及びＶＬドメインは非共有結合的に会合する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂがファージ上に提示され、ここで一方の連鎖（重鎖または軽鎖）がｇ３キャプシドタンパク質及び可溶性分子として周辺質に搬出される相補鎖に融合される。いくつかの実施形態において、上記２の連鎖は、同一または異なるレプリコン上にコードされ得る。いくつかの実施形態において、各Ｆａｂ分子における２の抗体鎖が翻訳後に会合し、該ダイマーは、一方の連鎖の例えばｇ３ｐへの結合を介してファージ粒子中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、抗体はファージ上に提示される。
いくつかの実施形態において、上記結合部分はアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、上記アプタマーは核酸から形成される抗体類似体を含む。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ナノ−ＣＨＥＭ−ＦＥＴなどの、再配置が直接検出されることとなる、いくつかのアッセイにおいて検出される標識の結合を必要としない。いくつかの実施形態において、結合部分はアプタザイムを含む。いくつかの実施形態において、上記アプタザイムは核酸から形成される抗体類似体を含む。いくつかの実施形態において、アプタザイムは、第２の特定の被分析物の存在下においてのみ、配置を変更するように作用して、特定の分子を捕捉する。
「小分子」または「有機小分子」という用語は、一般的に医薬品に用いられる有機分子に匹敵する大きさの分子をいう。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸等）を含まない。好ましい小分子は、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａまでの大きさの範囲である。
いくつかの実施形態において、上記抗体フラグメントは、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは組換え宿主細胞によって直接産生される。いくつかの実施形態において、上記Ｆａｂ、ＦｖまたはＳｃＦｖ抗体フラグメントはＥ． ｃｏｌｉ中で発現し、且つＥ． ｃｏｌｉから分泌され、従って、大量のこれらフラグメントを容易に製造することが可能になる。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは抗体ファージライブラリから単離される。いくつかの実施形態において、上記Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントをＥ． ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる。いくつかの実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組換え宿主細胞培養から直接単離される。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントはインビボ半減期が増加する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、サルベージレセプタ結合エピトープ残基を含む。抗体フラグメントの産生のための他の技法は当業者には明らかであろう。ある特定の実施形態において、最適な抗体は単鎖Ｆｖフラグメントである。いくつかの実施形態において、上記ＦｖまたはｓＦｖは、定常領域を欠く完全な結合部位を有し、従って、該ＦｖまたはｓＦｖはインビボでの使用中における非特異的結合の低減に好適である。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは「直鎖状抗体」である。いくつかの実施形態において、上記直鎖状抗体フラグメントは単一特異性である。いくつかの実施形態において、直鎖状抗体フラグメントは二重特異性である。
いくつかの実施形態において、上記抗体フラグメントは二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）である。いくつかの実施形態において、上記二重特異性抗体は、二価または二重特異性であってよい２の抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。
いくつかの実施形態において、上記抗体フラグメントは単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、上記単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部または軽鎖可変領域の全て若しくは一部含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。
いくつかの実施形態において、上記プローブは検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、プローブは検出可能な特性を有する。検出可能な標識／検出可能な特性としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。例示的な有用な標識としては、蛍光ナノ粒子(例えば、量子ドット（Ｑドット））、蛍光色素(例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等、例えば、モレキュラー・プローブス社（米国オレゴン州ユージーン）を参照のこと）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４１Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ等）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられるその他のもの）、様々な発色標識、磁性または常磁性標識（例えば、磁性及び／または常磁性ナノ粒子）、スピン標識、放射線不透過性標識などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
あるいはまたは更に、上記プローブは、検出可能な標識を含む別の粒子に結合する。あるいはまたは更に、プローブは、検出可能な特性を有する他の粒子に結合する。いくつかの実施形態において、プローブは検出区域で検出可能な信号(例えば、試験線、対照線）を与える。いくつかの実施形態において、上記検出可能な標識／特性は、発色標識／特性、蛍光標識／特性、酵素標識／特性、発熱標識／特性及び放射性標識／特性からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、プローブは金ナノ粒子であり、検出可能な特性が色である。いくつかの実施形態において、上記色は橙色、赤色及び紫色から選択される。
いくつかの実施形態において、上記プローブは、磁性及び／または常磁性粒子を含む。いくつかの実施形態において、上記磁性粒子は、鉄、ニッケル、コバルト、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、アルニコ、アルミニウム−ニッケル−コバルト合金を含む。いくつかの実施形態において、磁性粒子は希土類金属の合金を含む。いくつかの実施形態において、上記希土類金属は、スカンジウム、イットリウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、またはそれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態において、上記磁性成分は希土類鉱物を含む。いくつかの実施形態において、上記希土類鉱物は天然磁石を含む。いくつかの実施形態において、上記磁性粒子は鉄を含む。いくつかの実施形態において、磁性粒子は強磁性材料を含む。いくつかの実施形態において、上記強磁性材料は軟強磁性材料である。いくつかの実施形態において、上記軟強磁性材料は焼鈍鉄を含む。いくつかの実施形態において、軟強磁性材料は、亜鉛、ニッケル、マンガンまたはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、軟強磁性材料は、マンガン−亜鉛フェライト（ＭｎａＺｎ（ｌ−Ａ）Ｆｅ２Ｏ４）及びニッケル−亜鉛フェライト（ＮｉａＺｎ（ｌ−ａ）Ｆｅ２Ｏ４）から選択される。いくつかの実施形態において、強磁性材料は硬強磁性材料である。いくつかの実施形態において、上記硬強磁性材料は、アルニコまたはフェライトを含む。いくつかの実施形態において、硬強磁性材料は、ストロンチウムフェライト、ＳｒＦｅ１２Ｏ１９（ＳｒＯ・６Ｆｅ２Ｏ３）、バリウムフェライト、ＢａＦｅ１２Ｏ１９（ＢａＯ・６Ｆｅ２Ｏ３）及びコバルトフェライト、ＣｏＦｅ２Ｏ４（ＣｏＯ・Ｆｅ２Ｏ３）から選択される。いくつかの実施形態において、上記磁性成分はフェライトを含む。いくつかの実施形態において、上記フェライトはヘマタイト（Ｆｅ２Ｏ３）から選択される。いくつかの実施形態において、磁性成分はフェライトを含む。いくつかの実施形態において、上記フェライトはマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）から選択される。いくつかの実施形態において、上記磁性粒子はＦｅ３Ｏ４を含む。いくつかの実施形態において、磁性粒子はＦｅ２Ｏ３を含む。いくつかの実施形態において、磁性粒子はＦｅ３Ｏ４から本質的になる。いくつかの実施形態において、磁性粒子はＦｅ２Ｏ３から本質的になる。
いくつかの実施形態において、上記磁性粒子は、球体、立方体、楕円体、棒体、カプセル形状、錠剤形状、特徴のない無秩序な形状から選択される形状であるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態において、上記磁性粒子は、約１ｎｍ〜約１００μｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約２０ｎｍ〜約１μｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約１００ｎｍ〜約７５０ｎｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約５００ｎｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約１μｍ〜約１５μｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約２μｍ〜約１０μｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約１μｍ〜約５μｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約１μｍの平均径を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、その最も広い点で約０．５μｍ〜約２０μｍの平均径を有する。
図２１は、ＡＴＰＳ中で被分析物を濃縮するために磁気プローブを用いる方法の、例証としての、但し非限定的な一例を示す。目的とする被分析物に対して特異的な抗体（または他の結合部分）を用いて、ＡＴＰＳ中のバルク相の１つの中で、磁気プローブによって標的が捕捉及び濃縮される。多様な分子を含有する複雑な試料において、ＡＴＰＳは、目的とする被分析物またはプローブに対して類似した物理化学的特性を有する分子を非特異的に濃縮する場合がある。しかしながら、磁石または外部磁場の使用により、磁気捕捉プローブに結合した、目的とする被分析物の更なる濃縮及び単離が検出の前に達成される。
いくつかの実施形態において、本デバイスは磁性材料を備える。いくつかの実施形態において、上記磁性材料は磁場の発生源である。いくつかの実施形態において、上記磁石は、マグネタイト、天然磁石、コバルト、ニッケル、マンガン、アルミニウム、ガドリニウム、ジスプロシウム、セラミック（例えば、フェライト）及びアルニコから選択される物質を含む。いくつかの実施形態において、磁石は鉱石を含む。いくつかの実施形態において、磁石は鉄鉱石を含む。いくつかの実施形態において、磁石は希土類磁石を含む。いくつかの実施形態において、上記希土類磁石は、サマリウム−コバルト磁石及びネオジム−鉄−ホウ素磁石（ＮＩＢ）から選択される。いくつかの実施形態において、磁石は、約０．１ガウス、約０．２ガウス、約０．３ガウス、約０．４ガウス、約０．５ガウス、約０．６ガウス、約０．７ガウス、約０．８ガウス、約０．９ガウスまたは約１ガウスの磁界強度を有する。いくつかの実施形態において、磁石は、約１ガウス、約２ガウス、約３ガウス、約４ガウス、約５ガウス、約６ガウス、約７ガウス、約８ガウス、約９ガウス、または約１０ガウスの磁界強度を有する。いくつかの実施形態において、磁石は、約１０ガウス、約２０ガウス、約３０ガウス、約４０ガウス、約５０ガウス、約６０ガウス、約７０ガウス、約８０ガウス、約９０ガウス、約１００ガウス、約１１０ガウス、約１２０ガウス、約１３０ガウス、約１４０ガウス、約１５０ガウス、約１６０ガウス、約１７０ガウス、約１８０ガウス、約１９０ガウス、約２００ガウス、約２５０ガウス、約３００ガウス、約３５０ガウス、約４００ガウス、約４５０ガウス、または約５００ガウスの磁界強度を有する。いくつかの実施形態において、磁石は約１００ガウスの磁界強度を有する。
いくつかの実施形態において、上記磁石は、目的とする被分析物の第１の相溶液または第２の相溶液中への分配を促進する及び／または増加させるように構成される。いくつかの実施形態において、磁石は、ＬＦＡを通る目的とする被分析物の流動を促進する及び／または増加させるように構成される。いくつかの実施形態において、磁石は、本デバイスへの取り付け及び／または該デバイスからの取り外しが可能である。いくつかの実施形態において、磁石は捕集器中／上に設けられる。
いくつかの実施形態において、本デバイスは、少なくとも１種の目的とする被分析物、若しくは少なくとも２種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも３種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも４種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも５種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも７種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも１０種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも１５種の異なる目的とする被分析物、若しくは少なくとも２０種の異なる目的とする被分析物と相互作用する１種または複数種のプローブを利用する及び／または備えるように構成される。
目的とする被分析物／試料
様々な実施形態において、本明細書に記載のデバイス、システム及び／または方法は、１種または複数種の目的とする被分析物（複数可）を検出及び／または定量する。いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は、タンパク質、抗原、生体分子、糖部分、脂質、核酸、ステロール、有機小分子、及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、植物、動物、ウィルス、真菌、原生動物、及び細菌からなる群より選択される生物に由来する。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は生物学的分子を含む。いくつかの実施形態において、上記生物学的分子は、核酸、タンパク質、脂質、小分子、代謝産物、糖、抗体、抗原、酵素、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記糖はラクトースである。
「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義で用いられる。いくつかの実施形態において、上記タンパク質はアミノ酸残基のポリマーを指す。いくつかの実施形態において、タンパク質は、１種または複数種のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマーをいう。
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において同義で用いられる。いくつかの実施形態において、上記核酸は、少なくとも２の互いに共有結合したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸は三本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸はホスホジエステル結合を含む。いくつかの実施形態において、核酸は核酸類似体を含む。いくつかの実施形態において、上記核酸類似体は、ホスホジエステル結合以外の及び／またはホスホジエステル結合に加えて、それらに限定されないが、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはＯ−メチルホスホラミダイト結合などの結合を含む骨格を有する。いくつかの実施形態において、核酸類似体は陽性の骨格、非イオン性骨格及び非リボース骨格ら選択される骨格を有する核酸類似体から選択される。いくつかの実施形態において、核酸は、１種または複数種の炭素環式糖を含有する。いくつかの実施形態において、核酸は、そのリボース−リン酸骨格の修飾を含む。いくつかの実施形態において、これらの修飾は、標識などの追加部分の付加を容易にするために行われる。いくつかの実施形態において、これらの修飾は、生理的環境におけるかかる分子の安定性及び半減期を増加させるために行われる。
いくつかの実施形態において、上記生物学的分子はウィルスに由来する。いくつかの実施形態において、生物学的分子はウィルス粒子である。いくつかの実施形態において、上記ウィルス粒子は、インフルエンザウィルス、免疫不全ウィルス、呼吸器系ウィルスからなる群より選択されるウィルスに由来する。いくつかの実施形態において、上記ウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、パピローマウィルス、ポックスウィルス、パルボウィルス、アストロウィルス、カリシウィルス、ピコルナウィルス、コロナウィルス、フラビウィルス、トガウィルス、ヘペウィルス、レトロウィルス、オルトミクソウィルス、アレナウィルス、ブンヤウィルス、フィロウィルス、パラミクソウィルス、ラブドウィルス及びレオウィルスから選択される。いくつかの実施形態において、ウィルスは、ロタウィルス、オルビウィルス、コルティウィルス、マールブルグウィルス、風疹ウィルス、ノーウォークウィルス、ライノウィルス、エプスタイン・バーウィルス、及びサイトメガロウィルスから選択される。いくつかの実施形態において、ウィルスは天然痘ウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスは肝炎ウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスは狂犬病ウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスは呼吸器合胞体ウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスは流行性耳下腺炎ウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスは麻疹ウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスはエボラウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスはポリオウィルスである。いくつかの実施形態において、ウィルスは季節性Ｈ１Ｎ１、ブタＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２インフルエンザから選択される。いくつかの実施形態において、ウィルスはバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージはＭ１３バクテリオファージである。
いくつかの実施形態において、上記生物学的分子は細菌に由来する。いくつかの実施形態において、生物学的分子は細菌粒子である。いくつかの実施形態において、上記細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａから選択される属のものである。いくつかの実施形態において、細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓである。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ、及びＹｅｒｓｉｎｉａからなる群より選択される属のものである。いくつかの実施形態において、細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｉａｅである。いくつかの実施形態において、細菌はＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである。いくつかの実施形態において、細菌はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。
いくつかの実施形態において、細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍである。いくつかの実施形態において、細菌はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉである。
いくつかの実施形態において、上記細菌は口腔細菌である。いくつかの実施形態において、上記口腔細菌は歯周病を引き起こす。いくつかの実施形態において、口腔細菌は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓから選択される。
いくつかの実施形態において、上記試料または目的とする被分析物は原生動物に由来する。いくつかの実施形態において、上記原生動物はアメーバ症、ジアルジア症、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症、トリコモナス症、シャーガス病、リーシュマニア症、睡眠病、アメーバ赤痢、アカントアメーバ角膜炎及び原発性アメーバ性髄膜脳炎からなる群より選択される疾患を引き起こす。いくつかの実施形態において、原生動物はマラリアを引き起こすことが知られているＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属である。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｚｓｅ（ｐＬＤＨ）である。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は食物アレルゲンである。いくつかの実施形態において、上記食物アレルゲンは植物生体分子である。いくつかの実施形態において、上記植物生体分子は植物タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記植物タンパク質はグルテンである。いくつかの実施形態において、上記食物アレルゲンは植物生体分子である。いくつかの実施形態において、上記植物生体分子は植物タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記植物タンパク質はグルテンである。いくつかの実施形態において、食物アレルゲンは動物生体分子である。いくつかの実施形態において、上記動物生体分子は多糖である。いくつかの実施形態において、上記多糖類はラクトースである。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物はタンパク質である。いくつかの実施形態において、上記タンパク質は生物学的試料（例えば血液、血漿、血清、尿、唾液、涙／眼液、綿棒により採取された体液）中に存在する及び／また該試料に由来する。いくつかの実施形態において、タンパク質はバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、タンパク質は疾患または疾病のバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物はトロポニンまたはそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物はトランスフェリンまたはそのフラグメントである。
いくつかの実施形態において、本デバイスは、試料中の複数の被分析物を検出する／定量するように構成される。いくつかの実施形態において、上記ＡＴＰＳは、類似した物理化学的特性をもつ複数の被分析物を濃縮する。いくつかの実施形態において、上記ＬＦＡは、複数の目的とする被分析物を試験することができる。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは複数の試験線を備える。いくつかの実施形態において、ＬＦＡは、第１の目的とする被分析物に対して特異的である第１の捕捉部分を有する第１の試験線及び、第２の目的とする被分析物に対して特異的である第２の捕捉部分を有する第２の試験線を備え、第１の捕捉部分と第２の捕捉部分とは異なる。本デバイスは、約１の試験線について約２の試験線、約３の試験線、約４の試験線、約５の試験線、約６の試験線、約７の試験線、約８の試験線、約９の試験線または約１０の試験線を備えることができる。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は試料中に存在する。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は試料に由来する。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は試料から単離される。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は試料から精製される。
