CN103290047A

CN103290047A - 一种快速制备植物富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶多克隆抗体的方法和应用

Info

Publication number: CN103290047A
Application number: CN2013102540940A
Authority: CN
Inventors: 杨磊; 兰文智; 唐仁杰; 陆桂华
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明公开了一种利用蛋白体外原核表达纯化技术高效且快速地制备植物富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶多克隆抗体的方法及应用。该方法制备过程包括：将编码植物蛋白的基因插入到表达质粒pET-30a上，然后转化到大肠杆菌BL21中表达目的蛋白，经过亲合纯化得到纯化的高浓度的蛋白，并用纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，并用不完全福氏佐剂加强，得到植物抗体，取血得到相应的血清，并经过抗体纯化得到纯化的具有一定OD值得抗体溶液。以本发明的制备方法制备出来的多表位抗体可以在蛋白识别，纯化，免疫沉淀，定量定性分析，以及免疫荧光和免疫电镜等很多实验及生产中可以得到广泛应用。

Description

一种快速制备植物富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶多克隆抗体的方法和应用

技术领域

本发明涉及植物富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶原核表达载体的构建、表达、纯化技术以及多克隆抗体的制备方法。

背景技术

富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶（LRR-RLK）是植物基因组中已知的最大的一类跨膜类受体激酶亚家族，在拟南芥中已经鉴别出这类基因亚家族的216个成员，水稻中已鉴别出300多个成员。LRR-RLK的胞外富含亮氨酸结构域与胞外的信号分子如离子、化学小分子或多肽等的特异性结合后，激活胞内激酶结构域的互磷酸化和自磷酸化的活性，从而参与一系列的生物学过程。

此类基因的结构由胞外LRR结构域，单跨膜区以及胞内激酶结构域3部分组成。LRR-RLK在细胞内的广泛分布及结构特点决定了其功能的重要性。该家族基因参与植物的生长发育，它们分别在器官大小和形态控制，器官脱落，配子体发育，划分和柱头的识别以及体细胞胚胎发生的生物过程中起重要的作用。并且该家族的一些基因还参与植物激素的信号转导，包括油菜素甾醇(BR)，脱落酸(ABA)以及植物硫肽激素(PSK)等。此外，该家族成员还广泛参与植物的防御和对病原微生物的识别，其中具有抗病功能的FLS2以及植物免疫抗性相关基因Xa21等研究的较为清楚。因此，植物通过该家族的富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶感知胞外信号，然后通过胞内的激酶结构域传递信号到细胞内，从而指导植物对胞外的信号作出相应的反应。就像动物一样，植物通过受体开启错综复杂的信号通路，信号通路间可以相互作用或者形成反馈环使多个复杂的单元联合在一起指导目标基因的转录。

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系（克隆）。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位、可引起沉淀反应，制备时间短，成本低的原因广泛应用于研究和诊断方面。

传统用短肽制备的单个抗原表位的抗体存在长度短，体内容易降解及免疫原性较弱等问题。因此我们选择利用植物全长蛋白来免疫制备相应的多克隆抗体，可以获得多抗原表位，且稳定高效的植物抗体，在生产实验中广泛得到应用。

抗体制备过程中常用的技术方法要点如下：

动物的选择：可作为免疫的选择对象有家兔、山羊或绵羊、马和豚鼠等实验动物。动物种类的选择主要是根据抗原的特性和所要获得抗体的量和用途。如马匹常用于制备大量抗毒素血清；豚鼠适用于制备抗酶类抗体和补体结合试验用的抗体，但抗血清产量较少。对蛋白质抗原，大部分动物均适合，常用的是家兔和山羊；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性，每批免疫宜同时使用数只动物。

抗原种类（或类型）的选择：根据所制备抗血清的用途选用不同类型的抗原，如制备用于筛选细菌表达cDNA文库或免疫沉淀，最好选用降解的蛋白质抗原，而用于筛选真核细胞转染系统表达的cDNA文库或免疫沉淀，最好选用自然的蛋白质抗原。若制备抗独特型抗体，所用抗原可以是可溶性Ig分子，或者是完整的细胞，也可以是基因工程表达产品独特型决定簇、人工合成多肽及抗原化抗体等。

