CN108802381B - 牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸条及其制备方法，以快速灵敏检测BVDV抗体。该试纸条由支撑底板、包被吸附材料层、蛋白标记承载材料层、样品缓冲材料层、液体吸收材料层、外层保护材料组成；所述包被吸附材料设有测试线和质控线；所述试纸条的蛋白标记采用胶体金标记；所述蛋白标记所用的蛋白为从噬菌体多肽文库中筛选所得的与BVDV抗体结合的噬菌体单克隆；所述噬菌体单克隆表达的多肽表位为LTPHKHHKHLHA。其制备方法包括金标噬菌体单克隆的制备、金标垫的制备、硝酸纤维素膜的制备、组装各部件，即得。本发明可以在十分钟之内获得检测结果，快速敏感，成本低，操作简单易于基层在生产和科研中推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及家畜病毒诊断技术领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸条及其制备方法。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、猪瘟病毒(Classicalswine fever virus，CSFV)及人丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV)等都属于黄病毒科瘟病毒属。
BVDV感染引起免疫抑制从而激发呼吸道感染，病毒感染引起孕期母畜流产等对养牛业造成巨大经济损失，是养牛业所面临的最重要的疾病之一。BVDV能够通过胎盘传播，而导致胎儿持续性感染（Persistently infection，PI），PI 牛终生带毒而成为重要传染源。BVDV病毒除了感染牛以外，还可以感染猪、羊等40多种动物，并引起发病，急性感染后可以转为持续性感染（Persistent infection， PI）。除了牛之外多种PI患畜都终生带毒、排毒，促进了本病毒的传播。目前已确定有8种动物可以发生BVDV持续性感染（PI）。
目前，多种方法可以用来检测BVDV病毒，如病毒分离，免疫组化技术，ELISA抗原检测试剂盒，免疫荧光技术及PCR等技术。但是上述检测方法实验操作复杂周期长，另外由于该技术都依赖于一定的仪器而限制了野外临诊应用。当前我国尚未使用BVDV疫苗，当前有商品化的BVDV抗体检测试剂盒适合用于检测BVDV抗体，通过检测血清抗体而筛查BVDV PI牛，而然该试剂盒主要依赖于进口产品，价格昂贵极大的限制了应用。
随着我国畜牧业的迅猛发展，亟需开发价格低廉而适合于在底层广泛推广使用的检测方法和试剂盒，以进行PI患畜筛查。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸条及其制备方法，以快速灵敏检测BVDV抗体，便于在基层进行推广使用。
为解决上述技术问题，本发明的技术思路为：
提供一种从噬菌体多肽文库中筛选获得与BVDV抗体结合的噬菌体单克隆, 利用该噬菌体制备抗原，研制适用对BVDV抗体进行快速检测的试纸条，以适用于在生产和科研中推广和应用。
具体采用如下技术方案：
设计一种牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，由支撑底板、包被吸附材料层、蛋白标记承载材料层、样品缓冲材料层、液体吸收材料层、外层保护材料组成；
所述包被吸附材料设有测试线和质控线；所述测试线上有抗猪IgG单抗、兔抗猪IgG二抗、金黄色葡萄球菌A蛋白中的至少一种；所述质控线上有抗牛病毒性腹泻高免血清IgG；
所述试纸条的蛋白标记采用胶体金标记；所述蛋白标记所用的蛋白为从噬菌体多肽文库中筛选所得的与BVDV抗体结合的噬菌体单克隆；所述噬菌体单克隆表达的多肽表位为LTPHKHHKHLHA。
优选的， 所述支撑底板的材料为不吸水的硬质纸条或PVC。
优选的， 所述包被吸附材料层的材质为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素膜、FUSION 5、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚酯膜中的任意一种。
优选的，所述蛋白标记承载材料层或所述样品缓冲材料层的材质为玻璃纤维膜、FUSION 5、聚酯膜中的任意一种。
优选的， 所述液体吸收材料层的材质为吸水纸、FUSION 5、吸水纤维中的任意一种。
优选的， 所述外层保护材料层的材质为塑料胶膜或成型塑料外壳。
优选的， 所述测试线和质控线组合排列形式为“=”、 “┷”、“+” 中的一种。
其中，所述噬菌体单克隆的筛选方法为：
（1）将BVDV 抗血清包被；
（2）将噬菌体文库稀释；
（3）将所述稀释的噬菌体与所述包被的BVDV抗体结合；
（4）将所述与抗体结合的噬菌体洗脱后进行扩增获得噬菌体多克隆，挑选阳性克隆；
（5）将BVDV 抗血清包被，将所述噬菌体多克隆阳性克隆进行第二轮结合、洗脱、和扩增；
（6）将所述步骤（1）～（5）重复3次；