いくつかの実施形態において、上記試料は、生物学的有機体由来の組織／流体、食品試料、化学的試料、薬物試料、環境試料、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、上記食品試料は、ナッツ、乳製品、小麦製品、大豆製品、及び卵製品から選択される。いくつかの実施形態において、上記食品試料は豆である。いくつかの実施形態において、上記食品は果実である。
いくつかの実施形態において、上記試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、唾液試料、涙／眼液試料、綿棒採取試料、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、上記試料は、細菌、ウィルス、原生動物、藻類、真菌、薬物、病原体、毒素、環境汚染物質、及びそれら構成成分、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される供給源に由来する。いくつかの実施形態において、試料は生物兵器剤である。いくつかの実施形態において、試料は水試料である。いくつかの実施形態において、上記水試料は水試験施設由来のものである。いくつかの実施形態において、水試料は浄水施設由来のものである。
いくつかの実施形態において、上記試料は、建物、無生物の構造物または化学溶液に由来する。いくつかの実施形態において、試料は、カーペット、塗料、防腐処理木材、消臭剤、洗浄製品、化粧品、衣類、昆虫忌避剤、消臭剤、床、壁、天井、リノリウム、プラスチック、昆虫スプレー、及び歯科ゲル／ペーストに由来する。
ＩＩ．方法
本明細書においては、試料中の１種または複数種の目的とする被分析物（複数可）の検出方法が開示される。試料中の１種または複数種の目的とする被分析物（複数可）の定量方法であって、本明細書に開示のデバイスのいずれかの１に該試料を印加すること、及びラテラルフローアッセイ上で該目的とする被分析物（複数可）を定量することを含む、上記定量方法もまた提供される。試料中の目的とする被分析物の濃縮方法もまた提供される。様々な実施形態において、本方法は、本明細書に開示のデバイスのいずれかの１に試料を印加すること、及びラテラルフローアッセイ上で該目的とする被分析物の有無を検出することを含む。様々な実施形態において、本方法は、本明細書に開示のデバイスのいずれかの１に試料を印加すること、及び水性二相系中及び／またはラテラルフローアッセイ上で目的とする被分析物（複数可）を濃縮することを含む。本明細書において、試料中の１種または複数種の目的とする被分析物（複数可）の分配／分離方法が開示される。様々な実施形態において、本方法は、本明細書に開示のデバイスのいずれかの１に試料を印加すること、及び水性二相系中及び／またはラテラルフローアッセイ上で目的とする被分析物を分配／分離することを含む。いくつかの実施形態において、本方法（複数可）は、ＡＴＰＳに試料を印加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法（複数可）は、ＬＦＡに試料を印加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＡＴＰＳと一体化されたＬＦＡに試料を印加することを含む。
いくつかの実施形態において、本方法はＡＴＰＳに試料を印加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法はＬＦＡに試料を印加することを含み、ここでは該ＬＦＡ上でＡＴＰＳが脱水される。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は、ＡＴＰＳの相溶液または界面に集中する。いくつかの実施形態において、本方法は、上記相溶液または相間から濃縮された目的とする被分析物を抽出すること、及び該被分析物をＬＦＡに印加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＡＴＰＳを、例えば本明細書に記載されるような捕集器に接触させることを含み、ここで、目的とする被分析物、プローブ及び／またはプローブ−被分析物複合体は、捕集器に対する親和性を有し、捕集器と相互作用する。いくつかの実施形態において、本方法は、捕集器が検出ウェルに挿入される際に、捕集器上で目的とする被分析物を検出することを含む（図１１）。
いくつかの実施形態において、本方法は、試料から目的とする被分析物を抽出することを含む。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物の抽出はＡＴＰＳの使用を更に含んでもよい。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物の抽出は、試料の破砕、溶解、摩砕、配合、切り刻み、撹拌、遠心分離または切断を含んでもよい。いくつかの実施形態において、固体食物由来の食物アレルゲンを試験するためには、試料は最初に摩砕される。いくつかの実施形態において、抽出緩衝液によって、粉砕試料から目的とする被分析物が抽出される。いくつかの実施形態において、摩砕試料は、試料から目的とする被分析物を抽出するためのＡＴＰＳ液と混合される。
いくつかの実施形態において、本方法は、試料及び／または目的とする被分析物をプローブと混合することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、試料及び／または目的とする被分析物をＡＴＰＳ及び／またはＬＦＡに印加する前に、試料及び／または目的とする被分析物をプローブと混合して、プローブ−被分析物複合体を生成させることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、試料及び／または目的とする被分析物をＡＴＰＳ及び／またはＬＦＡに印加する前に、プローブ−被分析物複合体を洗浄することを更に含む。
ＩＩＩ．使用
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法及びデバイスは、試料中の目的とする被分析物を検出するために用いられる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法及びデバイスは、試料中の目的とする被分析物を定量するために用いられる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法及びデバイスは、試料中の目的とする被分析物を検出及び定量するために用いられる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、疾病または疾患の診断を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に開示のデバイスのＬＦＡ上の結果を観察すること、及び該結果に基づいて診断を決定することを含んでもよい。特定の場合において、上記アッセイの結果は診断の方向を決定する一方、他の文脈においては、上記アッセイ結果は鑑別診断の文脈で評価されてもよい。いくつかの実施形態において、疾病または疾患の診断には、更なるデバイスによる更なる試験を必要とする。
感染症
いくつかの実施形態において、上記疾病または疾患は感染症である。いくつかの実施形態において、上記感染症は呼吸器感染症である。いくつかの実施形態において、感染症はインフルエンザである。いくつかの実施形態において、感染症は熱帯病である。
いくつかの実施形態において、上記感染症は感冒、子宮頸癌、ヘルペス、天然痘、水痘、帯状疱疹、肝炎、狂犬病、流行性耳下腺炎、及びポリオから選択される。いくつかの実施形態において、感染症は結核である。いくつかの実施形態において、感染症はエボラである。いくつかの実施形態において、感染症はマラリアである。いくつかの実施形態において、感染症は麻疹である。いくつかの実施形態において、感染症は百日咳である。いくつかの実施形態において、感染症は破傷風ある。いくつかの実施形態において、感染症は髄膜炎である。いくつかの実施形態において、感染症は梅毒である。いくつかの実施形態において、感染症はＢ型肝炎である。
性感染症
いくつかの実施形態において、上記疾病または疾患は性感染症である。いくつかの実施形態において、上記性感染症は、クラミジア、淋病、ヘルペス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウィルス感染症、梅毒、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ａ型肝炎、細菌性膣炎、ケジラミ、疥癬、トリコモナス症、アメーバ症、クリプトスポリジウム、ジアルジア症、カンジダ症、及び細菌性赤痢から選択される。
歯周病
いくつかの実施形態において、上記疾病または疾患は歯周病である。いくつかの実施形態において、上記歯周病は歯肉炎である。いくつかの実施形態において、歯周病は歯周炎である。いくつかの実施形態において、歯周病は口腔内の細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓの存在によって引き起こされる。
アレルゲン／毒素
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は、液体または食品試料中の汚染物質である。いくつかの実施形態において、目的とする被分析物は、液体または食品試料中のアレルゲンである。いくつかの実施形態において、上記アレルゲンは、乳製品アレルギー、卵アレルギー、大豆アレルギー、小麦アレルギー、貝アレルギー、及びナッツアレルギーから選択される。いくつかの実施形態において、上記ナッツアレルギーはピーナッツアレルギーである。いくつかの実施形態において、上記疾病または疾患は、食品または食品成分に対する不耐性または感受性である。いくつかの実施形態において、上記疾病または疾患はグルテン不耐症である。
いくつかの実施形態において、上記目的とする被分析物は環境毒素である。上記環境毒素は農薬及び除草剤から選択される。いくつかの実施形態において、上記環境毒素は糸状菌及び真菌から選択される。いくつかの実施形態において、環境毒素はポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）及びフタル酸エステルから選択される。いくつかの実施形態において、環境毒素は、揮発性有機化合物、ダイオキシン、アスベスト、重金属、クロロホルム及び塩素から選択される。
本明細書において企図される様々な実施形態としては、下記の１または複数、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定される必要はない。
実施形態１：ａ．ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）と、ｂ．第１の相溶液及び第２の相溶液に分離する混合相溶液を含む水性二相系（ＡＴＰＳ）とを備える、試料中の目的とする被分析物の検出及び／または定量のためのデバイス。
実施形態２：上記混合相の第１の相溶液及び第２の相溶液への上記分離が上記ＬＦＡ内で起こる、実施形態１のデバイス。
実施形態３：上記混合相の第１の相溶液及び第２の相溶液への上記分離が上記ＬＦＡ内で起こらない、実施形態１のデバイス。
実施形態４：上記目的とする被分析物が上記混合相溶液と接触し、該目的とする被分析物が第１の相溶液または第２の相溶液中に分配される、実施形態１〜３のいずれか１のデバイス。
実施形態５：上記目的とする被分析物が上記混合相溶液と接触し、該目的とする被分析物が第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される、実施形態１〜３のいずれか１のデバイス。
実施形態６：上記目的とする被分析物が分配時に濃縮される、実施形態４または５のデバイス。
実施形態７：第１の相溶液がミセル溶液を含み、第２の相溶液がポリマーを含む、実施形態１〜６のいずれか１のデバイス。
実施形態８：第１の相溶液がミセル溶液を含み、第２の相溶液が塩を含む、実施形態１〜６のいずれか１のデバイス。
実施形態９：上記ミセル溶液が界面活性剤を含む、実施形態７または８のデバイス。
実施形態１０：上記界面活性剤が、イオン性界面活性剤、双性イオンを含む界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤からなる群より選択される、実施形態９のデバイス。
実施形態１１：上記ミセル溶液がＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含む、実施形態７〜１０のいずれか１に記載のデバイス。
実施形態１２：第１の相溶液が第１のポリマーを含み、第２の相溶液が第２のポリマーを含む、実施形態１〜６のいずれか１のデバイス。
実施形態１３：第１／第２のポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びデキストランから選択される、実施形態１２のデバイス。
実施形態１４：第１の相溶液がポリマーを含み、第２の相溶液が塩を含む、実施形態１〜６のいずれか１のデバイス。
実施形態１５：第１の相溶液がポリエチレングリコールを含み、第２の相溶液がリン酸カリウムを含む、実施形態１４のデバイス。
実施形態１６：第１の相溶液が表１の構成成分１から選択され、第２の相溶液が表１の構成成分２から選択される、実施形態１〜６のいずれか１のデバイス。
実施形態１７：上記目的とする被分析物が、タンパク質、抗原、生体分子、有機低分子、糖部分、脂質、核酸、ステロール、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態１〜６のいずれか１のデバイス。
実施形態１８：上記目的とする被分析物が、植物、動物、ウィルス、原生動物、真菌及び細菌からなる群より選択される生物に由来する、実施形態１７のデバイス。
実施形態１９：上記目的とする被分析物と相互作用するプローブを更に備える、実施形態１〜１７のいずれか１のデバイス。
実施形態２０：少なくとも１の目的とする被分析物、または少なくとも２の異なる目的とする被分析物、または少なくとも３の異なる目的とする被分析物、または少なくとも４の異なる目的とする被分析物を含む、または少なくとも５の異なる目的とする被分析物、または少なくとも７の異なる目的とする被分析物、または少なくとも１０の異なる目的とする被分析物、または少なくとも１５の異なる目的とする被分析物、または少なくとも２０の異なる目的とする被分析物と相互作用する１種または複数種のプローブを備える、実施形態１９のデバイス。
実施形態２１：少なくとも２の異なるプローブ、または少なくとも３の異なるプローブ、または少なくとも４の異なるプローブ、または少なくとも５の異なるプローブ、または少なくとも７の異なるプローブ、または少なくとも１０の異なるプローブ、または少なくとも１５の異なるプローブ、または少なくとも２０の異なるプローブを備える、実施形態１９または２０のデバイス。
実施形態２２：上記プローブが、合成ポリマー、金属、鉱物、ガラス、石英、セラミック、生物学的ポリマー、プラスチック、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む、実施形態１９のデバイス。
実施形態２３：上記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーを含む、実施形態１９のデバイス。
実施形態２４：上記プローブが、デキストラン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される生物学的ポリマーを含む、実施形態１９のデバイス。
実施形態２５：上記プローブが、金、銀、白金、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される金属を含む、実施形態１９のデバイス。
実施形態２６：上記プローブがナノ粒子を含む、実施形態１９のデバイス。
実施形態２７：上記ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１９のデバイス。
実施形態２８：上記プローブがコーティングを含む、実施形態１７〜２７のいずれか１のデバイス。
実施形態２９：上記コーティングが、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールから選択されるポリマーを含む、実施形態２８のデバイス。
実施形態３０：上記コーティングがデキストランを含む、実施形態２８のデバイス。
実施形態３１：上記コーティングが親水性タンパク質を含む、実施形態２８のデバイス。
実施形態３２：上記コーティングが血清アルブミンを含む、実施形態２８のデバイス。
実施形態３３：上記コーティングが、第１の相溶液または第２の相溶液に対して親和性を有する、実施形態２８〜３２のいずれか１のデバイス。
実施形態３４：上記プローブが、上記目的とする被分析物に結合する結合部分を更に含む、実施形態２８〜３３のいずれか１のデバイス。
実施形態３５：上記結合部分が、抗体、レクチン、タンパク質、糖タンパク質、核酸、低分子、ポリマー、脂質、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態３４のデバイス。
実施形態３６：上記結合部分が抗体または抗体フラグメントである、実施形態３４のデバイス。
実施形態３７：上記プローブが磁性粒子を含む、実施形態１８〜３５のいずれか１のデバイス。
実施形態３８：磁石を更に備える、実施形態３７のデバイス。
実施形態３９：上記磁石が、上記目的とする被分析物の第１の相溶液または第２の相溶液中への分配を促進する及び／または増加させるように構成される、実施形態３８のデバイス。
実施形態４０：上記磁石が、上記ＬＦＡを通る上記目的とする被分析物の流動を促進する及び／または増加させるように構成される、実施形態３８のデバイス。
実施形態４１：実施形態３８〜４０のいずれか１のデバイスであって、上記磁石が、該デバイスへ取り付け可能及び／または該デバイスから取り外し可能である、上記デバイス。
実施形態４２：上記ＡＴＰＳと接触して配置されるように構成された捕集器を更に備え、該捕集器と第１の相溶液及び／または第２の相溶液との界面で、上記目的とする被分析物が分配される、実施形態１〜４１のいずれか１のデバイス。
実施形態４３：上記捕集器が、プラスチック、メソポーラス材料、シリカ、ポリプロピレン、磁石、細孔を有する材料、溝を有する材料、及びそれらの組み合わせから選択される材料を含む、実施形態４２のデバイス。
実施形態４４：上記プローブが検出可能な標識を含む、実施形態１９〜４３のいずれか１のデバイス。
実施形態４５：上記検出可能な標識が、発色標識、蛍光標識、酵素標識、発熱標識、放射性標識、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態４４のデバイス。
実施形態４６：上記ＬＦＡが多孔質マトリクスを備える、実施形態１〜４５のいずれか１のデバイス。
実施形態４７：上記多孔質マトリクスが、上記混合相溶液、第１の相溶液、第の二相溶液、及び／または目的とする被分析物が上記ＬＦＡを通って流れることを可能にするために十分に多孔質である、実施形態４６のデバイス。
実施形態４８：上記多孔質マトリクスが、上記混合相溶液、第１の相溶液、第の二相溶液並びに／または目的とする被分析物が上記ＬＦＡを通って垂直及び／若しくは水平に流れるために十分に長い並びに／または深い、実施形態４６または４７のデバイス。
実施形態４９：第１の相溶液が第１の速度で上記多孔質マトリクスを通って流れ、第２の相溶液が第２の速度で上記多孔質マトリクスを通って流れ、第１の速度と第２の速度が異なる、実施形態４６〜４８のいずれか１のデバイス。
実施形態５０：上記多孔質マトリクスが、セルロース、線維ガラス、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷変性ナイロン、ポリエーテルスルホン、及びそれらの組み合わせから選択される材料を含む、実施形態４６〜４９のいずれか１のデバイス。
実施形態５１：上記ＬＦＡが、上記目的とする被分析物と相互作用する、目的とする被分析物の捕捉部分を含む、実施形態１〜５０のいずれか１のデバイス。
実施形態５２：競合アッセイが用いられる場合に、上記ＬＦＡが競合アッセイを提供するように構成される、実施形態１〜５１のいずれか１のデバイス。
実施形態５３：上記ＬＦＡが上記目的とする被分析物を含む、実施形態１〜５１のいずれか１のデバイス。
実施形態５４：サンドイッチアッセイが用いられる場合に、上記ＬＦＡがサンドイッチアッセイを提供するように構成される、実施形態５３のデバイス。
実施形態５５：上記ＬＦＡが、上記プローブまたはその構成成分と相互作用するプローブ捕捉部分を含む、実施形態１８〜５４のいずれか１のデバイス。
実施形態５６：第１の相溶液の構成成分及び／または第２の相溶液の構成成分が、上記ＬＦＡストリップ上及び／または該ストリップ中で脱水され、且つ、上記試料の添加の際に、上記混合相溶液が第１の相溶液及び第２の相溶液中に分配される、実施形態１〜５５のいずれか１のデバイス。
実施形態５７：上記ＬＦＡが、上記ＡＴＰＳの少なくとも一部、第１の相溶液の少なくとも一部、第２の相溶液の少なくとも一部、目的とする上記被分析物の再懸濁溶液、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される溶液を収容するために十分な体積を有するウェルを備える、実施形態１〜５６のいずれか１のデバイス。
実施形態５８：上記十分な体積が、約１ナノリットル〜約５ミリリットルである、実施形態５７のデバイス。
実施形態５９：上記ウェルが、角部、端部、中央部、接続部、中心を外れた部位、及び屈曲部から選択されるＬＦＡの位置に配置される、実施形態５７のデバイス。
実施形態６０：上記ウェルがパッドを備える、実施形態５６〜５８のいずれか１のデバイス。
実施形態６１：上記パッドが、塩パッド、緩衝液パッド、フィルターパッド、界面活性剤パッド、プローブパッド、ポリマーパッド、及びそれらの組み合わせからなる群いり選択される、実施形態６０のデバイス。
実施形態６２：上記ＬＦＡが、図１６、２０及び６２〜７０に示される構造より選択される構造に従って構成される、実施形態１〜６１のいずれか１のデバイス。
実施形態６３：上記ＬＦＡが複数の経路を備える、実施形態１〜６２のいずれか１のデバイス。
実施形態６４：上記ＬＦＡが乾燥した受入れ紙を備える、実施形態１〜６３のいずれか１のデバイス。
実施形態６５：ラニングバッファを備える、実施形態１〜６４のいずれか１のデバイス。
実施形態６６：実施形態１〜６５のいずれか１のデバイスであって、該デバイスへの試料の投入のためのポートを備える、上記デバイス。
実施形態６７：上記ポートがＡＴＰＳに接続される、実施形態６６のデバイス。
実施形態６８：上記ＡＴＰＳと上記ＬＦＡが一体化され、上記ポートがＬＦＡに接続される、実施形態６６のデバイス。
実施形態６９：上記ポートが、管、ロート、弁、シリンジ、ストロー、流路、プランジャ、ピストン、ポンプ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される構造体を備える、実施形態６６〜６８のいずれか１のデバイス。
実施形態７０：動力源を必要としない、実施形態１〜６９のいずれか１のデバイス。
実施形態７１：実施形態１〜７０のいずれか１のデバイスであって、上記ＡＴＰＳ及び上記ＬＦＡが該デバイスの使用前に一体化される、上記デバイス。
実施形態７２：実施形態１〜７０のいずれか１のデバイスであって、上記ＡＴＰＳ及び上記ＬＦＡが該デバイスの使用前に分離されている、上記デバイス。
実施形態７３：上記ＡＴＰＳに上記ＬＦＡを挿入するように構成されている、実施形態７２のデバイス。
実施形態７４：ａ：上記ＡＴＰＳを収容するためのチャンバを備える第１の構成要素と、ｂ：上記ＬＦＡを備える第２の構成要素とを備える、実施形態７２または７３のデバイス。
実施形態７５：上記ＡＴＰＳ中に上記試料及び／または目的とする被分析物を送達するアクチュエータを備える、実施形態１〜７４のいずれか１のデバイス。
実施形態７６：上記ＬＦＡに溶液を送達するアクチュエータを備える、実施形態１〜７５のいずれか１のデバイス。
実施形態７７：上記溶液が、上記混合相溶液、第１の相溶液、第２の相溶液、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態７６のデバイス。
実施形態７８：上記ＡＴＰＳ及び上記ＬＦＡが単一の筐体内に収容される、実施形態１〜７７のいずれか１のデバイス。
実施形態７９：携帯型デバイスである、実施形態１〜７８のいずれか１のデバイス。
実施形態８０：試料中の目的とする被分析物の検出及び／または定量方法であって、ａ：上記試料を実施形態１〜７８のいずれか１のデバイスに印加することと、ｂ：上記ＬＦＡ上で有無を検出する及び／または上記目的とする被分析物を定量することとを含む、上記方法。
実施形態８１：上記ＡＴＰＳに上記試料を印加することを含む、実施形態８０の方法。
実施形態８２：上記ＡＴＰＳと一体化された上記ＬＦＡに上記試料を印加することを含む、実施形態８０の方法。
実施形態８３：上記ＡＴＰＳ中で上記目的とする被分析物を濃縮すること含む、実施形態８０〜８２のいずれか１の方法。
実施形態８４：上記ＬＦＡ中で上記目的とする被分析物を濃縮することを含む、実施形態８０〜８３のいずれか１の方法。