抗原剂量的选择：病原生物抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、免疫次数、注射途径以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等的不同而异。剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，但剂量过高，又有可能造成免疫耐受。在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。一般而言，小鼠首次抗原剂量为50～400ug/次；大鼠为100ug～1mg/次；兔为200ug～1mg/次，加强免疫剂最为首次剂量的1/5～2/5。

佐剂的应用：可溶性抗原加用佐剂增强抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，以刺激机体产生较强的免疫应答。如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔或山羊，在加用佐剂时一次注入量一般为0.5～1mg/kg。不加佐剂，则抗原剂量应加大10～20倍。佐剂有福氏（Freund’s）佐剂、脂质体佐剂及氢氧化铝佐剂等。其中最常用的是完全福氏佐剂（complete Freund’sadjuvant,CFA）和不完全福氏佐剂（incomplete Freund’s adjuvant，IFA）两种。IFA由羊毛脂1份、石腊油5份组成，每毫升IFA中加入1～20mg卡介苗即为CFA。

感染或免疫的途径：抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内等不同途径注入抗原进行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2～4周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA认作2～5次加强免疫，每次间隔2～3周，皮下或腹腔注射加强免疫。感染途径视感染病原体的种类和被感染动物而定。

多克隆抗体（抗血清）的提取：完成免疫程序后，先取少量血清测试抗体效价达到要求时，即可从动物心脏穿刺（豚鼠及家兔），颈静脉或颈动脉放血（家兔或羊），待血液凝固后，离心深沉分离出血清，加入0.1%叠氮钠作为防腐剂。

发明内容

本发明的目的在于针对目前商业化的抗体是通过体外合成蛋白的20个左右氨基酸多肽作为抗原得到的抗体，它只能识别蛋白的某段氨基酸序列，对蛋白的研究存在一定的局限；此外传统用短肽制备的单个抗原表位的抗体存在长度短，体内容易降解及免疫原性较弱等问题。为此我们提供一种以在生物体内表达除跨膜区氨基酸以外的植物蛋白作抗原制备多克隆抗体的方法。

本发明构建一种原核表达的重组质粒载体，该载体含有拟南芥富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶基因LRR-RLK(基因编号为At2g01210)的胞外区和胞内区序列，是在原核表达载体pET-30a的多克隆位点BamHI/XhoI和EcoRI/XhoI分别插入SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列而获得。

本发明的另外一个目的在于通过上述载体的体外原核系统表达，用分离纯化技术纯化该拟南芥蛋白LRR-RLK(At2g01210)。

本发明还提供了一种快速制备植物单跨膜受体蛋白的方法，是构建上述重组质粒载体，并转化到大肠杆菌BL21中表达目的蛋白，经过亲合纯化得到纯化的高浓度的蛋白。

本发明制备植物单跨膜受体蛋白的方法，具体包括以下步骤：

（1）以SEQ ID NO.1和2；SEQ ID NO.3和4所示序列为引物，拟南芥基因组为模板，克隆得到两段目标序列，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，将所述两个目标序列分别通过多克隆位点BamHI,XhoI和EcoRI,XhoI构建到原核表达载体pET-30a上；

Nter-pET30a-F5'GGGGGATCCTTAAACGACGAAGGCTTTGCG3'（SEQ ID NO.1）；

Nter-pET30a-R5'GGGCTCGAGTCAGCTTTTGCTCAAACCACTTGATTTC3'(SEQ IDNO.2)；

CT-pET30a-F5'GGGGAATTCAAGTTCTGCGCTTGTAACCGC3'(SEQ ID NO.3)；

CT-pET30a-R5'GGGCTCGAGTCAATCGCCGGCCACGGGT3'(SEQ ID NO.4)。

（2）培养BL21菌株，把步骤（1）得到的，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.7；

（3）在BL21中诱导表达目的蛋白：在培养的大肠杆菌BL21培养液中加入0.2mM IPTG诱导剂，25℃诱导4小时；

（4）裂解表达目的蛋白的BL21大肠杆菌：把诱导后的菌体离心收集后，用细胞裂解液重悬，在冰浴条件下，超声波破碎细胞30-40次，每次3-6秒；然后把破碎后的菌液在4℃条件下，13000rpm离心10分钟，分别收集上清和沉淀；