（7）将上述经第三次洗脱和扩增的噬菌体多克隆进行感染，形成单克隆；
（8）挑选上述单克隆进行扩增并提取基因组DNA 后测序；
（9）根据序列筛选目的单克隆。
设计一种所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
（1）金标噬菌体单克隆的制备：将待标记的噬菌体单克隆除去杂质，生理盐水调整浓度至0.2mg/ml；采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；胶体金调整pH 9.0；加入0.5ml～20ml的所述噬菌体单克隆，混匀温育；加入BSA，混匀孵育离心弃上清；沉淀用BSA 重悬，离心弃上清；沉淀用重悬缓冲液混匀备用；
（2）金标垫的制备：将所述金标噬菌体单克隆稀释；将蛋白标记的重悬液按照3～15ul/cm的用量喷射在所述蛋白标记承载材料层上，扩散宽度为2～8mm，加入干燥剂密封保存；
（3）硝酸纤维素膜的制备：将所述测试线上的蛋白和所述质控线上的蛋白分别稀释至0.5mg/ml～10mg/ml，按照0.5～1.5ul/cm的用量分别喷射在所述包被吸附材料层上的所述测试线和所述质控线处；
（4）组装各部件，切成条状的试纸条，即得。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明成本低，操作过程不依赖于大型仪器，操作简单易于基层在生产和科研中推广和应用。
2.本发明检测结果的判断原理简单，不具备较深的专业背景的畜牧生产工作者也可以进行操作，扩大了其使用范围。
3.本发明可以在十分钟之内获得检测结果，快速敏感。
附图说明
图1为试纸条结构示意图；
其中，1为样品垫，2为胶金垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为支撑底板；
图2为牛病毒性腹泻病毒鉴别检测试纸条与BVDV阳性血清和阴性血清的反应性图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：与BVDV抗体结合的噬菌体单克隆的筛选
具体步骤如下：
（1）将10 μg BVDV 抗血清溶于3 mL 0.1 M NaHCO3(pH 8.6)，加入60 mm 细胞培养皿中，4℃过夜孵育；
（2）将所述包被液弃去，用封闭液[0.1 M NaHCO3 (pH 8.6)，5 mg/ml BSA，0.02%NaN3]，室温下作用1h；
（3）将购于New England BioLabs的商品化噬菌体文库，用TBST稀释（1:100），加入所述经封闭后60mm 细胞培养皿中，室温作用60 min；
（4）将所述噬菌体上清弃掉，用TBST洗10次，每次间隔5 min，加入1 mL洗脱buffer[0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)，1 mg/ml BSA]，所述结合的噬菌体充分洗净；
（5）将所述噬菌体采用20 mL 大肠杆菌 ER2738 扩增；
（6）将所述扩增的噬菌体，12000 g、4℃离心 10 min，弃去沉淀；
（7）将所述上清加入1/6体积的20% PEG8000/2.5 M NaCl，4过夜沉淀；
（8）将所述PEG沉淀后的上清，12000 g、4℃离心 20 min，弃去上清，将沉淀溶解于1mL TBS 中；
（9）将所述1mL 悬液，14000 rpm、4℃离心 5 min，弃去沉淀；
（10）将所述上清采用1/6体积的20% PEG8000/2.5 M NaCl，4℃过夜沉淀；
（11）将所述上清，14000 rpm、4℃离心 10 min，弃去上清；
（12）将所述沉淀加入200 μL TBS；
（13）再重复上述步骤（1）至（12）二次，获得与BVDV抗体结合的噬菌体文库；
（14）将所述获得的BVDV结合的噬菌体文库利用固体琼脂板进行过夜培养，以测定病毒滴度，并挑选单克隆进行扩增；
（15）将大肠杆菌ER2738 按照1：100比例用LB培养基稀释， 取1mL 置于10mL 细菌培养管中；
（16）挑取所述噬菌体单克隆，加入所述细菌培养管中，37℃培养4.5～5 h；
（17）取上述培养液，14000 rpm、4℃离心 30秒，将上清转入新的离心管中， 4℃保存或者加入等量甘油后置于-20℃保存；
（18）取上述噬菌体液体500 μL, 加入新的离心管中，加入200 μL 20% PEG/2.5 MNaCl， 室温作用10min；
（19）将所述作用后的液体，14000 rpm、4℃离心10 min，弃掉上清，沉淀即为所要的噬菌体；
（20）将所述沉淀加入100 μL 裂解液[10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，4 MNaI]，250 μL乙醇，室温作用10min；
（20）将所述反应液14000 rpm、4℃离心10 min，弃掉上清，0.5 mL 70% 乙醇洗剂沉淀，弃掉上清，待沉淀快干燥；
（22）将所述沉淀溶解于30 μL TE 缓冲液中，即为所得噬菌体基因组；