実施形態８５：上記試料が、生物学的有機体由来の組織／流体、食品試料、化学試料、薬物試料、環境上の試料、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態８０〜８４のいずれか１の方法。
実施形態８６：上記試料が、血液試料、綿棒採取試料、血清試料、血漿試料、尿試料、唾液試料、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態８０〜８５のいずれか１の方法。
実施形態８７：上記試料が、細菌、ウィルス、原生動物、藻類、真菌、薬物、病原体、哺乳動物、毒素、環境汚染物質、及びそれらの構成成分、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される供給源に由来する、実施形態８０〜８６のいずれか１の方法。
実施形態８８：上記目的とする被分析物が生物学的分子を含む、実施形態８０〜８７のいずれか１の方法。
実施形態８９：上記生物学的分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、脂質、低分子、糖、抗体、抗原、酵素、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態８８の方法。
実施形態９０：多孔質マトリクスを備える、試料中の目的とする被分析物の検出のためのペーパー流体デバイスであって、上記多孔質マトリクスが、ａ：ＡＴＰＳまたはその構成成分を受け入れる及び／または含有するように構成され、ｂ：上記ＡＴＰＳまたはその構成成分が流体相中にある場合に、該ＡＴＰＳまたはその構成成分が上記多孔質マトリクスを通って流れることが可能なように構成され、且つそのように流れることが可能であるために十分な多孔性を有する、上記デバイス。
実施形態９１：上記ＡＴＰＳまたはその構成成分を含有する、実施形態９０のペーパー流体デバイス。
実施形態９２：上記ＡＴＰＳまたはその構成成分が、第１の相溶液、第２の相溶液、及び、第１の相溶液と第２の相溶液との混合物を含む混合相溶液からなる群より選択される、実施形態９０または９１のペーパー流体デバイス。
実施形態９３：上記ＡＴＰＳまたはその構成成分が、上記多孔性マトリクスの少なくとも第１の部分上及び／または該部分中で脱水される、実施形態９１または９２のペーパー流体デバイス。
実施形態９４：上記多孔性マトリクスの第１の部分が、該多孔質マトリクスの第２の部分とは異なる幅を有する、実施形態９３のペーパー流体デバイス。
実施形態９５：実施形態９４のペーパー流体デバイスであって、該デバイスへの上記試料の印加によって上記ＡＴＰＳが加水され、それによって流体相のＡＴＰＳまたはその構成成分を与えるように構成される、実施形態９４のペーパー流体デバイス。
実施形態９６：上記混合相溶液、第１の相溶液、第２の相溶液、上記試料、プローブ、及びそれらの組み合わせから選択される溶液を収容するためのウェルを更に備える、実施形態９２〜９５のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態９７：上記ウェルが、該ウェルの内容物を上記多孔質マトリクス中及び／または該マトリクス上に向けて放出するためのアクチュエータを備える、実施形態９６のペーパー流体デバイス。
実施形態９８：上記ウェルがパッドを備える、実施形態９６または９７のデバイス。
実施形態９９：上記パッドが、塩パッド、緩衝液パッド、フィルターパッド、界面活性剤パッド、プローブパッド、ポリマーパッド、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態９８のデバイス。
実施形態１００：使用中に、第１の相溶液及び第２の相溶液が異なる速度で上記多孔質マトリクスを通って流れる、実施形態９２〜９９のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１０１：使用中に、第１の相溶液と第２の相溶液が異なる方向に多孔質マトリクスを通って流れる、実施形態９２〜１００のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１０２：第１の相溶液がミセル溶液を含み、第２の相溶液がポリマーを含む、実施形態９２〜１０１のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１０３：第１の相溶液がミセル溶液を含み、第２の相溶液が塩を含む、実施形態９２〜１０１のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１０４：上記ミセル溶液が界面活性剤を含む、実施形態１０２または１０３のペーパー流体デバイス。
実施形態１０５：上記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、双性イオンを含む界面活性剤、及びイオン性界面活性剤からなる群より選択される、実施形態１０４のペーパー流体デバイス。
実施形態１０６：上記ミセル溶液がＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含む、実施形態１０５のペーパー流体デバイス。
実施形態１０７：第１の相溶液がポリマーを含み、第２の相溶液がポリマーを含む、実施形態９３〜１０１のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１０８：第１の相溶液がポリマーを含み、第２の相溶液が塩を含む、実施形態９２〜１０１のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１０９：第１の相溶液がポリエチレングリコールを含み、第２の相溶液がリン酸カリウムを含む、実施形態１０８のペーパー流体デバイス。
実施形態１１０：第１の相溶液が表１の構成成分１から選択され、第２の相溶液が表１の構成成分２から選択される、実施形態９２〜１０１のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１１１：図１６、２０及び６２〜７０に示される構造から選択される構造に従って構成される、実施形態９０〜１１０のいずれか１に係るペーパー流体デバイス。
実施形態１１２：上記多孔性マトリクスが第１の経路及び第２の経路を備える、実施形態９０〜１１１のいずれか１に係るペーパー流体デバイス。
実施形態１１３：第１の相溶液が優先的に第１の経路を通って流れ、第２の相溶液が優先的に第２の経路を通って流れる、実施形態１１２のペーパー流体デバイス。
実施形態１１４：上記目的とする被分析物に結合して、プローブ−被分析物複合体を生成するプローブを備える、実施形態９０〜１１３のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１１５：上記目的とする被分析物がプローブ−被分析物複合体中のプローブに結合している、実施形態９０〜１１４のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１１６：上記プローブが磁性粒子を含む、実施形態１１４または１１５のペーパー流体デバイス。
実施形態１１７：上記磁性粒子を上記多孔質マトリクスの一部に引き付けるように配向した磁場を更に備え、該磁性粒子にかかる該磁場の力が、上記プローブ−被分析物複合体の上記多孔質マトリクスの一部に向かう流動を高める、実施形態１１６のペーパー流体デバイス。
実施形態１１８：上記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））、デキストラン、ポリ塩化ビニル、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーを含む、実施形態１１４〜１１７のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１１９：上記プローブが、セルロース及びキチンからなる群より選択される生物学的ポリマーを含む、実施形態１１４〜１１８のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１２０：上記プローブが、金、銀、チタン、ステンレス鋼、アルミニウム、白金、及びそれらの合金、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される金属を含む、実施形態１１４〜１１９のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１２１：上記プローブがナノ粒子を含む、実施形態１１４〜１２０のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１２２：上記ナノ粒子が金ナノ粒子である、実施形態１２１のペーパー流体デバイス。
実施形態１２３：上記プローブがコーティングを含む、実施形態１１４〜１２２のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１２４：上記コーティングが、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールから選択されるポリマーを含む、実施形態１２３のペーパー流体デバイス。
実施形態１２５：上記コーティングがデキストランを含む、実施形態１２３のペーパー流体デバイス。
実施形態１２６：上記コーティングが親水性タンパク質を含む、実施形態１２３のペーパー流体デバイス。
実施形態１２７：上記コーティングが血清アルブミンを含む、実施形態１２３のペーパー流体デバイス。
実施形態１２８：上記コーティングが、第１の相溶液または第２の相溶液に対して親和性を有する、実施形態１２３〜１２７のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１２９：上記プローブが、上記目的とする被分析物に結合する結合部分を含む、実施形態１１４〜１２８のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１３０：上記結合部分が、抗体、レクチン、タンパク質、代謝産物、糖タンパク質、核酸、小分子、ポリマー、及び脂質からなる群より選択される、実施形態１２９のペーパー流体デバイス。
実施形態１３１：上記結合部分が抗体または抗体フラグメントである、実施形態１２９のペーパー流体デバイス。
実施形態１３２：上記プローブが検出可能な標識を含む、実施形態１１４〜１３１のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１３３：上記検出可能な標識が、発色標識、蛍光標識、酵素標識、発熱標識、放射性標識、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態１３２のペーパー流体デバイス。
実施形態１３４：乾燥した受入れ紙を備え、第１の相溶液または第２の相溶液が、優先的に上記多孔質マトリクスを通って該乾燥した受入れ紙に向かって流れる、実施形態９０〜１３３のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１３５：ラニングバッファを備え、第１の相溶液及び／または第２の相溶液が、該ラニングバッファと接触すると、上記多孔性マトリクスを通ってより速く流れる、実施形態９０〜１３４のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１３６：上記多孔質マトリクスが、セルロース、線維ガラス、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、電荷変性ナイロン、ポリエーテルスルホン、及びそれらの組み合わせから選択される材料を含む、実施形態９０〜１３５のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１３７：上記多孔質マトリクスがプローブ捕捉部分を含み、使用中に、該プローブ捕捉部分が上記プローブまたはその構成成分と相互作用する、実施形態９０〜１３６のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１３８：上記多孔性マトリクスが目的とする被分析物の捕捉部分を含み、使用時に、該目的とする被分析物の捕捉部分が、当該の目的とする被分析物またはその構成成分と相互作用する、実施形態９０〜１３７のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１３９：実施形態１３８のペーパー流体デバイスであって、該ペーパー流体デバイスが使用中である場合に、上記ＬＦＡがサンドイッチアッセイを提供するように構成される、上記デバイス。
実施形態１４０：上記多孔質マトリクスが上記目的とする被分析物を含む、実施形態９０〜１３７のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１４１：実施形態１４０のペーパー流体デバイスであって、該ペーパー流体デバイスが使用中である場合に、上記ＬＦＡが競合アッセイを提供するように構成される、上記デバイス。
実施形態１４２：上記多孔性マトリクスが、上記目的とする被分析物が該多孔性マトリクスを通って流れる際に、該目的とする被分析物を濃縮するように構成される、実施形態９０〜１４１のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１４３：対照被分析物を更に含み、上記多孔性マトリクス上での該対照被分析物と上記目的とする被分析物とを比較することにより、該目的とする被分析物の定量が行われる、実施形態９０〜１４２のいずれか１のペーパー流体デバイス。
実施形態１４４：試料中の目的とする被分析物の検出または定量方法であって、ａ：実施形態９０〜１４３のいずれか１のデバイスに上記試料を印加することと、ｂ：有無を検出する及び／または上記目的とする被分析物を定量することとを含む、上記方法。
以下の特定の非限定的実施例は、単なる説明として解釈されるべきであり、本開示を制限するものとしていかようにも解釈されるべきではない。更に詳述することなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて本開示を最大限に利用できると考えられる。本明細書に引用されている全ての出版物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
実施例１．二相系において磁石または固体により濃縮させるためにＰＥＧ化金ナノプローブを用いるＡＴＰＳ
２つの手法を、水性二相系（ＡＴＰＳ）をラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）と統合して、ＬＦＡの感度を改善することについて調査した。第１の手法は、ＡＴＰＳ溶液から標的タンパク質を捕捉し得る磁気ナノプローブを収集するために、磁石を利用した。第２の手法は、ナノプローブをＡＴＰＳとポリプロピレン表面との固液界面に分配できるように表面化学が操作されて、シリンジまたは磁石を使用することなく迅速で容易な収集を可能する、新たに発見された現象を利用した。
磁気ナノ粒子を効率的に回収するため、磁気ナノ粒子のサイズは、磁場に応答するほど大きい必要があると推測された。しかし、粒子のサイズが大きすぎると、粒子は、ＬＦＡ試験ストリップの中を移動することに困難を生じ得る。
この問題に対処するため、金被覆磁気ナノプローブ（ＧＭＰ）と一緒にＡＴＰＳを使用して、最初に、試料溶液中の標的生体分子を捕捉した。高価な嵩高磁石を使用して、弱い磁場に応答し得る溶液中の粒子または大型のナノプローブを収集することを避けるため、最初にＡＴＰＳを使用して、最初に、ＧＰＭがＡＰＴＳの２つの嵩高相のうちの１つに小さい体積に受動的に濃縮するようにした。続いて、安価で移動式の磁石を使用して、ＧＰＭを迅速に回収し、生体分子を捕捉した。ＧＭＰの金コーティングは、ＬＦＡの発色指標としても作用するので、ＧＭＰをＩＦＡストリップに直接適用した。
ＡＴＰＳを使用してＧＭＰの磁気抽出を改善することに加えて、ＡＴＰＳの相分離は、ＧＭＰ及び磁場の使用によって利益を得ていることが見出された。ＰＥＧ塩ＡＴＰＳ相は、数時間のオーダーで完全に分離した。下部ＰＥＧ不足相のナノプローブの濃度が、巨視的なＰＥＧ不足相におけるＰＥＧ豊富ドメインの最小限の飛沫同伴の結果として一定のままであるので、濃縮試料の抽出は、系が平衡に達する前に生じる可能性があるが、後に続くＬＦＡのために十分な量の下部相の抽出を達成するために、依然として３０分が必要であった。あるいは、ＡＴＰＳにおけるＧＭＰは、相分離が誘発されると、ＰＥＧ不足ドメインに極度に、ほぼ瞬時に分配された。ＧＭＰを含有するＰＥＧ不足ドメインは、おそらくＧＭＰが磁場に応答してＰＥＧ不足ドメインを引っ張ることに起因して、磁場の存在下で互いに見つけ合って、より容易に合体することができる。この力は、重力と共に、ＰＥＧ不足ドメインの合体を更に推進し、したがって、相分離の加速をもたらし、抽出に十分な量の下部相を僅か１０分以内に生じる。
この研究では、流動の問題を有することなくＬＦＡ試験ストリップの中を移動するのに十分に小さいＧＭＰを、最初に調製した。次にこれらのＧＭＰを使用して、９：１（上部相：下部相）の体積比を生じるＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液において、モデルタンパク質のトランスフェリン（Ｔｆ）を捕捉した。小型磁石（直径１／８”×厚さ１／３２”）を溶液の中に置いて、相分離を加速させた。ＧＰＭ及び捕捉されたタンパク質を１０分後に回収し、小型磁石を取り出し、ＧＭＰ−Ｔｆ複合体を検出のためにＬＦＡに直接適用した。
前述の手法は、磁気ナノプローブを用いるＡＴＰＳを使用してＴｆを効果的に濃縮及び検出するが、小型磁石を依然として必要とした。以下の手法は、外部磁場を使用せず、代わりにＰＥＧ化金ナノプローブ（ＰＧＮＰ）の表面化学を操作して、ＡＴＰＳとポリプロピレン（ＰＰ）表面との固液界面に極度に分配させることによって、標的ナノプローブ複合体の抽出の可能性を探った。ポリマーまたは塩のみから構成された水溶液が使用されたとき、ＰＧＮＰが固液界面に分配されないので、この特有の現象はＡＴＰＳ特異的であることが見出された。更に、ＰＧＮＰが本発明者たちのＡＴＳのポリプロピレン（ＰＰ）表面に極度に分配されるが、ガラス表面には分配されないので、この現象は材料特異的であることも見出された。
ＰＰ−ＡＴＰＳ固液界面における標的ＰＧＮＰ複合体の収集を推進するため、抗Ｔｆ抗体が装飾されたＰＧＮＰを、Ｔｆを含有するＡＴＰＳ溶液に加え、続いて市販のＰＰストローをＡＴＰＳの中に沈めた。ＰＧＮＰは、ＡＴＰＳにおいて標的タンパク質を最初に捕捉し、次に優先的にＰＰ表面に分配された。１０分後、ＰＰストローをＡＴＰＳから取り出し、有意な量のタンパク質ＧＮＰ複合体が、依然として表面に吸着していた。このことは、シリンジを使用して濃縮Ｔｆ−ＰＧＮＰを手作業で抽出する必要性を、効果的に排除した。
この試験において、ＰＧＮＰは、ＡＴＰＳにおいてＰＰ−液界面に分配された。次にこれらのＰＧＮＰを使用して、１：１の体積比を生じるＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液においてＴｆを捕捉した。ＰＰストローをＡＴＰＳ溶液に沈め、ＰＧＮＰ及び捕捉タンパク質を、１０分後に、溶液からストローを引き抜くことによって回収した。ストロー上のＰＧＮＰ−Ｔｆ複合体をランニングバッファーで洗浄し、検出のためにＬＦＡに直接適用した。ＰＰ−ＡＴＰＳ界面に最小限の体積が関連し、ストローからＰＧＮＰを洗い落とすのに小さい体積が必要であるので、ＰＧＮＰは、極度に濃縮され、ＬＦＡにおけるＴｆの検出限界は、５０倍改善した。
ＬＦＡストリップを調製するため、競合機構を利用するＬＦＡ試験を実施した。競合アッセイでは、対象の標的はニトロセルロース膜に固定化されて、試験線を形成する。ナノプローブ（ＧＭＰまたはＰＧＮＰ）上の一次抗体に対する固定化二次抗体が、対照線を構成する。ＬＦＡでは、試料がナノプローブと最初に接触したとき、目的分子が試料中に存在する場合、目的分子は、ナノプローブに装飾された特定の抗体に結合する。試料中に存在する目的分子が、ナノプローブ上の抗体を飽和する場合、これらのナノプローブは、試験ストリップに固定化された目的分子と、もはや結合することができない。その結果、ナノプローブは、試験線において可視バンドを形成せず、このことは陽性の結果を示す。他方、試料がナノ粒子上の抗体を飽和できる濃度で目的分子を含有しない場合、ナノ粒子上のこれらの抗体は、試験ストリップに固定化された標的分子に結合し、試験線に可視バンドを形成することができる。このことは、陰性の結果を示す。更に、試料中の目的分子の存在にかかわらず、ナノプローブ上の抗体は、対照線の固定化二次抗体に結合し、ことのことは、十分な試料が試験線を通って吸収排出されて、対照線に到達したことを示している。可視対照線の存在は、有効な試験であることを示している。
ＧＮＰを調製するため、直径５０ｎｍの酸化鉄磁石ナノ粒子を金で被覆した。簡潔には、酸化鉄粒子を、０．０１Ｍのクエン酸ナトリウムで希釈し、１０分間撹拌した。続いて、１％ｗ／ｖの塩化金溶液の４回の追加を、１０分間の撹拌の間隔を置いて、酸化鉄ナノ粒子溶液に適用した。溶液は、塩化金の添加後に黒色から栗色に変わった。次に金被覆磁気ナノ粒子を、磁石の使用により回収した。
捕集機は、小型ネオジム磁石（直径１／８”×厚さ１／３２”、ＫＪ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を、飲用ストローの先端に付けることによって構築した。磁石にパラフィルムを巻いて、溶液中のＧＭＰとの直接的な接触を防止した。
ＧＭＰがＰＥＧ塩ＡＴＰＳの下部ＰＥＧ不足相に極度に分配されるかを確認するため、３０μＬのＧＭＰを、９：１の体積比を生じる２ｍＬのＡＴＰＳ溶液に加えた。磁石の存在が相分離を加速するかを確認するため、分配実験を、磁気収集子を用いて、または用いることなく実施した。下部相の体積を、それぞれの実験において１０分及び３０分に測定した。
次にＧＭＰを、ＡＴＰＳ及びＬＦＡに組み込むことができるかを試験した。最初に、様々な濃度のＴｆを添加した、２ｍＬの９：１のＡＴＰＳ溶液を調製した。３０μＬのＧＭＰを各溶液に適用し、続いて磁気収集子を加えた。溶液を２５℃の水浴中に置き、１０分間インキュベートした。インキュベーション時間の後、収集子を溶液から取り出し、５０μＬのランニングバッファーを含有する管に移した。小型磁石をストローから取り外し、ストローに収集されたＧＭＰを、ストローをランニングバッファー中で数秒間振とうさせることにより洗い落とした。次にストローを取り出し、ＬＦＡ試験ストリップを、収集されたＧＭＰを含有するランニングバッファーに浸けた。１０分後、試験ストリップを管から取り出し、試験ストリップの画像を、Ｃａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）の使用により撮影した。
そのままの金ナノ粒子を調製して、直径がおよそ２５〜３０ｎｍの粒径を有する清澄なサクラ色の溶液を生成した。ＰＰＧＮＰを調製するため、３２０ｍｇのヤギ抗Ｔｆ抗体を２０ｍＬのコロイド金溶液と共に３０分間インキュベートし、続いてＰＥＧ：ＮＰの５０００：１のモル比を使用してチオール化ＰＥＧ２０００を加え、更に３０分間インキュベートした。コロイド金の表面への他のタンパク質の非特異的結合を防止するため、２ｍＬの１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を混合物に加え、更に１５分間混合した。得られた溶液を、インキュベーションの時間にわたって、振とう器により穏やかに混合した。遊離非結合抗体、ＰＥＧ及びＢＳＡを除去するため、続いて混合物を４℃及び９，０００ｇで３０分間遠心分離した。ＰＧＮＰのペレットを１％ＢＳＡ溶液で洗浄し、この洗浄ステップを２回繰り返した。最後に、回収したＰＧＮＰを３ｍＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。
１：１体積比を生じ、様々なＴｆ濃度を含有するＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液を、最初にガラス管の中に調製した。５μＬのＧＮＰ溶液をＴｆ−ＡＴＰＳ溶液に加えて、最終体積を１ｍＬにした。ＡＴＰＳ溶液を十分に混合し、ＰＰストローを、それぞれのＡＴＰＳ溶液に挿入した。次に溶液を２５℃で１５分間インキュベートした。それぞれの混合物では、ＰＰストローをＡＴＰＳ溶液から注意深く取り出した。ＰＰ−ＡＴＰＳ界面の総体積がおよそ１μＬであると想定して、４９μＬの試験緩衝液を使用し、ＡＴＰＳ溶液に浸したストローの部分から、吸着したＴｆ−ＧＮＰ複合体を洗浄して、総体積の５０μＬを達成した。ストローの内面及び外面を合計で１０秒間洗浄した。次にＬＦＡ試験ストリップを、試料パッドが混合物と接触するように、垂直方向に浸けた。試験ストリップを１０分後に混合物から取り出し、試験ストリップの画像を、Ｃａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）の使用により直ぐに撮影した。
この試験において開発されたＧＭＰは、以下の４つの機能を達成した。（１）試料中の目的タンパク質を捕捉すること、（２）ＡＴＰＳの嵩高相のうちの一方に極度に分配すること、（３）安価な携帯型磁石により収集されること及び（４）抽出され、ＬＦＡペーパーストリップに適用された後に、ＬＦＡの発色指標として直接的な機能を果たすこと。機能（２）及び（３）は、ＧＭＰをＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液の中に入れることによって実証された。図２１Ａに示されているように、ＧＭＰと、ＰＥＧ豊富相におけるより多数のＰＥＧ分子との間に作動する反発的で立体的な排除体積的相互作用に起因して、ＧＭＰは下部ＰＥＧ不足相に極度に分配されることが観察された。このことは、ＧＭＰが小さい体積に濃縮することを可能にし、そのことは、より小型で軽量の磁石（図２１Ｂ）による収集を可能にした。更に、これらのＧＭＰが磁石に近接しているときに高度に応答したので、粒子を、後の検出のために迅速に回収及び移動することができた（図２１Ｃ）。最後に大事なことは、この手法を使用することによって、ＧＭＰを非常に小さな体積に収集することができ、そのことは目的タンパク質の極度の濃縮を可能にした。