（5）诱导表达的蛋白与Ni柱进行亲合吸附及洗脱得到纯化的蛋白：将上清与Ni柱混合，4℃孵育过夜后，收集从Ni柱中的流出液，用洗涤液清洗Ni柱中的beads几次，然后用Imidazole洗脱目的蛋白;然后用去除Ni²⁺缓冲液将Ni²⁺从Ni柱上洗脱下来;如果蛋白表达裂解后在包涵体中，则通过特殊方法来纯化包涵体中的蛋白。

上述方法步骤（4）中，细胞裂解液为20mM PBS buffer,0.5M NaCl,0.1%Triton X-100,0.1%NP40,1mM EDTA,1mM PMSF,1mM TCEP,PH按照蛋白等电点设定。

步骤（5）中，Ni柱洗涤液为：20mM PBS buffer,0.5M NaCl,20mM imidazole,4M Gdn HCl,PH按照蛋白等电点设定；

洗脱液为：20mM PBS buffer,0.5M NaCl,300mM imidazole,4M Gdn HCl,PH按照蛋白等电点设定；

去除Ni²⁺缓冲液为：0.1M Tris,50mM EDTA,0.5M NaCl。

蛋白纯化步骤为：用10ml去离子水清洗凝胶柱，用1.5ml0.1M NiSO₄饱和凝胶柱，然后用洗脱液清洗凝胶柱，再用清洗液平衡凝胶柱。用0.45um过滤器过滤蛋白样品，缓慢上样目的蛋白溶液，上样完用清洗液洗涤凝胶柱，之后用不同浓度的洗脱液洗脱获得目的蛋白样品。洗脱蛋白后，用去除Ni²⁺缓冲液清洗凝胶柱，最后用水洗涤整个凝胶柱数次，将凝胶柱保存在20%酒精中备用。

包涵体中的蛋白回收方法：用6M尿素溶解包涵体蛋白，其中加入1mM PMSF，1mMTCEP。之后用第4项的方法进行纯化。另一种回收方法为，SDS-PAGE电泳，切取一个通道进行考马斯亮蓝染色，染色后和未染色的凝胶进行对比，割胶回收目的蛋白条带。液氮研磨并用蛋白溶解溶液溶解蛋白，并电泳检测。

本发明还公开了用制得的植物单跨膜受体蛋白进一步制备多克隆抗体的方法，是将富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶的胞外区和胞内区的两段序列插入到表达质粒pET-30a上，然后转化到大肠杆菌BL21中表达目的蛋白，经过亲合纯化得到纯化的高浓度的蛋白，用纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，并用不完全福氏佐剂加强，得到植物抗体，并经过抗体纯化得到纯化的具有一定OD值得抗体溶液。

本发明从拟南芥组织提取总RNA，并以提取的总RNA为模版，先转录合成cDNA第一链，再根据植物基因组数据库的At2g01210基因序列，针对该蛋白的氮端和羧基端分别设计合成一对引物进行高保真的PCR扩增，

本发明采用的pET-30a为表达与His-tag融合的原核高效表达载体，带有强的T7启动子。构建的质粒中，多克隆位点位于His tag基因后，采用分子克隆方法将目的基因序列插入后，将含有植物非跨膜区的编码序列构建到原核表达载体pET-30a上，并且在该载体中此编码序列与6XHis tag融合，接在6XHis tag基因的下游，保持一致的读码框。重组质粒测序后证实含有目的基因以及基因序列的正确性。pET-30a载体如图2所示。

将含有目的基因序列的pET-30a融合表达载体转化进大肠杆菌BL21中，将该转化菌株放入含有氨苄青霉素的LB培养基中进行培养，用0.2mM IPTG诱导表达后，离心收集菌体，用细胞裂解缓冲液将菌体重悬，在冰上超声波破碎细菌溶液几次，最大转速离心后分别收集上清及沉淀。分别将离心后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。明确目的蛋白在上清或者在沉淀中存在。

存在于上清中的蛋白，接下来将裂解上清液通过Ni柱进行吸附，经过溶液洗涤后，用5ml含有Imidazole的洗脱液分10次将目的蛋白分别洗脱到10个不同的离心管中，洗脱下来的蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测其浓度和纯度，用不同浓度的BSA做对照进行浓度比对。