（23）将所述噬菌体基因组委托基因测序公司进行DNA测序。
所得噬菌体克隆表达的多肽表位是LTPHKHHKHLHA，能够与BVDV抗体结合，具有dot-blot反应活性。
实施例2： BVDV抗体结合的噬菌体单克隆的大量制备
具体步骤如下：
（1）将大肠杆菌ER2738 按照1:100比例用LB稀释， 取50 mL置于250mL 锥形瓶中；
（2）取实施例1所得噬菌体按1：1000比例接入加入上述大肠杆菌菌液中；
（3）将所述菌液置于37℃摇床中，培养4.5 h；
（4）将所述菌液12000 g，4℃ 离心 10 min，弃去沉淀；
（5）将所述上清加入1/6体积的20% PEG8000/2.5 M NaCl，过夜沉淀， 12000 g、4℃离心 20 min，弃去上清，将沉淀溶解于1mL TBS 中；
（6）将所述1mL 悬液，14000 rpm、4℃离心 5 min，弃去沉淀；
（7）将所述上清采用1/6体积的20% PEG8000/2.5 M NaCl，过夜沉淀；
（8）将所述上清，14000 rpm、℃离心 10 min，弃去上清；
（9）将所述沉淀加入1 mL TBS，即为与BVDV抗体结合的噬菌体单克隆。
实施例3： BVDV抗体检测试纸条的制备
（1）金标噬菌体单克隆的制备：
①
将待标记的噬菌体单克隆 10000 r/min离心20min，除去杂质，生理盐水调整浓度至0.2mg/ml；
②
胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备：即在100ml沸腾的含0.01%氯金酸水溶液中加入0.5～8ml的1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌煮沸3～20min，可获得直径10～60nm左右的胶体金溶液；
③
胶体金用0.1 mol/L K2CO3 溶液调节胶体金溶液的pH 9.0，室温保存备用；
④
向100 ml pH9.0的胶体金溶液中缓慢地加入0.5ml～20ml的噬菌体单克隆溶液，混匀后，室温温育40 min；
⑤
缓慢加入10% BSA 至其终浓度为1%（W/V），混匀后，室温孵育15min；12000 r/min、4℃，离心30分钟，弃上清；
⑥
沉淀用2% 的BSA 重悬，12000 r/ min、4℃ 离心30min，弃上清；
⑦
沉淀用重悬缓冲液（20mmol/L Na2B4O7，1% BSA，0.1% NaN3）调整至原体积的十分之一，充分混匀后，4℃保存备用。
（2）金标垫的制备：
①
用缓冲液（100mmol/L pH8.0 Tris-HCl，5% BSA，0.1% Triton X-100，5% 蔗糖溶液）将金标噬菌体单克隆的重悬液作2倍稀释；
②
用Bio-Dot X-only单向喷点仪将蛋白标记的重悬液按照3～15ul/cm的用量喷射在预先裁好的规格为8mm×300mm的蛋白标记承载材料上，调节合适的气流大小及气动喷头喷嘴开度，使喷到蛋白标记承载材料上后能扩散成2～8mm宽，然后45℃ 鼓风干燥1小时后，制成蛋白标记垫，加入干燥剂密封、干燥、避光4℃ 保存。
（3）硝酸纤维素膜（质控线、测试线）的制备
①
以抗猪单抗IgG、抗猪二抗IgG或金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），用生理盐水配制成0.5mg/ml~10mg/ml，然后用Bio-Dot X-only单向喷点仪将蛋白按照0.5～1.5ul/cm的用量喷射在包被吸附材料上作为测试线；
②
以抗牛病毒性腹泻高免血清IgG，用生理盐水配制成0.5mg/ml~10mg/ml，然后用Bio-Dot X-only单向喷点仪将蛋白按照0.5～1.5ul/cm的用量喷射在包被吸附材料上作为质控线。
（4）将上述几种材料和吸水纸、支撑底板、样品垫等依照试纸结构图依次组装各部件，最后经BIO-DOT CM4000切条机切成需要的宽度即得BVDV鉴别检测试纸条。
综上，所得牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条的最下层为支撑底板，提供整个产品骨架，支撑底板是用不吸水的硬质纸条或PVC制成，上表面带有胶水涂层；向上具有包被吸附材料层、蛋白标记承载材料层、样品缓冲材料层、液体吸收材料层、外层保护材料等几部分。包被吸附材料的材质可以是硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素膜、FUSION 5、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜等；蛋白标记承载材料的材质可以是玻璃纤维膜、FUSION5或聚酯膜等；液体吸收材料的材质可以是吸水纸、FUSION 5或吸水纤维等；样品缓冲材料的材质可以是玻璃纤维膜、FUSION 5或聚酯膜等；外层保护材料的材质可以是塑料胶膜或成型塑料外壳。
其中在包被吸附材料上有高效拦截的测试线和质控线。测试线和质控线可组合排列为“=”、 “┷”或“+”等形式。
试纸条的结构如图1所示：