ＧＭＰが、ＡＴＰＳと一緒に使用したとき、ＬＦＡの感度を改善できたかを確認するため、前濃縮ステップを用いて、または用いないで予備ＬＦＡ研究を実施した（図２２）。
ＡＴＰＳをＬＦＡと統合する第２の手法は、ＰＥＧ化金ナノプローブ（ＰＧＮＰ）を、ＡＴＰＳとポリプロピレン（ＰＰ）固体との固液界面に誘導することであった。第１の手法と類似しているが、この手法は、もはや外部磁石を必要としない。この機構はＡＴＰＳを必要とする。図２３Ａ及びＢに示されているように、ＰＧＮＰは、ＰＥＧのみ、または塩のみの水溶液が使用されたとき、固液界面に分配されなかった。代わりに、ＰＧＮＰは、固液界面を優先することなく、各水溶液の全体にわたって均一に分散すると思われた。ＰＧＮＰが相分離ＡＴＰＳの存在下でのみ固液界面に分配されることが見出されているので、１：１の体積比を有するＡＴＰＳをこの試験に使用し、それは、このＡＴＰＳ相が、他の体積比のＡＴＰＳと比較して最も速く分離するからである。図２３Ｃは、１０分後のＰＰストロー上のＰＧＮＰの極度の分配動作を実証した。ＰＰストローは、濃縮目的ＰＧＮＰ複合体の容易な抽出も可能にした。ストローを抜き取った後、収集されたＰＧＮＰを、ランニングバッファーの使用により容易に洗い落とし、ＬＦＡに直接適用した（図２３Ｄ）。
ＬＦＡの結果を図２４に示す。 それぞれの試験は対照線の存在を示し、このことは、流体がストリップの中を通って完全に流れたことを示し、試験の有効性が確認された。Ｔｆが不在である陰性対照では、試験線が現れ、したがって真の陰性結果を示した。高いＴｆ濃度（１０ｎｇ／μＬ）では、試験線は現れず、したがって真の陽性結果を示した。しかし、前濃縮ステップを有さない場合の低いＴｆ濃度では、可視試験線が現れ、ＰＧＮＰに装飾された抗体を飽和するには不十分な量のＴｆが、試料中に存在することを示唆した。したがって、これらの試験は、偽陰性結果を示した。この手法を使用したＬＦＡの結果を上側パネル（図２４、上部）に示す。偽の陰性結果が、前濃縮を用いないＬＦＡ研究の１ｎｇ／μＬにおいて現れたので、このことは、ＬＦＡにおけるＴｆの検出限界が１０ｎｇ／μＬであることを示した。
ＬＦＡの性能を改善するため、単一ＬＦＡ試験に使用した同じ量のＰＧＮＰを、Ｔｆ濃度が１ｎｇ／μＬのＡＴＰＳ溶液の中に入れた。このＡＴＰＳ溶液の体積をＬＦＡストリップに使用した体積と比較して５０倍増加することによって、ＰＧＮＰは、５０倍多いＴｆと相互作用することができ、したがってより高度の飽和レベルを達成することができた。しかし、ＰＧＮＰは、５０倍に希釈されてもいるので、検出の前に濃縮及び収集される必要があった。ＰＰストローをＡＴＰＳ溶液に入れることによって、ＰＧＮＰはストローの表面に極度に分配された。ＡＴＰＳ溶液を室温で１０分間インキュベートした後、ＰＰストローを溶液から取り出した。固体表面上の物質が典型的には回収可能ではない他の吸着現象と異なり、ＰＧＮＰは、ランニングバッファーでストローをすすぐことによって容易に回収された。次に、ＰＧＮＰを含有するこのバッファーをＬＦＡに直接適用した。この手法を使用したＬＦＡの結果を下部パネル（図２４、下部）に示す。０．２ｎｇ／μＬが、真の陽性結果を実証する最低濃度であるので、ＬＦＡにおけるＴｆの検出限界は、１０ｎｇ／μＬから０．２ｎｇ／μＬに改善し、５０倍の改善があった。携帯型デバイスをこれら２つの手法に使用し、ユーザーが、最小限のステップでアッセイを操作できるようにする（図２５）。
実施例２．ＡＴＰＳ及びデキストラン被覆金ナノ粒子
伝統的なクエン酸塩でキャップした、またはそのままの金ナノ粒子は、典型的には、表面クエン酸塩イオンの陰電荷によりもたらされる静電反発相互作用に起因して、水溶液中に凝集しない。しかし、ファンデルワールス引力相互作用が静電反発相互作用よりも大きい、より高いイオン強度の溶液中では凝集する。デキストラン被覆金ナノ粒子は、還元剤でもあり、安定剤でもあるデキストランをクエン酸塩の代わりに使用して、成功裏に作られた。デキストラン被覆金ナノ粒子の安定性を、伝統的なクエン酸塩キャップ金ナノ粒子及び一般的に使用されるＰＥＧ被覆金ナノ粒子と比較した。ＰＥＧ塩ＡＴＰＳの相分離動作を最適化して、室温でのＤＧＮＰの迅速な抽出を可能にした。続いてＤＧＮＰの分配動作を、ＰＥＧ塩ＡＴＰＳにおいて調査した。鉄輸送のための一般的な血清タンパク質であるトランスフェリン（Ｔｆ）を、モデルタンパク質バイオマーカーとして選択した。次にＬＦＡにおけるＴｆの検出限界を、ＤＧＮＰを使用する前濃縮ＡＴＰＳステップを用いて及び用いないで決定した。ＬＦＡの定性的な結果を、視覚的に解釈し、コンピューター画像分析も、ＬＦＡ結果の更なる定量的検証のために実施した。
伝統的なクエン酸塩でキャップした、またはそのままの金ナノ粒子を調製した。簡潔には、１０ｍＬのｄｄＨ２Ｏを、撹拌しながら１００℃に加熱した。加熱溶液が沸騰し始めると、１００μＬの１％ｗ／ｖ塩化金（ＩＩＩ）溶液を加えた。溶液を撹拌し、１分間沸騰させ、その後、２５μＬの６％ｗ／ｖクエン酸ナトリウム溶液を加えた。溶液は、暗紫色から清澄な暗サクラ色に急速に変わり、その後、室温に冷却し、４℃で保存した。
ＰＥＧ被覆（ＰＥＧ化）金ナノ粒子を調製する前に、前に調製したそのままの金ナノ粒子溶液の濃度を決定した。任意の所定のＰＥＧ：金ナノ粒子のモル比のために必要なＰＥＧの量を決定することに使用されるこの濃度は、１ｃｍの経路長により、ベールの法則を使用して計算した。
Figure 2021073465
 ここでＣは、金ナノ粒子の濃度（モル単位）であり、Ａは、金ナノ粒子のピーク吸光度値であり、εは、モル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）であり、ｌは、経路長（ｃｍ）である。ε値を決定するため、最初にナノ粒子の直径を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ粒子分析機（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、動的光散乱法（ＤＬＳ）により定量した。次にモル吸光係数を、ε値と金ナノ粒子の直径とを相関させる、ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により提供されたデータシートから読み取った。次に金ナノ粒子のピーク吸光度値を、ＵＶ可視分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して定量化し、濃度を方程式（１）によって決定した。
メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）チオール（分子量５０００、Ｎａｎｏｃｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用して、金ナノ粒子表面にＰＥＧ層を装飾した。簡潔には、最初に５ｍＬのそのままの金ナノ粒子溶液を、１Ｎ ＮａｏＨ溶液を使用してｐＨ９．０に調整した。メトキシＰＥＧチオールを粒子溶液に５０，０００：１のＰＥＧ：ナノ粒子モル比で加えて、金ナノ粒子の表面が十分に被覆されることを確実にした。次に混合物を室温で３０分間反応させて、ＰＥＧのチオール基が金ナノ粒子と供与結合を形成することを可能にした。遊離ＰＥＧを、９０００ｇで３０分間遠心分離して除去した。得られたＰＥＧ化金ナノ粒子を５００μＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。
デキストラン被覆金ナノ粒子を調製した。簡潔には、１２ｇのデキストラン（分子量１５，０００〜２５，０００）を１６０ｍＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅ滅菌水（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に溶解し、溶液を、撹拌しながら１００℃に加熱した。加熱溶液が沸騰し始めると、２．１６ｍＬの１％ｗ／ｖ塩化金（ＩＩＩ）溶液を加えた。溶液を撹拌し、溶液の色が青紫色に変わるまで、２０分間沸騰させた。次に溶液を室温に冷却し、４℃で保存した。続いて過剰デキストランを、９０００ｇで３０分間遠心分離して除去した。
そのままの（すなわち、クエン酸塩でキャップした）、ＰＥＧ化した及びデキストラン被覆した金ナノ粒子溶液を、様々な濃度の貯蔵リン酸カリウム溶液と別々に混合した。混合溶液を室温で３０分間インキュベートした。それぞれの試料の吸光スペクトルを、ＵＶ可視分光光度計を使用して決定した。臨界凝固濃度（ＣＣＣ）を、ピーク吸光波長に近いＧＮＰ溶液の吸光スペクトルが強度を有意に減少する塩濃度として特定した。
貯蔵リン酸カリウム溶液（５：１の二塩基：一塩基）を、ダルベッコーリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｐＨ７．４、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．６７ｍＭのＫＣｌ及び０．４９５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）において調製した。続いて、貯蔵ポリエチレングリコール（ＭＷ８０００、ＶＷＲ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＣＡ）溶液をＰＢＳにおいて調製した。貯蔵溶液を使用して、２ｍＬの、ＰＢＳ中のＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液を、ＰＥＧ豊富（塩不足）：ＰＥＧ不足（塩豊富）体積比の９：１を生じるＰＥＧと塩の特定の濃度で調製した。この体積比は、ＡＴＰＳ溶液を室温で最低１２時間にわたってインキュベートした後に測定した。
ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）を使用して、ヤギ抗Ｔｆ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）のチロシン残基を放射標識した。簡潔には、Ｎａ１２５Ｉ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により活性化した。続いて、活性化された１２５Ｉを、ヤギ抗Ｔｆ抗体と１５分間反応させた。放射標識された抗体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５サイズ排除カラムの使用により遊離１２５Ｉから精製した。放射標識抗体の特異的な活性及び濃度を、リンタングステン酸アッセイにより決定した。
デキストラン被覆金ナノ粒子（ＤＧＮＰ）を調製するため、最初に１０ｍＬの予め調製したデキストラン被覆金ナノ粒子溶液を、１Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ９．０に調整した。続いて８０μｇのヤギ抗Ｔｆ抗体を、デキストラン被覆金ナノ粒子溶液に加えた。次に混合物を室温で３０分間反応させて、抗体が粒子と供与結合を形成することを可能にした。遊離非結合抗体を、９０００ｇで３０分間遠心分離して除去した。回収したＤＧＮＰを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液により、ＢＳＡがＤＧＮＰのあらゆる意の自由表面を覆って非特異的結合を防止できるように、更に洗浄した。過剰ＢＳＡ及び追加非結合抗体を、９０００ｇで３０分間遠心分離して除去した。回収したＤＰＧＮＰを1ｍＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に再懸濁した。
ＰＥＧ塩ＡＴＰＳにおけるＤＧＮＰの分配動作を試験するため、ＡＴＰＳ溶液の各相におけるＤＧＮＰの濃度を定量した。放射標識ＤＧＮＰを、放射標識ヤギ抗Ｔｆ抗体をデキストラン被覆金ナノ粒子に結合させることによって調製した。それぞれの分配実験では、２００μＬの放射標識ＤＧＮＰ溶液を、それぞれ最終体積の２ｍＬを有する３つの同一のＰＢＳ中ＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液に加えた。混合物を、２５℃で３０分間、２時間、４時間及び１２時間インキュベートした。ＰＥＧ豊富で塩不足の上部相及びＰＥＧ不足で塩豊富な下部相を、注意深く抽出し、各相の体積を測定した。各相における放射標識ＤＧＮＰの量は、Ｃｏｂｒａ Ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して、ＤＧＮＰに結合した放射標識抗体の放射能を測定することによって定量した。
競合的ＬＦＡをこの試験に利用した。詳細な図解を図２７に見出すことができる。第１には、Ｔｆタンパク質をニトロセルロース膜に固定化して、試験線を形成した。ＤＧＮＰの一次抗体と結合することができる二次抗ＩｇＧ抗体も、固定化Ｔｆタンパク質の下流に固定化して、対照線を形成した。Ｔｆタンパク質が試料溶液に中に存在しない場合、ＤＧＮＰは、ストリップに印刷されたＴｆと結合し、試験線に可視バンドを形成する。他方、Ｔｆタンパク質が試料中に存在する場合、Ｔｆタンパク質は、最初にＤＧＮＰの表面における特定の抗体と結合する。ＤＧＮＰがＴｒタンパク質で飽和されている場合、ＤＧＮＰは、ストリップに印刷されたＴｆを迂回して、試験線に可視バンドの不在をもたらす。過剰ＤＧＮＰは、依然として対照線に結合し、流体が実際にストリップの中を流れたこと及び結果が有効であることを示す。まとめると、陰性試験は、１つが試験線のものであり、１つが対照線のものである、２つの可視バンドにより示され、一方、陽性試験は、対照線における１つの可視バンドのみにより示された。
ＰＥＧ塩ＡＴＰＳ前濃縮ステップを有さないＬＦＡを、ＡＴＰＳと組み合わせる前に実施した。この試験では、様々な濃度のＴｆを含有するＰＢＳ溶液を調製し、それぞれのＴｆ濃縮物を３重で試験した。各ＬＦＡストリップにおいて、１０μＬの対応するＴｆ溶液を１０μＬのＤＧＮＰ溶液及び試験ストリップ中の試料の流動を助けるために使用した３０μＬの試験緩衝液（０．２％のＢＳＡ、０．３％のＴｗｅｅｎ２０、０．２％のアジ化ナトリウム、０．１％のポリエチレングリコール、０．１ｍのＴｒｉｚｍａ塩基、ｐＨ８）と混合した。ＬＦＡ試験ストリップを、試料パッドが混合物と接触するように、各混合物の中に垂直方向に浸けた。ストリップを１０分後に取り出し、結果を視覚的に読み取り、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を使用して定量した。
続いて、ＰＥＧ塩ＡＴＰＳ前濃縮ステップを有するＬＦＡを実施した。これらの実験では、様々なＴｆ濃度を含有するＰＢＳ溶液を最初に調製し、それぞれのＴｆ濃縮物を３回試験した。下部相の体積がおよそ２００μＬであったので、１００μＬのＤＧＮＰ溶液をＴｆ／ＡＴＰＳ溶液に加え、最終体積をｍＬにして、ＡＴＰＳステップを有さないで実施したＬＦＡ試験と同様のＤＧＮＰ濃度を達成した。ＡＴＰＳ溶液を十分に混合し、２５℃で３０分間インキュベートした。それぞれの混合物において、２０μＬのＰＥＧ不足下部相を抽出し、３０μＬの試験緩衝液と混合して、ＡＴＰＳステップを有さない試験に使用された体積と一致させた。ＬＦＡ試験ストリップを、試料パッドが混合物と接触するように、垂直方向に浸けた。ストリップを１０分後に取り出し、結果を視覚的に読み取り、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を使用して定量化した。
ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）カスタムスクリプトを書き込んで、得られた画像を定量的に分析した。ＬＦＡ試験が完了した直後に、試験ストリップの画像を、Ｃａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）の使用により撮影した。画像の一貫性を確実にするため、照明を制御し、各ストリップを同じ方向に向けた。これらのイメージをトリミングし、８ビットグレースケールマトリックスに変換した。強度を、流動に垂直、ならびに試験及び対照線に平行な軸にそって平均化し、一次元強度マップを生成した。２つの最大値を、対照及び試験線で特定し、これら２本の線の間の距離を、陰性対照（強力な試験及び対照線を有する）を使用して較正した。
一連の試験データから試験線の強度を得るため、対照線の位置を特定し、試験線の位置は、予め較正された距離を使用して決定した。試験線領域を、この試験線の位置の中央にある１５画素幅と設定した。次にこの測定のベースラインは、試験線の両側に位置する２つの２５画素幅領域のシグナルを平均することによって決定した。最初のベースライン領域は、試験線の位置の上流の２５個の画素から始まり、上流へ２５個の画素まで続き、もう一方は試験線位置の下流の２５個の画素から始まり、下流に２５個の画素まで続いた。次に試験線の強度を、試験線領域の曲線下面積として計算して、試験線に結合した全てのＤＧＮＰの効果を捕らえた。
そのままの、ＰＥＧ化した及びデキストラン被覆した金ナノ粒子試料の臨界凝固濃度（ＣＣＣ）値を測定して、デキストランコーティングが、ＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液中の金ナノ粒子に必要な立体安定性を提供するかを決定した。金ナノ粒子の吸光スペクトルのピーク吸光波長は、およそ５３５ｎｍであった。したがって、それぞれの種類の金ナノ粒子の５３５ｎｍ近くの吸光スペクトルは、リン酸カリウムがＰＥＧ塩ＡＴＰＳの塩構成成分であるので、リン酸カリウム濃度の範囲にわたって観察された。結果を図２８に示す。各プロットにおいて、ピーク吸光値には、１．０の値（または１００％正規化吸光度）が割り当てられ、プロットの残りの吸光値は、それに従って調整された。これらのプロットから、そのままの金ナノ粒子のＣＣＣは、０．３〜３．４％ｗ／ｗのリン酸カリウムであり、ＰＥＧ化金ナノ粒子のＣＣＣは、７．５〜１０％ｗ／ｗリン酸カリウムであり、デキストラン被覆金ナノ粒子溶液のＣＣＣは、３０％ｗ／ｗを超えるリン酸カリウムであったことが決定された。これらの結果は、デキストラン被覆金ナノ粒子が、リン酸カリウム塩溶液中のＰＥＧ化金ナノ粒子よりもさらに安定していたことを示した。更に、３０％ｗ／ｗリン酸カリウムが下部相のリン酸カリウム濃度（約１０％ｗ／ｗ）よりも大きいので、デキストラン被覆金ナノ粒子は、本発明者たちのＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液中において安定性及び機能性を保つことが予測された。このことは、本明細書に記載されている試験における使用が成功していることによって確認された。
最初に放射標識ＤＧＮＰの分配動作を、９：１のＰＥＧ豊富：ＰＥＧ不足の体積比を有するＰＥＧ塩ＡＴＰＳにおいて視覚的に観察した。初めは、ＤＧＮＰを含有するＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液は、不透明な明紫色を現した（図２９Ａ)。次に暗紫色の下部相が現れ、ＤＧＮＰがＰＥＧ不足下部相に極度に分配されたことを示した（図２９Ｂ)。経時的に、下部相は、ＤＧＮＰ豊富なＰＥＧ不足ドメインがＡＴＰＳ溶液の下部に移動したので、体積が増大した。対照的に、ＤＧＮＰは、上部相には紫色がほとんどないので、上部ＰＥＧ豊富相には最小限の分配を示したことが見出された。１２時間の平衡時間の後、上部及び下部相の体積は、もはや変化せず、上部相は清澄になり、全てのＤＧＮＰ豊富なＰＥＧ不足ドメインがＡＴＰＳ溶液の下部相に達したことを示唆した（図２９Ｃ）。およそ３０分後、下部相の色強度は、経時的に変化せず下部相のＤＧＮＰ濃度が３０分間から１２時間にわたって比較的一定のままであったことを示唆した。
次に２つの相への放射標識ＤＧＮＰの分配動作を、下記に定義される分配係数（ＫＤＧＮＰ）により定量化した。
Figure 2021073465
 ここで、ＣＤＧＮＰ上部及びＣＤＧＮＰ下部は、それぞれ上部及び下部相のＤＧＮＰ濃度である。ＫＤＧＮＰ値は、０．００６０５±０．０００１０であると測定され、これは、比較的多いＤＧＮＰがＰＥＧ不足の下部相に極度に分配されるはずであるという概念と一致していた。
ＤＧＮＰが予測的にＰＥＧ塩ＡＴＰＳに濃縮され得ることを実証するため、ＤＧＮＰの濃度係数または濃度倍数（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｆｏｌｄ）改善を、９：１のＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液において測定した。濃度係数は、下部相におけるＤＧＮＰの濃度、ＣＤＧＮＰ下部を初期のＤＧＮＰ濃度、ＣＤＧＮＰ初期で割ったもの、と定義される。
Figure 2021073465
濃度係数の式は、ＡＴＰＳ溶液中のＤＧＮＰのモル平衡方程式により開始して誘導することができる。
Figure 2021073465
 ここで、Ｖ上部及びＶ下部は、それぞれ上部及び下部相の体積である。方程式（２）と（３）を組み合わせ、方程式（４）を再構成すると、
Figure 2021073465
 を生じる。
ＤＧＮＰの分配係数がＶ下部／Ｖ上部よりはるかに少ないので、濃縮率を、更に簡素化して、下記：
Figure 2021073465
 にすることができ、これは、濃度係数が、単に極限ＫＤＧＮＰ値の体積比の関数であることを意味している。したがって、９：１の体積比または溶液全体の体積の１／１０である下部相体積によって、濃度倍数の１０が予測される。このことは、ＣＤＧＮＰ下部が１２時間のインキュベーションの後で測定された、ＤＧＮＰの分割実験により確認された。しかし、ＡＴＰＳが巨視的相分離平衡を達成するまで１２時間待つことは、ポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）用途において望ましくなく、下部相のＤＧＮＰ濃度は３０分後の時点で無関係であるので、濃度係数を、早い時点で測定した。図３０は、ＡＴＰＳ溶液の濃度係数が、３０分間から１２時間にわたって比較的一定のままであることを示している。その結果、下部相を、ＬＦＡ適用の３０分の時点で抽出した。
ＤＧＮＰをＬＦＡの発色指標として使用できることを実証するため、ＬＦＡを、前濃縮ＡＴＰＳステップを有さないでＴｆの検出を実施した。この試験の結果を図３１Ａに示す。バンドがＬＡＦストリップに観察されたので、ＤＧＮＰは、発色指標として機能したと結論付けられた。それぞれの試験は対照線の存在を示し、このことは、流体がストリップの中を通って完全に流れたことを示し、試験の有効性が確認された。Ｔｆが存在しない陰性対照では、試験線の出現は、真の陰性結果を示した。高いＴｆ濃度が使用されたとき（３．１６ｎｇ／μＬ及び１．０ｎｇ／μＬ）、試験線は不在であり、真の陽性結果を示した。しかし、０．３１６ｎｇ／μＬなどの低い濃度では、可視試験線が現れ、したがって、偽の陰性結果を示した。このことは、前濃縮ステップのないＬＦＡにおけるＴｆの検出限界が、１ｎｇ／μＬであったことを示唆した。
９：１のＰＥＧ塩体積比溶液を利用して、ＬＦＡの検出限界が、Ｔｆで飽和されたＤＧＮＰを濃縮することによって１０倍改善され得ることを実証した。この試験の結果を図３１Ｂに示す。ＡＴＰＳ溶液を室温で３０分間インキュベートした後、ＰＥＧ不足下部相における濃縮ＤＧＮＰを抽出し、ＬＦＡに適用した。前の実験と同様に、対照線と試験線の両方ともＴｆの不在下で現れ、有効な陰性結果を示した。より高いＴｆ濃度（０．３１６ｎｇ／μＬ及び０．１ｎｇ／μＬ）で試験線は現れなかったが、可視試験線は、最初に０．０３１６ｎｇ／μＬで現れ、前濃縮ステップを有するＬＦＡにおけるＴｆの検出限界は、０．１ｎｇ／μＬであることを示した。これは、ＤＧＮＰ及びＰＥＧ塩ＡＴＰＳが使用されたときのＬＦＡの検出限界の１０倍の改善に相当する。
ＬＦＡ結果の視覚的解釈を更に検証するため、試験ストリップの画像を撮影し、試験線の強度を定量した。前濃縮ステップを使用したとき、各ＬＦＡの試験線のシグナルは、同じＴｆ濃度を試験したときに弱く、このことは、Ｔｆが濃縮され、ＤＧＮＰを飽和したことを示し、飽和ＤＧＮＰは、試験線に結合することができず、陽性の結果を示した。対照線及び試験線の両方のシグナル強度は、ＡＴＰＳと組み合わせた及び組み合わせない陰性対照において、類似していた。このことは、両方の実験において、ＬＦＡストリップを移動したＤＧＮＰの量が類似していたことを示した。ＬＦＡパネルのＭＡＴＬＡＢ（登録商標）分析も、検出限界の改善を実証した（図３２）。特に、図３２の２つの曲線は、ほぼ同じ試験線のシグナルの初期Ｔｆ濃度で１０倍の差により隔てられている。
実施例３．混合ＰＥＧ塩ＡＴＰＳのＬＦＡへの直接的な添加
この実施例では、ＡＴＰＳ相分離及び下流検出能力の両方を有する次世代の一体化デバイスの感度、速度及び使いやすさを、最適化した。ＡＴＰＳの相分離の後に濃縮試料を適用する代わりに、混合ＡＴＰＳをペーパーに基づくデバイスに直接添加することが可能であった。溶液は、検出区域に向かって流れながら二相に分離し、このことは、濃縮及び検出ステップが同時に発生すること及び結果を得るまでの全体的な時間が更に低減されることを可能にする。ペーパー膜は、ＡＴＰＳの巨視的な相分離の速度を速めることを示唆した。この現象を更に活用するため、ペーパーデバイスを垂直方向に広げ、それによって流動の断面積を増大し、巨視的分離における毛細管作用及び／または重力の効果を利用した。相分離の加速に加えて、この三次元構成要素は、より大量の、より希釈された体積の試料を処理する能力も有し、より大きな濃縮倍数改善をもたらす。新規な三次元紙構造内のＡＴＰＳ及びＬＦＡは、結果を得るまでの全体的な時間を低減し、使用しやすさを維持しながら、モデルタンパク質Ｔｆの検出限界に１０倍の改善をもたらすことに成功した。このデバイスは、伝統的なＬＦＡ試験に対して有意な改善を提供し、特徴的なバイオマーカーのレベルの低い様々な疾患の検出のために変更することができる。この新たなプラットフォーム技術は、高感度であり、低価格であり、迅速であり、機器を使用することがなく、したがって、資源不足の地域内の診断医療の現状に革命を起こす可能性を有する。