用纯化好的蛋白制备免疫兔子的蛋白溶液进行兔子免疫注射，免疫注射前抽取5ml的兔子血液作为对照。之后按照时间表免疫兔子4次。在4次免疫注射完成后，将兔子血取出（大概50-70ml血液），经过4℃过夜后，最大转速离心，从血液中收集血清，保存在-70℃冰箱中。

制备CNBr激活的琼脂糖凝胶柱，并从免疫血清中取5ml用来亲和纯化制备的抗体。纯化好的抗体可以应用到各种检测实验中。

本发明的另外一个目的在于利用纯化的具有一定浓度的该蛋白快速制备该植物蛋白的多克隆抗体，该抗体可以用来检测并鉴定该蛋白在植物中不同时期以及不同组织部位的蛋白表达水平，以及从植物中免疫共沉淀该蛋白以及与该蛋白相互作用的相关蛋白，并且利用该抗体进行免疫荧光分析，可以在细胞和组织中快速定位该蛋白在植物细胞和组织中的分布。

附图说明

图1是富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶（LRR-RLK）分为胞外区（氮端）和胞内区（羧基端）示意图。

图2是pET-30a载体示意图。

图3是蛋白诱导表达裂解的细菌全蛋白电泳图。

图4是蛋白从亲和柱洗脱纯化后的蛋白电泳图。

图5是纯化后的蛋白定量电泳图。

图6是不同的蛋白抗体对重组蛋白的识别专一性western杂交图。

图7是用抗体识别野生型和转基因植物中相应蛋白的western杂交图。

图8是用制备的抗体进行免疫荧光分析。

图9是用制备的抗体进行免疫电镜分析。

图10是用制备的抗体在植物总蛋白中进行免疫共沉淀的银染电泳图。

具体实施方式

以下实施方式步骤将结合附图对本发明作进一步说明。

1、富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶（LRR-RLK）分为胞外区（氮端）和胞内区（羧基端）两部分（图1），我们将该蛋白（拟南芥基因At2g01210编码）分为胞外区和胞内区的两部分分别进行基因克隆（引物序列为Nter-pET30a-F5'GGGGGATCCTTAAACGACGAAGGCTTTGCG3'；Nter-pET30a-R5'GGGCTCGAGTCAGCTTTTGCTCAAACCACTTGATTTC3'；CT-pET30a-F5'GGGGAATTCAAGTTCTGCGCTTGTAACCGC3'；CT-pET30a-R5'GGGCTCGAGTCAATCGCCGGCCACGGGT3'），得到胞外区序列如SEQ ID NO.5所示，得到胞内区序列如SEQ ID NO.6所示，将得到的两个序列分别通过多克隆位点BamHI,XhoI和EcoRI,XhoI构建到带有强的T7启动子并与6XHis tag融合的蛋白表达载体上。构建的质粒中，多克隆位点位于His tag基因后，采用分子克隆方法将目的基因的氮端和羧基端序列分别构建到原核表达载体pET-30a上，并且在该载体中此编码序列与6XHis tag融合，接在6XHis tag基因的下游，保持一致的读码框。重组质粒测序后证实含有目的基因以及基因序列的正确性。pET-30a载体如图2所示。

2、培养BL21菌株，把重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，37℃培养转化了重组质粒的BL21到OD值0.7。图3的第1、3、5道为未添加IPTG诱导剂的转化了空载体和重组质粒的BL21全菌蛋白电泳图。

3、在BL21中诱导表达目的蛋白。在培养的大肠杆菌BL21培养液中加入0.2mM IPTG诱导剂，25℃诱导4小时。图3第2、4、6道为转化了空载体和重组质粒的BL21全菌蛋白电泳图。红色箭头标明诱导出的目的蛋白。胞外氮端蛋白在图中我们用蛋白1表示，胞内羧基端蛋白用蛋白2表示。

4、裂解表达目的蛋白的BL21大肠杆菌。把诱导后的菌体离心收集后，用细胞裂解液重悬，在冰浴条件下，超声波破碎细胞30-40次，每次3-6秒。然后把破碎后的菌液在4℃条件下，13000rpm离心10分钟，分别收集上清和沉淀。