1为样品垫，2为胶金垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为支撑底板。
实施例4：用BVDV鉴别检测试纸条检测血清样本
BVDV阳性血清和阴性血清分别来自于中国兽药监察所标记和VMDR公司。具体鉴别步骤如下：
（1）取所述血清1：10稀释，加入96孔板中；
（2）将所述BVDV抗体检测试纸条浸入所述血清中，即可取出置放于室温；
（3）将所述试纸体，室温下观察10 min，判定结果；
（4）所述结果的判定依据是：如果检测线和质控线同时显色可以判定为BVDV抗体阳性，如果只有质控线显色，而检测线不显色可以判定为BVDV抗体阴性，如果检测线和质控线同时不显色，可以判定为试纸条无效。
如图2所示：对于阳性待检血清，检测线和质控线同时显色可以判定为BVDV抗体阳性，与预期结果一致；而对于阴性待检血清，只有质控线显色可以判定为BVDV抗体阴性。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
Claims (8)
1.一种牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，由支撑底板、包被吸附材料层、蛋白标记承载材料层、样品缓冲材料层、液体吸收材料层、外层保护材料组成；其特征在于，
所述包被吸附材料设有测试线和质控线；所述测试线上有抗猪IgG单抗、兔抗猪IgG二抗、金黄色葡萄球菌A蛋白中的至少一种；所述质控线上有抗牛病毒性腹泻高免血清IgG；
所述试纸条的蛋白标记采用胶体金标记；所述蛋白标记所用的蛋白为从噬菌体多肽文库中筛选所得的与BVDV抗体结合的噬菌体单克隆；所述噬菌体单克隆表达的多肽表位为LTPHKHHKHLHA；
所述测试线和质控线组合排列形式为“┷”或“+”。
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，其特征在于， 所述支撑底板的材料为不吸水的硬质纸条或PVC。
3.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，其特征在于， 所述包被吸附材料层的材质为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素膜、FUSION 5、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚酯膜中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，其特征在于， 所述蛋白标记承载材料层或所述样品缓冲材料层的材质为玻璃纤维膜、FUSION 5、聚酯膜中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，其特征在于， 所述液体吸收材料层的材质为吸水纸、FUSION 5、吸水纤维中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，其特征在于， 所述外层保护材料层的材质为塑料胶膜或成型塑料外壳。
7.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条，其特征在于，所述噬菌体单克隆的筛选方法为：
（1）将BVDV 抗血清包被；
（2）将噬菌体文库稀释；
（3）将所述稀释的噬菌体与所述包被的BVDV抗体结合；
（4）将所述与抗体结合的噬菌体洗脱后进行扩增获得噬菌体多克隆，挑选阳性克隆；
（5）将BVDV 抗血清包被，将所述噬菌体多克隆阳性克隆进行第二轮结合、洗脱、和扩增；
（6）将所述步骤（1）～（5）重复3次；
（7）将上述经第三次洗脱和扩增的噬菌体多克隆进行感染扩增，形成单克隆；
（8）挑选上述单克隆进行扩增并提取基因组DNA 后测序；
（9）根据序列筛选目的单克隆。
8.一种权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）金标噬菌体单克隆的制备：将待标记的噬菌体单克隆除去杂质，生理盐水调整浓度至0.2mg/ml；采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；胶体金调整pH 9.0；加入0.5ml～20ml的所述噬菌体单克隆，混匀温育；加入BSA，混匀孵育离心弃上清；沉淀用BSA 重悬，离心弃上清；沉淀用重悬缓冲液混匀备用；
（2）金标垫的制备：将所述金标噬菌体单克隆稀释；将蛋白标记的重悬液按照3～15ul/cm的用量喷射在所述蛋白标记承载材料层上，扩散宽度为2～8mm，加入干燥剂密封保存；
（3）硝酸纤维素膜的制备：将所述测试线上的蛋白和所述质控线上的蛋白分别稀释至0.5mg/ml～10mg/ml，按照0.5～1.5ul/cm的用量分别喷射在所述包被吸附材料层上的所述测试线和所述质控线处；
（4）组装各部件，剪裁成条状的试纸条，即得。
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