ポリマー塩ＡＴＰＳ溶液体積比の決定
全ての材料、化学薬品及び試薬は、特に示されない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ、ＶＷＲ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＣＡ）及びリン酸カリウムの塩（５：１の二塩基：一塩基比）を、ダルベッコーリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ、ｐＨ７．４、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７．９２ｍＭのＮａＣｌ、２．６７ｍＭのＫＣｌ及び０．４９ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）に溶解した。平衡体積比（上部相の体積を下部相の体積で割ったもの）を、ＰＥＧ及び塩のｗ／ｗ組成を同じタイラインに沿って変えることによって得た。１：１及び９：１体積比のＡＴＰＳが見出され、更なる実験に使用した。
抗体装飾デキストラン被覆金ナノプローブ（ＤＧＮＰ）の調製
デキストラン被覆金ナノ粒子を合成した。簡潔には、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ（ロイコノストック）種からの６ｇのデキストラン（Ｍｗ．１５，０００〜２５，０００）を、８０ｍＬの濾過ＵｌｔｒａＰｕｒｅ滅菌水（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に溶解した。溶液を撹拌し、加熱沸騰させ、その後、１０８０μＬの１％ｗ／ｖ塩化金（ＩＩＩ）水和物溶液を加えた。反応混合物の色は、赤みを帯びた青紫色に変わり、それを約２０分間にわたって、撹拌し、沸騰させた。新たに形成されたデキストラン被覆金ナノ粒子を遠心分離して、遊離デキストランを除去し、７０ｍＬの水に再懸濁した。官能化ＤＧＮＰを形成するため、デキストラン被覆金ナノ粒子溶液のｐＨを、１．５Ｍ ＮａＯＨを使用して９．０に調整した。デキストラン被覆金ナノ粒子溶液の１ｍＬ毎に、８μｇの抗Ｔｆ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）を加えた。反応混合物を振とう器に３０分間設置して、抗体とデキストラン被覆金ナノ粒子との供与結合の形成を推進した。遊離抗体を遠心分離により除去した。ペレットを１００μＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。
ＡＴＰＳの可視化
ＡＴＰＳの二相を可視化するため、表面プラスモン共鳴及びブリリアントブルーＦＣＦ色素（Ｔｈｅ Ｋｒｏｇｅｒ Ｃｏ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）に起因して紫色であるデキストラン被覆金ナノ粒子を、予め決定された濃度のＰＥＧ及び塩を１：１及び９：１の体積比で含有する合計３ｇのＰＢＳ溶液に加えた。これらの溶液をボルテックスにより十分に混合し、２５℃でインキュベートした。溶液の画像を、ＡＴＰＳが平衡に達したときに撮影した。全ての画像は、Ｃａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）の使用により撮った。
次にＡＴＰＳの二相を、ペーパー膜に沿って流れるときに可視化した。２枚の８×３０ｍｍストリップのガラス繊維紙を、ＶｅｒｓａＬＡＳＥＲ ３．５０（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）によりレーザー切断した。続いて、ブリリアントブルーＦＣＦ色素及びデキストラン被覆金ナノ粒子を含有する５０ｍｇの混合ＡＴＰＳ（１：１または９：１平衡体積比に相当）を、ピペットを使用してストリップの一方の端部に滴加した。得られた流動の画像を、０、３０、１０５及び３００秒で撮った。ビデオも、市販のスマートフォン（Ａｐｐｌｅ Ｉｎｃ．、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）の８メガピクセルカメラにより撮影した。
三次元ペーパーウエル内のＡＴＰＳの相分離を可視化するため、ブリリアントブルーＦＣＦ色素及びデキストラン被覆金ナノ粒子を含有する１４０ｍｇの混合ＡＴＰＳを、ペーパーウエルに加えた。三次元ペーパーウエルは、ガラス繊維紙の９枚の８×１０ｍｍのレーザー切断ストリップを、ガラス繊維の８×６０ｍｍのレーザー切断ストリップの一方の縁部に積み重ねることによって形成した。混合ＡＴＰＳを三次元ペーパーウエルに適用した後、５０μＬのランニングバッファー（０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．３％のＴｗｅｅｎ２０、０．１ｍＬのＴｒｉｚｍａ塩基、ｐＨ８）を三次元ペーパーウエルに加えた。ランニングバッファーを加えて、試料がペーパーウエルからデバイスの残りの部分へ流れることを助けた。ビデオを撮影し、画像を、０及び３０秒の時点、ランニングバッファーの添加の時点、ならびに流動が完了した後に撮った。
Ｔｆの検出
Ｔｆ検出のためのＬＦＡ試験
競合アッセイフォーマットを利用するＬＦＡ試験ストリップを、組み立てた。簡潔には、抗Ｔｆ抗体が装飾されたＤＧＮＰを、最初に試料溶液に加え、試料中に存在する任意のＴｆと結合させて、ＤＧＮＰ／Ｔｆ複合体を形成した。ＬＦＡによるＴｆの検出限界を検証するため、３０μＬのランニングバッファーと、１５μＬの、ＰＢＳ中の既知の量のＴｆ及び５μＬのＤＧＮＰからなる２０μＬの試料溶液とを、試験管の中で混合した。ＬＦＡ試験ストリップを、管の中に垂直方向に挿入して、試料の中に試料パッドを沈め、流体が、吸収パッドに向かってストリップにより吸収排出された。Ｔｆが存在する場合、ＬＦＡストップの中を進むＤＧＮＰ／Ｔｆ複合体は、試験線に固定化されたＴｆと結合することができず、対照線での単一バンドの存在により陽性の結果を示す。あるいは、Ｔｆが存在しない場合、ＤＧＮＰ上の抗体は、試験線のＴｆと結合することができる。これらのプローブが紫色を帯びた赤色を示すので、ＤＧＮＰが試験線に蓄積して可視バンドを形成し、陰性の結果を示す。Ｔｆの存在にかかわらず、ＤＧＮＰ上の抗体は、対照線に固定化された二次抗体と常に結合する。対照線のバンドは、試料がストリップの中を完全に流れたことを意味し、有効な試験であることを示す。したがって、陰性結果は２本のバンドにより示され、１本は試験線のものであり、１本は対照線のものであ対照的に、陽性結果は、対照線の単一バンドにより示される。各Ｔｆ濃縮物を３重で試験した。代表的なＬＦＡストリップを、１０分後に、制御照明環境下でＣａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラにより画像化した。
三次元ペーパーウエルによるＴｆの検出
ペーパーに基づくデバイスのＬＦＡ構成要素を、前述の設定から僅かに変更した。具体的には、セルロース試料パッドを、５×２０ｍｍのガラス繊維紙に交換し、これを、試験及び対照線を含有するニトロセルロース膜と接続した。試料パッドの起点には、ガラス繊維紙の複数のストリップから構成される三次元ペーパーウエルを使用した。１：１体積比のＡＴＰＳを使用する実験では、ウエルを、５層（４枚の５×７ｍｍのストリップ＋下部試料パッド）のガラス繊維紙から構成した。試験を開始するため、既知の濃度のＴｆを含有する４０μＬの１：１体積比の混合ＡＴＰＳを、ペーパーウエルに加え、続いて５０μＬのランニングバッファーを加えた。画像を１０分後に撮った。９：１体積比のＡＴＰＳを使用する実験では、２０層の紙（１９枚の５×７ｍｍのストリップ＋下部試料パッド）を使用して、ペーパーウエルを形成した。既知の濃度のＴｆを含有する２００μＬの９：１体積比の混合ＡＴＰＳを、ペーパーウエルに加え、１０分間インキュベートして、続いて１００μＬのランニングバッファーを加えた。更に１０分後、画像を制御照明環境下でＣａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラにより撮った。各Ｔｆ濃縮物を３重で試験した。
ＡＴＰＳの可視化
ＡＴＰＳとＬＡＦの統合は、伝統的なＬＦＡ試験の検出限界を、その利点を犠牲にすることなく有意に改善することができた。これを達成するため、最初に、相がペーパー膜の中を通っている間に可視化され得るＡＴＰＳを、特定する必要があった。具体的には、上部により疎水性のＰＥＧ豊富相及び下部により高密度で親水性のＰＥＧ不足相を形成する、ＰＥＧ塩ＡＴＰＳを使用した。ＡＴＰＳにおける生体分子の分配は、主に、相対的親水性（生体分子は、最大の引力相互作用を受ける層を優先する傾向があるため）及びサイズ（大型の生体分子は、ＰＥＧ豊富相において大多数のＰＥＧ分子と大きな立体的な排除体積的反発相互作用を受けるので、ＰＥＧ豊富相には典型的には留まらないため）によって決まる。ブリリアントブルーＦＣＦ色素を、混合ＡＴＰＳに加え、小型で疎水性であるので、色素はＰＥＧ豊富相に極度に配分される。紫色のデキストラン被覆金ナノ粒子も、混合ＡＴＰＳに加え、これらは大型（動的光散乱法により測定して直径が約５０ｎｍ）であり、親水性であるので、ＰＥＧ不足相に極度に分配された。１：１体積比のＡＴＰＳ及び９：１体積比のＡＴＰＳの画像を、相分離の前後に撮影した（図３３）。ブリリアントブルーＦＣＦ及びデキストラン被覆金ナノ粒子の量を、１：１及び９：１の体積比のＡＴＰＳにおいて一定に保った。結果として、相分離の後、９：１体積比のＡＴＰＳの上部相は、１：１体積比のＡＴＰＳの上部相と比較して体積が大きく、したがってブルー色素の濃縮が少なかった。加えて、９：１体積比のＡＴＰＳの下部相は、１：１体積比のＡＴＰＳの下部相より体積がかなり小さく、暗い色彩の紫色を示し、下部相の縮小が、デキストラン被覆金ナノ粒子をＡＴＰＳ内に効果的に濃縮できることを実証した。９：１体積比のＡＴＰＳ試料は、下部相の体積が試料溶液全体の体積の１／１０になるので、ナノ粒子を１０倍濃縮させることが予測された。体積比が極度になるほど、より大きな濃縮倍数改善を獲得できるが、システムが分離に要する時間も多くなることに留意すること。
紙におけるＡＴＰＳの可視化
混合ＡＴＰＳをペーパー膜に加えた後、紫色のデキストラン被覆金ナノ粒子を含有するＰＥＧ不足相が、紙の中を急速に流れたことが観察された。その間、ブルー色素を含有するＰＥＧ豊富相は、ペーパー膜の起点に保持された（図３４）。このことは、ＡＴＰＳの両方の相が、紙の中に流動が誘発される前に、ガラスウエル内で完全に分離することが可能であった場合（図８０）と類似していた。ペーパー膜内で生じる増強された相分離が、１：１体積比のＡＴＰＳを使用したときに明白であり（図３４Ａ）、１：１体積比のＡＴＰＳ相は、紙内でほぼ直後に分離した。図３３に示されているように、ＡＴＰＳを使用して達成された紫色のデキストラン被覆金ナノ粒子の濃縮倍数は、体積比の関数である。具体的には、粒子がＰＥＧ不足相に極度に配分されるので、１：１体積比は、流動の先頭部として初期体積の半分が流れるので、粒子の２倍濃縮を生じるはずである。ペーパー膜における相分離動作についての１つの可能な説明は、ＰＥＧ豊富ドメインが、紙からより多くの相互作用を受け、移動性が少なくなることである。更に、ＰＥＧ豊富ドメインは、より多くの粘性もあり、したがって蛇行性の紙網状組織の中を移動することがより困難になり得る。対照的に、ＰＥＧ不足ドメインは、紙との相互作用が少なく、粘性が少なく、紙網状組織の中を急速に移動し、先頭部において合体することが可能である。９：１体積比のＡＴＰＳでは、ＰＥＧ不足ドメインは、総体積の１０分の１のみを含み、合体すること及びＰＥＧ豊富ドメインの先に流れることがより困難になる。具体的には、紙において生じる巨視的相分離に必要な時間は、流体が紙に吸収排出されるのに必要な時間よりも長く、良好な分離は観察されなかった（図３４Ｂ）。
１：１及び９：１の両方の体積比のＡＴＰＳを使用すると、一部のＰＥＧ不足ドメインが、流動の先頭部に達しないことも観察された。このことは、全てのＰＥＧ不足ドメインがＰＥＧ豊富ドメインから逃れることができるわけではないことを示し、試験管において測定された平衡体積比が、ペーパー膜の吸収排出距離比と一致しない理由を明らかにした。ＬＦＡを改善するため、大部分のＰＥＧ不足ドメインは、巨視的なＰＥＧ不足相に到達し、検出区域に到達する前に巨視的なＰＥＧ不足相から分離される必要があった。したがって、追加の構成要素が、相分離現象を更に改善するために必要であった。
三次元ペーパーウエルデバイスにおけるＡＴＰＳの可視化
三次元紙構造を利用するペーパーウエルを、相分離動作が更に増強するように設計した。三次元パーパーウエルを使用することは、通常は試験管において相分離を誘導する重力が、紙内のＡＴＰＳ相分離を助けるために作用することも可能にする。三次元紙構造は、また、流動の方向に対して直角に断面積を増加する。したがって、より多くの体積を同時に紙に吸収排出することができ、より多くのＰＥＧ豊富素メインが紙との相互作用を妨げられ、ＰＥＧ不足ドメインがより容易に合体することを可能にする。図３５に示されているように、三次元ペーパーウエルは、以前に示された二次元ペーパー膜より大きい相分離効率に寄与した。ＰＥＧ豊富ドメインは、ペーパーウエルの上部層に保持され、一方、濃縮デキストラン被覆金ナノ粒子を含有するＰＥＧ不足ドメインは、ペーパーウエルの下部層に向かって流れた。加えて、ＰＥＧ不足ドメインは、最初にペーパーウエルから遊離し、ＰＥＧ豊富ドメインから効果的に分離された。ランニングバッファーも加えて、流体の流動を更に誘発し、あらゆる残留ＰＥＧ不足ドメインをペーパーウエルから一気に流すことを助け、この添加は、将来的に自動化され得ることが考慮されている。粘性の多いＰＥＧ豊富相の大きな体積が存在するので、９：１体積比のＡＴＰＳを使用したとき、流動はゆっくりであった（溶液は３９０秒後にストリップの末端に到達しない）ことに留意すること。
三次元ペーパーウエルデバイスを使用したＴｆの検出
三次元ペーパーウエルデバイス内の改善されたＡＴＰＳ相分離及び流動の動作を可視化した後、ＬＦＡがこの技術を組み合わせて、検出限界を改善できるかを検討した。ブリリアントブルーＦＣＦ色素はもはや使用せず、官能化抗Ｔｆ ＤＧＮＰを、デキストラン被覆金ナノ粒子の代わりに使用した。ＤＧＮＰは、ＡＴＰＳにおいてデキストラン被覆金ナノ粒子と同様に分配されるが、試料中の目的バイオマーカーを捕捉し、ＬＦＡの発色指標として作用することもできる。
ＡＴＰＳ及び三次元ペーパーウエルデバイスが組み込まれなかったＬＦＡのみの対照の検出限界を、特定した。競合フォーマットにおいて対照に対してＬＦＡの検出限界を改善するために、ＤＧＮＰに装飾された抗体は、より多くのＴｆに結合する必要がある。このことは、同じ数のＤＧＮＰをより多数のＴｆ分子に曝露することによって達成することができ、固定濃度のＴｆでは、溶液の総体積が増加する必要がある。ＤＧＮＰを総体積の増加により飽和させることができるが、体積の倍増により希釈される。各ＬＦＡストリップは２０μＬの試料しか扱うことができないので、ＤＧＮＰの希釈のため、不十分なＤＧＮＰが対照線に結合するので、無効な試験がもたらされる。しかし、ＡＴＰＳ及び三次元ペーパーウエルデバイスを使用すると、Ｔｆ分子で飽和されたＤＧＮＰは、ＰＧＥ不足相に極度に分配され、したがって、紙における流動の先頭部に集し、これにより有効な試験がもたらされる。したがって、試料の体積は、ＤＧＮＰを２倍濃縮することが予測される１：１体積比のＡＴＰＳを使用したときに、２倍の４０μＬに増加され、対照と比較したとき、同じ数のＤＧＮＰが検出区域に進入することをもたらした。同様に、試料の体積は、ＤＧＮＰを１０倍濃縮することが予測される９：１体積比のＡＴＰＳを使用したときに、１０倍の２００μＬに増加された。ＤＧＮＰを含有する１：１及び９：１体積比のＡＴＰＳの下部相のみが、検出区域を通過するので、デバイスの体積処理容量は、三次元ペーパーウエルを含む層の数を変えることにより微調整した。この増加を試料体積に対応するため、１：１体積比のＡＴＰＳ溶液内のＴｆの検出に使用される三次元ペーパーウエルデバイスを、５層の紙から構成し、一方、９：１体積比のＡＴＰＳ溶液では、２０層の紙に増加して（図３６Ｂ及びＣ）、増加した体積に対応した。層の数の有意な増加にもかかわらず、９：１体積比のＡＴＰＳの三次元ペーパーウエルデバイスは、依然として１０セント硬貨と比較して比較的小型のままであった。
ＤＧＮＰを含有するＡＴＰＳ溶液がペーパーウエルに添加されたとき、ＤＧＮＰは、デバイを通して吸収排出されて、溶液の先頭部に急速に集中した。ＤＧＮＰは、ペーパーウエルに保持された溶液の残部より先に、デバイスの検出領域に到達した。競合アッセイでは、試験線の存在は、陰性の結果を示し、一方、試験線の不在は、陽性の結果を示す。モデルタンパク質Ｔｆを含有しない陰性対照を使用したとき、２５分未満に、１：１及び９：１体積比のＡＴＰＳを使用する設定は、両方とも、試験及び対照線の両方にそれぞれ可視バンドをもたらし、Ｔｆの不在及び有効な試験を示した（図３６）。三次元ペーパーウエルをＩＦＡと組み合わせて、陰性対照ＡＴＰＳ試料におけるＴｆの不在を正確に評価できることを検証した後、Ｔｆ濃度を変えて、１：１及び９：１体積比のＡＴＰＳ溶液を使用したときの検出限界を見出した。これらの実験は、従来のＬＦＡよりも、Ｔｆの検出限界において２倍及び１０倍の改善それぞれ実証した（図３７）。三次元ペーパーウエルを用いる９：１体積比のＡＴＰＳ実験では、試料を、デバイス内で更に１０分間インキュベートして、ランニングバッファーを添加する前に、ＤＧＮＰが目的タンパク質を捕捉し、巨視的に相分離するための十分な時間を与えた。インキュベーション時間は、ＤＧＮＰが混合ＡＴＰＳにおいてより濃縮されているので、１：１体積比のＡＴＰＳでは必要なく、ＤＧＮＰが溶液全体を探索することを容易にする。これらの実験の結果は、従来のＬＦＡがＴｆを１ｎｇ／μＬの濃度（試験線が現れない濃度）で検出したが、この三次元ペーパー診断装置は、１：１体積比のＡＴＰＳを使用したとき、Ｔｆを０．５ｎｇ／μＬ（検出限界の２倍の改善）で検出できたことを示した。同様に、三次元ペーパー診断装置は、９：１体積比のＡＴＰＳを使用したとき、Ｔｆを０．１ｎｇ／μＬ（検出限界の１０倍の改善）で検出することができた。これらの結果は、望ましい体積比を有するＡＴＰＳ溶液を適切なサイズの三次元ペーパーウエルと組み合わせて、ＬＦＡを使用するバイオマーカー検出を、有意に予測性をもって改善できることを示唆している。
実施例４．ＰＥＧ塩ＡＴＰＳにおけるＭ１３バクテリオファージの検出
ポイントオブニード（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｎｅｅｄ）（ＰＯＮ）環境においてＡＴＰＳをＬＦＡと組み合わせる実現性を増やすため、システムに対して以下の変更を行った。（１）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とリン酸カリウム（塩）ＡＴＰＳを短時間の相分離により調査し、（２）抽出時間に有意な更なる低減をもたらす生体分子分配の動力学的挙動を検査し、（３）ＬＦＡに使用した金ナノ粒子指標とＰＥＧ塩ＡＴＰＳの塩豊富相との適合性を、ＰＥＧを金表面に装飾することによって確実にし、（４）特別仕様ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを生成して、観察されたＬＦＡシグナル強度を定量した。これらの変化をまとめた視覚的表現を図３８に示す。
バクテリオファージＭ１３の培養
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌株ＥＲ２７３８（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、インキュベーター振とう器中の８ｍＬのルリア培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）において３７℃で６時間インキュベートした。モデルウイルスバクテリオファージＭ１３（ＡＴＣＣ）を培養するため、少量の凍結Ｍ１３を細菌培養物に加えた。次に細菌培養物をインキュベーター振とう器の中に３７℃で１４時間設置した。溶液を４℃及び６０００ｇで１５分間遠心分離して、Ｍ１３を、ペレット中の細菌から上澄み中に単離した。上澄みを溶液から抽出し、０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）により濾過した。この貯蔵Ｍ１３溶液の希釈物を、プラークアッセイにより決定されたＭ１３の濃度を使用して計算した。したがってＭ１３濃度は、１ｍＬあたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）で報告される。全ての試薬及び材料は、特に示されない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
ＰＥＧ塩系の体積比の見出し
ポリマー塩ＡＴＰＳでは、ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ、ＶＷＲ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＣＡ）及びリン酸カリウム（５：１の二塩基：一塩基）を、ダルベッコーＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ、ｐＨ７．４、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７．９２ｍＭのＮａＣｌ、２．６７ｍＭのＫＣｌ及び０．４９ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）に溶解した。ルリア培地を含有するＭ１３試料を伴う実験と一致する、２％（ｗ／ｗ）のルリア培地を含有する総質量が５ｇの最終溶液を、作製した。平衡体積比（巨視的上部相の体積を、巨視的下部相で割ったもの）を、最低１２時間後（平衡を十分に過ぎている）に、界面及び溶液の最上部を、管の外側に印を付けることにより測定した。次に管を空にし、乾燥し、秤により計量した。水を印まで加え、両方の相の体積を、１ｇ／ｍＬを使用して、水の密度として測定した。異なる平衡体積比が、初期ＰＥＧ濃度、初期塩濃度を変え、温度を３７℃に一定に保持することによって見出された。これらの体積比が同じタイラインで選択されて、生体分子の類似した分配を確実にしたことに留意するべきであり、使用した特定の操作条件が表２に提示されている。
Figure 2021073465
Ｍ１３の分配及び濃縮
それぞれの濃縮実験において、４つの同一の５ｇのＰＥＧ塩溶液を調製した。これらの溶液のうち、３つを濃縮ステップに使用し（ｎ＝３）、一方、１つを初期Ｍ１３濃度を表す対照として使用した。各溶液が相分離の前に１つの相であることを確実にするため、全ての溶液を４℃で平衡にし、均質に混合した。次にＭ１３を４つの溶液に加えて、全体的な初期濃度の１×１０８ｐｆｕ／ｍＬを生じた。Ｍ１３濃度が時間によってどのように変わるかを決定するため、９：１体積比の溶液を、３７℃の水浴において３０分間、１時間、４時間及び２４時間インキュベートした。Ｍ１３濃度が体積比によってどのように変わるかを決定するため、９：１、６：１、３：１及び１：１の体積比の溶液を３７℃の水浴において３０分間インキュベートした。それぞれの実験において、３つの溶液の下部相を、シリンジの使用により注意深く抜き取った。対照溶液は、試験溶液と同じ条件を模倣するため、同じインキュベーションステップを受けた。しかし、インキュベートした後、ＡＴＰＳにおけるＭ１３の初期濃度を表すためにアリコートを抜き取る前に、対照を再び４℃に平衡にし、均質に混合した。抽出された下部層及び対照溶液のＭ１３濃度を、プラークアッセイによって決定した。
金ナノ粒子の調製
コロイド金ナノ粒子を調製した。次に金ナノ粒子の直径を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＳＺ粒子分析機（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ）の使用により決定した。続いて金ナノ粒子の濃度を、ベールの法則を使用して決定した。使用された吸光度値は、ピーク吸光度であり、次にモル吸光係数は、ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供されたデータシートから取った（表３を参照すること）。
Figure 2021073465
金ナノ粒子の定量化の後、Ｍ１３被覆タンパク質ｐＶＩＩＩ（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に対するマウスモノクローナル抗体を、ナノ粒子溶液に、コロイド金１ｍＬあたり１６μｇの抗Ｍ１３の比で加えて、金ナノプローブを形成した。溶液のｐＨを、０．１Ｍ ＮａｏＨを使用して９．０に調整して、抗体と金との供与結合を促進し、この溶液を振とう器により３０分間混合した。金ナノプローブを、ＬＦＡの前にＰＥＧ不足塩豊富相に加えるときに立体コロイド安定性を提供するため、ＰＥＧ−２０００−ＳＨ（Ｎａｎｏｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）分子を、金ナノプローブ１個に対して５０００個のＰＥＧ−２０００−ＳＨ分子のモル比で金ナノ粒子に結合させた。溶液を更に３０分間混合した。非特異的結合を防止するため、１００μＬの１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を１ｍＬのコロイド金溶液に加えて、残りの過剰な表面を遮断し、この溶液を３０分間混合した。最後に、溶液を４℃及び８６００ｇで３０分間遠心分離して、遊離抗体、ＰＥＧ及びＢＳＡを除去した。装飾された金ナノプローブを、１５０μＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。