5、诱导表达的蛋白与Ni柱进行亲合吸附及洗脱。将上清与Ni柱混合，4℃孵育过夜后，收集从Ni柱中的流出液,图4第2道。用洗涤液清洗Ni柱中的beads几次，然后用Imidazole洗脱目的蛋白。图4的3-10道（图中标号为1-8）给出洗脱下来的不同Eppendoff tubes中蛋白浓度的情况。

6、洗脱下来的蛋白定量分析。图5显示用不同浓度的BSA溶液为定量标准，将不同管中的蛋白溶液电泳与之对比，估算目的蛋白的浓度。

7、用纯化的蛋白做抗原进行免疫兔子。每只兔子首次免疫前取5ml血液获得血清作为免疫前对照。每只兔子每次免疫用抗原蛋白大于250微克，并用不完全福氏佐剂加强，按照免疫时间表连续免疫4次。

8、得到目的蛋白的抗体血清。于免疫第4次后，将兔子血取出（大概50-70ml血液），经过4℃过夜后，最大转速离心，从血液中收集血清，保存在-70℃冰箱中。

9、从免疫血清中纯化目的蛋白的抗体。制备CNBr激活的琼脂糖凝胶柱，并从免疫血清中取5ml用来亲和纯化制备的抗体。经过和琼脂糖凝胶柱交联、洗涤以及洗脱，得到一定OD值的纯化的抗体溶液。

10、目的蛋白抗体的应用。纯化后的抗体用来进行Western检测蛋白的表达，利用重组蛋白进行抗体对目的蛋白的检测，图6显示不同蛋白抗体对重组蛋白的识别专一性。此外该抗体可以用来检测并鉴定该蛋白在植物中的蛋白表达水平，图7利用野生型和在野生型植物中过量表达目的蛋白的转基因植株进行的Western检测，直观的表现出不同植物中该蛋白的表达量水平，用以分析在植物中过量表达该蛋白的功能。图8和图9分别利用该抗体进行免疫荧光和免疫电镜分析，可以在细胞和组织中快速定位该蛋白在植物细胞和组织中的分布。并且图10利用该蛋白的抗体从植物中免疫共沉淀该蛋白以及与该蛋白相互作用的相关蛋白，用以识别鉴定相互作用的蛋白，有利于对此蛋白发挥功能的通路中其他蛋白进行研究分析。

Claims

1.一种原核表达的重组质粒载体，其特征在于，该载体含有拟南芥富含亮氨酸的单跨膜受体蛋白激酶基因LRR-RLK的胞外区和胞内区序列，是在原核表达载体pET-30a的多克隆位点BamHI/XhoI和EcoRI/XhoI分别插入SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列而获得。

2.一种快速制备植物单跨膜受体蛋白的方法，其特征在于：构建权利要求1所述重组质粒载体，并转化到大肠杆菌BL21中表达目的蛋白，经过亲合纯化得到纯化的高浓度的蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（5）诱导表达的蛋白与Ni柱进行亲合吸附及洗脱得到纯化的蛋白：将上清与Ni柱混合，4℃孵育过夜后，收集从Ni柱中的流出液，用洗涤液清洗Ni柱中的beads几次，然后用Imidazole洗脱目的蛋白;然后用去除Ni²⁺缓冲液将Ni²⁺从Ni柱上洗脱下来。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

步骤（4）中，细胞裂解液为20mM PBS buffer,0.5M NaCl,0.1%Triton X-100,0.1%NP40,1mM EDTA,1mM PMSF,1mM TCEP,PH按照蛋白等电点设定；

去除Ni²⁺缓冲液为：0.1M Tris,50mM EDTA,0.5M NaCl。

5.一种快速制备植物单跨膜受体蛋白多克隆抗体的方法，其特征在于：构建权利要求1所述重组质粒载体，并转化到大肠杆菌BL21中表达目的蛋白，经过亲合纯化得到纯化的高浓度的蛋白，用纯化后的蛋白做抗原去免疫兔子，并用不完全福氏佐剂加强，得到植物抗体，并经过抗体纯化得到纯化的具有一定OD值得抗体溶液。