ＡＴＰＳとＬＦＡの組み合わせ
ＡＴＰＳ前濃縮ステップをＬＦＡと組み合わせるため、様々なＭ１３濃縮物を、９：１体積比のＰＥＧ塩溶液に加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、濃縮下部相を、シリンジの使用により抽出した。前濃縮ステップを用いて及び用いないで実施しるイムノアッセイ間の一貫性のため、Ｍ１３を、最初はＭ１３を含有しなかった９：１溶液の試料の下部相に加え、それによって対照溶液を形成した。続いて３０μＬの下部相試料及び１０μＬの抗Ｍ１３装飾コロイド金プローブ溶液を、３０μＬのランニングバッファーと一緒に混合した。試験ストリップの中の試料の流動を助けるランニングバッファーは、ｄｄＨ２Ｏ中の０．２％ｗ／ｖのＢＳＡ、０．３％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０、０．２％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム、０．１％のＰＥＧ−８０００及び０．１ＭのＴｒｉｚｍａ塩基からなり、ｐＨは８に調整された。抗体をＭ１３に結合させるため、得られた溶液を混合し、ＬＦＡストリップを加える前に５分間インキュベートした。図３９に概略的に示されているように、ＬＦＡストリップを組み立てて、サンドイッチアッセイを実施した。１０分後、ＬＦＡストリップを取り出し、結果は、ＬＦＡストリップの試験及び対照線を視覚的に検査することによって得た。
ＬＦＡの定量的分析
ＬＦＡストリップの画像を、試験が終了した直後に、Ｃａｎｏｎ ＤＳＬＲカメラにより制御照明環境下で撮影した。ＬＦＡの結果を定量するため、特別仕様ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを書き込んだ。イメージをトリミングし、８ビットグレースケールマトリックスに変換した。続いて、マトリックスを半分に分け、得られたマトリックスの一方は対照線を含有し、他方は試験線を含有していた。マトリックスの各半分において、最小強度（最も暗いスポット）を、対照または試験線に対して垂直なベクトルに沿って位置決めした。これらの最小値の平均の位置を、対照または試験線の長さにおよぶ１５高画素長方形領域の中心として使用した。続いて、対照線領域における全ての画素の平均グレースケール強度（Ｉ対照）を計算した。同じ手順を、試験線を含有する残りの半分の画像に適用して、試験線領域の平均グレースケール強度（Ｉ強度）を生じた。幅が１５個の画素であり、試験線の上流の５０個の画素まである第３の基準領域の平均グレースケール強度（Ｉ基準）を使用して、試験及び対照線の強度を以下のように正規化した。
Figure 2021073465
 が対照線の式であり、
Figure 2021073465
 が試験線の式である。高い強度値は、白色領域に対応することに留意すること。
生体分子の分配
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ミセルＡＴＰＳをＬＦＡと組み合わせて、ＬＦＡウイルス検出限界に１０倍の改善を達成することができる。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ミセル系は、両方の相の体積が平衡するまで６時間超を費やす。対照的に、この試験のポリマー塩ＡＴＰＳは、より迅速な相分離を有する。加えて、９：１体積比には早期抽出時間の３０分を使用した。
塩及び水素結合相互作用を有意に受けるポリマーであるＰＥＧから構成される水溶液は、巨視的な相分離を受ける。ＰＥＧ豊富な塩不足相が上部に形成され、一方、ＰＥＧ不足の塩豊富相が下部に形成される。大型の親水性生体分子は、下部のＰＥＧ不足相に極度に分配される。この例では、エボラ及びマールブルグウイルスにサイズ及び形状が類似したモデルウイルスである、バクテリオファージＭ１３を調査した。Ｍ１３が９００ｎｍの長さ及び相対的に親水性のタンパク質シェルを有するので、ＰＥＧ豊富相と比べてＰＥＧポリマーとの反発的で立体的な排除体積的相互作用をほとんど受けないことに起因して、下部のＰＥＧ不足相に極度に分配されると予測された。水性二相ミセル系において、Ｍ１３は、巨視的なミセル不足相に極度に分配され、そこでも、Ｍ１３ウイルス粒子は排除体積的相互作用をほとんど受けないことが観察された。
溶液が加熱され、相分離が最初に開始されると、ＰＥＧ豊富（Ｍ１３不足）ドメイン及びＰＥＧ不足（Ｍ１３豊富）ドメインが、溶液全体にわたって形成される。これらの微視的なドメインにおけるウイルス濃度は、極めて急速に平衡値に達すると想定され、同様のドメインが互いに合体し始める。これらのドメインが大きくなると、密度の差は、不均一な重力及び浮力を生成し、このことは、ＰＥＧ豊富ドメインを上昇させ、ＰＥＧ不足ドメインを沈下させる。このことは、巨視的な上部ＰＥＧ豊富（Ｍ１３不足）相及び巨視的な下部ＰＥＧ不足（Ｍ１３豊富）相の形成をもたらす。この過程の動力学及び同伴または捕捉ドメインの効果を、下記に更に説明する。
ウイルスは、巨視的な下部相に極度に分配されると予測されるので、唯一の関心事は、抽出時の下部相における生体分子の濃度であった。そのため濃度係数を、巨視的な下部相におけるウイルスの濃度、Ｃウイルス、下部を初期の全体的な濃度、Ｃウイルス、初期で割ったもの、と定義する。
Figure 2021073465
濃度係数に否定的な影響を与え得る１つの潜在的な懸念は、巨視的な下部相に同伴されたＰＥＧ豊富（Ｍ１３不足）ドメインの存在である。平衡になる前、全てのドメインが、対応する巨視的な相に移動するのに十分な時間を有していたわけではない。しかし、平衡体積比の９：１を使用したときには、このことは問題とならない。９：１体積比のＰＥＧ豊富ドメインに関連する大きな体積に起因して、ＰＥＧ豊富ドメインは、合体すること及び連続相を形成することが容易である。ＰＥＧ豊富ドメインは、巨視的下部相が非常に小さいので、巨視的上部相に到達するために移動する距離も小さい。その結果、巨視的下部相におけるＰＥＧ豊富（Ｍ１３不足）ドメインの同伴も最小限であり、生体分子の濃度は、平衡値に近いと予測される。しかし、ＰＥＧ不足（Ｍ１３豊富）ドメインは、依然として巨視的上部相にあることが予測される。ＰＥＧ不足ドメインに関連する小さな体積に起因して、これらのドメインが合体することは、より困難である。巨視的下部相に到達するために、粘性の多いＰＥＧ豊富巨視的相の中を更なる距離にわたって移動する必要もある。しかし、主な懸念が下部相における生体分子の濃度であり、ＬＦＡに小さい体積しか必要でないので、３０分の時点で抽出することが可能であり、依然として、予測される平衡濃度係数を達成することが可能である。
時間の関数としての９：１体積比溶液の相分離を視覚的に検査した。最初に、ＰＥＧ豊富及びＰＥＧ不足ドメインが、溶液全体にわたって形成される。ＰＥＧ豊富ドメインは、急速に合体し、連続相を形成する。溶液は、同伴されたＰＥＧ不足ドメインが光を散乱させるので、混濁して現れる（図４０Ａ）。ＰＥＧ不足ドメインが合体し、高い密度のため下部に沈下するので、巨視的な下部ＰＥＧ不足相が下部から上に向かって形成される。３０分後、清澄な巨視的下部ＰＥＧ不足相から分離した、混濁した巨視的な上部ＰＥＧ豊富相が存在する（図４０Ｂ）。上部相が同伴ＰＥＧ不足（Ｍ１３豊富）ドメインを含有するが、主な関心事は、下部相が濃縮生体分子を含有するので、下部相の混濁度である。長時間の後、全ての、または大部分のＰＥＧ不足ドメインは、巨視的下部相に移動し、系は、２つの清澄な相により示されているように、ほぼ平衡になる（図４０Ｃ）。３０分の時点での下部相が、有意な量の同伴ＰＥＧ豊富（Ｍ１３不足）ドメインの不在に起因して既に清澄であり、その相におけるウイルスの測定濃度が平衡値を既に反映しているはずであることを示唆していることに、留意すること。
３０分の時点で下部相を抽出するために、巨視的な下部ＰＥＧ不足（Ｍ１３豊富）相が、有意な量のＰＥＧ豊富（Ｍ１３不足）ドメインを含有しないと確認することが、望ましかった。したがって、濃度係数は、下部相におけるＭ１３の測定された濃度が、短時間後でも平衡値と等しいことを示す時間の関数として、決定された。具体的には、Ｍ１３分配実験は、図４０で使用されたものと同じ温度、ならびに初期ＰＥＧ及び塩濃度（すなわち、９：１平衡体積比を生じる条件）を使用して実施され、３０分、１時間、４時間及び２４時間（平衡を十分に過ぎている）の時点で下部相から抽出された。図４１に示されているように、濃度係数は、３０分から２４時間の抽出時間の関数として一定のままであり、巨視的な下部ＰＥＧ不足（Ｍ１３豊富）相におけるＰＥＧ豊富（Ｍ１３不足）ドメインの同伴が実際に最小限であることを実証した。したがって、続く試験において、３０分の抽出時間を、ＰＯＮ用途に必要な短い時間として使用した。
ＡＴＰＳにおけるＭ１３の分配
方程式（９）の濃度係数は、体積比の関数であることを示すことができる。単一の均質相におけるウイルスの初期モルを、２つの得られた相におけるウイルスの総モルと均等化するモル平衡を使用して、以下の式を得た。
Figure 2021073465
 ここで、Ｃウイルス、上部は、巨視的上部相におけるウイルスの濃度であり、Ｖ上部及びＶ下部は、それぞれ上部相及び下部相の体積である。方程式（１０）を再構成すると、濃度係数の以下の式をもたらす。
Figure 2021073465
９：１体積比のＡＴＰＳを使用して、Ｍ１３の分配係数を測定し（上部相の平衡濃度を、下部相の平衡濃度で割ったもの）、０．０００１未満であった。測定された分配係数がＶ下部／Ｖ上部値の１／９よりかなり小さいので、この式を以下のように近似させることができる。
Figure 2021073465
したがって、線形関係が、体積比の関数としての濃度係数に予測される。濃度係数は、生体分子が下部相に極度に分配されるので、体積比が増大すると増大し、体積比の増大は、Ｍ１３が極度に分配される相の縮小に対応する。具体的には、９：１体積比が使用される場合、Ｍ１３が極度に分配される相の体積が初期体積の１／１０であるので、Ｍ１３は、１０倍濃縮されることが予測される。続いて、このことを、短い時間がＰＯＮ用途に必要であるので、３０分抽出時間を使用して試験した。Ｍ１３分配実験を３７℃により、９：１、６：１、３：１及び１：１平衡体積比を生じるＰＥＧ及び塩の初期濃度を用いて実施した。図４２は、体積比の関数として濃度係数を試験した実験の結果を示す。実験データがモデル予測と一致するかを統計的に決定するため、決定係数またはＲ二乗値を計算した。Ｒ二乗値は、０．８５８であることが見出され、実験データが予測値とほど良く一致していることを示唆し、簡単なモデルが３０分抽出時間であっても適切であることが更に確認された。
ＬＦＡを介したＭ１３の検出
Ｍ１３がＡＴＰＳを介して３０分で濃縮され得ることを実証した後、コロイド金プローブ及びＬＦＡストリップを調製した。金プローブの表面に装飾されたＰＥＧは、立体安定性を提供し、抽出された塩豊富相の環境において金プローブの凝集を防止した。図４３は、前濃縮ステップを受けなかった試料によるＬＦＡの結果を示す。Ｍ１３濃度を、対数目盛に沿って等間隔を置いた点で選択した。ポリクローナル抗ＩｇＧ抗体を含有する対照線または上側バンドの存在は、試料がストリップ全体を流れたことが確認されるので、有効な試験であることを示す。Ｍ１３コーティングタンパク質ｐＶＩＩＩの抗体を含有する試験線または下側バンドの存在は、Ｍ１３の存在を示す。図４３Ａに示されている陰性対照は、Ｍ１３を含有せず、予測されるように、可視試験線が存在しない。残りのパネルでは、試験線の強度は、図４３Ｂに示されている最高Ｍ１３濃度において最大であり、線の強度は、Ｍ１３濃度が減少すると、減少する。試験線は、３．２×１０８ｐｆｕ／ｍＬ（図４３Ｅ）においてもはや見えなくなり、検出限界がおよそ１×１０９ｐｆｕ／ｍＬ（図４３Ｄ）であることを示している。
ＬＦＡに先立つＭ１３の濃縮
１×１０９ｐｆｕ／ｍＬに確立された検出限界によって、検出限界の可能性な改善を、ＡＴＰＳを利用して調査した。方程式（１２）に基づいておよそ１０倍の濃度係数を生じると予測された、９：１体積比溶液を使用した。３７℃で３０分間インキュベートした後、下部相を抽出し、試料をＬＦＡのために準備した。図４４は、前濃縮ステップを有するＬＦＡの結果を示す。ここでも、試験線は、Ｍ１３を含有しない陰性対照において、不在であった（図４４a）。残りのパネルでは、初期Ｍ１３濃度は、図６に示されたものより１０倍少ないが、ＬＦＡ試験線の強度は、前濃縮ステップを有さない試料と一致している。試験線の強度は、Ｍ１３の濃度が減少して、３．２×１０７ｐｆｕ／ｍＬ（図４４Ｅ）においてもはや見えなるまで、減少し、検出限界がおよそ１×１０８ｐｆｕ／ｍＬ（図４４d）であることを示している。このことは、ＡＴＰＳ濃縮ステップが適用されたとき、検出限界に１０倍の改善があることを示した。
ＬＦＡストリップの視覚的解釈からの結論を確認するため、ＬＦＡ画像をグレースケールに変換し、試験線強度を、本発明者たちの特別仕様ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを使用してバックグラウンドに対して検査した。ＡＴＰＳ濃縮ステップを用いた及び用いない結果を、図４５に示す。２つの曲線が、ほぼ同じ試験線シグナルでの初期Ｍ１３濃度では１０倍の差により隔てられており、本発明者たちの１０倍濃縮改善が更に確認されていることに留意すること。
実施例５．ＰＥＧ塩ＡＴＰＳの界面抽出による生物学的血清におけるトランスフェリンの検出
単一ＡＴＰＳステップを使用する生体分子の濃縮は、目的生体分子を、２つの嵩高相の界面に向けて誘導することによって最適化した。界面領域は、体積比に無関係に形成され得る極めて小さい体積領域を表すので、この新規手法は、標的の濃度が、長い相分離時間を有する極度体積比（１を大きく上回る、または大きく下回る体積比）に依存しないことを可能にする。代わりに、最速で平衡に到達できる体積比が選択され、これは、抽出時間を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）において１０分以内に低減し、以前の手法に対する有意な改善であった。この手法は、界面の体積が２つの巨視的嵩高相よりもかなり小さいので、単一ＡＴＰＳステップにおいて達成され得る最大濃度倍数に向かっており、したがって、生体分子は、さらにいっそう極度に濃縮され得る。最後に大事なことは、試料体積の増加は、望ましいことに、界面に濃縮され、ＬＦＡにより検出され得る目的生体分子の総数を増加する。このことは、極度体積比を使用して嵩高相に目的分子を濃縮することについても当てはまるが、試料体積の増加は、相分離時間も増加する。提案されている界面抽出手法において、極度体積比は、もはや必要ない。図４６は、界面抽出を２つの嵩高相のうちの１つの抽出と図解的に比較している。
目的生体分子を界面に向かって誘導するため、ＧＮＰを伴う捕捉機構を利用した。粒子表面を装飾する特定の抗体によって、ＧＮＰは、最初に、試料中の目的タンパク質を捕捉した。ＧＮＰの表面化学を、粒子が相分離のときに界面に分配されるように最適化した。次に、ＧＮＰにより捕捉されたタンパク質を界面から抽出した。界面の体積が非常に小さいので、タンパク質は、高度に濃縮されており、続いてＬＦＡ検出ストリップに適用された。この例は、ＰＥＧ塩ＡＴＰＳの界面に分配する能力のある調製済ＧＮＰの要約を提供する。相が最速に分離し、ＧＮＰの最大回収も可能にする体積比を、次に調査した。続いて、モデルタンパク質のトランスフェリン（Ｔｆ）を使用して、ＡＴＰＳ界面抽出ステップと組み合わせたＬＦＡのＴｆに対する１００倍の改善を実証した。次に研究を拡大して実社会の用途に近づけ、ウシ胎児血清（ＦＡＢ）及び合成尿、ならびに採血に好ましい小さい体積のためにシステムを再最適化した。データは、より複雑なシステムであっても、ＡＴＰＳ界面抽出は、１５〜２５分以内に実施することができ、ＬＦＡにおけるＴｆの検出限界に１００倍の改善をもたらし得ることを示している。
この例は、界面に局在化することができ、ＬＦＡの発色指標としても機能することができるナノプローブの開発を提供する。この手法は、目的生体分子を濃縮及び収集するために官能化された磁気または金粒子を使用する点において、前に研究された抽出方法と異なっており、これらの手法は、ポイントオブケアデバイスに適していない機器を必要とした。本方法は、ＬＦＡの検出限界を１００倍改善し、実験室用のイムノアッセイとペーパーに基づくイムノアッセイとの感度の差を縮めることに有効であり、なおかつ迅速な手法である。増強された感度を有する改善されたＬＦＡは、診断の分野に有意な影響を与え、現在利用可能ではないポイントオブケア溶液の提供に近づいている。他方、この手法がＬＦＡ検出の性能を改善できることが実証されたが、この前濃縮手順を、他の検出不法に適用することもできる。
抗Ｔｆ抗体の放射標識
全ての試薬及び材料は、特に示されない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）を使用して、ヤギ抗ヒトＴｆポリクローナル抗体（カタログ番号Ａ８０−１２８Ａ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）のチロシン残基を放射標識した。簡潔には、Ｎａ１２５Ｉ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により活性化した。続いて、活性化された１２５Ｉを、ヤギ抗Ｔｆ抗体と１５分間反応させた。放射標識されたタンパク質を精製し、遊離１２５Ｉを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５サイズ排除カラムを使用して除去した。リンタングステン酸アッセイを使用して、放射標識タンパク質の放射能及び濃度を定量した。
ＧＮＰの調製
そのままの金ナノ粒子を調製して、直径がおよそ２５〜３０ｎｍの粒径を有する清澄なサクラ色の溶液をもたらした。ＧＮＰを調製するため、３２０ｍｇのヤギ抗Ｔｆ抗体を２０ｍＬのコロイド金溶液と共に３０分間インキュベートし、続いてＰＥＧ：ＧＮＰの３０００：１のモル比を使用してチオール化ＰＥＧ５０００を加え、更に３０分間インキュベートした。コロイド金の表面への他のタンパク質の非特異的結合を防止するため、２ｍＬの１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を混合物に加え、更に１０分間混合した。得られた溶液を、インキュベーションの時間にわたって、振とう器により穏やかに混合した。遊離（非結合）抗体、ＰＥＧ及びＢＳＡを除去するため、続いて混合物を４℃及び９，０００ｇで３０分間遠心分離した。ＧＮＰのペレットを１％ＢＡＳ溶液で２回洗浄した。最後に、回収したＧＮＰを２ｍＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。
ＧＮＰの分配
放射標識抗Ｔｆ抗体で装飾されたＧＮＰを、異なる条件でＡＴＰＳにおいて分配させて、最速及び最高のＧＮＰ回収を生じ得る体積比を決定した。それぞれの分配実験において、ダルベッコーリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｐＨ７．４、イオン強度１５４ｍＭ）中の３つの同一のＰＥＧ塩溶液を調製して、総体積の５０００μＬにした。３つの異なる体積比（１：１、６：１及び１：６）のＰＥＧ塩ＡＴＰＳ溶液を、ＰＥＧとリン酸カリウムの特定の濃度を使用して調製した。続いて、１０μＬの、放射標識抗Ｔｆ抗体が装飾されたＧＮＰを、各ＡＴＰＳ溶液に加えた。溶液を０℃で平衡にして、溶液が均質であること確実にした。０℃で平衡を得ると、溶液を水浴中に３７℃でインキュベートして、相分離を誘発し、ＧＮＰは２つの共存相に分配されることが見出された。界面のＧＮＰを、ピペットの使用により注意深く抜き取り、３０μＬの界面溶液を抜き取って、界面における、全部ではないとしても大部分のＧＮＰを収集した。２つの共存相も、ピペットを使用して別々に抜き取った。界面及び２つの共存相におけるＧＮＰの量は、ＧＮＰが放射標識抗Ｔｆ抗体に結合しているので、Ｃｏｂｒａ Ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して、各領域における放射能の量を測定することによって定量化した。３つの領域のそれぞれにおけるＧＮＰの定量化した量を使用して、物質収支を使用して界面におけるＧＮＰの回収率を計算した。
ＬＦＡ試験ストリップの調製
競合機構を利用するＬＦＡ試験をこの研究において実施した（図４７）。競合アッセイでは、対象の標的はニトロセルロース膜に固定化されて、試験線を形成する。ＧＭＰ上の一次抗体に対する固定化二次抗体が、対照線を構成する。ＬＦＡを実施すると、試料は最初にＧＮＰと接触し、目的分子が試料中に存在する場合、目的分子は、ＧＮＰに装飾された特定の抗体と結合する。試料中に存在する目的分子が、ＧＮＰ上の抗体を飽和する場合、これらのＧＮＰは、試験ストリップに固定化された目的分子と、もはや結合することができない。その結果、ＧＮＰは、試験線において可視バンドを形成せず、このことは陽性の結果を示す。他方、試料がＧＮＰ上の抗体を飽和できる濃度で目的分子を含有しない場合、ＧＮＰ上のこれらの抗体は、試験ストリップに固定化された標的分子に結合し、試験線に可視バンドを形成することができる。このことは、陰性の結果を示す。更に、試料中の目的分子の存在にかかわらず、ＧＮＰ上の抗体は、対照線の固定化二次抗体に結合し、ことのことは、十分な試料が試験線を通って吸収排出されて、対照線に到達したことを示している。可視対照線の存在は、有効な試験であることを示している。
Ｔｆを用いるが、前濃縮を用いない、ＬＦＡの実施
様々な濃度のＴｆを含有するＴｆ貯蔵溶液をＰＢＳにより調製した。続いて、２０μＬの各Ｔｆ貯蔵溶液を１０μＬのＧＮＰ懸濁液及び試験ストリップ中の試料の流動を助けるために使用した２０μＬの試験緩衝液（０．２％のＢＳＡ、０．３％のＴｗｅｅｎ２０、０．２％のアジ化ナトリウム、０．１％のＰＥＧ、０．１ＭのＴｒｉｚｍａ塩基、ｐＨ８）と混合した。様々な濃度のＴｆを有する合計で５つの試料溶液（それぞれ５０μＬ）を調製した（０（陰性対照）、０．００１、０．０１、０．１及び１ｎｇ／μＬ）。試験ストリップを、試料パッドが溶液と接触するように、各試料溶液の中に垂直方向に浸けた。１０分後、試験ストリップを取り出し、各ストリップの画像を、Ｃａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）により直ぐに撮影した。
ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、特徴決定済、ｐＨ７．４）において実施された実験では、ＧＮＰの体積を低体積実験用に適切に縮小できるように、より濃縮されたＧＮＰ懸濁液を使用した。ＦＢＳ貯蔵溶液中のＴｆの濃度は、５μＬのＴｆ貯蔵溶液を５μＬのＧＮＰ懸濁液に加え、続いて４０ｍＬの試験緩衝液に加えることによって、ＰＢＳ実験に使用した最終Ｔｆ濃度と同じになるように調整した。同様に、実験を合成尿の使用によって実施した。
ＴｆのためのＡＴＰＳ界面抽出とＬＦＡとの組み合わせ
体積比の１：１を、ＧＮＰ分配実験における知見に基づいてＰＢＳにおいて実施された試験に使用した。抗Ｔｆ抗体を利用することによって、ＧＮＰは最初に試料中のＴｆを捕捉し、続いて全てのＴｆ−ＧＮＰＳ複合体が界面に濃縮された。様々な濃度のＴｆもＡＴＰＳ溶液に添加したことを除いて、ＧＮＰ分配の節に記載されたものと同じプロトコールを使用した。簡潔には、１０μＬのＧＮＰ懸濁液を、１：１体積比を生じ、様々なＴｆ濃度（０（陰性対照）、０．００１、０．０１及び０．１ｎｇ／μＬ）を含有する、４９９０μＬのＴｆ添加ＡＴＰＳ溶液に加えた。溶液を０℃で平衡にして、溶液が均質であること確実にした。平衡が得られると、溶液を水浴中に３７℃で置いて、相分離を誘発した。１０分後、濃縮されたＧＮＰ及びＴｆを含有する３０μＬの界面溶液を抜き取った。この界面溶液を２０μＬの試験緩衝液と混合して、５０μＬの試料溶液を形成した。ＬＦＡ試験ストリップを、試料パッドが溶液と接触するように、各試料溶液の中に垂直方向に浸けた。１０分後、試験ストリップを取り出し、各ストリップの画像を、Ｃａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラにより直ぐに撮影した。
ＦＢＳ及び合成尿において実施された試験では、ＰＥＧ及びリン酸カリウムの濃度を最初に調整して、１：１体積比を達成する必要があった。ＦＢＳにおけるＡＴＰも、さらにゆっくりと相分離し、ＰＢＳ系に使用して１０分インキュベートする代わりに、溶液を３７℃の水浴中に２５分間保持した。加えて、前述のように、体積を低減した。したがって、５０００μＬ（ＬＦＡのみの実験に使用された５０μＬのＴｆ貯蔵溶液の１００倍多い体積）を使用して検出限界の増大を示すのではなく、ＦＢＳ及び合成尿において実施された試験は、１０００μＬ（ＬＦＡのみの実験に使用された１０μＬのＴｆ貯蔵溶液の１００倍多い体積）を使用して同等の改善を示した。ＰＢＳにおいて既に記載されたプロトコールを低体積のために変更し、それによって、５μＬのより濃縮した金懸濁液を、９９５μＬの、ＦＢＳまたは合成尿中のＴｆ添加ＡＴＰＳ溶液に加えた。２０μＬの界面領域を抽出し、続いて３０μＬの金緩衝液を加えた。各ＬＦＡストリップを、取り出して画像化する前に、懸濁液の中に１５分間浸けた。
ＡＴＰＳ界面抽出と、ペーパーに基づいたＬＦＡ検出アッセイとを組み合わせるため、この例において開発されたＧＮＰは３つの機能を有した。第１は、ＧＮＰの表面の装飾特異的抗体が、試料中に存在する目的タンパク質を捕捉したことである。第２は、ＧＮＰの表面におけるＰＥＧとタンパク質の最適化された配合が、ＧＮＰを界面に分配させ、嵩高相には分配させなかったことである。最後は、ＧＮＰがＬＦＡの発色指標として直接作用し、したがって続く検出アッセイを、余分な洗浄または他の準備ステップなしで直ちに実施できたことである。ＧＮＰの概略図を図４８Ａに示す。ＧＮＰは、ＰＥＧポリマー、金ナノ粒子及び抗Ｔｆ抗体という３つの主な構成成分要素を有する。各構成要素はそれ自体ナノ粒子を２つの嵩高相のうちの１に誘導する。最初に、装飾ＰＥＧは、粒子表面のポリマーと、上部相中の豊富なポリマーとの好ましいＰＥＧ−ＰＥＧ相互作用に起因して、ナノ粒子を上部ＰＥＧ豊富相に誘導する（図４８Ｂ）。具体的には、ＰＥＧ：ＧＮＰのモル比の増大は、結合ＰＥＧの立体構造が「ブラシ」の立体構造に酷似するように変化させ、曝露される表面積の量を拡大して、ＰＥＧ−ＰＥＧ相互作用を増加させる。他方、サイズの大きな金ナノ粒子は、ナノ粒子がＰＥＧポリマーとのより少ない反発的な排除体積的相互作用を受ける、下部ＰＥＧ不足相へのナノ粒子の分配を引き起こす。ＧＮＰ上の親水性タンパク質（抗Ｔｆ ＡＢ及びＢＳＡ）は、ＧＮＰの親水性を増加し、上部ＰＥＧ豊富相より親水性がある下部ＰＥＧ不足相へのＧＮＰの分配も引き起こす。しかし、下部ＰＥＧ不足相も塩が豊富であるので、ナノ粒子は、十分な立体安定性を提供するのに十分なＰＥＧがナノ粒子の表面にないときに凝集する（図４８Ｃ）。組み合わせると、ＧＮＰの３つの構成要素を変え、微妙に均衡を取って、最終的にＧＮＰをＡＴＰＳの界面に誘導することができる（図４８Ｄ）。
競合的ＬＦＡでは、試料中の目的タンパク質の検出の成功は、ＧＮＰ上の抗体が標的により飽和されることに依存している。抗体が飽和されない場合、ＧＮＰは、ＬＦＡ上の固定化標的に結合して試験線を形成し得、偽の陰性結果を示す。低濃度の標的を有する試料を検出する１つの方法は、試料体積を増加することである。このことは目的分子の総数を増加し、そのことは、潜在的には、所定の固定量のＧＮＰへの抗体の飽和をもたらす。しかし、小さい体積のみがＬＦＡ試験ストリップの中を流れることができ、ＧＮＰがこの手法では希釈されるので、十分なＧＮＰが試験ストリップの中を流れない場合、対照線は可視化されず、無効の結果を示す。ＡＴＰ界面抽出の使用が、少量の目的タンパク質で飽和されるＧＮＰを集める迅速で有効な手段を提供するので、この手法は、より大きな試料体積の分析を可能にすることによって、低濃度の目的タンパク質の検出をもたらすことができる。
３つの体積比を試験して、最短のインキュベーション時間内に大部分のＧＮＰを回収できる最適な体積比を決定した。結果を表４に示す。
Figure 2021073465
１：１体積比相は、最速に分離し、ＧＮＰの最大の回収を可能にした。相分離が、温度の上昇により誘発されるとき、微視的ＰＥＧ豊富及びＰＥＧ不足ドメインが形成され、類似したドメインは、互いに見つけ合って合体する。ドメインが合体すると、移動し、最終的に、２つの相の界面張力及び密度の差に起因して、巨視的なＰＥＧ豊富塩不足相を上部に形成し、巨視的なＰＥＧ不足塩豊富相を下部に形成する。１：１体積比相は、それぞれの相が有意な量で存在するとき、ドメインが互いに見つけ合い、合体するのに容易であるので、６：１または１：６体積比よりも速く分離する。より不均一な体積比では、小さな体積の相のドメインは、ドメインにとって合体することが難しいので、大きな連続相に同伴され得る。更に、６：１体積比相は、ＰＥＧ豊富相が６：１体積比の連続相であり、ＰＥＧ不足ドメインが互いに見つけ合い、より粘性のあるＰＥＧ連続相の対応する巨視的相へ進むことがより困難であるので、１：６体積比よりもゆっくりと分離する。
Figure 2021073465
ＧＮＰがいずれのドメインにも分配されないので、ＧＮＰは、ドメインが合体するとドメインの間に留まる。最終的に、ＧＮＰは、相分離が完了すると、界面に薄い赤色膜として現れる。ＧＮＰの回収は、１：１体積比を使用すると有効であり、それは、同伴がこの体積比では最小限であり、したがって少ない量のＧＮＰしか、同伴ドメインと連続相との間に存在する界面において失われないからである。１：１体積比相が、最高のＧＮＰ回収を生じながら、最速で分離するので、１：１体積比相を続く実験に使用した。
ＡＴＰＳ界面抽出ステップを組み込むことによるＬＦＡの増強を実証するため、モデルタンパク質のトランスフェリン（Ｔｆ）を利用した。Ｔｆは、鉄輸送のための血清タンパク質である。ＬＦＡにおいてＴｆの検出限界を確立するため、任意の前濃縮ステップを用いない様々なＴｆ濃度による一連のＬＦＡ試験を実施した。試料が、ＧＮＰに装飾された抗Ｔｆ抗体を飽和するのに十分なＴｆ分子を含有した場合、これらの抗Ｔｆ抗体は、試験線でニトロセルロース膜の固定化Ｔｆに結合せず、したがって試験線に可視バンドを形成しなかった。このことは陽性の結果を示し、これは、１ｎｇ／μＬのＴｆ濃度を有する試料を試験したときに観察された（図４９、上部パネル）。他方、抗Ｔｆ抗体を飽和するのに不十分なＴｆが試料中に存在する、または抗Ｔｆ抗体を飽和するＴｆが試料中に存在しない場合、これらの抗Ｔｆ抗体は、ニトロセルロース膜の固定化Ｔｆへの結合に成功し、したがって、試験線に可視バンドを形成した。このことは陰性の結果を示し、これは、１ｎｇ／μＬ未満のＴｆ濃度を有する試料を試験した時に観察された。１ｎｇ／μＬが、真の陽性結果を示した最低のＴｆ濃度であるので、このことは、前濃縮ステップなしのＬＦＡを実施するとき、Ｔｆの検出限界がおよそ１ｎｇ／μＬであることを示した。
ＡＴＰＳ界面抽出ステップがＬＦＡを使用したＴｆの検出限外を１００倍改善できるかを実証するため、同じ量のＧＮＰを、ＬＦＡの検出限界より１００倍低いＴｆ濃度（０．０１ｎｇ／μＬ）を有するＡＴＰＳ溶液に適用した。試料体積を５０μＬから５０００μＬに１００倍増加させて、Ｔｆ分子の総数を同数に保った。制限された量の試料（５０μＬ）しかＬＦＡ試験ストリップに適用できないので、この大量の試料溶液中の希釈ＧＮＰを濃縮して、ＬＦＡに適用する必要があった。目的タンパク質により飽和されたこれらのＧＮＰを回収するため、溶液を水浴中に３７℃で設置して、ＧＮＰを界面で１０分以内に収集した。次にＧＮＰを抽出し、ＬＦＡ試験ストリップに直接適用した。この研究の結果を図４９の下部パネルに示す。真の陽性結果を０．０１ｎｇ／μＬで得て、これは、検出限界に１００倍の改善を示した。この手法を使用した０．００１ｎｇ／μＬでの偽陰性結果の試験線強度は、同じＴｆ濃度の試料を比較したとき、前濃縮ステップを用いないものより軽く、より多くのＴｆが捕捉されて、ＧＮＰが試験線に結合するのを困難にしていることを示した。試験線強度は、Ｔｆ濃度が減少しても増加し、このことは、抗体を飽和するのに利用可能なＴｆの量が減少したので、予測されたことであった。
ＡＴＰＳ界面濃縮の有効性を研究するため、ＦＢＳから作製された低体積のＡＴＰＳ溶液を、患者から採血した少量の血液試料を模倣するかについて試験した。ＦＢＳのより複雑な組成に起因して、ＰＢＳのＡＴＰＳを使用した手順を、ＦＢＳ系のために再最適化した。ＦＢＳの高いタンパク質含有量はＡＴＰＳの体積比を変更するので、１：１体積比を形成するため異なる濃度のＰＥＧ及び塩を必要とした。ＦＢＳにおいて実施された実験も小さい試料体積を利用したので、ＧＮＰの体積を縮小する必要があり、より濃縮されたＧＮＰ貯蔵液を作製した。加えて、ＡＴＰＳのインキュベーション時間を、ＦＢＳが相分離過程を遅延させたので、１０から２５分に延長した。加えて、ＦＢＳを含む複合混合物のため、ＬＦＡ試験の時間を１０から１５分に延長した。血清が、より複雑なマトリックスを表すにもかかわらず、図５０は、ＡＴＰＳ界面抽出と組み合わせたＬＦＡが、前濃縮を用いないＬＦＡと比較して、検出限界に依然として１００倍の改善を生じたことを示している。ＬＦＡの１０μＬの試料を使用し、ＬＦＡの１０００μＬの試料を、ＡＴＰＳ界面抽出と組み合わせた。同様の最適化過程を合成尿系において実施し、図５１に示されているように、最終的に、検出限界において類似した１００倍の改善を実証した。
実施例６．Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１１４ ＡＴＰＳ及び三次元ＬＦＡを使用したマラリアバイオマーカーの検出
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳを三次元紙構造に適用して、紙設定がこのミセル系の分離過程も増強できるかを決定した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ミセル系の相は、ＰＥＧリン酸塩ＡＴＰＳよりかなりゆっくりと分離し、少なくとも８時間から約３分間に相分離時間のさらに大きな低減をもたらし、紙におけるこの相分離現象の、ミセルＡＴＰＳへの適用性を拡大する。次に、ペーパーに基づく設計をＬＦＡと一体化して、ユーザーが関与することなく疾患バイオマーカーを同時に濃縮及び検出する、ペーパーに基づく一体型診断ストリップを形成した。これを実証するため、診断ストリップを、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び無希釈ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の溶液における、マラリアバイオマーカーのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（プラスモディウム・ファルシパルム）乳酸デヒドロゲナーゼ（ｐＬＤＨ）の検出に使用した。堅牢な１ステップ自動化診断ストリップは、ｐＬＤＨを２０分以内に濃縮及び検出し、伝統的なＬＦＡ設定と比較したとき、ｐＬＤＨ検出限界に１０倍の改善を実証した。このプラットフォーム技術は、前述の限界を克服し、現状の診断アッセイを、資源不足の環境内でマラリア及び他の疾患のために転換することに使用できる。材料及び
金ナノプローブ（抗ｐＬＤＨ ＧＮＰ）の調製
流体力学的な平均直径の２４ｎｍを有する金ナノ粒子の溶液を調製し、暗サクラ色の溶液として現れた。金ナノ粒子の直径を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ粒子分析機（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、動的光散乱測定によって得た。
ナノ粒子を形成した後、１ｍＬの金ナノ粒子溶液のｐＨを、最初に、１．５Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ９に調整した。続いて１６μＬのマウスモノクローナル抗Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（ファルシパルム）／Ｐ．ｖｉｖａｘ（ビバックス）ＬＤＨ抗体（ＢＢＩ溶液、Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）を、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、コロイド金溶液に加え、振とう器により３０分間混合した。コロイド金ナノ粒子の表面への他のタンパク質の非特異的結合を防止するため、２００μＬの１０％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を混合物に加え、振とう器により２０分間混合した。遊離した非結合抗体を除去するため、次に混合物を４℃及び１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、続いてコロイド金ナノ粒子のペレットを、２００μＬの１％ｗ／ｖＢＳＡ溶液に再懸濁した。遠心分離及び再懸濁ステップを更に２回繰り返し、３回目の遠心分離の後、金ナノ粒子のペレットを、１００μＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。抗ｐＬＤＨ抗体により機能化された金ナノ粒子を、以降、抗ｐＬＤＨ金ナノプローブ（抗ｐＬＤＨ ＧＮＰ）と呼ぶ。抗体により官能化されないＢＳＡ被覆金ナノ粒子を、可視化の目的に使用し、以降、ＢＳＡ−ＧＮと呼ぶ。
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳの調製及び可視化
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳの平衡体積比（上部相の体積を、下部相の体積で割ったもの）は、ダルベッコーリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ、ｐＨ７．４、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３７．９２ｍＭのＮａＣｌ、２．６７ｍＭのＫＣｌ及び０．４９ｍＭのＭｇＣｌ２を含有）ならびにＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の溶液における、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の初期ｗ／ｗ濃度を変えることによって見出された。これらの溶液を、温度制御水浴において２５℃で相分離及び平衡到達させた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４／ＰＢＳ溶液中のＢＳＡ−ＧＮは、上部相への好ましい分配を示し、一方、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４／ＦＢＳ溶液中のＢＳＡ−ＧＮは、下部相に好ましく分配された。したがって、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４／ＰＢＳ中の１：９体積比（すなわち、上部相の体積を下部相の体積で割ったもの）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４／ＦＢＳ中の９：１体積比の条件を見出して、更なる実験に使用した。これらの体積比は、ナノ粒子の１０倍濃縮を可能にした。
ＰＢＳ中のミセルＡＴＰＳの２つの相を可視化するため、１００μＬのＢＳＡ−ＧＮ及び４μＬのブリリアントブルーＦＣＦ色素（Ｔｈｅ Ｋｒｏｇｅｒ Ｃｏ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を、ＰＢＳ中に１：９体積のために予め決定された濃度のＸ−１１４を含有する２．５ｇの溶液に加えた。これらの溶液をボルテックスにより十分に混合し、２５℃でインキュベートした。溶液の画像を、８時間で平衡の達するまで、毎時間撮影した。溶液が混濁の外観を失い、全ての可視ドメインが対応する相に移り、測定された界面高さが安定したままであるとき、平衡が確立された。サクラ色のＢＳＡ−ＧＮ及び青色の色素は、ミセル不足相及びミセル豊富相それぞれにおける発色指標である。全ての画像は、Ｃａｎｏｎ ＥＯＳ １０００Ｄカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を、制御照明環境下で使用して撮った。
三次元ペーパー芯のＰＢＳ中のミセルＡＴＰＳの相分離を可視化するため、２μＬのブリリアントブルーＦＣＦ色素及び１０μＬのＢＳＡ−ＧＮを含有する２００ｍｇの混合均質溶液をボルテックスし、続いて水浴に２５℃で設置した。三次元ペーパー芯は、３枚の５×１５ｍｍガラス繊維紙シートを５×４０ｍｍのガラス繊維ストリップの一方の縁部に重ねることによって形成した。調製した溶液を２５℃で５分間インキュベートした後、三次元ペーパー芯を溶液の中に垂直方向に入れ、紙積層に溶液を吸収させた。ペーパーストリップの画像を、０、３０、６０及び１８０秒で撮った。
ＬＦＡのみによるｐＬＤＨの検出
競合アッセイフォーマットを利用するＬＦＡ試験ストリップを、組み立てた。固定化されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（ファルシパルム）Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｐＬＤＨ、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、試験線を構成し、一次抗ｐＬＤＨ抗体に特異的な固定化されたヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）は、対照線を構成した。試料中にＧＮＰを飽和するのに十分なｐＬＤＨが存在する場合、ＬＦＡストリップの中を進むｐＬＤＨ−ＧＮＰ複合体は、試験線の固定化ｐＬＤＨに結合せず、試験線に可視着色バンドの不在をもたらす。ｐＬＤＨが存在しない場合、ＧＮＰ上の非占有抗体は、固定化ｐＬＤＨに結合し、着色バンドが試験線領域に形成される。ｐＬＤＨの存在にかかわらず、ＧＮＰ上の抗体は、対照線に固定化された二次抗体に結合し、可視線を形成して、ストリップ中の試料流動が成功したことを示す。したがって、陰性結果は、２本の着色バンド（１本は、試験線であり、１本は対照線である）により特定され、一方、陽性結果は、対照線のみにおける１本の着色バンドにより特定される。
ＬＦＡのみによるｐＬＤＨの検出限界を検証するため、抗ｐＬＤＨ ＧＮＰを試料溶液に加え、試料中に存在するｐＬＤＨに結合させて、ｐＬＤＨ−ＧＮＰ複合体を形成した。１０μＬの抗ｐＬＤＨ ＧＮＰ及び１０μＬの、ＰＢＳまたはＦＢＳ中の既知濃度のｐＬＤＨからなる２０μＬの試料溶液を、試験管中の３０μＬのランニングバッファー（０．２％のＢＳＡ、０．３％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）、０．１ＭのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８）と混合した。ＬＦＡ試験ストリップを試料溶液の中に垂直方向に挿入し、試料溶液を、ストリップの中を毛細管作用によって吸収パッドに向かって吸収排出させた。ＰＢＳ及びＦＢＳ試料の両方の試験ストリップの画像を、制御照明環境下で、２０分後に撮影した。
三次元のペーパーに基づくＬＦＡ及びＡＴＰＳによるｐＬＤＨの検出
ＬＦＡ試験ストリップの設計を、三次元ペーパー芯を加えることによって僅かに変更した。具体的には、ニトロセルロース膜に接続されたセルロース試料パッドを、５×２０ｍｍのガラス繊維パッドに交換した。このガラス繊維パッドの上に、５×１５ｍｍのガラス繊維シートの３枚の追加のストリップを重ねて、合計で４層のガラス繊維紙を形成した。ガラス繊維層を、Ｓｃｏｔｃｈテープ接着剤（３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）できつく巻いた。
ＰＢＳ試料中のｐＬＤＨの検出では、１０μＬの抗ｐＨＤＨ ＧＮＰ及び既知濃度のｐＬＤＨを含有する２００μＬの十分に混合した１：９体積比のＡＴＰＳを、試験管に加えた。溶液を２５℃で５分間インキュベートして、溶液が、相分離の開始を示す混濁になることを確実にし、ＧＮＰが溶液中のｐＬＤＨを捕捉することを可能にした。次に三次元芯変更ＬＦＡストリップを混合ＡＴＰＳの中に入れ、流体を、三次元芯の中を吸収パッドに向かってに通過させた。得られた検出領域の画像を、２０分後に撮った。
ＦＢＳ試料中のｐＬＤＨの検出は、２００μＬの混合９：１体積比ＡＴＰＳを代わりに調製した以外は、非常に類似したプロトコールに従った。インキュベーション時間及び線が発生する時間を含む試験条件は、ＰＢＳ試料のものと一致していた。検出領域の画像を、また、２０分後に撮った。
試験管中のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳの相分離
特定の温度を超えるＰＢＳの溶液では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ミセルＡＴＰＳは、上部のミセル不足相及び下部のミセル豊富相を形成する。溶液に存在する分子は、疎水性及びサイズなどの物理的及び化学的特徴に基づいて２つの相に分配される。親水性ＢＳＡ−ＧＮは、主に、ミセル豊富相におけるナノ粒子と大型でより豊富なミセルとの反発的で立体的な排除体積的相互作用により誘導されて、ミセル不足相に極度に分配された。特定の抗体により官能化されたナノ粒子は、目的分子と複合体を形成することができ、これらの複合体も、ミセル不足相に極度に分配される。表面プラスモン共鳴に起因してサクラ色を現す非機能化ＢＳＡ−ＧＮを使用して、相分離の後に得られたミセル不足相を可視化した。対照的に、ブリリアントブルーＦＣＦ色素は、小型で疎水性であり、したがって、ミセル豊富相に極度に分配された。混合ＡＴＰＳ溶液に加える場合、青色色素は、相分離後に得られたミセル豊富相を可視化するために使用した。
相分離を達成するのに必要な時間は、異なる二相系において様々である。例えば、ＰＥＧリン酸塩ＡＴＰＳ相は、大部分の二相系より急速に分離するが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ミセルＡＴＰＳは、小さい密度差及び二相の界面張力に起因して、巨視的相分離平衡を達成するのに有意に長い時間を必要とする。相分離時間は、１：９または９：１などのより極度な体積比によっても増加し、それは、一方の相が比例してかなり小さくなり、その相の微視的ドメインは合体することが難しいからである。ＰＢＳ中の１：９体積比のＡＴＰＳの画像を特定の時点において２５℃で撮影し、完全な巨視的相分離平衡は、およそ８時間後まで達成されなかった（図５３Ａ）。得られたミセル不足相の体積を測定して、溶液の総体積の１０分の１であり、１：９体積比が確証された。
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳ相分離を増強するペーパー膜の使用
複数層の紙が紙における相分離を増強する必須の要素であると仮定した。したがって、複数層の薄い強固に結合したペーパーストリップからなる「三次元ペーパー芯」を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳの相分離過程を増加するように設計した。三次元芯を、ＰＢＳ中の混合ＡＴＰＳ溶液の中にまっすぐに立てて入れると、溶液はストリップの中を上方へ垂直方向に流れた。ストリップを加えたほぼ直後に、ＧＮＰを含有するミセル不足相は、青色色素を含有するゆっくりと進むミセル豊富相の先を流れた（図５３Ｂ）。分離は、およそ３０秒後にストリップの三次元芯部分内において既に観察され、より完全な分離は、流体が既に芯を出た後、１８０秒（３分）の時点で見られることに留意すること。
これらの実験は、芯の追加の層が流動の方向に対して直角に増加断面積を提供して、微視的相ドメインの合体を助け、所定の時間内により多くの体積が紙の中を吸収排出されることを可能にすることを示す。更に、粘性のより小さいミセル不足ドメインは、多孔質の紙の中を急速に前進して合体すると予測され、一方、ミセル豊富ドメインは、大きな粘性があり、潜在的に紙材料との相互作用を好むので、引き止められて、ゆっくりと進むと予測される。その結果、試験管において数時間台で発生することが示されている２つの相の巨視的な分離は、ペーパー膜では単に数分間で目の当たりにする。三次元ペーパー芯の追加の利益は、大量のＡＴＰＳ溶液が処理されることである。一般に、三次元芯の層の数は、大量の溶液に対応するために増加される。最適化された要素には、ストリップの長さ、幅及びストリップの数が含まれた。設計は、芯の長さにわたって完全な相分離達成すること及び分離されたミセル不足相が芯を出るために移動するのに必要な距離を最小限にすることができる。これらのペーパーに基づいた構造を、潜在的には、分離するのにさらに長い時間を必要とする他の多くの二相系を増強するために使用することができる。
ＦＢＳにおけるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳ相分離の増強
ＰＢＳ溶液と対照的に、ＦＢＳ試料中に形成されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳは、むしろ、上部のミセル豊富相及び下部のミセル不足相を生じた。これは、ＦＢＳにおいて見出された追加のタンパク質及び塩により引き起こされた密度の差に起因する可能性が高い。ＧＮＰが、むしろ下部相に極度に分配されたので、総体積の１０分の１、換言すると９：１の体積比で濃縮下部相を生じるように、初期Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４濃度を調整する必要があった。
２つの相の配向は、血清では逆転されるので、逆転された配向を試験して、三次元ペーパー芯による相分離の効果を決定した。事実、三次元芯をＦＢＳ中の混合ＡＴＰＳに入れると、結果は、ＰＢＳ実験で観察されたものと非常に類似していた。したがって、密度の差がＦＢＳ中のミセル不足相を試験管の下部に誘導するが、ミセル不足相は、依然として、三次元芯の中を上方に流れる速い方の相のままである。したがって、ミセル不足相は、試験管における相対的相密度によって決まる相配向と無関係に、先頭部にある。したがって、粘性の多いミセル豊富相は、一貫してゆっくりと進み、多孔質膜により引き止められ、粘度効果が、紙に導入されたミセルＡＴＰＳの流動動作に対する任意の密度効果より優位であることを示している。
ＰＢＳにおけるｐＬＤＨのＬＦＡに基づいた検出の改善
濃縮ＧＮＰを含有するミセル不足相が、三次元ペーパー芯の存在によって先頭部に流れるので、芯を、ＬＦＡペーパーストリップにおけるニトロセルロースに基づいた検出領域の上流に取り付けた。そうすることによって、濃縮ステップから検出ステップまでの途切れのない移動を可能にし、シリンジによる抽出の必要性を排除した。ペーパーに基づいた一体化診断ストリップの設計を、図５４Ａに示す。複数層のガラス繊維ペーパーストリップからなる三次元芯（濃縮区域）は、固定化された対照及び試験線（検出区域）を有するニトロセルロース膜と接続されており、次に、流体の流動を誘導する吸い込み口として使用される吸収パッドに接続されている。全ての構成要素は、接着性裏地により固定されており、三次元芯は、混濁ＡＴＰＳ溶液の中に垂直方向に浸けられる。
ｐＬＤＨ検出試験では、ブリリアントブルーＦＣＦ色素はもはや使用せず、機能化抗ｐＬＤＨ ＧＮＰを、ＢＳＡ−ＧＮの代わりに使用した。抗ｐＬＤＨ ＧＮＰは、ＢＳＡ−ＧＮと極めて類似した分配動作を示すが、ｐＬＤＨを捕捉することができ、ＬＦＡの発色指標として作用することができる。
最初に、ＡＴＰＳ及び三次元ペーパー芯が組み込まれないＬＦＡのみの対照の検出限界を、２０μＬの試料総体積を使用して特定した。ＬＦＡのみの対照がｐＬＤＨを１０ｎｇ μＬ−１で成功裏に検出することができたが、ｐＬＤＨを１ｎｇ μＬ−１で成功裏に検出することができなかったので、検出限界は、１０ｎｇ μＬ−１であると決定した。低濃度のｐＬＤＨを検出することによって、検出限界に改善を示すため、ＬＦＡのみの対照に使用したＧＮＰと同じ数のＧＮＰを、低濃度のｐＬＤＨを含有する溶液の総体積を増加することによって、同じ数のｐＬＤＨ分子に曝露した。体積の増加は、典型的にはＧＮＰを希釈し、所定の時間で検出区域に入るＧＮＰの量の低減をもたらすが、ＡＴＰＳ及び三次元芯の添加は、ＧＮＰを先頭部に小さい体積で集中させると予測される。効果的に、ＧＮＰは、低濃度で同じ量のｐＬＤＨに曝露されるが、ＬＦＡのみの対照により処理されたものに類似した体積に濃縮される。ＧＮＰを１０倍濃縮することが予測された１：９ＡＴＰＳを使用すると、試料総体積は、１０倍（２００μＬ）に増加して、ＬＦＡのみの対照と比較して、同じの量のＧＮＰが検出区域に入ることを確実にした。
図５４Ｂは、溶液中にｐＬＤＨを含有しない陰性対照試験における、改変ＬＦＡデバイスの使用を実証している。改変ＬＦＡストリップを、ＰＢＳ中の抗ｐＬＤＨ ＧＮＰを含有するＡＴＰＳ溶液に浸けたとき、ＧＮＰは、６０秒での暗赤色による印により明らかなように、三次元芯区分における溶液の先頭部に急速に集中した。溶液は、追加のランニングバッファーを用いることなく、ニトロセルロース膜を容易に横断して流れた。ＧＮＰは、検出領域に急速に到達し、その間、多くの溶液は、ペーパー芯に保持された。可視バンドが対照及び試験線領域の両方に２０分以内に現れ、有効な陰性試験を示した。
有効な陰性試験が検証されると、ｐＬＤＨ濃度を変えて、１：９体積比溶液中の一体化デバイスの検出限界を決定した。これらの実験の結果は、従来のＬＦＡがｐＬＤＨを１０ｎｇ μＬ−１の濃度で検出したが（真の陽性結果を生じる）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ ＡＴＰＳ及びＬＦＡを一体化した診断ストリップは、ｐＬＤＨを１．０ｎｇ μＬ−１で検出することができ、これは、検出限界の１０倍の改善であることを実証した（図５５）。
ＦＢＳにおけるｐＬＤＨのＬＦＡに基づいた検出の改善
これらの実験を、９：１体積比を生じるように変更された操作条件を使用して、ＦＢＳ試料において繰り返した。ここでも、三次元のペーパーに基づいた診断デバイスは、ＦＢＳ中のｐＬＤＨの１．０ｎｇ／μＬでの検出の成功によって、検出限界の１０倍の改善を実証し、一方、ＬＦＡのみの対照は、ＦＢＳ中のｐＬＤＨの１０ｎｇ／μＬでの検出に成功したが、１．０ｎｇ／μＬでは成功しなかった（図５６）。ＦＢＳ試料中に、ペーパーに基づいた一体化デバイスを利用する実験は、ニトロセルロースに基づいた検出領域の中をゆっくりと流れる流体を実証した。これは、試料の全体的な粘度を増加させた、大きな初期濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４及び他の血清構成成分の存在に起因する可能性があった。対照及び試験線シグナルは、２０分以内に完全に展開されたが（図５６）、ミセル不足相全体は、更に１０分の追加の時間が与えられた後にのみ検出領域を通過して流れ、バックグラウンド暗雑音の低減をもたらした（図８１）。ＰＢＳにおける上記の試験の場合のように、ＦＢＳによる全ての試験は、緩衝液による任意の前希釈、抽出ステップまたは流動を助けるためのランニングバッファーの添加を必要としない。
血清中のマラリアｐＬＤＨのＬＦＡ検出の改善を実証することによって、デバイスを、潜在的に、マラリア迅速診断検査（ＲＤＴ）の現状を改善することに使用できる。マラリアＲＤＴの製造及び使用は増加しているが、これらは大部分の場合において、結果を検証するために、血液塗抹標本顕微鏡検査などの追加の方法と一緒に使用することが必要である。限られた感度及び使いやすさにおけるばらつきは、ＬＦＡが、隔離されたマラリア感染環境において信頼のおける独立型アッセイとして使用されることを防止する２つの要因である。ペーパーに基づく一体化デバイスは、これらの２つの懸念に対処する潜在性を有する。デバイスの一体化された濃縮構成成分は、感度における有意な改善を可能にする。加えて、これらのＲＤＴの多くが試料緩衝液による希釈または流体の流動を助けるためにランニングバッファーの使用を必要とするので、この診断デバイスは、これらのステップを排除することによってユーザーに優しい改善を実証している。
実施例７．ＬＦＡペーパーの比較
粘度は、どちらの相が先頭部に現れるかを決定するのに、役割を果たし得る。
ＡＴＰＳ構成要素と紙材料との相互作用（疎水的、体積排除的、静電的）は、どちらの相が先頭部に現れるかを決定するのに、役割を果たし得る（ガラス繊維では、ＰＰＧ豊富相がＰＰＧ／塩ＡＴＰＳを先導し、一方、ＰＥＧ豊富相が、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳから遅れる。ＰＰＧはＰＥＧより疎水性である）。
ペーパーにおける異なるＡＴＰＳを調査して、ペーパーがどのように相分離過程を増強させるかについて検討した。最初に、相分離がペーパーにおいて観察されるかを決定した。そうであれば、どの相が先頭部に現れたかを記載した。先頭部は、ＬＦＡの試験線に到達する相に対応するので、この相が、濃縮された目的分子及びナノプローブを含有することが望ましい。
Figure 2021073465
ペーパーにおける相分離は、異なるＡＴＰＳによって変わった（例えば、ＰＥＧ/塩対ＰＰＧ／塩）。
異なる紙材料は、相分離動作を変化させた（例えば、ガラス繊維対セルロースにおけるＰＥＧ塩）。
幾つかの場合において、粘性の多い相は遅れた（例えば、ガラス繊維材料では、粘性の多いＰＥＧ豊富相がＰＥＧ／塩系に遅れ、一方、粘性の多いデキストラン豊富相が、ＰＥＧ／デキストラン系に遅れた）。しかし、このことが常に当てはまるとは限らなかった。
この例では、ＡＴＰＳにおけるポリマーの濃度を変えることが、どの相が先導するかの順序を変えるとは思われなかった。
この例では、重力がペーパーに流れる相の順序を変えるとは思われなかった（例えば、塩豊富相は、管において相分離すると、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳにおいて下部相にあるが、塩豊富相は、紙が垂直または水平に配向されているかに無関係に、ガラス繊維の先頭部になる）。
ペーパーがＡＴＰＳの相分離をどのように加速及び増強するかを調査するため、同じ型のＡＴＰＳ（ＰＥＧ／塩）を異なる種類のペーパーに適用した。異なる結果が観察された。
観察
十分に混合されたＡＴＰＳを様々な種類のペーパーに適用すると、類似した結果を生じなかったことが観察された。むしろ、相分離の速度が大きく変わり、相分離の程度も大きく変わった。更に驚くべきことに、特定の種類のペーパーが、先頭流体に出現する相の順番を変えることができた。結果について図５８及び表７を参照すること。
Figure 2021073465
実施例８．ＬＦＡペーパーを調製する幾つかの方法
溶媒中の既知の濃度の溶質を、１ｃｍ２（ほぼ１〜２ｍｍの高さを有するガラス繊維紙）あたり４０ｕＬ（溶媒）の値でマイクロピペットによりペーパーに加えた。液滴を、ペーパーに均一に分布された点に加えた。添加した後、ペーパーを穏やかに円筒形に巻いて（ピペットの先端を用いて）、流体がペーパーに均一に分布するのを助けた。
溶液をピペットにより、液滴を形成する非吸収性の表面（例えば、ポリプロピレン）に移した。ペーパー区分は、液滴と、紙の区分の点、縁または表面で接触した。この方法は、脱水の独特で特定的な設計をするのに有用である。そのような設計の例は、図５９Ａ〜Ｄを参照すること。
実施例９．ＰＥＧ豊富相を有する血液試料のＬＦＡペーパーへの適用
第１の実験は、ペーパーを目詰まりさせることなく血液試料を引き止め、ＡＴＰＳの２つの相が先に流れることを可能にできるペーパーを見つけるために実施した。以下の実験は成功裏に実施され、ＡＴＰＳ濃縮系と、赤血球の濾取に使用されるＭＦ１ペーパーとの一体化を可能にした。
１：１ＰＥＧ塩溶液を調製した。上部ＰＥＧ豊富相を除去した。ＰＥＧ豊富相を、全血試料と共に濾紙ストリップに適用した。
ＰＥＧ豊富相は、依然として濾紙の中を進むことができた。血液は濾紙を目詰まりさせなかった。ＭＦ１はＡＴＰＳと独特に適合性があった。図７１を参照すること。
赤血球を濾過できなかった、またはＡＴＰＳ相が通過できなかった他の種類のペーパーを調査した。ＬＦ１及びＳ１７では、血液は濾過されなかった。ＭＦ１では、血液は濾過されたが、流動はゆっくりであった。図７２を参照すること。
第２の実験を、ペーパーにおける血漿の相分離及び濃縮を可能にし、同時に赤血球を引き止めるペーパーの配置及び種類を得るために実施した。下記は、赤血球を濾過し、同時にＡＴＰＳ相を通過させる、三次元ペーパーウエル設計の能力についての２つの実証である。
第１には、ＰＥＧ塩ＡＴＰＳを有する血液試料を、三次元ペーパーウエルを有するペーパーに適用した。９：１ＰＥＧ塩ＡＴＰＳを調製し、小さい体積の全血試料をＰＥＧ塩溶液に導入した。流動ストリップを、起点の紙構成成分の量を変えながら、三次元ペーパーウエルを調製した。青色色素を使用して、ＰＥＧ豊富相を可視化し、液体がストリップの中を上に向かって吸収排出されたかを検査した。ここで全血試料を含有しているＰＥＧ塩溶液を、三次元ウエルに適用した。分離及び濃縮を観察した。
青色の液体が、先に流れたことが観察された。血液は、三次元ウエルに残ったままであった。図７３を参照すること。
第２には、ＰＥＧ塩ＡＴＰＳを有する血液試料を、三次元ペーパーウエルを有する濾紙に適用した。９：１ＰＥＧ塩ＡＴＰＳを調製し、小さい体積の全血試料をＰＥＧ塩溶液に導入した。青色色素を使用して、ＰＥＧ豊富相を可視化した。金ナノ粒子を使用して、塩豊富相を可視化した。ここで全血試料を含有しているＰＥＧ塩溶液を、三次元ウエルに適用し、分離及び濃縮を観察した。
金ナノ粒子の代わりにＰＢＳを加えた条件も、実施した。
青色液体の先頭が、ウエルの中を吸収排出されたことが観察された。対照ストリップと比較して、はっきりと識別された青色相がＡＴＰＳストリップに存在し、赤血球保持に加えて、相分離を示唆した。図７４を参照すること。
試料がＡＴＰＳ構成要素と接触し、先行流体に標的を集中させることを可能にする前に、赤血球の濾過を可能にする配置が、望ましい。この代替的な配置は、赤血球が相分離動作に影響を与えるシナリオにおいて有用である。このような目的にとって成功した１つの実験設定は、三次元ペーパーウエル内に、濾過及び濃縮する種類のペーパーを重ねることであった。血液が引き止められ、一方、ＰＥＧ層を最初に送り出したことが観察された。図７５を参照すること。
実施例１０．Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（クラミジア・トラコマチス）のＡＴＰＳ−ＬＦＡ検出
ＡＴＰＳ及びＬＦＡを、得られたスワブ試料の貯蔵に使用されるウイルス輸送培地の溶液中にＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（クラミジア・トラコマチス）抗原を検出するために使用された、ペーパーに基づいた単一診断デバイスと一体化した。
抗Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコマチス）ＤＧＮＰの調製
１ｍＬのデキストラン被覆金ナノ粒子（ＤＧＮＰ）溶液のｐＨを、最初に、１．５Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ９に調整した。続いて、１６μｇのマウスモノクローナルＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（クラミジア・トラコマチス）抗体を、コロイド金溶液に加え、振とう器により３０分間混合した。コロイド金ナノ粒子の表面への他のタンパク質の非特異的結合を防止するため、２００μＬの１０％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を混合物に加え、振とう器により２０分間混合した。遊離した非結合抗体を除去するため、次に混合物を４℃及び９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、続いてＤＧＮＰのペレットを、２００μＬの１％ｗ／ｖＢＳＡ溶液に再懸濁した。遠心分離及び再懸濁ステップを更に２回繰り返し、３回目の遠心分離の後、ＤＧＮＰのペレットを、１００μＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。
ＬＦＡを使用した検出
サンドイッチアッセイフォーマットを利用するＬＦＡ試験ストリップを、本発明者たちの以前の試験と同様に組み立てた。このフォーマットにおいて、固定化されたＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（クラミジア・トラコマチス）抗体は、試験線を構成し、一次Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗体に特異的な固定化された二次抗体は、対照線を構成した。
ＬＦＡによるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコマチス）の検出限界を検証するため、ＤＧＮＰを試料溶液に加え、試料中に存在するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓと結合させた。ウイルス輸送培地（ＢＤ、Ｆｒａｎｌｋｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中のＤＧＮＰ及び既知の濃度のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコマチス）から構成される試料溶液を、試験管の中で混合した。ＬＦＡ試験ストリップを試料溶液の中に垂直方向に挿入し、試料溶液を、ストリップの中を毛細管作用によって吸収パッドに向かって上方に吸収排出させた。ＰＢＳ及びＦＢＳ試料の両方の試験ストリップの画像を、制御照明環境下で、１０分後に撮影した。
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコマチス）抗原が、ウイルス輸送培地の溶液中に検出された。図７６を参照すること。使用した複合体は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコマチス）抗原のリポ多糖（ＬＰＳ）に対する特異的抗体を有するデキストラン被覆金ナノプローブ（ＤＧＮＰ）であった。従来のＬＦＡサンドイッチフォーマットを使用して、設定の検出限界を、およそ１０μｇ／ｍＬであると決定した。次のステップは、適切なＡＴＰＳを使用してバイオマーカーを濃縮し、濃縮試料をＬＦＡに適用し、一体化システムの検出限界を確立することである。
ＰＢＳ中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（トラコマチス）抗原の検出限界も、同じＬＦＡ設定を使用して１０μｇ／ｍＬであると決定した。
Ａｂｃａｍの抗ＭＯＭＰ抗体と複合体形成したＤＧＮＰによる抗原の検出についても、試験した。これらは、ＰＢＳまたはＶＴＭ溶液のいずれにおいても抗原を成功裏に検出したとは思われず、したがって無視した。
実施例１１．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ストレプトコッカス・ミュータンス）のＡＴＰＳ−ＬＦＡ検出
ＡＴＰＳ及びＬＦＡを、う歯（窩洞）もたらし得る優勢な細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（ストレプトコッカス・ミュータンス）の検出に使用された、ペーパーに基づいた単一診断デバイスに組み込んだ。
抗Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）ＤＧＮＰの調製
１ｍＬのデキストラン被覆金ナノ粒子（ＤＧＮＰ）溶液のｐＨを、最初に、１．５ＮのＮａＯＨを使用してｐＨ９に調整した。続いて、１６μｇのマウスモノクローナルＳ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）抗体を、金溶液に加え、振とう器により３０分間混合した。コロイド金ナノ粒子の表面への他のタンパク質の非特異的結合を防止するため、２００μＬの１０％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を混合物に加え、振とう器により２０分間混合した。遊離した非結合抗体を除去するため、次に混合物を４℃及び９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、続いてＤＧＮＰのペレットを、２００μＬの１％ｗ／ｖＢＳＡ溶液に再懸濁した。遠心分離及び再懸濁ステップを更に２回繰り返し、３回目の遠心分離の後、ＤＧＮＰのペレットを、１００μＬの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。
ＬＦＡを使用した検出
サンドイッチアッセイフォーマットを利用するＬＦＡ試験ストリップを、本発明者たちの以前の試験と同様に組み立てた。このフォーマットにおいて、固定化されたＳ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）抗体は、試験線を構成し、一次抗体に特異的な固定化された二次抗体は、対照線を構成した。
ＬＦＡによるＳ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）の検出限界を検証するため、ＤＧＮＰを試料溶液に加え、試料中に存在するＳ．ｍｕｔａｎｓと結合させた。ＤＧＮＰ及び既知の濃度のＳ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）から構成される試料溶液を、試験管の中で混合した。ＬＦＡ試験ストリップを試料溶液の中に垂直方向に挿入し、試料溶液を、ストリップの中を毛細管作用によって吸収パッドに向かって上方に吸収排出させた。試験ストリップの画像を、制御照明環境下で、１０分後に撮影した。
ＡＴＰＳを伴うＬＦＡを使用した検出
１：９のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ミセルＡＴＰＳ試料溶液を調製し、これは既知の濃度のＳ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）から構成された。ＡＴＰＳ試料溶液を２５Ｃで８時間インキュベートして、相分離を生じさせた。濃縮Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）を含有する上部ミセル不足相を抽出し、抗Ｓ．ｍｕｔａｎｓＤＧＮＰと共にインキュベートした。ＬＦＡ試験ストリップを、得られた混合物の中に垂直方向に挿入し、試験ストリップの画像を、制御照明環境下において、１０分後に撮影した。
９：１のＰＥＧ／リン酸カリウムＡＴＰＳ試料溶液を調製し、これは既知の濃度のＳ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）から構成された。ＡＴＰＳ試料溶液を２５Ｃで３０分間インキュベートして、相分離を生じさせた。濃縮Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）を含有する下部ＰＥＧ不足相を抽出し、抗Ｓ．ｍｕｔａｎｓＤＧＮＰと共にインキュベートした。ＬＦＡ試験ストリップを、得られた混合物の中に垂直方向に挿入し、試験ストリップの画像を、制御照明環境下において、１０分後に撮影した。
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（ミュータンス）は、ＬＦＡを使用して成功裏に検出された（図７７及び７８を参照すること）。従来のＬＦＡサンドイッチフォーマットを使用して、設定の検出限界を、およそ１×１０７個の細胞／ｍＬであると決定した。１×１０７から１×１０６個の細胞／ｍＬへの検出限界の１０倍改善も、実証された。
次のステップは、ＡＴＰＳ及びペーパーを伴うＬＦＡを、三次元ウエルまたは三次元芯フォーマットのいずれかに組み込んで、同時の、または途切れのない濃縮及び検出を達成することである。
実施例１２．トロポニンのＡＴＰＳ−ＬＦＡ検出
ＡＴＰＳ及びＬＦＡを、心筋梗塞のバイオマーカーであるトロポニンの検出に使用される、ペーパーに基づく単一診断デバイスに組み込んだ。
抗トロポニンＤＧＮＰの調製
抗トロポニン抗体以外は、上記の実施例１１と同じ手順を使用する。
ＬＦＡを使用した検出
競合アッセイフォーマットを利用するＬＦＡ試験ストリップを、本発明者たちの以前の試験と同様に組み立てた。このフォーマットにおいて、固定化されたトロポニン抗体は、試験線を構成し、ＤＧＮＰ上の一次抗体に特異的な固定化された二次抗体は、対照線を構成した。
ＬＦＡによるトロポニンの検出限界を検証するため、ＤＧＮＰを試料溶液に加え、試料中に存在するトロポニンに結合させた。ＤＧＮＰ及び既知の濃度のトロポニンを含有する試料溶液を、試験管の中で混合した。ＬＦＡ試験ストリップを試料溶液の中に垂直方向に挿入し、試料溶液を、ストリップの中を毛細管作用によって吸収パッドに向かって上方に吸収排出させた。ＰＢＳ試料の試験ストリップの画像を、制御照明環境下で、１０分後に撮影した。
ＡＴＰＳを伴うＬＦＡを使用した検出
９：１のＰＥＧ／リン酸カリウムＡＴＰＳ試料溶液を調製し、これは既知の濃度のトロポニンから構成された。ＡＴＰＳ試料溶液を２５℃で３０分間インキュベートして、相分離を生じさせた。濃縮トロポニンを含有する下部ＰＥＧ不足相を抽出し、抗トロポニンＤＧＮＰと共にインキュベートした。ＬＦＡ試験ストリップを、得られた混合物の中に垂直方向に挿入し、試験ストリップの画像を、制御照明環境下において、１０分後に撮影した。
トロポニンは、ＬＦＡを使用して成功裏に検出された（図７９を参照すること）。 従来のＬＦＡ競合フォーマットを使用して、設定の検出限界を、およそ１ｎｇ／μＬであると決定した。１から０．１ｎｇ／μＬへの検出限界の１０倍の改善が、成功裏に実証された。
実施例１３．脱水方法
液体の適用
この方法は、溶質として脱水される所望の構成成分を含有する液状溶液を、脱水の前にペーパーに適用することを含んだ。
溶媒中の既知の濃度の溶質を、１ｃｍ２（ほぼ１〜２ｍｍの高さを有するガラス繊維紙）あたり４０ｕＬ（溶媒）の値でマイクロピペットによりペーパーに加えた。液滴を、ペーパーに均一に分布された点に加えた。添加した後、ペーパーを穏やかに円筒形に巻いて（本発明者たちはピペットの先端を用いた）、流体がペーパーに均一に分布するのを助けた。溶液をピペットにより、液滴を形成する非吸収性の表面（例えば、ポリプロピレン）に移した。ペーパー区分は、液滴と、ペーパー区分の点、縁または表面で接触した。この方法は、脱水の独特で特定的な設計をするときに好ましいものである。そのような設計の例は、図５９Ａ〜Ｄにおいて見られる。
失敗した方法：ペーパー区分の全体を溶媒の中に沈めると、ペーパーを過剰飽和し、恐らく不均一な脱水に起因して、実験の堅牢度の低減をもたらした。更に、１ｃｍ２（ほぼ１〜２ｍｍの高さを有するガラス繊維紙）あたり６０μＬ超（溶媒）を加えても、ペーパー区分を過剰飽和した。
凍結乾燥
この方法は、構成成分が再可溶化されることが所望の結果であった場合に好ましかった。凍結乾燥器は脱水の前に先に除霜されることが重要であることが、見出された。それをしないと、ペーパー内の構成成分の不均一な脱水の危険性が増加した（例えば、デキストラン被覆金ナノプローブ（ＤＧＮＰ）は、ペーパー縁部の近くにより多く分布される）。
瞬間冷凍及び凍結乾燥
ペーパー区分は、ペーパーを液体窒素に沈めること、または液体窒素をペーパーに注ぐことによって、液体窒素を使用して瞬間冷凍した。次に冷凍されたペーパー区分を急速に凍結乾燥器の中に入れ、そこで冷凍液を昇華させた。この方法を試す論理的根拠は、脱水過程における溶質の移行を低減して、脱水過程に（液体状態の溶液の蒸発の際の溶質の移行に対して）より多くの制御を確実にすることであった。しかし、この過程は、予想外の流動パターン及び相分離挙動をもたらした。下記は、予想外のデータの経時的画像データである（図６０を参照すること）。
真空容器
ペーパー区分を凍結乾燥器ではなく真空容器の中に入れた以外は、上記に記載された「凍結乾燥」と類似している。真空容器における圧力の低下は、あまり一定しない実験結果を示し、脱水の最の不均一な溶質分布に起因する可能性が高い。
焼成
ペーパー区分をオーブンチャンバーに、摂氏２５度を超える温度（典型的には摂氏６０度）で入れた。この方法は、望ましい目標が溶質を加水し、同時に溶質の移動性を妨げることである場合に好ましいことがある。この観察される効果の１つの可能な説明は、焼成方法の際の高温が、溶質と紙との共有結合または強力な相互作用をもたらし得ることである。
不均一な脱水に結果として不均一な相分離もたらした、脱水方法の失敗した試みについては、図６１を参照すること。

Claims (1)

  1. ａ．ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）と、
    ｂ．第１の相溶液及び第２の相溶液に分離する混合相溶液を含む水性二相系（ＡＴＰＳ）と
    を備える、試料中の目的とする被分析物の検出及び／または定量のためのデバイス。
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